JP2003265180A - ハイブリダイゼーション促進剤及び促進方法 - Google Patents
ハイブリダイゼーション促進剤及び促進方法Info
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- JP2003265180A JP2003265180A JP2002071331A JP2002071331A JP2003265180A JP 2003265180 A JP2003265180 A JP 2003265180A JP 2002071331 A JP2002071331 A JP 2002071331A JP 2002071331 A JP2002071331 A JP 2002071331A JP 2003265180 A JP2003265180 A JP 2003265180A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼーショ
ンを強固なものに促進し、塩を洗浄した後でも、読み取
り感度と精度を向上させる。 【解決手段】 ＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼー
ション溶液にＤＮＡ結合タンパク質を使用することで、
ハイブリダイゼーションシグナル強度の上昇、さらに、
洗浄過程において純水を使用することでバックグランド
の低減を行い、結果としてＳ／Ｎ比を上昇させることが
可能とする。
ンを強固なものに促進し、塩を洗浄した後でも、読み取
り感度と精度を向上させる。 【解決手段】 ＤＮＡチップにおけるハイブリダイゼー
ション溶液にＤＮＡ結合タンパク質を使用することで、
ハイブリダイゼーションシグナル強度の上昇、さらに、
洗浄過程において純水を使用することでバックグランド
の低減を行い、結果としてＳ／Ｎ比を上昇させることが
可能とする。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、バイオチップやビ
ーズなどを用いて行われるハイブリダイゼーションを促
進し、相補的結合を強固にするハイブリダイゼーション
促進剤、ハイブリダイゼーション促進方法、及びハイブ
リダイゼーション検出方法に関する。
ーズなどを用いて行われるハイブリダイゼーションを促
進し、相補的結合を強固にするハイブリダイゼーション
促進剤、ハイブリダイゼーション促進方法、及びハイブ
リダイゼーション検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＤＮＡやＲＮＡといった生体高分子は、
その相補鎖と特異的にハイブリダイゼーションを行う。
相補鎖に蛍光色素や放射性同位元素（ＲＩ）で標識する
ことで、特異的にハイブリダイゼーションを行っている
ところを検出した。ＤＮＡ、ＲＮＡやタンパク質（ポリ
アミノ酸、ポリペプチド）といった生体高分子はチャー
ジを持っており、ＤＮＡ、ＲＮＡの場合はリン酸基のマ
イナスチャージ、タンパク質は、アミノ酸の種類によ
り、プラスチャージやマイナスチャージを持っている。
ＤＮＡの二重鎖は、通常マイナスイオンのため反発がお
こり純水中ではハイブリダイズはおこなえないが、プラ
スイオンが存在する系においてはたとえばＮａ+イオン
がＤＮＡのリン酸基にキレートすることでイオン存在下
では水素結合によりハイブリダイズを行うことが可能と
なる。また、プラスチャージを持っているタンパク質な
どは、そのチャージの部分でマイナスチャージをもって
いるＤＮＡに結合する。このように、ハイブリダイゼー
ションの進行はイオン強度に左右されることが多い。
その相補鎖と特異的にハイブリダイゼーションを行う。
相補鎖に蛍光色素や放射性同位元素（ＲＩ）で標識する
ことで、特異的にハイブリダイゼーションを行っている
ところを検出した。ＤＮＡ、ＲＮＡやタンパク質（ポリ
アミノ酸、ポリペプチド）といった生体高分子はチャー
ジを持っており、ＤＮＡ、ＲＮＡの場合はリン酸基のマ
イナスチャージ、タンパク質は、アミノ酸の種類によ
り、プラスチャージやマイナスチャージを持っている。
ＤＮＡの二重鎖は、通常マイナスイオンのため反発がお
こり純水中ではハイブリダイズはおこなえないが、プラ
スイオンが存在する系においてはたとえばＮａ+イオン
がＤＮＡのリン酸基にキレートすることでイオン存在下
では水素結合によりハイブリダイズを行うことが可能と
なる。また、プラスチャージを持っているタンパク質な
どは、そのチャージの部分でマイナスチャージをもって
いるＤＮＡに結合する。このように、ハイブリダイゼー
ションの進行はイオン強度に左右されることが多い。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来のハイブリダイゼ
ーションは、ＤＮＡやＲＮＡがリン酸基のマイナスチャ
ージのため、高イオン濃度の溶媒中でしかハイブリダイ
ゼーションが行えなかった。このため、ハイブリダイゼ
ーション後の測定時に塩が析出し、測定誤差となってい
