BR112019018314A2 - Kit para detecção de doenças sexualmente transmissíveis (dst) silenciosas em uma amostra de urina - Google Patents

Kit para detecção de doenças sexualmente transmissíveis (dst) silenciosas em uma amostra de urina Download PDF

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Abstract

um kit de diagnóstico para detectar simultaneamente pelo menos sete doenças sexualmente transmissíveis (dst) silenciosas compreendendo: uma tira de diagnóstico compreendendo zonas de detecção com pelo menos oito sondas com seq id nos: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24; pelo menos 14 iniciadores com seq id nos: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23; um manual de instruções; um conjunto de sequências de nucleotídeos para detectar simultaneamente pelo menos sete doenças sexualmente transmissíveis (dst) silenciosas; uso do referido kit para detectar pelo menos os seguintes patógenos: vírus da herpes tipo 1, vírus da herpes tipo 2, chlamydia trachomatis, ureaplasma urealitycum, mycoplasma hominis, mycoplasma genitalium e papilomavírus humano (hpv); um método para detectar simultaneamente pelo menos sete doenças sexualmente transmissíveis (dst) silenciosas.

Description

KIT PARA DETECÇÃO DE DOENÇAS SEXUALMENTE TRANSMISSÍVEIS (DST) SILENCIOSAS EM UMA AMOSTRA DE URINA DESCRIÇÃO [001] A presente invenção descreve um Kit para detectar simultaneamente patógenos que podem causar doenças sexualmente transmissíveis (DST) silenciosas a partir de amostras de urina humana não invasivas, a seguir denominado Kit-U. O grupo de patógenos detectados são: Vírus da Herpes tipo 1, Vírus da Herpes tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium e Papilomavírus Humano (HPV). Um conjunto de 24 sequências formadas por 16 iniciadores e 8 sondas é usado para realizar essa detecção, iniciadores e sondas que identificam exclusivamente cada um dos patógenos do referido grupo. As sequências conhecidas na técnica são usadas no caso do HPV. O uso das referidas sequências e o método de detecção dos referidos patógenos são aqui descritos. Hoje, não existem técnicas eficientes, rápidas e econômicas para diagnosticar simultaneamente DSTs de uma amostra biológica humana não invasiva.
[002] Este Kit-U tem base nas referidas sequências para realizar um método começando com a extração do DNA presente em uma amostra de urina, amplificando o referido
DNA por meio de um PCR multiplexada de reação única,
amplificando mais de uma sequência de DNA de diferentes
patógenos, neste caso, e que inclui a rotulação, e
subsequentemente desnaturação e hibridização do referido DNA amplificado e rotulado em uma membrana de náilon em uma tira de diagnóstico para visualizar resultados com sondas específicas complementares às sequências específicas de
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2/21 cada patógeno, o que permite detectar a presença de qualquer um dos patógenos na amostra de urina, detectando o rótulo incluído nas sequências de DNA amplificadas, o que resulta em uma linha roxa na referida membrana para visualização dos resultados.
FUNDAMENTOS [003] As doenças sexualmente transmissíveis (DSTs) são causadas por um conjunto de patógenos e vírus, que causam lesões na pele, prurido, dor e, em alguns casos, febre, entre outros sintomas. Esses patógenos também têm sido associados à infertilidade e/ou abortos espontâneos. Os tratamentos para essas infecções são baseados na aplicação de antibióticos, e/ou medicamentos antivirais. Nesse sentido, a detecção específica de quais patógenos está(ão) presente(s) em uma amostra é um problema técnico de interesse importante, pois define o tratamento mais adequado a ser seguido em cada caso.
[004] Atualmente, não há alternativa no mercado para diagnosticar simultaneamente Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Chlamydia trachomatis, Herpes Virus e HPV, usando um único teste de uma única amostra. Além disso, as metodologias usadas na técnica, tais como, culturas celulares, fluorescência e PCR em tempo real, são caras, difíceis de implementar e manter, têm pouca especificidade e são difíceis de acessar pela população, serviços de saúde e laboratórios. Por outro lado, os tratamentos para DST são caros e os pacientes, na maioria dos casos, são tratados com antimicrobianos por várias semanas. Um antibiótico de amplo espectro é escolhido quando o diagnóstico é inespecífico, mas o referido
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3/21 antibiótico pode gerar resistência futura a um eventual contágio de DST. Dessa maneira, surge o problema de ter um único Kit de uma única amostra, que simultaneamente e rapidamente pode detectar patógenos como Herpes e Chlamydia trachomatis que se provaram coadjuvantes, aumentando o risco de persistência do virus HPV e infecção por HIV-AIDS, porque induzem um processo inflamatório aumentando a
irrigação das áreas afetadas, causando microlacerações nos
epitélios.
[005] As DSTs são usualmente detectadas e
identificadas através de amostras do tipo invasivo, tal
como sangue ou exame com escova para citologia, entre outras, de modo que a urina se torne uma amostra mais simples e não invasiva para detectar essas infecções.
