KR20220044486A - 샘플 내 분석 물질의 신호 인코딩 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법, 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들의 용도, 및 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 키트에 관한 것이다.
Description
본 발명은 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법, 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들의 용도, 및 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 키트에 관한 것이다.
기술분야
본 발명은 분자 생물학 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 샘플에서 분석 물질을 검출하는 것, 바람직하게는 생물학적 샘플에서 핵산 분자 및/또는 단백질과 같은 생체 분자를 검출하는 것에 관한 것이다.
생물학적 및 비-생물학적 샘플에서 소량의 분석 물질을 분석하고 검출하는 것은 임상 및 분석 환경에서 일상적인 관행이 되었다. 이를 위해 수많은 분석 방법이 확립되었다. 그 방법들 중 일부는 특정의 두 번째 분석 물질에 할당된 코드와 다른 특정의 첫 번째 분석 물질에 특정 판독 가능 코드를 할당하는 인코딩 기술을 사용한다.
이 분야의 선행 기술 중 하나는 샘플에서 mRNA 분자를 검출하기 위해 본질적으로 개발된 소위 '단일 분자 형광 제자리 혼성화(smFISH)'이다. 문헌[Lubeck et al. (2014), Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization, Nat. Methods11(4), p. 360-361]에서, 관심 있는 mRNA는 특정의 직접 표지된 프로브 세트들을 통해 검출된다. 한 라운드의 혼성화 및 검출 후, mRNA 특이적 프로브 세트가 mRNA로부터 용리되고, 다른(또는 동일한) 형광 표지가 있는 동일한 프로브 세트가 다음 라운드의 혼성화 및 이미징에 사용되어 여러 라운드에 걸쳐 유전자 특이적 색상-코드 체계(gene specific color-code scheme)가 생성된다. 이러한 기술은 전사체 당 서로 다른 태그가 지정된 여러 프로브 세트가 필요하며 매번의 검출 라운드 후에 이러한 프로브 세트들을 변성시켜야 한다.
이러한 기술의 추가 개발에는 직접 표지된 프로브 세트들을 사용하지 않는다. 대신, 프로브 세트들의 올리고뉴클레오티드는 신호 증폭을 가능하게 하는 기술인 혼성화 연쇄 반응(HCR)의 개시자 역할을 하는 핵산 서열을 제공한다; 문헌[Shah et al. (2016), In situ transcription profiling of single cells reveals spatial organization of cells in the mouse hippocampus, Neuron 92(2), p. 342-357] 참조.
'다중 오류 강력한 형광 제자리 혼성화(merFISH)'라고 하는 또 다른 기술은 문헌[Chen et al. (2015), RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells, Science 348(6233):aaa6090]에 기재되어 있다. 여기서, 관심 mRNA는 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 후속 특이적 혼성화를 위한 추가 서열 요소를 제공하는 특이적 프로브 세트들을 통해 검출된다. 각 프로브 세트는 총 16개의 서열 요소 중 4개의 서로 다른 서열 요소를 제공한다. 특이적 프로브 세트들을 관심 mRNA에 혼성화한 후, 소위 판독 혼성화를 수행한다. 각 판독 혼성화에서, 서열 요소들 중 하나에 상보적인 16개의 형광 표지된 올리고뉴클레오티드 중 하나가 혼성화된다. 모든 판독 올리고뉴클레오티드는 동일한 형광색을 사용한다. 이미징 후 형광 신호는 조명을 통해 파괴되고, 다음 라운드의 판독 혼성화는 변성 단계 없이 발생한다. 그 결과, 각 mRNA 종에 대해 바이너리 코드가 생성된다. 16회 라운드에서 4개 신호의 고유한 신호 서명은 특이적 프로브 세트들을 관심 mRNA에 결합하기 위한 단일 혼성화 라운드를 사용하여 생성된 다음 단일 형광 색상으로 표지된 판독 올리고뉴클레오티드의 16회 혼성화 라운드를 사용하여 생성된다.
이러한 기술의 추가 개발은 두 가지 다른 형광 색상을 사용하여 처리량을 개선하고, 판독-올리고뉴클레오티드와 형광 표지 및 대체 혼성화 완충액 사이의 이황화물 절단을 통해 신호를 제거한다; 문헌[Moffitt et al. (2016), High-throughput single-cell gene-expression profiling with multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 113(39), p. 11046-11051] 참조.
'인트론 seqFISH'라고 하는 기술은 문헌[Shah et al. (2018), Dynamics and spatial genomics of the nascent transcriptome by intron seqFISH, Cell 117(2), p. 363-376]에 기재되어 있다. 여기서, 관심 mRNA는 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 후속 특이적 혼성화를 위한 추가 서열 요소를 제공하는 특이적 프로브 세트들을 통해 검출된다. 각 프로브 세트는 색상-코딩 라운드 당 12개의 가능한 서열 요소(사용된 12개의 '의사 색상(pseudocolors)'을 나타냄) 중 하나를 제공한다. 각 색상-코딩 라운드는 4개의 직렬 혼성화로 구성된다. 이러한 직렬 혼성화 각각에서, 각각 다른 형광단으로 표지된 3개의 판독 프로브들이 mRNA-특이적 프로브 세트의 해당 요소에 혼성화된다. 이미징 후 판독 프로브들은 55% 포름아미드 완충액으로 제거되고 다음 혼성화가 이어진다. 각각 4개의 직렬 혼성화가 있는 5개의 색상-코딩 라운드 후에 색상-코드가 완료된다.