た。また、純水で洗浄すると、ハイブリダイゼーション
したＤＮＡなどが剥がれ落ちるという問題があった。そ
こで、バイオチップやビーズなどでの相補的結合を強固
にするように、ハイブリダイゼーションを促進し、測定
の感度と精度を向上させる方法の開発が求められてい
た。
ーションは、ＤＮＡやＲＮＡがリン酸基のマイナスチャ
ージのため、高イオン濃度の溶媒中でしかハイブリダイ
ゼーションが行えなかった。このため、ハイブリダイゼ
ーション後の測定時に塩が析出し、測定誤差となってい
た。また、純水で洗浄すると、ハイブリダイゼーション
したＤＮＡなどが剥がれ落ちるという問題があった。そ
こで、バイオチップやビーズなどでの相補的結合を強固
にするように、ハイブリダイゼーションを促進し、測定
の感度と精度を向上させる方法の開発が求められてい
た。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
した結果、特定の物質をハイブリダイゼーション促進剤
として用いることにより、上記課題が解決されることを
見出し、本発明に到達した。即ち、本発明のハイブリダ
イゼーション促進剤は、ＤＮＡ結合タンパク質よりなる
ハイブリダイゼーション促進剤である。また、本発明の
ハイブリダイゼーション促進方法は、ハイブリダイゼー
ション溶液にＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加するもの
である。
した結果、特定の物質をハイブリダイゼーション促進剤
として用いることにより、上記課題が解決されることを
見出し、本発明に到達した。即ち、本発明のハイブリダ
イゼーション促進剤は、ＤＮＡ結合タンパク質よりなる
ハイブリダイゼーション促進剤である。また、本発明の
ハイブリダイゼーション促進方法は、ハイブリダイゼー
ション溶液にＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加するもの
である。
【０００５】ＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡ結合ドメイ
ンの部分にプラスチャージをもち、マイナスチャージを
もつＤＮＡやＲＮＡに特異的、非特異的に結合すること
を特徴とする。そして、これらＤＮＡ結合タンパク質が
結合した二重鎖のＤＮＡはイオン強度が低くなるほど、
結合は強固になる。
ンの部分にプラスチャージをもち、マイナスチャージを
もつＤＮＡやＲＮＡに特異的、非特異的に結合すること
を特徴とする。そして、これらＤＮＡ結合タンパク質が
結合した二重鎖のＤＮＡはイオン強度が低くなるほど、
結合は強固になる。
【０００６】本発明のハイブリダイゼーション促進剤及
び促進方法は、バイオチップ又はビーズで行われるハイ
ブリダイゼーションなど各種タイプのハイブリダイゼー
ションに適用され、特に、バイオチップ又はビーズで行
われるハイブリダイゼーションに好適に適用される。
び促進方法は、バイオチップ又はビーズで行われるハイ
ブリダイゼーションなど各種タイプのハイブリダイゼー
ションに適用され、特に、バイオチップ又はビーズで行
われるハイブリダイゼーションに好適に適用される。
【０００７】本発明のハイブリダイゼーション促進剤の
添加時期は広く選択できる。例えば、ハイブリダイゼー
ション前又はハイブリダイゼーション中のバイオチップ
又はビーズに前記ＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加して
も良く、及び／又はハイブリダイゼーション後のバイオ
チップ又はビーズに前記ＤＮＡ結合タンパク質溶液を添
加しても良い。
添加時期は広く選択できる。例えば、ハイブリダイゼー
ション前又はハイブリダイゼーション中のバイオチップ
又はビーズに前記ＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加して
も良く、及び／又はハイブリダイゼーション後のバイオ
チップ又はビーズに前記ＤＮＡ結合タンパク質溶液を添
加しても良い。
【０００８】本発明のハイブリダイゼーション促進剤及
び促進方法が対象とするハイブリダイゼーションは、２
種以上のイオン性高分子が相補的に結合するものであ
り、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡの相補的結合を強固にする
ためのハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡの相補
的結合を強固にするためのハイブリダイゼーション、Ｒ
ＮＡ−ＲＮＡの相補的結合を強固にするためのハイブリ
ダイゼーション、イオン性高分子間の結合を強固にする
ためのハイブリダイゼーションが挙げられる。
び促進方法が対象とするハイブリダイゼーションは、２
種以上のイオン性高分子が相補的に結合するものであ
り、例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡの相補的結合を強固にする