[006] Atualmente, o mercado oferece várias alternativas para a detecção de patógenos que causam doenças sexualmente transmissíveis (DST) silenciosas a partir de amostras de urina. Por exemplo, kits comerciais: Kit de PCR para virus da Herpes Simplex 1 GeneProof (HSV-
1) , Kit de PCR de virus da Herpes Simplex 2 GeneProof (HSV-
2) , Kit de PCR de Chlamydia trachomatis GeneProof, Kit de PCR para Ureaplasma GeneProof, Kit de PCR para Mycoplasma genitalium/hominis GeneProof, que fazem uma detecção individual e separada de cada patógeno, bactéria ou vírus, a partir de amostras de urina ou sangue. No entanto, nenhum desses kits descreve a detecção simultânea de vários patógenos no mesmo teste de uma única amostra não invasiva, tal como urina.
[007] WO2015034764 descreve um método e um kit para a detecção de papilomavírus humano (HPV); US4937199 descreve
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4/21 o método de detecção de Herpes; US5516638 descreve o método de detecção de Chlamydia trachomatis; todos esses documentos detectam patógenos em amostras de urina humana. Esses documentos descrevem métodos de detecção específicos para cada um dos patógenos de interesse divulgados pelo presente pedido, usando técnicas diferentes e específicas para cada tipo de patógeno (bactérias e/ou vírus), mas a integração de todos esses métodos em uma macrotécnica não permite alcançar a identificação simultânea de diferentes patógenos. No entanto, nenhum desses documentos descreve um único método e kit para diagnosticar simultaneamente cada um desses patógenos.
[008] O presente pedido descreve um Kit destinado a detectar patógenos que causam as doenças sexualmente transmissíveis silenciosas mais frequentes na população humana em geral, permitindo subagrupar pacientes infectados, que no caso de Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Chlamydia trachomatis, Vírus da Herpes e HPV poderão ter acesso oportuno ao tratamento. Chlamydia trachomatis e Herpes Virus são coadjuvantes do HPV, portanto, pacientes conhecidos por serem portadores desses patógenos poderíam ser acompanhados com mais frequência para detectar a patologia em estágios iniciais, prevenindo lesões pré-neoplásicas. Chlamydia trachomatis, por outro lado, pode afetar a capacidade reprodutiva em homens e mulheres.
[009] No caso do HPV, a utilidade clínica a curto prazo é o acompanhamento dos pacientes, a decisão terapêutica, a vacinação, e a utilidade clínica a longo prazo é a redução da infertilidade e as taxas de câncer
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5/21 cervical ou outras associadas ao HPV.
PROBLEMA TÉCNICO [0010] Atualmente, os testes de diagnóstico de Doenças sexualmente transmissíveis (DST) silenciosas se relacionam apenas à detecção e/ou identificação de um agente causador por análise, que geralmente exige uma implementação complexa e cara nos equipamentos; levando um periodo de tempo que pode chegar a sete dias, durante os quais o paciente não pode receber um tratamento apropriado. Assim, a detecção rápida e econômica de doenças sexualmente transmissíveis é geralmente um problema frequente de laboratórios e serviços de saúde. Portanto, é necessário desenvolver metodologias e kits sensíveis que, a baixo custo, permitam detectar simultaneamente várias DST silenciosas em uma única amostra não invasiva, tal como urina, permitindo aplicar o tratamento especifico de acordo com o patógeno detectado.
SUMÁRIO [0011] A presente invenção descreve um Kit para detectar simultaneamente patógenos causadores de Doenças sexualmente transmissíveis (DST) silenciosas a partir de uma única amostra de urina humana não invasiva, a seguir denominada Kit-U. O grupo de patógenos detectados são: Vírus da Herpes tipo 1, Vírus da Herpes tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, além do papilomavírus humano (HPV),
Kit que usa sonda e iniciadores já conhecidos. Para
realizar esta detecção simultânea, a presente invenção
descreve um conjunto de 24 sequências formadas por 16
iniciadores e 8 sondas, que identificam distintamente os 6
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6/21 primeiros patógenos do grupo. No caso do HPV, são usadas 3 sequências conhecidas. É necessário detectar os 6 primeiros patógenos do grupo juntamente com o HPV, porque a dinâmica desses patógenos é sinergistica. 0 presente Kit-U usa 3 sequências conhecidas (2 iniciadores e 1 sonda) que identificam uma porção do gene constituinte da β-globina como um controle para a extração correta do DNA, de modo a detectar os patógenos de interesse. 0 uso das sequências e o método de detecção dos referidos patógenos são aqui descritos, o método que busca fornecer uma ferramenta de diagnóstico fácil, rápida e econômica para detecção simultânea a partir de uma única amostra de urina humana não invasiva. A fácil implementação e o uso deste Kit-U permitiria sua implementação em qualquer laboratório de diagnóstico, considerando que o processo leva aproximadamente 8 horas desde a chegada da amostra ao laboratório até a obtenção de um resultado a ser relatado. Oferecer uma alternativa em que com uma única amostra possa detectar simultaneamente a presença de 7 patógenos resulta em uma redução de custos no processamento e na análise de amostras, o que permitiria alcançar uma população maior que poderia ter acesso a um teste alternativo mais barato e mais rápido, especialmente considerando que atualmente, cada painel de patógenos é analisado separadamente, aumentando assim o custo desses testes. Os patógenos detectados são: Vírus da Herpes tipo 1, Vírus da Herpes tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium e adicionalmente papilomavírus humano (HPV) para os quais são usadas sequências conhecidas.
