ES2946791T3 - Kit de detección de enfermedades de transmisión sexual silentes (etss) en muestra de orina - Google Patents

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Abstract

Un kit de diagnóstico para detectar en forma simultánea al menos 7 enfermedades de transmisión sexual silentes (ETSs), que comprende: una tira diagnóstica, que comprende zonas de detección con al menos 8 sondas de secuencias SEQ ID Nos: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24; al menos 14 partidores de secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23; manual de instrucciones; Un conjunto de secuencias nucleotídicas para la detección en forma simultánea de al menos 7 enfermedades de transmisión sexual silentes (ETSs); Uso de dicho kit para detectar al menos los siguientes patógenos: Herpes Virus tipo 1, Herpes Virus tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, y Human papillomavirus (HPV); Un procedimiento para detectar en forma simultánea al menos 7 enfermedades de transmisión sexual silentes (ETSs).

Description

DESCRIPCIÓN
Kit de detección de enfermedades de transmisión sexual silentes (etss) en muestra de orina
La presente invención describe un Kit de detección simultánea de patógenos que pueden causar enfermedades de transmisión sexual silentes (ETSs) a partir de muestras no invasivas de orina de seres humanos, en adelante llamado “Kit-U”. El grupo de patógenos detectados son: Herpes Virus tipo 1, Herpes Virus tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium y Human papillomavirus (HPV). Para realizar esta detección se utiliza un conjunto de 24 secuencias formadas por 16 cebadores y 8 sondas, las cuales identifican de manera única a cada uno de los patógenos de dicho grupo. Para el caso de HPV, se utilizan secuencias conocidas del arte. Se describe uso de las secuencias, y procedimiento de detección de dichos patógenos. Hoy en día, no existen técnicas eficientes, rápidas, y económicas para diagnosticar simultáneamente ETSs a partir de muestra biológica no invasiva de seres humanos.
Este Kit-U se basa en dichas secuencias para realizar un procedimiento que se inicia con la extracción de ADN presente en una muestra de orina, amplificar dicho ADN a través de un PCR Multiplex permitiendo en una única reacción, amplificar más de una secuencia de ADN, en este caso de diferentes patógenos, y en el cual se incluye un marcaje, y posteriormente denaturar e hibridar dicho ADN amplificado y marcado, sobre una membrana de nylon en una tira diagnóstica de visualización de resultados con sondas específicas y complementarias a secuencias propias de cada patógeno, lo que permite detectar si alguno de los patógenos está presente en la muestra de orina, a través de la detección del marcaje que se incluye en las secuencias de ADN amplificada, lo cual da como resultado una línea de color morado sobre dicha membrana de visualización de resultados.
ARTE PREVIO
Las enfermedades de transmisión sexual (ETSs) son causadas por un conjunto de patógenos y virus, los cuales ocasionan lesiones cutáneas, prurito, dolor, y en algunos casos fiebre, entre otros síntomas. También se han relacionado estos patógenos con infertilidad y/o abortos espontáneos. Los tratamientos para estas infecciones se basan en aplicación de antibióticos, y /o medicamentos antivirales. En este sentido, la detección específica de cual o cuales son los patógenos presentes en una muestra es un problema técnico de importante interés, ya que determina el tratamiento más apropiado que se debe seguir en cada caso.
Hoy en el mercado no existe una alternativa para el diagnóstico simultáneo de Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Chlamydia trachomatis, Virus Herpes, y HPV, que contemple un única prueba a partir de una única muestra. Además, las metodologías utilizadas en el arte tales como cultivos celulares, Fluorescencia y PCR Real Time, son de alto costo, difíciles de implementar y mantener, siendo poco específicas y de difícil acceso para la población, servicios de salud y laboratorios. Por otro lado, los tratamientos de las ETS son de un alto costo y en la mayoría de los casos se trata a los pacientes con antimicrobianos por varias semanas. Si el diagnóstico es no específico, se opta por un antibiótico de amplio espectro, lo que puede generar resistencia futura a eventual contagio de alguna ETS. De esta forma, surge el problema de contar con un Kit único a partir de una muestra única, que detecte en forma simultánea y rápida patógenos como Herpes y Chlamydia trachomatis los cuales han demostrado ser co-ayudantes, incrementando el riesgo de la persistencia del Virus HPV y la infección de HIV-SIDA, debido a que inducen un proceso inflamatorio incrementando la irrigación de las zonas afectadas, causando microlaceraciones de los epitelios.