ためのハイブリダイゼーション、ＤＮＡ−ＲＮＡの相補
的結合を強固にするためのハイブリダイゼーション、Ｒ
ＮＡ−ＲＮＡの相補的結合を強固にするためのハイブリ
ダイゼーション、イオン性高分子間の結合を強固にする
ためのハイブリダイゼーションが挙げられる。
【０００９】更に、本発明のハイブリダイゼーション検
出方法では、従来のように、担体に固定された第１のイ
オン性高分子（第１のＤＮＡなど）に相補的に結合する
第２のイオン性高分子（第２のＤＮＡなど）を蛍光色素
又は放射性元素（ＲＩ）で標識しておき、ハイブリダイ
ゼーション及び洗浄後に、残留する蛍光強度などを測定
しても良い。また、蛍光性を有するＤＮＡ結合タンパク
質を用いたり、ＤＮＡ結合タンパク質を染色して、その
強度を測定しても良い。即ち、ＤＮＡ結合タンパク質を
ハイブリダイゼーション促進剤として用いると共に、ハ
イブリダイゼーションの結果を測定する標識剤としても
利用するものである。ＤＮＡ結合タンパク質を染色する
場合は、染色をハイブリダイゼーションの前に行っても
後に行っても良い。後染めの場合は、ハイブリダイゼー
ション溶液にＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加すること
によりハイブリダイゼーションを促進し、前記ハイブリ
ダイゼーション後に、前記ＤＮＡ結合タンパク質を特異
的に染色することで、前記ハイブリダイゼーション結果
を検出する。これに対して、前染めの場合は、ＤＮＡ結
合タンパク質を蛍光色素又は放射性同位元素（ＲＩ）で
標識し、ハイブリダイゼーション溶液に前記標識された
ＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加することによりハイブ
リダイゼーションを促進し、ハイブリダイゼーション及
び洗浄後に、残留する後に、前記標識されたＤＮＡ結合
タンパク質の蛍光色素又は放射性元素（ＲＩ）を測定す
ることにより、前記ハイブリダイゼーション結果を特異
的に検出する。
出方法では、従来のように、担体に固定された第１のイ
オン性高分子（第１のＤＮＡなど）に相補的に結合する
第２のイオン性高分子（第２のＤＮＡなど）を蛍光色素
又は放射性元素（ＲＩ）で標識しておき、ハイブリダイ
ゼーション及び洗浄後に、残留する蛍光強度などを測定
しても良い。また、蛍光性を有するＤＮＡ結合タンパク
質を用いたり、ＤＮＡ結合タンパク質を染色して、その
強度を測定しても良い。即ち、ＤＮＡ結合タンパク質を
ハイブリダイゼーション促進剤として用いると共に、ハ
イブリダイゼーションの結果を測定する標識剤としても
利用するものである。ＤＮＡ結合タンパク質を染色する
場合は、染色をハイブリダイゼーションの前に行っても
後に行っても良い。後染めの場合は、ハイブリダイゼー
ション溶液にＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加すること
によりハイブリダイゼーションを促進し、前記ハイブリ
ダイゼーション後に、前記ＤＮＡ結合タンパク質を特異
的に染色することで、前記ハイブリダイゼーション結果
を検出する。これに対して、前染めの場合は、ＤＮＡ結
合タンパク質を蛍光色素又は放射性同位元素（ＲＩ）で
標識し、ハイブリダイゼーション溶液に前記標識された
ＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加することによりハイブ
リダイゼーションを促進し、ハイブリダイゼーション及
び洗浄後に、残留する後に、前記標識されたＤＮＡ結合
タンパク質の蛍光色素又は放射性元素（ＲＩ）を測定す
ることにより、前記ハイブリダイゼーション結果を特異
的に検出する。
【００１０】本発明で用いられるＤＮＡ結合タンパク質
とは、ＤＮＡに親和性をもち，塩基配列に対して特異的
あるいは非特異的に結合するタンパク質を意味する。こ
のようなＤＮＡ結合タンパク質には、主に１）ＤＮＡ構
造に変化を与えて遺伝子発現を調節する２本鎖ＤＮＡ結
合タンパク質、２）ＤＮＡの複製、組換え、修復の過程
に必須な１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、３）染色体の高
次構造の保持に関与するタンパク質、４）ＤＮＡ依存性
ＡＴＰ分解、５）ＤＮＡ超らせん構造を形成するトポイ
ソメラーゼ、などがある。１）の多くは転写因子であ
り、ラムダファージＣｒｏタンパク質とｃＡＭＰ受容体
タンパク質の構造から見出されたヘリックス‐ターン‐
ヘリックス、システィンとヒスチジンにより亜鉛イオン
をキレートさせたジンクフィンガー、αヘリックスの片
側にロイシンが並んだタンパク質が２分子集まりジッパ
ーのように組み合わさって形成されるロイシンジッパー
などのいくつかの構造モチーフが知られている。２）は
バクテリオファージから高等生物までみられるタンパク
質であり、ＳＳＢ（ｓｉｎｇｌｅ―ｓｔｒａｎｄｅｄＤ
ＮＡ―ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる。