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7/21 [0012] O diagnóstico rápido obtido por este Kit-U permite a dispensação de um tratamento limitado ao patógeno que afeta efetivamente o paciente, evitando a medicação excessiva que poderia gerar resistência futura a um possível contágio de DST.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0013] Figura 1. Gráfico comparativo da presença/ausência de DNA em amostras de urina. Este gráfico mostra que o Kit-U detectou a presença de DNA em 4 6 amostras do total de 46 amostras testadas, enquanto o kit de laboratório comercial detectou apenas a presença de DNA em 8 amostras. Usando a mesma concentração inicial da amostra em ambos os casos. Isso mostra que a sensibilidade do Kit-U é maior que do kit de laboratório comercial.
[0014] Figura 2. Gráfico que mostra a distribuição dos resultados obtidos ao analisar as amostras com Kit-U. Distribuição de m.o. detectado pelo Kit-U. Este gráfico mostra a distribuição das detecções feitas com Kit-U, encontrando 34 detecções para Ureaplasma urealit icum, 13 para Mycoplasma hominis, 3 Chlamidia trachomatis, 2 Mycoplasma genitalium, 1 HPV e 10 amostras negativas.
[0015] Figura 3. Gráfico que mostra a distribuição dos resultados obtidos ao analisar as amostras pelo Laboratório Comercial. Distribuição de m.o. detectado pelo Laboratório Comercial. Este gráfico mostra a distribuição das detecções realizadas com o Kit do Laboratório Comercial, constatando que, do total de 8 amostras detectadas pelo DNA, apenas 2 detecções identificam Mycoplasma hominis, enquanto as 6 amostras restantes não foram identificadas.
[0016] Figura 4. Esta figura mostra o padrão espacial
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8/21 que mostra a localização das sondas de detecção para cada patógeno. As tiras de detecção são localizadas paralelas a esse padrão para identificar quais patógenos estão presentes na amostra.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0017] A presente invenção descreve um kit para detectar simultaneamente patógenos que causam Doenças sexualmente transmissíveis (DST) silenciosas a partir de uma única amostra de urina humana não invasiva, aqui denominada Kit-U. O grupo de patógenos de interesse detectados são:
• Vírus da herpes tipo 1, • Vírus da herpes tipo 2, • Chlamydia trachomatis, • Ureaplasma urealitycum, • Mycoplasma hominis, • Mycoplasma genitalium e • Papilomavírus humano (HPV) .
[0018] A presente invenção descreve um conjunto de 24 sequências, em que as SEQ ID NOs : 1 a 18 são projetadas especificamente para a detecção dos 6 primeiros patógenos do grupo de patógenos de interesse usando 2 iniciadores e 1 sonda para cada patógeno. Três sequências já conhecidas (2 iniciadores, 1 sonda) são usadas para HPV. Adicionalmente, o presente Kit-U requer a detecção do gene da β-globina (controle interno para qualidade e amplificação do DNA), para o qual são usadas outras 3 sequências conhecidas da técnica. Este Kit-U permite realizar um método de detecção com base na amplificação por PCR multiplexada de sequências da região do genoma de diferentes patógenos. O produto de
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PCR é hibridizado em uma tira de diagnóstico formada por uma membrana de náilon contendo sondas especificas para diferentes patógenos [0019] Os iniciadores usados na etapa de PCR multiplexada são previamente rotulados na extremidade 5' com uma molécula de digoxigenina, que é usada para detectar a presença do patógeno. As sondas têm uma modificação na extremidade 5' com um Modificador de Amino C6 (AmMC6), permitindo que a sonda tenha aderência à membrana de náilon na tira de diagnóstico.
[0020] Se o genoma de qualquer um dos patógenos de interesse a ser detectado estiver acoplado à sua sonda complementar, ele expõe a molécula de Digoxigenina em um dos iniciadores agora localizados no DNA amplificado. Esta molécula de Digoxigenina é detectada através de uma reação com anticorpo anti-Digoxigenina, este anticorpo é conjugado com fosfatase alcalina para sua visualização com o composto NBT/BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato/nitroazul de tetrazólio), que forma um precipitado púrpura na membrana no local da sonda que reagiu com o DNA do patógeno presente na amostra.