Las muestras que habitualmente se utilizan para detectar e identificar ETSs son de tipo invasiva tales como sangre, o citobrush, entre otras, por lo que la orina se transforma en una muestra más simple y no invasiva, para detectar estas infecciones.
En la actualidad el mercado ofrece diversas alternativas para la detección de patógenos causantes de Enfermedades de Transmisión Sexual Silentes (ETSs) a partir de muestras de orina. Por ejemplo, los kits comerciales: GeneProof Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) PCR Kit, GeneProof Herpes Simplex Virus 2 (HSV-2) PCR Kit, GeneProof Chlamydia trachomatis PCR Kit, GeneProof Ureaplasma PCR Kit, GeneProof Mycoplasma genitalium/hominis PCR Kit, realizan una detección individual de cada patógeno o de bacteria o virus por separado, a partir de muestras de orina o sangre. Sin embargo, ninguno de estos kits describe una detección simultánea de varios patógenos en una misma prueba, a partir de una única muestra no invasiva, como es la de orina.
El documento WO2015034764, describe un método y un kit de detección de virus Human papillomavirus (HPV); el documento US4937199 describe método de detección de Herpes; el documento US5516638 describe método de detección de Chlamydia trachomatis; todos estos documentos realizan la detección de patógeno a partir de muestras de orina de humanos. Estos documentos describen métodos de detección específica de cada uno de los patógenos de interés en la presente solicitud, con técnicas distintas y específicas para cada tipo de patógeno (bacterias y/o virus), que al integrarlas a todas en una macro técnica no se logra la identificación simultanea de los diferentes patógenos. Sin embargo, ninguno de estos documentos describe un único método y kit para diagnosticar de forma simultánea cada uno de dichos patógenos.
REVISTA CHILENA DE INFECTOLOGÍA, vol. 33, no. 5, (2016), páginas 505-512 enseña una PCR en tiempo real independiente para cada uno de estos patógenos.
La presente solicitud describe un Kit orientado a la detección de los pátógenos causantes de enfermedades de transmisión sexual silentes más frecuentes en la población humana en general, permitiendo subagrupar a los pacientes infectados los cuales en el caso de Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Chlamydia trachomatis, Herpes Virus y HPV podrán acceder a tiempo a un tratamiento adecuado. Chlamydia trachomatis y Herpes Virus, son co-ayudantes del HPV, por lo tanto, saber si son o no portadores de estos patógenos en conjunto, las pacientes podrán hacer un seguimiento con mayor frecuencia que les permita pesquisar la patología en etapas tempranas, previniendo lesiones preneoplásicas. Chlamydia trachomatis por su parte puede afectar la capacidad reproductiva tanto en hombres como en mujeres.
La utilidad clínica a corto plazo es el seguimiento de pacientes, decisión terapéutica, vacunación en el caso de HPV, y a largo plazo reducción de la infertilidad y tasas de cáncer cervicouterino u otro asociado a HPV.
PROBLEMA DE LA TÉCNICA
En la actualidad las pruebas de diagnósticos de Enfermedades de transmisión sexual silentes (ETS) solo contemplan la detección y/o identificación de un agente causal por análisis, los cuales por lo general requieren de una implementación compleja y costosa en equipamiento; tardando un período de tiempo que puede llegar hasta siete días durante el cual el paciente no puede recibir el tratamiento adecuado. De esta forma, la detección en forma rápida y económica de ETS, es un problema frecuente de laboratorios y servicios de salud en general. Es por ello por lo que se hace necesaria el desarrollo de metodologías, y kits sensibles que, a un bajo costo, permitan detectar con un único kit simultáneamente varias ETS silentes en una única muestra no invasiva tal como es la orina, y permitiendo el tratamiento específico según el patógeno detectado.