유럽 특허 공보 EP 0 611 828호는 분석 물질에 특이적으로 결합하는 프로브에 신호 생성 요소를 모집하기 위한 가교 요소의 사용을 개시한다. 보다 구체적인 설명은 가교 핵산 분자를 모집하는 특이적 프로브를 통한 핵산 검출을 기재한다. 이러한 가교 핵산은 결국 신호 생성 핵산을 모집한다. 이 공보는 또한 분지형 DNA와 같은 신호 증폭을 위한 신호 생성 요소에 대한 하나 초과의 결합 부위를 갖는 가교 요소의 사용을 기재한다.
문헌[Player et al. (2001), Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization, J. Histochem. Cytochem. 49(5), p. 603-611]에는 관심 핵산이 추가 서열 요소를 제공하는 특이적 프로브 세트들을 통해 검출되는 방법이 기재되어 있다. 두 번째 단계에서 전증폭기 올리고뉴클레오티드가 이러한 서열 요소에 혼성화된다. 이러한 전증폭기 올리고뉴클레오티드는 후속 단계에서 혼성화되는 증폭기 올리고뉴클레오티드에 대한 다중 결합 부위를 포함한다. 이러한 증폭기 올리고뉴클레오티드는 표지된 올리고뉴클레오티드에 대한 다중 서열 요소를 제공한다. 이러한 방식으로 분기된 올리고뉴클레오티드 트리가 구축되어 신호가 증폭된다.
이러한 방법의 추가 개발은 문헌[Wang et al. (2012), RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues, J. Mol. Diagn. 14(1), p.22-29]에 기재되어 있는데, 이 문헌에서는 mRNA-특이적 프로브의 또 다른 디자인을 사용한다. 여기에서 mRNA-특이적 올리고뉴클레오티드 중 2개는 전증폭기 올리고뉴클레오티드를 모집할 수 있는 서열을 제공하기 위해 매우 근접하게 혼성화해야 한다. 이러한 방법은 위양성 신호의 수를 줄임으로써 방법의 특이성을 높인다.
문헌[Choi et al. (2010), Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression, Nat. Biotechnol. 28(11), p. 1208-1212]에는 'HCR-혼성화 연쇄 반응'으로 알려진 방법이 기재되어 있다. 관심 mRNA는 형광 표지된 올리고뉴클레오티드의 후속 특이적 혼성화를 위한 추가 서열 요소를 제공하는 특이적 프로브 세트들을 통해 검출된다. 추가 서열 요소는 혼성화 연쇄 반응을 시작하는 개시자 서열이다. 기본적으로, 혼성화 연쇄 반응은 개시자 서열을 통해 첫 번째 헤어핀이 열린 후 폴리머로 자가 조립되는 준안정 올리고뉴클레오티드 헤어핀을 기반으로 한다.
기술의 추가 개발은 RNAscope 기술과 유사하게 HCR에 대한 개시자 서열을 형성하기 위해 매우 근접하게 혼성화해야 하는 소위 분할 개시자 프로브를 사용하여 위양성 신호의 수를 줄인다; 문헌[Choi et al. (2018), Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development 145(12)] 참조.
문헌[Mateo et al. (2019), Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution, Nature Vol, 568, p. 49ff.]에는 '염색질 구조의 광학적 재구성(ORCA)이라고 하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 방법은 염색체 라인을 보이게 하기 위한 것이다.
그러나, 당업계에 공지된 방법들에는 많은 단점이 있다. 특히, 유연성이 없고 비용이 많이 들고 복잡하고 시간이 많이 걸리며 종종 정확하지 않은 결과를 제공한다. 특히, 기존 방법의 인코딩 능력은 낮고, 현대 분자 생물학 및 의학의 요구 사항을 충족시키지 못한다.
이러한 배경으로, 본 발명의 기초가 되는 목적은 선행 기술 방법의 단점을 줄이거나 심지어 피할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 이들 및 다른 요구를 만족시킨다.