[0021] A hibridização entre o DNA do patógeno presente na amostra de urina e a sonda especifica é visualizada por um precipitado colorido. A tira de diagnóstico inclui uma sonda para o gene da β-globina já conhecido na técnica, como controle interno de amplificação. As zonas de detecção são localizadas na tira de diagnóstico de acordo com um padrão espacial (Figura 4), estabelecido de modo que a tira de diagnóstico seja comparada com o referido padrão para determinar a presença ou ausência de cada patógeno
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10/21 especifico .
[0022] Mais especificamente, o presente pedido descreve um kit diagnóstico para detectar simultaneamente pelo menos sete doenças sexualmente transmissíveis (DST) silenciosas, que compreende • uma tira de diagnóstico, compreendendo zonas de detecção com pelo menos 8 sondas de SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24;
• pelo menos 14 iniciadores de SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23;
• manual de instruções.
[0023] O presente relatório descritivo também descreve as SEQ ID NOs: 1 a 18, cada uma separadamente, e sequências tendo pelo menos 90% de similaridade.
[0024] O presente pedido também descreve um conjunto de 24 sequências de nucleotídeos descritas em detalhes na Tabela 1, as primeiras 18 sequências de nucleotídeos, SEQ ID NOs: 1 a 18, foram projetadas especificamente para esta invenção. As sequências 19 a 21 são conhecidas na técnica para detecção de HPV, e as sequências 22 a 24 são conhecidas na técnica para detecção de β-globina. Também são descritas as sequências de nucleotídeos de 2 iniciadores e 1 sonda, respectivamente, para cada patógeno alvo a ser detectado. Os iniciadores são úteis para realizar uma amplificação de segmentos específicos por etapa de amplificação por PCR multiplexada, enquanto a sonda é útil para realizar a detecção dos referidos segmentos amplificados. Tabela 1
PATÓGENO Alvo Sequência (5'3') SEQ ID NO
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11/21
PATÓGENO Alvo Sequência (5'3') SEQ ID NO
Vírus da Herpes humana 1 Gene de DNA polimerase INICIADOR TGGCCAAGCTGACGGACATTT 1
INICIADOR 5DigN/GAGAGCTTGATCTTGTCGGTT 2
SONDA /SAmMC 6/TAAAGGTGAACGGCATGGTGAGC A 3
Vírus da Herpes humana 2 gene de glicoproteína I de virion e de glicoproteína E de virion INICIADOR TGTTTCTGGGCAGCTGTATC 4
INICIADOR 5DigN/CTATCGACGTTAGGGAAGGCAT 5
SONDA / 5AmMC 6 /CATAGATGCCAGCGCCGATACAGG 6
Chlamydia trachomatis Gene de Proteína v Membrana Externa Principal INICIADOR TCAAGGAGTGGAGTGTCTGCGTA 7
INICIADOR 5DigN/TGTCGCTCCGA TGCAGATGTTT 8
SONDA / 5AmMC 6 /ATAGGGAGTGTTTCTCGCCAAGCT 9
Ureaplasma urealytícum Gene ribossomal de RNA 16S INICIADOR GCAGGCGGGTTTGTAAGTTTGGTA 10
INICIADOR 5DigN/AGCCTAAGCGTCAGTGATAGTCCA 11
SONDA /5AmMC6/ ATAGGAAGAACACCGGTGGCGAA 12
Mycoplasma homínís Gene ribossomal de RNA 16S INICIADOR TGGAGAATCACTGACGCAGCTAAC 13
INICIADOR 5DigN/TGCGAAGGATGTCAAGAGTGGGTA 14
SONDA /5AmMC6/CCGCCTGAGTAGTATGCTCGCAAG 15
Mycoplasma genítalíum proteína ribossomal 30S S3 INICIADOR CGCAACGCTCAGGTGTCTAATGT 16
INICIADOR 5DigN/AGAGCTTGG CGCATTGCTGA 17
SONDA /5AmMC6/TCGGCTCTCCGATGTTATCAAGTAG GA 18
HPV Região do vírus LI INICIADOR C GT C CMARRGGAWAC T GAT C 19
INICIADOR 5DigN/ GCMCAGGGWCATAAYAATGG 20
SONDA /5AmMC6/TTTGTTACTGTTGTGAGATACCACT CGCAG 21
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12/21
PATÓGENO Alvo Sequência (5'3') SEQ ID NO
β-globina Gene constitutivo INICIADOR 5D1 gN / GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 22
INICIADOR CAACTTCATCCACGTTCACC 23
INICIADOR /5AmMC 6/TAAGCAAATAGATGGCTCTGCCCT 24
[0025] O presente pedido também descreve um conjunto que consiste em 24 sequências que têm pelo menos 90% de similaridade com as sequências do conjunto descrito na Tabela 1.