３）については，真核生物の染色体中のヒストンタンパ
ク質が代表例であり、ヌクレオソーム構造を形成する。
細菌においても、同様のＨＵタンパク質が結合しヌクレ
オソーム様の構造形成が知られている。４）には、ＤＮ
Ａ複製（ＤｎａＢタンパク質など）、組換え（Ｒｅｃ
Ａ、ＲｅｃＢＣタンパク質）や２本鎖ＤＮＡの巻き戻し
を促進するヘリカーゼがある。更に、本発明では、上記
のような本来ＤＮＡ結合性を有するタンパク質だけでな
く、物理的または化学的処理によってＤＮＡ結合性を有
することとなったタンパク質も用いることができる。こ
のように、本発明では、これらのＤＮＡ結合タンパク質
を広く用いることができる。また、１種類のＤＮＡ結合
タンパク質を用いる場合だけでなく、２種類以上のＤＮ
Ａ結合タンパク質を併用する場合も本発明に含まれる。
とは、ＤＮＡに親和性をもち，塩基配列に対して特異的
あるいは非特異的に結合するタンパク質を意味する。こ
のようなＤＮＡ結合タンパク質には、主に１）ＤＮＡ構
造に変化を与えて遺伝子発現を調節する２本鎖ＤＮＡ結
合タンパク質、２）ＤＮＡの複製、組換え、修復の過程
に必須な１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、３）染色体の高
次構造の保持に関与するタンパク質、４）ＤＮＡ依存性
ＡＴＰ分解、５）ＤＮＡ超らせん構造を形成するトポイ
ソメラーゼ、などがある。１）の多くは転写因子であ
り、ラムダファージＣｒｏタンパク質とｃＡＭＰ受容体
タンパク質の構造から見出されたヘリックス‐ターン‐
ヘリックス、システィンとヒスチジンにより亜鉛イオン
をキレートさせたジンクフィンガー、αヘリックスの片
側にロイシンが並んだタンパク質が２分子集まりジッパ
ーのように組み合わさって形成されるロイシンジッパー
などのいくつかの構造モチーフが知られている。２）は
バクテリオファージから高等生物までみられるタンパク
質であり、ＳＳＢ（ｓｉｎｇｌｅ―ｓｔｒａｎｄｅｄＤ
ＮＡ―ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）と呼ばれる。
３）については，真核生物の染色体中のヒストンタンパ
ク質が代表例であり、ヌクレオソーム構造を形成する。
細菌においても、同様のＨＵタンパク質が結合しヌクレ
オソーム様の構造形成が知られている。４）には、ＤＮ
Ａ複製（ＤｎａＢタンパク質など）、組換え（Ｒｅｃ
Ａ、ＲｅｃＢＣタンパク質）や２本鎖ＤＮＡの巻き戻し
を促進するヘリカーゼがある。更に、本発明では、上記
のような本来ＤＮＡ結合性を有するタンパク質だけでな
く、物理的または化学的処理によってＤＮＡ結合性を有
することとなったタンパク質も用いることができる。こ
のように、本発明では、これらのＤＮＡ結合タンパク質
を広く用いることができる。また、１種類のＤＮＡ結合
タンパク質を用いる場合だけでなく、２種類以上のＤＮ
Ａ結合タンパク質を併用する場合も本発明に含まれる。
【００１１】
【発明の実施の形態】図１は、本発明のハイブリダイゼ
ーション促進剤及びハイブリダイゼーション促進方法の
原理を示す模式図である。図１（ａ）は、タンパク質同
定用ＤＮＡチップの模式図を示す。担体１に特定の塩基
配列を有する第１のＤＮＡ２が固定されている。これを
イオン性溶媒中で第１の塩基配列と相補的な塩基配列を
有する第２のＤＮＡ３を加えると、両者は相補的に結合
して２重鎖を形成する（ｂ）。このようなＤＮＡチップ
にＤＮＡ結合タンパク質４を加えると、このタンパク質
４はＤＮＡ２とＤＮＡ３が相補的に結合した２重鎖の結
合を強固にし、自らも該２重鎖に結合する（ｃ）。この
ような現象を蛍光強度を計測することにより、サンプル
のＤＮＡの同定を行う。蛍光標識は、第２のＤＮＡ３に
標識されていても良いし、タンパク質４に予め、又は後
から標識されても良い。洗浄後に残留する蛍光を読み取
り、その結果よりハイブリダイゼーションしたＤＮＡを
同定する。上記の例では、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合を強固に
するためのハイブリダイゼーションを促進する場合であ
ったが、本発明はこれに限定されるものではなく、広く
イオン性高分子のハイブリダイゼーションに適用され
る。
ーション促進剤及びハイブリダイゼーション促進方法の
原理を示す模式図である。図１（ａ）は、タンパク質同
定用ＤＮＡチップの模式図を示す。担体１に特定の塩基
配列を有する第１のＤＮＡ２が固定されている。これを
イオン性溶媒中で第１の塩基配列と相補的な塩基配列を
有する第２のＤＮＡ３を加えると、両者は相補的に結合
して２重鎖を形成する（ｂ）。このようなＤＮＡチップ
にＤＮＡ結合タンパク質４を加えると、このタンパク質
４はＤＮＡ２とＤＮＡ３が相補的に結合した２重鎖の結
合を強固にし、自らも該２重鎖に結合する（ｃ）。この
ような現象を蛍光強度を計測することにより、サンプル
のＤＮＡの同定を行う。蛍光標識は、第２のＤＮＡ３に
標識されていても良いし、タンパク質４に予め、又は後