본 발명은 샘플에서 분석 물질의 순차적 신호-인코딩 방법을 제공하는 바, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(1)
한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들을 제공하는 단계, 각각의 분석 물질-특이적 프로브는
-
인코딩될 분석 물질들 중 하나와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소(S), 및
-
상기 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들에 고유한 뉴클레오티드 서열(고유 식별자 서열)을 포함하는 식별자 요소(T)를 포함함;
(2)
한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들을 샘플과 함께 인큐베이션하여, 분석 물질로의 분석 물질-특이적 프로브들의 특이적 결합이 인코딩되도록 하는 단계;
(3)
샘플로부터 결합되지 않은 프로브를 제거하는 단계;
(4)
한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들을 제공하는 단계, 각각의 디코딩 올리고뉴클레오티드는
-
고유 식별자 서열의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 커넥터 요소(t), 및
-
신호 올리고뉴클레오티드의 특이적 혼성화를 허용하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 번역기 요소(c)를 포함함;
(5)
한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들을 샘플과 함께 인큐베이션하여, 디코딩 올리고뉴클레오티드들을 고유한 식별자 서열에 특이적으로 혼성화시키는 단계;
(6)
샘플로부터 결합되지 않은 디코딩 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계;
(7)
한 세트의 신호 올리고뉴클레오티드들을 제공하는 단계, 각각의 신호 올리고뉴클레오티드는
-
번역기 요소(c)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 커넥터 요소(C), 및
-
신호 요소를 포함함; 및
(8)
한 세트의 신호 올리고뉴클레오티드들을 샘플과 함께 인큐베이션하여, 신호 올리고뉴클레오티드들을 번역기 요소(c)에 특이적으로 혼성화시키는 단계.
본 발명자들은 이러한 신규한 방법이 특정 혼성화를 통해 병렬로 샘플에서 상이한 분석 물질 또는 상이한 단일 분석 물질 분자의 특정 정량적 및/또는 공간적 검출 또는 카운팅을 허용하는 프로세스를 설정하는 데 필요한 필수 단계를 제공한다는 것을 깨달았다. 이러한 기술을 사용하면 사용 가능한 다른 신호보다 더 많은 수의 분석 물질을 구별할 수 있다. 다른 최첨단 방법과 대조적으로, 검출 가능한 신호를 제공하는 올리고뉴클레오티드는 샘플-특이적 핵산 서열과 직접 상호작용하지 않고 소위 '디코딩-올리고뉴클레오티드'에 의해 매개된다. 이러한 메카니즘은 분석 물질-특이적 올리고뉴클레오티드와 신호 올리고뉴클레오티드 사이의 의존성을 분리시키므로, 결과적으로 인코딩 능력을 극적으로 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 주제는 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들의 용도이며, 각각의 디코딩 올리고뉴클레오티드는 하기를 포함한다:
-
한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들에 고유한 뉴클레오티드 서열(고유 식별자 서열)의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 커넥터 요소(t), 및
-
신호 올리고뉴클레오티드의 특이적 혼성화를 허용하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 번역기 요소(c).
본 발명의 또 다른 주제는 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 키트이며, 이 키트는 하기를 포함한다:
-
한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들, 여기서 각각의 분석 물질-특이적 프로브는
-
인코딩될 분석 물질들 중 하나와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소(S), 및
-
상기 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들에 고유한 뉴클레오티드 서열(고유 식별자 서열)을 포함하는 식별자 요소(T)를 포함함; 및
-
한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들, 여기서 각각의 디코딩 올리고뉴클레오티드는
-
고유 식별자 서열의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 커넥터 요소(t), 및
-
신호 올리고뉴클레오티드의 특이적 혼성화를 허용하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 번역기 요소(c)를 포함함; 그리고 바람직하게는,
-
한 세트의 신호 올리고뉴클레오티드들, 여기서 각각의 신호 올리고뉴클레오티드는
-
번역기 요소(c)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 커넥터 요소(C), 및
-
신호 요소를 포함함.
디코딩-올리고뉴클레오티드의 용도는 훨씬 더 높은 유연성을 허용하면서 필요한 상이한 신호 올리고뉴클레오티드의 수를 극적으로 감소시켜 달성된 인코딩 능력을 차례로 증가시킨다. 디코딩 올리고뉴클레오티드의 활용은 다른 방법보다 더 유연하고, 저렴하고, 더 간단하고, 더 빠르고, 더 정확한 순차적 신호-코딩 기술을 유도한다. 특히, 본 발명은 선행 기술 방법과 비교하여 인코딩 능력을 상당히 증가시킨다.
디코딩 올리고뉴클레오티드의 용도는 표적 특이적 프로브와 신호 올리고뉴클레오티드 간의 의존성을 깨뜨린다. 최신 기술의 방법에서와 같이 표적 특이적 프로브 및 신호 생성을 분리하지 않고 2개의 상이한 분자 태그를 사용하는 경우에만 특정 표적에 대해 2개의 상이한 신호를 생성할 수 있다. 이러한 분자 태그들 각각은 한 번만 사용할 수 있다. 동일한 분자 태그의 다중 판독은 대상에 대한 정보를 증가시키지 않는다. 인코딩 체계(encoding scheme)를 생성하려면 각 라운드 후에 표적 특이적 프로브 세트를 변경해야 하거나(SeqFISH) 동일한 프로브 세트에 여러 분자 태그(예를 들어, merFISH, intronSeqFISH)가 있어야 한다. 본 기술 분야의 이러한 제한은 매우 관련성이 있으며 유연성, 코딩 능력, 정확성, 재현성을 감소시키고 실험 비용을 증가시킨다.