[0026] As sequências 19 a 24 são conhecidas na técnica. Elas são descritas aqui, uma vez que a detecção de HPV e β-globina é necessária como controle, juntamente com a detecção do restante dos patógenos do grupo: Vírus da herpes tipo 1, Vírus da herpes tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium.
[0027] Os iniciadores com SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 e 22 são rotulados nas suas extremidades 5' com a molécula de Digoxigenina. Essa molécula marcadora permite detectar subsequentemente as sequências hibridizadas, identificando assim o patógeno correspondente.
[0028] As sondas com SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 têm uma modificação na extremidade 5' (Modificador de Amino C6, AmMC6) que permite a sua adesão à membrana de náilon na tira de diagnóstico.
[0029] O presente pedido descreve o uso de SEQ ID NOs: 1 a 24, para a preparação de um kit de diagnóstico compreendendo as mesmas, úteis para a detecção de patógenos que causam doenças sexualmente transmissíveis. Outra forma de realização do presente pedido é o uso do kit para detectar pelo menos patógenos do grupo: Vírus da Herpes
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13/21 tipo 1, Vírus da Herpes tipo 2, Chlamydia trachomatis,
Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, e Papilomavírus Humano (HPV).
[0030] As sequências SEQ ID NOs: 1, 2, 3 são usadas para a detecção do vírus da herpes Humano 1.
[0031] As sequências SEQ ID NOs: 4, 5, 6 são usadas para a detecção do vírus da herpes Humano 2.
[0032] As sequências SEQ ID NOs: 7, 8, 9 são usadas para a detecção de Chlamydia trachomatis.
[0033] As sequências SEQ ID NOs: 10, 11, 12 são usadas para a detecção de Ureaplasma urealyticum.
[0034] As sequências SEQ ID NOs: 13, 14, 15 são usadas para a detecção de Mycoplasma hominis.
[0035] As sequências SEQ ID NOs: 16, 17, 18 são usadas para a detecção de Mycoplasma genitalium.
[0036] As sequências SEQ ID NOs : 19, 20, 21,
conhecidas na técnica, são usadas para a detecção de
papilomavírus humano (HPV).
[0037] As sequências SEQ ID NOs: 22, 23,
24, conhecidas na técnica, são usadas para a detecção do gene da β-globina, um gene constitutivo que é usado para controlar a extração correta do DNA da amostra.
[0038] O presente pedido também descreve um método para detectar simultaneamente pelo menos 7 Doenças
Sexualmente Transmissíveis (DST) silenciosas, que compreende as etapas de:
i) extração de DNA de uma amostra de fluido corporal por lise celular, e centrifugação para obter um sedimento contendo amostras de DNA a serem amplificadas; em que os fluidos corporais são selecionados a partir de urina,
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14/21 sangue, saliva, secreção uretral, fluido seminal, secreção vaginal;
ii) amplificação por PCR multiplexada usando os iniciadores descritos nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23; cópias de segmentos de DNA complementares aos referidos iniciadores são amplificadas ;
iii) hibridização do DNA amplificado na etapa ii) , usando as sondas descritas nas SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, por uma reação de hibridização entre as cópias obtidas na amplificação da etapa ii) usando as referidas sondas;
iv) detecção da presença ou da ausência de patógenos de interesse em uma membrana de náilon compreendendo as sondas das SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, arranjadas espacialmente de acordo com um padrão espacial previamente determinado.
EXEMPLO
Etapa 0:
[0039] Preparação da amostra de urina para extração de DNA, remoção do meio de transporte.
[0040] A amostra foi transferida para um tubo falcon de 15 mL, até que um sedimento da amostra total de urina fosse obtido.
[0041] Foi centrifugado a 4.000 rpm por 15 min em temperatura ambiente (TA) de 20 a 22 °C. O sobrenadante foi removido, tendo o cuidado de não destacar o sedimento.
1. 300 uL de tampão fosfato salino (PBS) ou tampão fosfato salino Dubelcco (DPBS) foram adicionados. Podem ser adicionados entre 300 e 600 uL de PBS, dependendo do
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15/21 tamanho do sedimento.
2. A amostra foi então dividida em dois tubos Eppendorf de 1,5 mL.
3. Foi centrifugado a 12.000 rpm, por 5 min em TA.
4. 0 sobrenadante foi removido cuidadosamente.
5. 500 uL de solução de lise foram adicionados.
6. Ficou 12 horas em TA, e a extração de DNA foi continuada.
Etapa i
Extração de DNA [0042] Após remover o meio de transporte e adicionar 500 mL de tampão de lise para iniciar a lise celular, foi realizado um procedimento de extração de acordo com as etapas descritas abaixo:
[0043] Observação: As amostras devem ter um volume minimo de 500 mL no inicio do processo de extração.