から標識されても良い。洗浄後に残留する蛍光を読み取
り、その結果よりハイブリダイゼーションしたＤＮＡを
同定する。上記の例では、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合を強固に
するためのハイブリダイゼーションを促進する場合であ
ったが、本発明はこれに限定されるものではなく、広く
イオン性高分子のハイブリダイゼーションに適用され
る。
【００１２】
【実施例】以下、本発明の実施例を述べる。以下の実施
例では、既に同定が行われているＴＲＦ、ｃ−Ｍｙｂ、
及びＰｕｒの各タンパク質をサンプルとして用いた。こ
こで、ＴＲＦは、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｎａｇａ
ｄｏｉ，Ａ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．，Ａｉｍｏｔ
ｏ，Ｓ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮ
Ａ−ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ
ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈＴＲＦ１.”
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６，１０５７−１０６５（１９９
８）、ｃ−Ｍｙｂは、Ｏｇａｔａ，Ｋ.，Ｈｏｊｏ，
Ｈ．，Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｎａｋａｉ，Ｔ．，Ｎａｋ
ａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓａｒａｉ，Ａ．，Ｉｓｈｉｉ，
Ｓ．＆Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ａｈｅｌｉｘ−ｔｕ
ｒｎ−ｈｅｌｉｘ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｔｉｆ ｗｉ
ｔｈ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓ
ｆｏｒｍｉｎｇ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｏｒ
ｅ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８９，６４２８−６４３２（１９９２）、及びＰｕ
ｒは、Ｎａｇａｄｏｉ，Ａ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，
Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｅｎａｒｉ，Ｍ．，Ｋ
ｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｓ
ａｍｐｅｉ，Ｇ．，Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓｃｈ
ｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｒ．Ｇ．
＆ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ａ
ｎｄ ＤＮＡ−Ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｕｒｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒＤＮＡ−ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．” Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３，
１２１７−１２２４（１９９５）等に紹介されてい
る。
例では、既に同定が行われているＴＲＦ、ｃ−Ｍｙｂ、
及びＰｕｒの各タンパク質をサンプルとして用いた。こ
こで、ＴＲＦは、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｎａｇａ
ｄｏｉ，Ａ．，Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｓ．，Ａｉｍｏｔ
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ｕｔｉｏｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮ
Ａ−ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ
ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈＴＲＦ１.”