본 발명에 따르면, "분석 물질"은 샘플에 존재하거나 존재하지 않는 것으로 구체적으로 검출되는 대상이고, 존재하는 경우에는 인코딩할 대상이다. 관심 대상이 되는 단백질 또는 핵산 분자(RNA 또는 DNA)를 비롯한 모든 종류의 개체일 수 있다. 분석 물질은 분석 물질-특이적 프로브와의 특이적 결합을 위한 적어도 하나의 부위를 제공한다. 본원에서 때때로 "분석 물질"이라는 용어는 "표적"으로 대체된다. 본 발명에 따른 "분석 물질"은 대상체들의 복합체, 예를 들어, 적어도 2개의 개별 핵산, 단백질, 또는 펩티드 분자를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서 "분석 물질"에는 염색체가 제외된다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서 "분석 물질"에는 DNA가 제외된다.
본원에서 언급된 "샘플"은 인코딩될 분석 물질을 포함하는 것으로 의심되는 액체 또는 고체 형태의 조성물이다.
본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 DNA, PNA, LNA, 또는 RNA와 같은 짧은 핵산 분자를 의미한다. 올리고뉴클레오티드의 길이는 연속적인 서열 요소의 수에 따라 4 내지 200 뉴클레오티드(nt), 바람직하게는 6 내지 80 nt, 더 바람직하게는 8 내지 60 nt, 더 바람직하게는 10 내지 50 nt, 더 바람직하게는 12 내지 35의 범위 내이다. 핵산 분자는 완전히 또는 부분적으로 단일 가닥일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 선형일 수 있거나 헤어핀 또는 루프 구조를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 비오틴, 표지 모이어티, 차단 모이어티, 또는 기타 변형과 같은 변형을 포함할 수 있다.
"분석 물질-특이적 프로브"는 적어도 2개의 요소, 즉 분석 물질들 중 하나와 특이적으로 상호작용하는 소위 결합 요소(S)와, '고유 식별자 서열'을 포함하는 소위 식별자 요소(T)로 구성된다. 결합 요소(S)는 혼성화 서열 또는 앱타머와 같은 핵산, 또는 항체와 같은 펩티드 구조일 수 있다. 분석 물질-특이적 프로브에 포함된 "고유 식별자 서열"이라 함은 이 서열이 다른 고유 식별자와 비교하여 고유하다는 것이다. 이러한 문맥에서 "고유한"은 Cyclin A, Cyclin D, Cyclin E 등과 같은 하나의 분석 물질만을 구체적으로 식별하거나, 또는 대안적으로 분석 물질 그룹이 유전자 패밀리를 포함하는지 또는 포함하지 않는지 여부와는 무관하게 분석 물질 그룹만을 구체적으로 식별함을 의미한다. 따라서, 이러한 고유 식별자에 의해 인코딩될 분석 물질 또는 분석 물질 그룹은 식별자 요소(T)의 고유한 식별자 서열을 기반으로 인코딩될 다른 모든 분석 물질 또는 분석 물질 그룹과 구별될 수 있다. 즉, 특정 분석 물질 또는 한 그룹의 분석 물질들의 경우에 '고유한 식별자 서열'은, 하나 초과, 즉 2개도 아닌 단 하나만 있다. 고유한 식별자 서열의 고유성으로 인해 식별자 요소(T)는 정확히 한 유형의 디코딩 올리고뉴클레오티드에 혼성화된다. 고유 식별자 서열의 길이는 병렬로 인코딩된 분석 물질의 수와 필요한 상호작용의 안정성에 따라 8 내지 60 nt, 바람직하게는 12 내지 40 nt, 더욱 바람직하게는 14 내지 20 nt 범위 내에 있다. 고유 식별자는 직접적으로 또는 링커, 공유 결합 또는 고친화성 결합 모드, 즉 항체-항원 상호작용, 스트렙타비딘-비오틴 상호작용 등에 의해 부착된 분석 물질-특이적 프로브의 서열 요소일 수 있다. 용어 "분석 물질 특이적 프로브"는 각각의 프로브가 동일한 분석 물질에 결합하지만, 가능하게는 이의 상이한 부분, 예를 들어 인코딩될 핵산 분자에 의해 포함된 뉴클레오티드 서열의 상이한(예를 들어, 이웃하는) 또는 중첩 부분에 결합하는 방식으로 이들의 결합 요소(S)가 다를 수 있는 복수의 프로브를 포함하는 것으로 이해한다. 그러나, 복수의 프로브 각각은 동일한 식별자 요소(T)를 포함한다.
"디코딩 올리고뉴클레오티드"는 적어도 2개의 서열 요소로 구성된다. "제1 커넥터 요소(t)"로 지칭되는 고유 식별자 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 하나의 서열 요소와, "번역기 요소(c)"로 지칭되는 신호 올리고뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 제2 서열 요소. 서열 요소의 길이는 병렬로 인코딩될 분석 물질의 수, 필요한 상호작용의 안정성 및 사용된 상이한 신호 올리고뉴클레오티드의 수에 따라 8 내지 60 nt, 바람직하게는 12 내지 40 nt, 더욱 바람직하게는 14 내지 20 nt 범위 내에 있다. 두 서열 요소의 길이는 같을 수 있거나, 혹은 같지 않을 수도 있다.