1. Adicionar 250 mL de etanol a 100%. Misturar vigorosamente em vórtice.
2. A coluna de extração foi inserida nos tubos de coleta de 2 mL.
3. O total da amostra da etapa 1 foi transferido na coluna de extração, incluindo qualquer precipitado que possa ter sido formado.
4. Centrifugar na velocidade máxima (à 10.000 x g) por 1 minuto.
5. O filtrado foi removido e o tubo de coleta foi reutilizado.
6. 500 mL de tampão HBC (Solução de Lavagem 1) foram adicionados.
7. Tampão HBC foi diluido com isopropanol antes do uso.
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8. Centrifugar na velocidade máxima por 30 segundos.
9. 0 filtrado e o tubo de coleta foram removidos.
10. A coluna de extração foi inserida em um novo tubo de coleta de 2 mL.
11. 700 mL de tampão de lavagem de DNA (Solução de Lavagem 2) foram adicionados. O tampão de lavagem de DNA foi diluído com etanol a 100% antes do uso.
12. Centrifugar na velocidade máxima por 30 segundos.
13. O filtrado foi removido e o tubo de coleta foi reutilizado.
14. As etapas 10 a 12 foram repetidas para uma segunda etapa de lavagem com tampão de lavagem de DNA (Solução de Lavagem 2).
15. A coluna de extração vazia foi centrifugada na velocidade máxima por 2 minutos para secar a coluna.
16. Foram adicionados 100 mL de tampão de eluição (solução de eluição) pré-aquecido a 70°C.
17. Foi deixado em temperatura ambiente por 2 minutos.
18. Foi centrifugado a 15.000 g por 1 minuto. Estágio ii.
Amplificação do DNA extraído.
[0044] Esta etapa foi realizada para aumentar o número de cópias do genoma de patógenos do grupo de interesse a ser detectado. Isso é alcançado com o uso de iniciadores de SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 23 e 24 descritos na Tabela 1. Que são rotulados na extremidade 5' com uma molécula de Digoxigenina que reage na próxima etapa (hibridização). Estes iniciadores estão contidos no PCR Mix.
1. 20 uL de PCR Mix foram distribuídos em cada tubo de
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17/21
PCR.
2. Adicionar :
• 5 uL de amostra para cada tubo • 5 uL de controle positivo • 5 uL de Controle em branco.
3. Os tubos foram tampados. Agitar no vórtice por 3 s vendo que não havia mais bolhas.
4. Os tubos foram colocados em um termociclador com o seguinte programa:
• Desnaturação: 94°C/3 min.
• 34 ciclos: 94°C/30s, 56°C/30s, 72°C/30s.
• Extensão: 72°C/3 min.
Etapa iii.
Hibridização amplificada de DNA.
[0045] Nesta etapa, as cópias amplificadas do genoma da etapa ii foram reagidas com as sondas da SEQ ID NO 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24 descritas na Tabela 1.
Método:
HIBRIDIZAÇÃO (Tempo do método: 3 h 30 min) [0046] IMPORTANTE: Antes de iniciar o método:
a. Solução de hibridização, Solução de Lavagem 3, Solução de Lavagem 4 e Solução de Lavagem 5 foram aquecidas e mantidas a 42 °C até serem usadas.
A. Desnaturação do produto de PCR:
1. 85 uL de Solução de Hibridização foram adicionados a um tubo de 0,5 mL e, em seguida, 15 uL do produto de PCR foram adicionados. O tubo foi bem tampado.
2. Desnaturação a 96°C por 10 min. Os tubos do termociclador ou bloco térmico foram removidos e
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18/21 imediatamente resfriados em gelo por 5 min.
Foi tomado extremo cuidado em manter os tubos fechados para evitar a contaminação de amplicon; especialmente ao trabalhar com tubos de 0,2 mL.
3. Centrifugar os tubos a 10.000 x g por 10 segundos antes de abrir para evitar contaminação.
B. Hidratação da tira de diagnóstico [0047] Enquanto os tubos foram resfriados em gelo (etapa 2, acima), 200 uL de Solução de Hibridização foram adicionados em uma bandeja de 8 canais, as tiras de diagnóstico foram adicionadas e hidratadas em temperatura ambiente por 5 min. As tiras de diagnóstico foram removidas com uma pinça do tubo contendo o mesmo.
C. Hibridização de produtos de PCR em Tiras de Diagnóstico
1. Produtos de PCR desnaturados foram adicionados (100 uL) em cada tira de diagnóstico e incubados a 42 °C por 60 min, agitando suavemente, evitando bolhas.
2. A solução de hibridização foi removida com uma pipeta Pasteur plástica estéril.
3. 1 mL de Solução de Lavagem 3 foi adicionado. Incubado a 42 °C por 10 min com agitação. A etapa 3 foi repetida.
4. A Solução de Lavagem 3 foi removida com uma pipeta Pasteur plástica estéril e foi adicionado 1 mL da Solução de Lavagem 4. Foi incubado a 42 °C por 2 min com agitação.