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，６，１０５７−１０６５（１９９
８）、ｃ−Ｍｙｂは、Ｏｇａｔａ，Ｋ.，Ｈｏｊｏ，
Ｈ．，Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．，Ｎａｋａｉ，Ｔ．，Ｎａｋ
ａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｓａｒａｉ，Ａ．，Ｉｓｈｉｉ，
Ｓ．＆Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ａｈｅｌｉｘ−ｔｕ
ｒｎ−ｈｅｌｉｘ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍｏｔｉｆ ｗｉ
ｔｈ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓ
ｆｏｒｍｉｎｇ ａ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｏｒ
ｅ．”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｓｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８９，６４２８−６４３２（１９９２）、及びＰｕ
ｒは、Ｎａｇａｄｏｉ，Ａ．，Ｍｏｒｉｋａｗａ，
Ｓ．，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｈ．，Ｅｎａｒｉ，Ｍ．，Ｋ
ｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｓ
ａｍｐｅｉ，Ｇ．，Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｓｃｈ
ｕｍａｃｈｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｒ．Ｇ．
＆ Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｒｅｅ ａ
ｎｄ ＤＮＡ−Ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐｕｒｉｎｅ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒＤＮＡ−ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ．” Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３，
１２１７−１２２４（１９９５）等に紹介されてい
る。
【００１３】まず、以下のようなプライマーを合成し、
スポッターにて図２のようにスポットし、ＤＮＡマイク
ロアレイを作成した。 Ｐｒｉｍｅｒ１： ５‘−ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ
−３’（５‘末端ビオチン化） Ｐｒｉｍｅｒ２： ３‘−ＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣ
−５’（５‘末端Ｃｙ５化） Ｐｒｉｍｅｒ３： ５‘−ＣＧＴＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣ
ＡＴＣＴＣ−３’（５‘末端ビオチン化）
スポッターにて図２のようにスポットし、ＤＮＡマイク
ロアレイを作成した。 Ｐｒｉｍｅｒ１： ５‘−ＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ
−３’（５‘末端ビオチン化） Ｐｒｉｍｅｒ２： ３‘−ＣＡＡＴＣＣＣＡＡＴＣＣＣ
−５’（５‘末端Ｃｙ５化） Ｐｒｉｍｅｒ３： ５‘−ＣＧＴＡＧＡＡＣＴＣＣＴＣ
ＡＴＣＴＣ−３’（５‘末端ビオチン化）
【００１４】図２の黒丸がＰｒｉｍｅｒ１で白丸がＰｒ
ｉｍｅｒ３を示す。その後、 ５ｘＳＳＣ溶液にサンプ
ルＤＮＡとしてＰｒｉｍｅｒ２の濃度を１０μＭとなる
ように調整して、ハイブリダイゼーションを行った。そ
の後、ＤＮＡ結合タンパク質であるＴＲＦを添加し、純
水で洗浄を行った。ＴＲＦを添加せずに純水で洗浄した
時の読み取り画像と、ＴＲＦを添加して純水で洗浄した
時の読み取り画像を図３に示す。図３のとおりに、ＴＲ
Ｆを添加した場合は純水で洗浄してもハイブリダイゼー
ションシグナルがはっきりとわかる。
ｉｍｅｒ３を示す。その後、 ５ｘＳＳＣ溶液にサンプ
ルＤＮＡとしてＰｒｉｍｅｒ２の濃度を１０μＭとなる
ように調整して、ハイブリダイゼーションを行った。そ
の後、ＤＮＡ結合タンパク質であるＴＲＦを添加し、純
水で洗浄を行った。ＴＲＦを添加せずに純水で洗浄した
時の読み取り画像と、ＴＲＦを添加して純水で洗浄した
時の読み取り画像を図３に示す。図３のとおりに、ＴＲ
Ｆを添加した場合は純水で洗浄してもハイブリダイゼー
ションシグナルがはっきりとわかる。
【００１５】
【発明の効果】従来は、ハイブリダイゼーションした後
に塩を含んだイオン性の溶液で洗浄する必要性があった
が、ＤＮＡ結合タンパク質を含む溶液により、純水で洗
浄してもハイブリダイゼーションシグナルの検出がおこ
なえるようになった。即ち、ＤＮＡチップやビーズにお
けるハイブリダイゼーション溶液にＤＮＡ結合タンパク
質を添加・使用することで、ハイブリダイゼーションシ
グナル強度の上昇、さらに、洗浄過程において純水を使
用することでバックグランドの低減を行い、結果として
Ｓ／Ｎ比を上昇させることが可能とする。これにより、
従来、測定に個人差が避けられなかったハイブリダイゼ
ーションを容易に標準化することができるようになっ