본원에 사용된 "신호 올리고뉴클레오티드"는 적어도 2개의 요소, 즉 디코딩 올리고뉴클레오티드의 번역기 요소(c)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 한 섹션에 특이적으로 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 갖는 소위 "제2 커넥터 요소"(C)와, 검출 가능한 신호를 제공하는 "신호 요소"를 포함한다. 이러한 요소는 검출 가능한 신호를 능동적으로 생성하거나, 이러한 신호를 조작을 통해, 예를 들어 형광 여기를 통해, 제공할 수 있다. 통상적인 신호 요소는 예를 들어, 검출 가능한 반응을 촉매하는 효소, 형광단, 방사성 요소 또는 염료이다.
"세트"는 복수의 모이어티 또는 대상체, 예를 들어, 분석 물질-특이적 프로브 또는 디코딩 올리고뉴클레오티드를 나타내는 것으로, 이는 상기 복수라고 하는 것의 개별 구성원들이 서로 동일하거나 상이하든지 간에 그렇다. 본 발명의 한 실시양태에서 단일 세트는 복수의 올리고뉴클레오티드를 지칭한다
"분석 물질 특이적 프로브 세트"는 복수의 모이어티 또는 대상체, 예를 들어, 서로 다르며 분석 물질의 독립적인 영역에 결합하는 분석 물질-특이적 프로브들을 나타낸다. 단일 분석 물질 특이적 프로브 세트는 동일한 고유 식별자가 추가 특징이다.
"디코딩 올리고뉴클레오티드 세트"는 코드 워드의 길이와 무관한 인코딩을 실현하는 데 필요한 특정 고유 식별자에 대해 특이적인 복수의 디코딩 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. "디코딩 올리고뉴클레오티드 세트"에 포함된 각각의 그리고 모든 디코딩 올리고뉴클레오티드는 분석 물질-특이적 프로브의 동일한 고유 식별자 요소(T)에 결합한다.
"본질적으로 상보적인"은 두 개의 뉴클레오티드 서열을 언급할 때 두 서열이 엄격한 조건 하에서 서로 특이적으로 혼성화할 수 있고, 이로써 수소 결합을 통해 서로 연결된 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 혼성 핵산 분자를 형성할 수 있음을 의미한다(왓슨 및 크릭 염기쌍). "본질적으로 상보적인"은 전체 가닥을 따른 완전한 염기쌍, 즉 완전한 상보적 서열뿐만 아니라 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화할 수 있는 능력을 여전히 갖고 있는 불완전한 상보적 서열을 포함한다. 전문가들 사이에서는 "본질적으로 상보적인" 서열이 완전하거나 완벽하게 상보적인 서열에 대해 적어도 88%의 서열 동일성을 갖는다는 것이 잘 받아들여지고 있다.
"서열 동일성 퍼센트" 또는 "동일성 퍼센트"는 차례로 서열이 기술되거나 청구된 서열("기준 서열")과 비교될 서열("비교 서열")의 정렬 후에 청구되거나 기술된 서열과 비교됨을 의미한다. 다음에 동일성 백분율은 하기 공식에 따라 결정된다: 동일성 백분율 = 100 [1 -(C/R)]
여기서, C는 기준 서열과 비교 서열 사이의 정렬 길이에 걸친 기준 서열과 비교 서열 간의 차이의 수이고, 여기서
(i) 비교 서열의 대응하는 정렬된 염기 또는 아미노산을 갖지 않는 기준 서열의 각 염기 또는 아미노산과,
(ii) 기준 서열의 각 간격과,
(iii) 비교 서열의 정렬된 염기 또는 아미노산과 상이한, 기준 서열의 각각의 정렬된 염기 또는 아미노산은 차이를 구성하고, (iiii) 정렬은 정렬된 서열의 위치 1에서 시작해야 하며;
그리고 R은 기준 서열에 임의의 간극이, 이 또한 염기 또는 아미노산으로 간주됨, 생성되어 있는 상태에서 비교 서열과 정렬된 길이에 걸친 기준 서열의 염기 또는 아미노산의 수이다.
위에서 계산된 동일성 백분율이 지정된 최소 동일성 백분율과 대략 같거나 그보다 큰, 비교 서열과 기준 서열 사이의 정렬이 존재하는 경우라면, 위에서 계산된 동일성 백분율이 지정된 동일성 백분율보다 작은 정렬이 존재한다 하더라도, 비교 서열은 기준 서열에 대한 지정된 최소 동일성 백분율을 갖는다.