5. A solução do conjugado foi preparada adicionando 1,3 uL de Conjugado à Solução do Conjugado. Foi misturado invertendo (Vórtice NO).
6. A Solução de Lavagem 4 foi removida com uma pipeta de Pasteur plástica estéril e foram adicionados 0,5 mL de
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Solução de Conjugado preparada na hora. Foi incubada a 42°C por 30 min com agitação. A solução conjugada foi removida.
7. 1 mL de Solução de Lavagem 5 foi adicionado. Incubado a 42 °C por 5 min com agitação. Esta etapa foi repetida.
8. A Solução de Lavagem 5 foi removida.
D. Desenvolvimento da Tira de Diagnóstico
1. 0,5 mL de Solução de Substrato foram adicionados. Foi incubada a 42 °C por 30 min no escuro, sem agitação.
2. A reação foi interrompida adicionando aproximadamente 1 mL de água destilada com uma pipeta. Esta etapa foi repetida pelo menos duas vezes.
3. A água foi removida por inversão, tomando cuidado para não varrer ao longo das tiras de diagnóstico. 2 mL de água destilada foram adicionados, deixados em repouso por pelo menos 30 min.
4. As tiras de diagnóstico foram removidas com uma pinça e colocadas em uma folha de papel para secar. Uma vez secas, elas foram cobertas com uma fita adesiva para armazená-las. Opcional: podem ser digitalizadas.
5. Os resultados são obtidos imediatamente. A tira de diagnóstico foi colocada paralela ao padrão (figura 4) incluído no kit.
Etapa iv
RESULTADOS E INTERPRETAÇÃO DA TIRA DE DIAGNÓSTICO [0048] A tira de diagnóstico contém sondas específicas para detectar patógenos: vírus da herpes tipo 1, vírus da herpes tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium e papilomavírus humano (HPV). Essas sondas são imobilizadas
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20/21 na tira de diagnóstico, permitindo uma leitura simples da visualização de uma marca em uma zona espacial específica na tira.
CONTROLES • POSITIVO: deve haver presença de bandas para todos os patógenos contidos no kit, incluindo a banda de β-globina.
• BRANCO: ausência de bandas.
[0049] Este exemplo foi realizado duas vezes, uma primeira vez usando os iniciadores e sondas descritos na Tabela 1 deste Kit-U, e uma segunda vez usando os iniciadores e sondas contidas em um kit de laboratório comercial. Permitiu obter resultados comparativos (Figuras 1, 2, 3) em relação à sensibilidade de detecção obtida com as sequências descritas no presente pedido em comparação com a sensibilidade obtida usando as sequências de um kit de laboratório comercial.
[0050] Os resultados podem ser lidos colocando cada tira de diagnóstico no padrão que contém as sondas ordenadas mostradas na figura 4, tentando corresponder à linha de base para garantir a interpretação correta dos resultados.
[0051] Uma análise comparativa contra o Kit de Laboratório Comercial foi realizada para validar este KitU, amostras foram coletadas de 47 pacientes que doaram duas amostras de urina cada. As duas amostras foram coletadas ao mesmo tempo.
[0052] A Figura 1 mostra uma comparação de sensibilidade entre o KIT-U e o Kit de Laboratório Comercial. Usando o Kit-U, foi possível obter DNA suficiente de 100% das amostras de urina para obter um
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21/21 resultado. Por outro lado, a análise realizada usando o kit de laboratório comercial não detectou a presença de DNA em 82,6% (n = 38) das amostras.
[0053] A Figura 2 mostra os patógenos detectados usando o Kit-U. Observa-se que o Kit-U foi capaz de detectar a presença de pelo menos um patógeno em 78,2% (n = 36) das amostras analisadas, com apenas 21,8% (n = 10) dos casos negativos.
[0054] Por outro lado, ao usar o kit de laboratório comercial — ver os resultados na Figura 3A — do total de amostras (n = 8) em que o DNA foi detectado, 75% (n = 6) foram negativos para os patógenos avaliados e apenas 25% (n = 2) foram positivos para Mycoplasma hominis.
[0055] Isso mostra que os iniciadores e sondas descritos nas SEQ ID NOs: 1 a 18 compreendidos pelo Kit-U, provêm sensibilidade melhorada em comparação com os iniciadores e as sondas do Kit de Laboratório Comercial.
[0056] É importante mencionar que essas sequências de iniciadores e sondas projetadas para este Kit-U, SEQ ID NOs: 1 a 18, juntamente com as sequências adicionais 19 a 24 conhecidas na técnica e usando o método de detecção, podem ser usadas com qualquer amostra biológica a partir da qual o DNA amplificável pode ser obtido, de preferência, fluidos, tais como, sangue, saliva, secreção uretral, fluido seminal, secreção vaginal.