RESUMEN
La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
La presente invención describe un Kit de detección simultánea de patógenos causantes de Enfermedades de Transmisión Sexual Silentes (ETSs) a partir de una única muestra no invasiva de orina de humanos, en adelante llamado “Kit-U”. El grupo de patógenos detectados son: Herpes Virus tipo 1, Herpes Virus tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, además de Human papillomavirus (HPV) el que utiliza una sonda y cebadores ya conocidos. Para realizar esta detección simultánea, la presente invención describe un conjunto de 24 secuencias formadas por 16 cebadores y 8 sondas, las cuales identifican de manera única a los primeros 6 patógenos del grupo. Para el caso del HPV, se utilizan 3 secuencias conocidas. Es necesario realizar la detección de los primeros 6 patógenos del grupo, en conjunto con HPV debido a que la dinámica de estos patógenos es sinérgica. El presente Kit-U, utiliza 3 secuencias también conocidas (2 cebadores y 1 sonda) las cuales identifican a una porción del gen constitutivo de la p-globina como control de la correcta extracción del ADN, para poder detectar los patógenos de interés. Se describe uso de las secuencias y procedimiento de detección de dichos patógenos, el cual busca entregar una herramienta de diagnóstico fácil, rápida, y económica, de detección simultánea a partir de una única muestra no invasiva de orina de seres humanos. La fácil implementación y utilización de este Kit-U permitiría que cualquier laboratorio de diagnóstico pudiera realizarlo, considerando que el procedimiento desde que la muestra llega al laboratorio y se obtiene un resultado para informar, toma aproximadamente 8 horas. Al ofrecer una alternativa que permita con una única muestra detectar la presencia de 7 patógenos simultáneamente conlleva una disminución de costos al realizar un procesamiento y análisis de la muestra, lo que permitiría llegar a un número mayor de población que podría contar con una alternativa de examen más económico y rápido, considerando que actualmente cada panel de patógenos se analiza por separado aumentando el costo de estos exámenes. Los patógenos detectados son: Herpes Virus tipo 1, Herpes Virus tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium y adicionalmente Human papillomavirus (HPV) para el que se utilizan secuencias conocidas.
La rapidez del diagnóstico que obtiene el presente Kit-U permite dar un tratamiento acotado al patógeno que efectivamente afecta al paciente, evitando la sobremedicación que podría generar una resistencia futura a un posible contagio de ETS.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Gráfico comparativo Presencia/Ausencia de ADN en muestras de orina. En este gráfico se muestra que, del total de 46 muestras testeadas, el Kit-U detectó presencia de ADN en las 46 muestras, mientras que el kit de laboratorio comercial sólo detectó presencia de ADN en 8 muestras. En ambos casos utilizando la misma concentración de muestra inicial. Esto demuestra que la sensibilidad del Kit-U es superior a la del kit de laboratorio comercial.
Figura 2. Gráfico de la distribución de los resultados obtenidos al analizar las muestras con el Kit-U. Distribución de m.o. detectados por Kit-U. En este gráfico se muestra la distribución de las detecciones realizadas con el Kit-U, encontrando 34 detecciones para Ureaplasma urealiticum, 13 para Micoplasma Hominis, 3 Chlamidia trachomatis, 2 Micoplasma genitalium, 1 HPV, y 10 muestras negativas.
Figura 3. Gráfico de la distribución de los resultados obtenidos al analizar las muestras por el Laboratorio Comercial. Distribución de m.o. detectados por Laboratorio Comercial. En este gráfico se muestra la distribución de las detecciones realizadas con el Kit de Laboratorio Comercial, encontrando que, del total de 8 muestras detectadas con ADN, sólo 2 detecciones identifican a Micoplasma hominis, mientras que las restantes 6 muestras no fueron identificadas.
Figura 4. En esta figura se muestra el patrón espacial de ubicación de sondas de detección según cada patógeno. Las tiras de detección se ubican en paralelo a este patrón para identificar cuales patógenos se encuentran presentes en la muestra.