본원에서 이해되는 "인큐베이션" 단계에서 프로브 또는 올리고뉴클레오티드와 같은 각각의 모이어티 또는 대상체는 특이적 결합 또는 혼성화 반응을 허용하는 숙련자에게 잘 알려진 조건, 예를 들어, pH, 온도, 염 보건 등 하에 서로 접촉하게 된다. 따라서, 이러한 단계는 바람직하게는 당업계에 잘 알려진 완충 시스템과 같은 액체 환경에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 "제거" 단계는 특정 조건, 예를 들어, 당업계에 공지된 pH, 온도, 염 조건 등에 의해 프로브 또는 올리고뉴클레오티드와 같이 제거될 모이어티 또는 대상체의 세척을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 실시양태에서 복수의 분석 물질이 병렬로 인코딩될 수 있음이 이해된다. 이를 위해서는 단계 (1)에서 여러 세트의 분석 물질-특이적 프로브를 사용해야 한다. 특정 세트의 분석 물질-특이적 프로브들은 다른 세트의 분석 물질-특이적 프로브들과 상이하다. 이것은 세트 1의 분석 물질-특이적 프로브들이 분석 물질 1에 결합하는 것, 세트 2의 분석 물질-특이적 프로브들이 분석 물질 2에 결합하는 것, 세트 3의 분석 물질-특이적 프로브들이 분석 물질 3에 결합하는 것 등등을 의미한다. 이러한 실시양태에서 또한 여러 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드의 사용이 단계 (4)에서 요구된다. 특정 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드는 다른 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드와 상이하다. 이는 세트 1의 디코딩 올리고뉴클레오티드가 분석 물질-특이적 프로브들의 상기 세트 1의 분석 물질-특이적 프로브에 결합하는 것, 세트 2의 디코딩 올리고뉴클레오티드가 분석 물질-특이적 프로브들의 상기 세트 2의 분석 물질-특이적 프로브에 결합하는 것, 세트 3의 디코딩 올리고뉴클레오티드가 분석 물질-특이적 프로브들의 상기 세트 3의 분석 물질-특이적 프로브에 결합하는 것 등등을 의미한다. 복수의 분석 물질이 병렬로 인코딩되어야 하는 이러한 실시양태에서, 여러 세트의 분석 물질-특이적 프로브들이 단계 (1)에서 여러 세트의 분석 물질-특이적 프로브들의 예비 혼합물로서 제공될 수 있고/있거나 여러 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드가 단계 (4)에서 여러 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드의 예비 혼합물로서 제공될 수 있다. 각 혼합물은 단일 바이알에 담길 수 있다. 대안적으로, 여러 세트의 분석 물질-특이적 프로브 및/또는 여러 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드가 단계 (1) 및/또는 (4)에서 단독으로 제공될 수 있다.
"키트"는 본 발명의 용도 및/또는 방법을 수행하는 데 유용한 개별 요소들의 조합으로서, 이 요소들은 방법에서 함께 사용하기 위해 최적화된다. 키트는 또한 본 발명에 따른 방법을 수행하는 데 유용할 수 있는 추가의 시약, 화학물질, 완충액, 반응 바이알 등을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 본 발명에 따른 방법을 수행하는 데 필요한 모든 필수 요소를 통합하여 오류의 위험을 최소화한다. 따라서, 이러한 키트는 또한 반숙련된 실험실 직원이 본 발명에 따른 방법을 수행할 수 있도록 한다.
본원에서 명시된 특징, 특성, 이점 및 실시양태는 구체적으로 나타내지 않더라도 본 발명에 따른 방법, 용도, 및 키트에 적용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 샘플은, 바람직하게는 생물학적 조직을 포함하고 더 바람직하게는 생물학적 세포를 포함하는, 생물학적 샘플이다. 생물학적 샘플은 기관, 오르가노이드, 세포 배양물, 줄기 세포, 세포 현탁액, 1차 세포, 바이러스, 박테리아 또는 진균에 감염된 샘플, 진핵 또는 원핵 샘플, 도말, 질병 샘플, 조직 절제 부분에서 유래할 수 있다.
이 방법은 생물학적 샘플 내, 예컨대 분석 물질로서 핵산 또는 단백질을 포함하는 샘플 내 분석 물질 또는 단일 분석 물질 분자를 인코딩하거나, 식별하거나, 검출하거나, 계수하거나, 또는 정량화하는 데 특히 적격이다. 생물학적 샘플은 자연 환경에 있는 그대로의 형태(즉, 액체, 반액체, 고체 등)이거나, 방법이 수행되기 전에 재-액화될 수 있는 장치의 표면에 건조된 필름으로 처리된 형태일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 단계 (2) 이전에 생물학적 조직 및/또는 생물학적 세포가 고정된다.
이러한 측정은 인코딩할 분석 물질, 예를 들면 핵산 또는 단백질을 고정하고, 떨어지지 않게 하는 장점이 있다. 그렇게 함으로써, 분석 물질은 본 발명에 따른 방법에 의해 더 나은 검출 또는 인코딩을 위해 준비된다. 샘플의 고정은 예를 들어 포르말린, 에탄올, 메탄올 또는 당업자에게 잘 알려진 기타 성분에 의해 수행될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들 내 개별 분석 물질-특이적 프로브들이, 인코딩될 분석 물질들 중 한 물질의 상이한 하위-구조들과 특이적으로 상호작용하는 결합 요소(S1, S2, S3, S4, S5)를 포함한다.