Claims (24)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Kit de diagnóstico para detectar simultaneamente pelo menos 7 doenças sexualmente transmissíveis (DST) silenciosas, caracterizado pelo fato de que compreende • uma tira de diagnóstico, compreendendo zonas de detecção com pelo menos 8 sondas de SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24;
    • pelo menos 14 iniciadores de SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23;
    • manual de instruções.
  2. 2. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade com, pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 1.
  3. 3. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade com, pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 2.
  4. 4. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade com, pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 3.
  5. 5. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade com, pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 4.
  6. 6. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade com, pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 5.
  7. 7. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade com, pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 6.
  8. 8. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade com,
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    2/5 pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 7.
  9. 9. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 8.
  10. 10. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 9.
  11. 11. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 10.
  12. 12. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 11.
  13. 13. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 12.
  14. 14. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 13.
  15. 15. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 14.
  16. 16. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 15.
  17. 17. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 16.
  18. 18. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade fato com, fato com, fato com, fato com, fato com, fato com, fato com, fato com, fato com, fato com,
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    3/5 pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 17.
  19. 19. Sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que consiste exatamente em, ou tem uma similaridade com, pelo menos 90% com a SEQ ID NO: 18.
  20. 20. Sequência de nucleotídeos estabelecida para a detecção simultânea de pelo menos 7 doenças sexualmente transmissíveis (DST) silenciosas, caracterizada pelo fato de que consiste nas seguintes sequências:
    Sequência (5'3') SEQ ID NO: TGGCCAAGCTGACGGACATTT 1 5DigN/GAGAGCTTGATCTTGTCGGTT 2 /5AmMC 6/TAAAGGTGAACGGCATGGTGAGCA 3 TGTTTCTGGGCAGCTGTATC 4 5DigN/CTATCGACGTTAGGGAAGGCAT 5 /5AmM6/CATAGATGCCAGCGCCGATACAGG 6 TCAAGGAGTGGAGTGTCTGCGTA 7 5DigN/TGTCGCTCCGATGCAGATGTTT 8 /5AmMC6/ATAGGGAGTGTTTCTCGCCAAGCT 9 GCAGGCGGGTTTGTAAGTTTGGTA 10 5DigN/AGCCTAAGCGTCAGTGATAGTCCA 11 /5AmMC 6/ATAGGAAGAACACCGGTGGCGAA 12 T GGAGAAT CAC T GAC GCAGC TAAC 13 5DigN/TGCGAAGGATGTCAAGAGTGGGTA 14 /5AmMC 6/CCGCCTGAGTAGTATGCTCGCAAG 15 CGCAACGCTCAGGTGTCTAATGT 16 5DigN/AGAGCTTGGCGCATTGCTGA 17 /5AmMC 6/TCGGCTCTCCGATGTTATCAAGTAGGA 18 CGTCCMARRGGAWACTGATC 19 5DigN/GCMCAGGGWCATAAYAATGG 20
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    4/5
    Sequência (5'3') SEQ ID NO: /5AmMC6/TTTGTTACTGTTGTGAGAT ACCACTCGCAG 21 5 D i gN/GAAGAGC CAAGGACAGGTAC 22 CAACTTCATCCACGTTCACC 23 /5AmMC 6/TAAGCAAATAGATGGCTCTGCCCT 24
    em que as SEQ ID NOs: 2, 5, 8, 11, 14, 17 são rotuladas na extremidade 5' com uma molécula de Digoxigenina (5DigN/); e em que as SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18 têm uma modificação na extremidade 5' (Modificador de Amino C6, 5AmMC6/), que é o que permite aderir à tira de diagnóstico.
  21. 21. Conjunto de sequências, caracterizado pelo fato de que suas sequências têm pelo menos 90% de similaridade com as sequências do conjunto de sequências como definido na reivindicação 20.
  22. 22. Uso do kit, como definido na reivindicação 1, caracterizado por ser para servir para detectar pelo menos os seguintes patógenos: Vírus da Herpes tipo 1, Vírus da Herpes tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, e Papilomavírus Humano (HPV) .
  23. 23. Método para detectar simultaneamente pelo menos 7 doenças sexualmente transmissíveis (DST) silenciosas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    i. extrair DNA de uma amostra de fluido corporal por lise celular, e centrifugar para obter um sedimento contendo amostras de DNA a serem amplificadas;
    ii. amplificar por PCR Multiplexada, usando os iniciadores descritos nas SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23;
    Petição 870190086450, de 03/09/2019, pág. 34/38
    5/5 iii. hibridizar o DNA amplificado na etapa ii), usando as sondas descritas nas SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 2 4;
    iv. detectar a presença ou ausência dos patógenos de interesse em uma tira de náilon compreendendo as sondas das SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24.
  24. 24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que na etapa i), as amostras de fluido corporal são selecionadas entre urina, sangue, saliva, secreção uretral, fluido seminal, secreção vaginal.
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