DESCRIPCION DE LA INVENCIÓN
La presente invención describe un kit de detección simultánea de patógenos causantes de Enfermedades de Transmisión Sexual Silentes (ETSs) a partir de una única muestra no invasivas de orina de seres humanos, aquí llamado “Kit-U”. El grupo de patógenos de interés detectados son:
• Herpes Virus tipo 1,
• Herpes Virus tipo 2,
• Chlamydia trachomatis,
• Ureaplasma urealitycum,
• Mycoplasma hominis,
• Mycoplasma genitalium, y
• Human papillomavirus (HPV).
La presente invención describe un conjunto de 24 secuencias, de las cuales las secuencias SEQ ID Nos: 1 a 18, fueron diseñadas específicamente para la detección de los 6 primeros patógenos del grupo de patógenos de interés, utilizando 2 cebadores y 1 sonda por cada patógeno. Para el caso de HPV, se utilizan 3 secuencias (2 cebadores, 1 sonda) ya conocidas. Adicionalmente el presente Kit-U requiere la detección del gen de la p-globina (control interno de la calidad de ADN y de la amplificación), para lo cual se utilizan otras 3 secuencias conocidas en el arte. Este kit-U permite realizar un procedimiento de detección basado en la amplificación mediante PCR Multiplex de secuencias de región del genoma de los diferentes patógenos. El producto de PCR es hibridado sobre una tira diagnóstica formada por una membrana de nylon que contiene sondas específicas para los diferentes patógenos.
Los cebadores utilizados en la etapa de PCR Multiplex, se encuentran previamente marcados en su extremo 5' con una molécula de digoxigenina, la cual se utiliza para detectar la presencia del patógeno. Las sondas poseen una modificación en su extremo 5' con un Amino Modifier C6, (AmMC6) que permite que se adhiera a la membrana de nylon en la tira diagnóstica.
Si el genoma de alguno de los patógenos de interés a ser detectados se acopla a su sonda complementaria, esta deja expuesta la molécula de Digoxigenina que se encuentra en uno de los cebadores y que ahora está en el ADN que se amplificó. Esta molécula de Digoxigenina es detectada a través de una reacción con anticuerpo anti-Digoxigenina, este anticuerpo está conjugado a fosfatasa alcalina permitiendo su visualización con el compuesto NBT/BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato/tetrazolio nitroazul), el cual forma un precipitado de color morado sobre la membrana en el lugar donde se encuentra la sonda que reaccionó con el ADN de el o los patógenos presentes en la muestra.
La hibridación entre el ADN de los patógenos presentes en la muestra de orina y la sonda específica se visualiza mediante un precipitado de color. La tira diagnóstica incluye una sonda para el gen de la p-globina ya conocida en el arte, como control interno de la amplificación. Las zonas de detección están ubicadas en la tira diagnóstica según un patrón espacial (Figura 4), establecido de modo que se compara la tira diagnóstica con dicho patrón para determinar la presencia o ausencia de cada patógeno específico.
Más concretamente la presente solicitud describe un kit de diagnóstico para detectar en forma simultánea al menos 7 enfermedades de transmisión sexual silentes (ETSs), que comprende
• una tira diagnóstica, que comprende zonas de detección con al menos 8 sondas de secuencias SEQ ID Nos: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,24;
• al menos 14 cebadores de secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23; • manual de instrucciones.
Se describen también las secuencias SEQ ID NO 1 a 18, y secuencias de al menos un 90 % de similitud con cada una de ellas.
La presente solicitud describe también un conjunto de 24 secuencias nucleotídicas descritas con detalle en tabla 1, de las cuales las primeras 18 secuencias nucleotídicas, SEQ ID Nos: 1 a 18, fueron diseñadas específicamente para esta invención. Las secuencias 19 a 21 son conocidas en el arte para la detección de HPV, y las secuencias 22 a 24 son conocidas en el arte para la detección de p-globina. Se describen las secuencias nucleotídicas de 2 cebadores y 1 sonda respectivamente para cada patógeno objetivo a ser detectado. Los cebadores sirven para realizar una amplificación de segmentos específicos en etapa de amplificación por PCR Multiplex, mientras que la sonda sirve para realizar la detección de dichos segmentos amplificados.
Tabla 1.
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La presente solicitud también describe un conjunto que consiste en 24 secuencias que poseen al menos un 90% de similitud con respecto las secuencias del conjunto descrito en la tabla 1.