이러한 수단에 의하면, 방법 또는 주기의 종료 시에 각각 얻어지는 신호 강도가 증가하기 때문에, 본 방법이 훨씬 더 강건해지고 신뢰성 있게 된다. 동일한 분석 물질에 결합하는 동안 세트의 개별 프로브들은 분석 물질에서 또는 분석 물질 상의 결합 위치 또는 결합 부위가 다른 것으로 이해된다. 따라서 첫 번째, 두 번째, 세 번째, 네 번째, 다섯 번째 등의 분석 물질-특이적 프로브의 결합 요소 S1, S2, S3, S4, S5 등은 중첩되거나 중첩되지 않을 수 있는 다른 위치에 결합하거나 다른 위치에서 결합한다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 하기의 추가 단계를 포함한다:
(9)
샘플로부터 결합되지 않은 신호 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계; 및
(10)
신호를 검출하는 단계.
이러한 수단에 의해, 본 방법은 신호 요소를 시각화하도록 구성된 임의의 수단이 인코딩된 분석 물질을 검출할 수 있게 하는 정도로 더 발전되었다. 검출 가능한 물리적 특징의 예는 예를 들면, 빛, 화학 반응, 분자 질량, 방사능 등을 포함한다.
본 발명에 따른 방법의 추가 실시양태에서, 하기 추가 단계가 수행된다:
(11)
샘플로부터 디코딩 올리고뉴클레오티드 및 신호 올리고뉴클레오티드를 선택적으로 제거함으로써, 인코딩될 분석 물질에 대한 분석 물질-특이적 프로브의 특이적 결합을 본질적으로 유지하는 단계.
이 측정에 의해 동일한 분석 물질-특이적 프로브에 추가 디코딩 올리고뉴클레오티드를 결합하는 또 다른 라운드에 대한 요구 사항이 설정되고, 따라서 최종적으로 하나 초과의 신호를 포함하는 코드 또는 인코딩 체계가 생성된다. 이 단계는 당업자에게 잘 알려진 조건 및 인자, 예를 들면 pH, 온도, 염 조건, 올리고뉴클레오티드 농도, 폴리머 등을 적용하여 실현된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다:
(12)
단계 (4)에서 단계 (11)까지를 적어도 한 번 반복하여[(42)-(112)] 적어도 두 개의 신호로 구성된 인코딩 체계를 생성하는 단계.
이 수단에 의하면, 하나 초과의 신호의 코드가, 즉 사용자가 수행하는 2 라운드[(42)-(112)], 3 라운드[(43)-(113)], 4 라운드[(44)-(114)], 5 라운드[(45)-(115)] 등의 [(4n)-(11n)] 라운드의 경우의, 여기서 'n'은 라운드 수를 나타내는 정수임, 2개, 3개, 4개, 5개 등의 신호의 코드가, 설정된다. 따라서 본 발명에 따른 방법의 인코딩 능력은 분석 물질의 특성 및 작업자의 필요에 따라 증가된다.
본 발명의 일 실시양태에서, 상기 인코딩 체계는 사전에 결정되고, 인코딩될 분석 물질에 할당된다.
이러한 수단은 사용된 디코딩 및 신호 올리고뉴클레오티드의 적절한 순차적 순서를 제공하여 정확한 실험 설정을 가능하게 하고 따라서 특정 분석 물질을 각각의 인코딩 체계에 올바르게 할당할 수 있다.
반복하는 단계[(42)-(112)]에서 사용된 디코딩 올리고뉴클레오티드는 이전의 단계 (4)에서 단계 (11)까지에 사용된 디코딩 올리고뉴클레오티드의 번역기 요소(c1)와 동일한 번역기 요소(c2)를 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 디코딩 올리고뉴클레오티드는 이전의 단계 (4)에서 단계 (11)까지에 사용된 디코딩 올리고뉴클레오티드의 번역기 요소(c1)와 상이한 번역기 요소(c2)를 포함하는 반복하는 단계[(42)-(112)]에서 사용된다.
디코딩 요소는 라운드에서 라운드로, 즉 번역기 요소 c2를 포함하는 제2 라운드[(42)-(112)]에서, 번역기 요소 c3를 포함하는 제3 라운드[(43)-(113)]에서, 번역기 요소 c4를 포함하는 제4 라운드[(44)-(114)]에서, 번역기 요소 c5를 포함하는 제5 라운드에서, 번역기 요소 cn을 포함하는 'n' 라운드[(4n)-(11n)](여기서, 'n'은 라운드 수를 나타내는 정수) 등 에서 변경될 수 있거나 변경되지 않을 수 있다는 것을 알 수 있다.
반복하는 단계[(42)-(112)]에서 사용된 신호 올리고뉴클레오티드는 이전의 단계 (4)에서 단계 (11)까지에 사용된 디코딩 올리고뉴클레오티드의 신호 요소와 동일한 신호 요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 신호 올리고뉴클레오티드는 이전의 단계 (4)에서 단계 (11)까지에 사용된 디코딩 올리고뉴클레오티드의 신호 요소와 상이한 신호 요소를 포함하는 반복하는 단계[(42)-(112)]에서 사용된다.