た。
に塩を含んだイオン性の溶液で洗浄する必要性があった
が、ＤＮＡ結合タンパク質を含む溶液により、純水で洗
浄してもハイブリダイゼーションシグナルの検出がおこ
なえるようになった。即ち、ＤＮＡチップやビーズにお
けるハイブリダイゼーション溶液にＤＮＡ結合タンパク
質を添加・使用することで、ハイブリダイゼーションシ
グナル強度の上昇、さらに、洗浄過程において純水を使
用することでバックグランドの低減を行い、結果として
Ｓ／Ｎ比を上昇させることが可能とする。これにより、
従来、測定に個人差が避けられなかったハイブリダイゼ
ーションを容易に標準化することができるようになっ
た。
【図１】ＤＮＡ結合タンパク質がハイブリダイゼーショ
ンを促進する様子を示す模式図。
ンを促進する様子を示す模式図。
【図２】バイオチップ上のスポットを説明する図。
【図３】ＤＮＡ結合タンパク質を添加しなかった場合と
添加した場合のＤＮＡハイブリダイゼーション後の読み
取り画像。
添加した場合のＤＮＡハイブリダイゼーション後の読み
取り画像。
１：担体、２：第１のＤＮＡ，３：第２のＤＮＡ，４：
タンパク質。
タンパク質。
フロントページの続き
(72)発明者 森田 敏樹
神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地
日立ソフトウエアエンジニアリング株式会
社内
(72)発明者 石井 華奈子
神奈川県横浜市中区尾上町６丁目81番地
日立ソフトウエアエンジニアリング株式会
社内
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA04 CA05 CA09 CA11
EA04 HA14
4B063 QA01 QA18 QQ42 QQ52 QR08
QR32 QR35 QR38 QR42 QR48
QR55 QR66 QR83 QR84 QS12
QS25 QS34 QS39 QX02 QX07
Claims (19)
- 【請求項１】 ＤＮＡ結合タンパク質よりなるハイブリ
ダイゼーション促進剤。 - 【請求項２】 バイオチップ又はビーズで行われるハイ
ブリダイゼーションを対象とする請求項１に記載のハイ
ブリダイゼーション促進剤。 - 【請求項３】 ＤＮＡ−ＤＮＡの相補的結合を強固にす
るためのハイブリダイゼーションを対象とすることを特
徴とする請求項１又は２に記載のハイブリダイゼーショ
ン促進剤。 - 【請求項４】 ＤＮＡ−ＲＮＡの相補的結合を強固にす
るためのハイブリダイゼーションを対象とすることを特
徴とする請求項１又は２に記載のハイブリダイゼーショ
ン促進剤。 - 【請求項５】 ＲＮＡ−ＲＮＡの相補的結合を強固にす
るためのハイブリダイゼーションを対象とすることを特
徴とする請求項１又は２に記載のハイブリダイゼーショ
ン促進剤。 - 【請求項６】 イオン性高分子間の結合を強固にするた
めのハイブリダイゼーションを対象とすることを特徴と
する請求項１又は２に記載のハイブリダイゼーション促
進剤。 - 【請求項７】 前記ＤＮＡ結合タンパク質が蛍光性を有
することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の
ハイブリダイゼーション促進剤。 - 【請求項８】 ハイブリダイゼーション溶液にＤＮＡ結
合タンパク質溶液を添加することを特徴とするハイブリ
ダイゼーション促進方法。 - 【請求項９】 バイオチップ又はビーズで行われるハイ
ブリダイゼーションを対象とする請求項８に記載のハイ
ブリダイゼーション促進方法。 - 【請求項１０】 ハイブリダイゼーション前又はハイブ
リダイゼーション中のバイオチップ又はビーズに前記Ｄ
ＮＡ結合タンパク質溶液を添加することを特徴とする請
求項９に記載のハイブリダイゼーション促進方法。 - 【請求項１１】 ハイブリダイゼーション後のバイオチ
ップ又はビーズに前記ＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加
することを特徴とする請求項９に記載のハイブリダイゼ
ーション促進方法。 - 【請求項１２】 ＤＮＡ−ＤＮＡの相補的結合を強固に
するためのハイブリダイゼーションを対象とすることを
特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載のハイブリ
ダイゼーション促進方法。 - 【請求項１３】 ＤＮＡ−ＲＮＡの相補的結合を強固に
するためのハイブリダイゼーションを対象とすることを
特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載のハイブリ
ダイゼーション促進方法。 - 【請求項１４】 ＲＮＡ−ＲＮＡの相補的結合を強固に
するためのハイブリダイゼーションを対象とすることを
特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載のハイブリ
ダイゼーション促進方法。 - 【請求項１５】 イオン性高分子間の結合を強固にする
ためのハイブリダイゼーションを対象とすることを特徴
とする請求項８〜１１のいずれかに記載のハイブリダイ
ゼーション促進方法。 - 【請求項１６】 高分子チップの担体に固定された第１
のイオン性高分子に相補的に結合する第２のイオン性高
分子を蛍光色素又は放射性元素（ＲＩ）で標識してお
き、ハイブリダイゼーション溶液にＤＮＡ結合タンパク
質溶液を添加することによりハイブリダイゼーションを
促進し、前記ハイブリダイゼーション及び洗浄後に、残
留する前記蛍光色素又は放射性元素（ＲＩ）を測定する
ことにより、前記ハイブリダイゼーション結果を検出す
ることを特徴とするハイブリダイゼーション検出方法。 - 【請求項１７】 ハイブリダイゼーション溶液に蛍光性