Las secuencias 19 a 24, son conocidas en el arte. Se describen aquí ya que se requiere la detección de HPV, y de p-globina como control, en conjunto con la detección del resto de los patógenos del grupo: Herpes Virus tipo 1, Herpes Virus tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium. Los cebadores de secuencias SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, 20 y 22 son marcados en su extremo 5' con molécula de Digoxigenina. Esta molécula marcadora permite posteriormente detectar las secuencias hibridadas, identificando así al patógeno correspondiente.
Las sondas de secuencias SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 tienen una modificación en el extremo 5' (Amino Modifier C6, AmMC6) que es la que permite que se adhiera a la membrana de nylon en la tira diagnóstica.
La presente solicitud, describe el uso de las secuencias SEQ ID NO 1 a 24, para la preparación de un Kit de diagnóstico que las comprende, útiles para la detección de patógenos causantes de enfermedades de transmisión sexual.
Otra modalidad de la presente solicitud es el uso del kit, para detectar al menos los patógenos del grupo: Herpes Virus tipo 1, Herpes Virus tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, y Human papillomavirus (HPV).
Las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 3, se utilizan para la detección de Human Herpes virus 1.
Las secuencias SEQ ID NO: 4, 5, 6, se utilizan para la detección de Human Herpes virus 2.
Las secuencias SEQ ID NO: 7, 8, 9, se utilizan para la detección de Chlamydia trachomatis.
Las secuencias SEQ ID NO: 10, 11, 12, se utilizan para la detección de Ureaplasma urealyticum.
Las secuencias SEQ ID NO: 13, 14, 15, se utilizan para la detección de Mycoplasma hominis.
Las secuencias SEQ ID NO: 16, 17, 18, se utilizan para la detección de Mycoplasma genitalium.
Las secuencias SEQ ID NO: 19, 20, 21, conocidas en el arte, se utilizan para la detección de Human papillomavirus (HPV).
Las secuencias SEQ ID NO: 22, 23, 24, conocidas en el arte, se utilizan para detectar el gen p-globina, gen constitutivo que se utiliza como control de la correcta extracción de ADN desde la muestra.
La presente solicitud además describe un procedimiento para detectar en forma simultánea al menos 7 enfermedades de transmisión sexual silentes (ETSs), que comprende las etapas de:
i) extraer ADN, a partir de muestra de fluidos corporales, mediante lisis celular, y centrifugación para obtener un pellet que contiene las muestras de ADN para ser amplificadas; en donde los fluidos corporales se seleccionan de entre, orina, sangre, saliva, secreción uretral, líquido seminal, secreción vaginal;
ii) amplificar mediante PCR Multiplex, utilizando los cebadores descritos en secuencias SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23; se amplifican copias de los segmentos de ADN complementarios dichos cebadores;
iii) hibridar el ADN amplificado en etapa ii), utilizando las sondas descritas en secuencias SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, mediante una reacción de hibridación entre las copias obtenidas en la etapa de ii) de amplificación con dichas sondas;
iv) detectar la presencia o ausencia de los patógenos de interés, en una membrana de nylon que comprende las sondas de secuencias SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, dispuestas espacialmente según un patrón espacial determinado previamente.
EJEMPLO
Etapa 0:
Preparación de la muestra de orina para la extracción de ADN, eliminación del medio de transporte.
La muestra se trasladó a un tubo falcón de 15 mL, hasta obtener un pellet de la muestra total de orina.
Se centrifugó a 4.000 rpm, por 15 min a temperatura ambiente (TA) de 20 a 22°C.
Se eliminó el sobrenadante, cuidando de no arrastrar el pellet.
1. Se agregó de 300 |jL de Buffer Fosfato Salino (PBS por sus siglas en inglés) o Buffer Fosfato Salino de Dubelcco (DPBS). Dependiendo del tamaño del pellet se puede agregar entre 300 a 600 j L de PBS.
2. Luego se dividió la muestra en dos tubos tipo eppendorf de 1,5 mL.
3. Se centrifugó a 12.000 rpm, por 5 min a TA.
4. Se eliminó el sobrenadante cuidadosamente.
5. Se agregó 500 j L de Solución de Lisis.
6. Se dejó 12 horas a TA, y se continuó con la extracción del ADN.
Etapa i.
Extracción DNA
Luego de eliminar el medio de transporte y de agregar los 500 mL Buffer de lisis para que comience la lisis celular, se realizó un procedimiento de extracción según los pasos descrito a continuación:
Nota: Las muestras deben tener un volumen mínimo de 500 mL al comenzar el proceso de extracción.
1. Se adicionó 250 mL de etanol 100%. Mezclando vigorosamente en vortex.
2. Se insertó la columna de extracción en los tubos colectores de 2 mL.
3. Se transfirió el total de la muestra del paso 1 en la columna de extracción incluyendo cualquier precipitado que se pudiera haber formado.
4. Se centrifugó a máxima velocidad (> 10.000 xg) por 1 minuto.
5. Se eliminó el filtrado y reusó el tubo colector.
6. Se agregó 500 mL de HBC Buffer (Solución de lavado 1).
7. El HBC Buffer se diluyó con isopropanol antes de usarlo
8. Se centrifugó a máxima velocidad por 30 segundos.
9. Se eliminó el filtrado y el tubo colector.
10. Se insertó la columna de extracción en un nuevo tubo colector de 2 mL.
11. Se agregó 700 mL de DNA Wash Buffer (solución Lavado 2).
El DNA Wash Buffer se diluyó con etanol 100% antes de su uso.
12. Se centrifugó a máxima velocidad por 30 segundos.
13. Se eliminó el filtrado y reusó el tubo colector.
14. Se repitieron los pasos 10-12 para un segundo paso de lavado con DNA Wash Buffer (solución Lavado 2).
15. Se centrifugó la columna de extracción vacía a máxima velocidad por 2 minutos para secar la columna. 16. Se agregó 100 mL de Elution Buffer (Solución de Elución) precalentado a 70°C.
17. Se dejó reposar a temperatura ambiente por 2 minutos.
18. Se centrifugó a 15.000 g por 1 minuto.
Etapa ii.
Amplificación del ADN extraído.
Esta etapa se realizó para aumentar el número de copias del genoma de los patógenos del grupo de interés para ser detectados. Esto se logra con la utilización de los cebadores de secuencias SEQ ID NO, 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10,11, ,13, 14, 16, 17, 19, 20, 23 y 24 descritos en Tabla 1. Los cuales están marcados en su extremo 5' con una molécula de Digoxigenina que reacciona en la etapa siguiente (hibridación). Estos cebadores se encuentran contenidos en el Mix de PCR.
1. Se distribuyó 20 |jL del Mix PCR en cada tubo de PCR.
2. Se agregó:
• 5 j L de muestra a cada tubo
• 5 j L Control positivo
• 5 j L Control Blanco
3. Se Taparon los tubos. Vortex por 3 seg. Se observó que no quedaran burbujas.
4. Se ubicaron los tubos en un termociclador con el siguiente programa:
• Denaturación: 94°C/3 min.
• 34 ciclos: 94°C/30seg, 56°C/30seg, 72°C/30seg.
• Extensión: 72°C/3 min.
Etapa iii.
Hibridación del ADN amplificado.
Es esta etapa se hicieron reaccionar las copias del genoma amplificado en la Etapa ii, con las sondas de secuencias SEQ ID NO 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 descritas en la Tabla 1.
Procedimiento:
HIBRIDACION
(Tiempo del proceso: 3 hr 30 min)
IMPORTANTE: Antes de comenzar el procedimiento:
а. Se calentó y mantuvo a 42°C las Soluciones de Hibridación, Lavado 3, Lavado 4 y Lavado 5, hasta ser usadas. A. Denaturación de los productos PCR:
1. En un tubo de 0,5 mL se puso 85 |jL de Solución Hibridación y se agregaron los 15 |jL del producto PCR. Se tapó bien el tubo.
2. Se denaturó a 96°C por 10 min. Se sacaron los tubos del Termociclador o bloque térmico y se enfrió inmediatamente sobre hielo por 5 min.
Se puso extremo cuidado que los tubos no se destaran para evitar contaminación de amplicones; sobre todo si se trabaja con tubos de 0,2 mL.