を有するＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加することによ
りハイブリダイゼーションを促進し、前記ハイブリダイ
ゼーション及び洗浄後に、前記ＤＮＡ結合タンパク質の
蛍光強度を測定することで、前記ハイブリダイゼーショ
ン結果を検出することを特徴とするハイブリダイゼーシ
ョン検出方法。 - 【請求項１８】 ハイブリダイゼーション溶液にＤＮＡ
結合タンパク質溶液を添加することによりハイブリダイ
ゼーションを促進し、前記ハイブリダイゼーション後
に、前記ＤＮＡ結合タンパク質を特異的に染色し、これ
を測定することで、前記ハイブリダイゼーション結果を
検出することを特徴とするハイブリダイゼーション検出
方法。 - 【請求項１９】 ＤＮＡ結合タンパク質を蛍光色素又は
放射性元素（ＲＩ）で標識し、ハイブリダイゼーション
溶液に前記標識されたＤＮＡ結合タンパク質溶液を添加
することによりハイブリダイゼーションを促進し、ハイ
ブリダイゼーション及び洗浄後に、残留する前記標識さ
れたＤＮＡ結合タンパク質の蛍光色素又は放射性同位元
素（ＲＩ）を測定することにより、前記ハイブリダイゼ
ーション結果を特異的に検出することを特徴とするハイ
ブリダイゼーション検出方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002071331A JP2003265180A (ja) | 2002-03-15 | 2002-03-15 | ハイブリダイゼーション促進剤及び促進方法 |
| US10/347,253 US20030175776A1 (en) | 2002-03-15 | 2003-01-21 | Hybridization accelerator and accelerating method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002071331A JP2003265180A (ja) | 2002-03-15 | 2002-03-15 | ハイブリダイゼーション促進剤及び促進方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003265180A true JP2003265180A (ja) | 2003-09-24 |
Family
ID=28035105
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002071331A Abandoned JP2003265180A (ja) | 2002-03-15 | 2002-03-15 | ハイブリダイゼーション促進剤及び促進方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030175776A1 (ja) |
| JP (1) | JP2003265180A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013191197A1 (ja) * | 2012-06-20 | 2013-12-27 | 東レ株式会社 | 核酸の検出方法および核酸検出キット |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102018214929B4 (de) | 2018-09-03 | 2022-01-27 | Vitesco Technologies GmbH | Katalysator mit metallischem Wabenkörper |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5015569A (en) * | 1989-12-01 | 1991-05-14 | Board Of Trustees Of Leland Stanford University | Acceleration of nucleic acid hybridization |
| AU1283095A (en) * | 1993-12-28 | 1995-07-17 | Daikin Industries, Ltd. | In-situ hybridization method using reca protein and reca protein having marker or ligand for use in said method |
-
2002
- 2002-03-15 JP JP2002071331A patent/JP2003265180A/ja not_active Abandoned
-
2003
- 2003-01-21 US US10/347,253 patent/US20030175776A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013191197A1 (ja) * | 2012-06-20 | 2013-12-27 | 東レ株式会社 | 核酸の検出方法および核酸検出キット |
| US10443085B2 (en) | 2012-06-20 | 2019-10-15 | Toray Industries, Inc. | Method for detecting nucleic acid and nucleic acid detection kit |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20030175776A1 (en) | 2003-09-18 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A762 Effective date: 20060522 |