3. Se centrifugaron los tubos a 10.000 x g por 10 seg antes de abrirlos para evitar contaminación.
B. Hidratación de las Tiras Diagnósticas
Mientras se enfriaron los tubos en hielo (paso 2 anterior), se agregaron 200 jiL de Solución Hibridación en una bandeja de 8 canales, se agregaron las tiras diagnósticas y se hidrataron a temperatura ambiente por 5 min.
Se tomaron las tiras diagnósticas con una pinza desde el tubo que las contiene.
C. Hibridación de los productos PCR sobre las tiras diagnósticas
1. Se agregaron los productos PCR denaturados (100 jiL) sobre cada tira diagnóstica, y se incubaron a 42°C por 60 min con agitación leve, evitando formar burbujas.
2. Se retiró la Solución de Hibridación con una pipeta Pasteur plástica estéril
3. Se agregó 1 mL de la Solución Lavado 3. Se Incubó a 42°C por 10 min con agitación. Se repitió el paso 3.
4. Se retiró la Solución Lavado 3 con una pipeta Pasteur plástica estéril y se agregó 1 mL de Solución Lavado 4. Se incubó a 42°C por 2 min con agitación
5. Se preparó la Solución del Conjugado: agregando a la Solución del Conjugado los 1,3 j L del Conjugado. Se mezcló por inversión (NO Vortex).
б. Se retiró la Solución Lavado 4 con una pipeta Pasteur plástica estéril y se agregó 0,5 mL de Solución del Conjugado recién preparado. Se Incubó a 42°C por 30 min con agitación. Se retiró la Solución del Conjugado.
7. Se agregó 1 mL de Solución de Lavado 5. Se incubó a 42°C por 5 min con agitación. Se repitió este paso.
8. Se retiró la Solución Lavado 5.
D. Revelado de la Tira diagnóstica
1. Se agregaron 0,5 mL de Solución del Sustrato. Se incubó a 42°C por 30 min en oscuridad sin agitación. 2. Se detuvo la reacción agregando aproximadamente 1 mL de agua destilada con una pipeta. Se repitió este paso al menos dos veces.
3. Se eliminó el agua por inversión cuidando de no arrastrar las tiras diagnósticas. Se agregó 2 mL de agua destilada, se dejó reposar por al menos 30 min.
4. Se sacaron las tiras diagnósticas con pinzas y fueron puestas sobre una hoja de papel para secarlas. Una vez secas se cubrieron con una cinta scotch para guardarlas. Opcional: se pueden digitalizar.
5. Los resultados se obtienen inmediatamente. La tira diagnóstica fue ubicada en paralelo con respecto a patrón (figura 4) incluida en el kit.
Etapa iv
RESULTADOS E INTERPRETACIÓN DE LA TIRA DIAGNOSTICA
La tira diagnóstica contiene las sondas específicas para detectar los patógenos: Herpes Virus tipo 1, Herpes Virus tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium y Human papillomavirus (HPV). Dichas sondas se encuentran inmovilizadas en la tira diagnóstica, permitiendo una lectura sencilla a partir de visualización de la marcación por zona espacial específica en la tira.
CONTROLES
• POSITIVO: debe haber presencia de bandas para todos los patógenos contenidos en el kit, incluyendo la banda para p-globina.
• BLANCO: ausencia de bandas.
Este ejemplo fue realizado 2 veces, una primera vez utilizando los cebadores y sondas descritos en tabla 1 del presente Kit-U, y una segunda vez utilizando los cebadores y sondas contenidos en kit de laboratorio comercial. De esta forma se pudo obtener resultados comparables (Figuras 1, 2, 3), respecto a la sensibilidad de detección que se obtiene con las secuencias descritas en la presente solicitud en comparación a la sensibilidad que se obtiene utilizando las secuencias en kit de laboratorio comercial.
Para la lectura de los resultados, cada tira diagnóstica debe ser enfrentada al patrón del orden de las sondas mostrado en figura 4, procurando coincidir la línea de referencia para asegurar la correcta interpretación de los resultados.
Para la validación del presente Kit-U se realizó un análisis comparativo contra Kit de laboratorio comercial, para lo cual se tomaron muestras de 47 pacientes los cuales donaron dos muestras de orina cada uno. Ambas muestras se tomaron al mismo tiempo.
En figura 1, se muestra una comparación de la sensibilidad del KIT-U vs el kit de laboratorio comercial. Se observa que al utilizar el Kit-U, en el 100% de las muestras de orina fue posible obtener ADN suficiente para obtener algún resultado, a diferencia del análisis realizado utilizando el kit de laboratorio comercial, el cual no detectó presencia de ADN en el 82,6% (n=38) de las muestras.
En figura 2, se muestran los patógenos detectados utilizando el Kit-U. Se observa que el Kit-U fue capaz de detectar la presencia de al menos un patógeno en el 78,2% (n=36) de las muestras analizadas, con solo un 21,8% (n=10) de casos negativos.
En cambio al utilizar el kit de laboratorio comercial, resultados en Figura 3A, del total de las muestras en las que se detectó ADN (n=8), el 75% (n=6) fueron negativas para los patógenos evaluados y solo el 25% (n=2) fue positiva para Micoplasma hominis.
Esto muestra que los cebadores y sondas descritos en las secuencias SEQ ID NO 1 a 18, comprendidas en el Kit-U, otorgan una sensibilidad mejorada respecto a los primers y sondas del Kit de laboratorio comercial.
Es Importante mencionar que para utilizar estas secuencias de cebadores y sondas diseñados para este Kit-U, secuencias SEQ ID Nos: 1 a 18, en conjunto con las secuencias adicionales 19 a 24 conocidas del arte, mediante el procedimiento de detección, se puede utilizar cualquier muestra de origen biológico que permita la obtención de ADN amplificable, preferiblemente en fluidos, tales como sangre, saliva, secreción uretral, líquido seminal, secreción vaginal.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un kit de diagnóstico para detectar en forma simultánea al menos 7 enfermedades de transmisión sexual silentes (ETSs), CARACTERIZADO porque comprende
• una tira diagnóstica, que comprende zonas de detección con al menos 8 sondas de secuencias SEQ ID Nos: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24;
• al menos 14 cebadores de secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22 y 23;
• un manual de instrucciones.
2. Un conjunto de secuencias nucleotídicas para la detección en forma simultánea de al menos 7 enfermedades de transmisión sexual silentes (ETSs), CARACTERIZADO porque consiste en las siguientes secuencias:
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
; en donde las secuencias SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 17, están marcados en su extremo 5' con una molécula de Digoxigenina (5DigN/); y
en donde las secuencias SEQ ID NO: 3, 6, 9, 12, 15, 18 tienen una modificación en el extremo 5' (Amino Modifier C6, 5AmMC6/) que es la que permite que se adhieran a la tira diagnóstica.
3. Un conjunto de secuencias, CARACTERIZADO porque las secuencias del conjunto de secuencias poseen al menos un 90% de similitud con respecto las secuencias del conjunto de secuencias de la reivindicación 2.
4. Uso del kit de la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque sirve para detectar al menos los siguientes patógenos: Herpes Virus tipo 1, Herpes Virus tipo 2, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealitycum, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, y Human papillomavirus (HPV).
5. Un procedimiento para detectar en forma simultánea al menos 7 enfermedades de transmisión sexual silentes (ETSs), CARACTERIZADO porque comprende las etapas de:
i) extraer ADN, a partir de muestra de fluidos corporales, mediante lisis celular, y centrifugación para obtener un pellet que contiene las muestras de ADN para ser amplificadas;
ii) amplificar las muestras de ADN de la etapa i) mediante PCR Multiplex, utilizando los cebadores descritos en secuencias SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, 23;
iii) hibridar el ADN amplificado en etapa ii), utilizando las sondas descritas en secuencias SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24;
iv) detectar la presencia o ausencia de los patógenos de interés en una tira de nylon que comprende las sondas de secuencias SEQ ID NOs: 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21,24.
6. El procedimiento de la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque en la etapa i), las muestras de fluidos corporales se seleccionan de entre orina, sangre, saliva, secreción uretral, líquido seminal, secreción vaginal.
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