이 측정에 의해 각 라운드마다 동일하거나 다른 신호가 제공되어 수 많은 다른 신호로 구성된 신호 서열을 특징으로 하는 인코딩 체계가 생성된다. 이 측정을 사용하면 인코딩 체계의 다른 모든 코드 단어와 다른 고유 코드 또는 코드 단어를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 분석 물질-특이적 프로브의 결합 요소(S)는 인코딩될 분석 물질에 대한 특이적 결합, 바람직하게는 인코딩될 분석 물질에 대한 특이적 혼성화를 허용하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다.
이러한 측정은 핵산 분석 물질, 예컨대 특정 DNA 분자, 예를 들면, 게놈 DNA, 핵 DNA, 미토콘드리아 DNA, 바이러스 DNA, 박테리아 DNA, 세포외 또는 세포내 DNA 등, 또는 특정 mRNA 분자, 예를 들면, hnRNA, miRNA, 바이러스 RNA, 세균 RNA, 세포외 또는 세포내 RNA 등을 인코딩하기 위한 조건을 생성한다.
본 발명의 대안적인 실시양태에서, 분석 물질-특이적 프로브의 결합 요소(S)는 인코딩될 분석 물질에 대한 특이적 결합을 허용하는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 결합 요소는 항체이다.
이러한 측정은 핵산 분석 물질, 예컨대 mRNA, 예를 들면 특정 단백질을 코딩하는 이러한 mRNA를 인코딩하기 위한 조건을 생성한다.
또 다른 실시양태에서, 인코딩되거나 검출될 분석 물질은 핵산, 바람직하게는 DNA 또는 RNA, 추가로 바람직하게는 mRNA이고/이거나 대안적으로 디코딩될 분석 물질은 펩티드 또는 단백질이다.
이러한 측정에 의해 본 발명은 임상적 기본 또는 생물학적 문제의 초점에서 가장 중요한 이러한 종류의 분석 물질의 검출에 적합하다.
앞서 언급된 특징 및 다음에 언급될 특징은 각각의 경우에 표시된 조합으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한 다른 조합으로 또는 분리된 방식으로 사용될 수 있음을 이해해야 합니다.
본 발명은 이제 본 발명의 추가적인 특징, 특징 및 이점을 초래하는 실시예에 의해 추가로 설명된다. 실시양태는 순수한 예시적 성격을 띠고, 본 발명의 범위 또는 범주를 제한하지 않는다. 특정 실시양태에서 언급된 특징은 특정 실시양태에 적용될 뿐만 아니라 본 발명의 임의의 실시양태의 맥락에서 분리된 방식으로 적용 가능한 본 발명의 일반적인 특징이다.
이제 본 발명을 하기의 비제한적인 실시예 및 도면을 참조하여 더욱 상세하게 기재하고 설명한다.
도 1:
분석 물질이 핵산이고, 프로브 세트가 분석 물질에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 실시양태. 프로브들은 디코딩 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 허용하는 고유한 식별자 서열을 포함한다;
도 2:
분석 물질은 단백질이고, 프로브 세트는 분석 물질에 특이적으로 결합하는 단백질(여기서, 항체)을 포함하는 실시양태. 프로브들은 디코딩 올리고뉴클레오티드의 혼성화를 허용하는 고유한 식별자 서열을 포함한다;
도 3:
본 발명에 따른 방법의 순서도;
도 4:
디코딩 및 신호 올리고뉴클레오티드 적용을 위한 대체 옵션.
도 5:
2개의 상이한 신호 유형 및 3개의 검출 라운드에 의한 3개의 상이한 핵산 서열의 신호 인코딩에 대한 실시예; 이 실시예에서 인코딩 체계는 오류 검출을 포함한다;
도 6:
검출 주기의 수에 대한 생성된 코드 단어의 수(로그 스케일);
도 7:
단일 단계 효율을 기반으로 하는 5-라운드 인코딩 체계의 계산된 총 효율;
도 8:
다른 실험 사이의 상대적 전사체 존재비의 비교;
도 9:
다른 실험 사이의 상대적 전사체 존재비의 상관관계;
도 10:
신호의 세포간 분포 비교;
도 11:
신호의 세포내 분포 비교;
도 12:
상이한 세포 주기 의존성 전사체의 분포 패턴.
실시예
1.
도입
본원에 개시된 방법은 동시에 많은 상이한 분석 물질의 특이적 검출을 위해 사용된다. 이러한 기술을 사용하면 다른 신호보다 더 많은 수의 분석 물질을 구별할 수 있다. 이러한 과정은 바람직하게는 특이적 결합, 신호 검출 및 선택적 변성의 적어도 2회의 연속 라운드를 포함하여(다음 라운드가 필요한 경우) 결국 신호 코드를 생성한다. 분석 물질 특이적 결합과 검출 가능한 신호를 제공하는 올리고뉴클레오티드 간의 의존성을 분리하기 위해 소위 "디코딩" 올리고뉴클레오티드가 도입된다. 디코딩 올리고뉴클레오티드는 분석 물질 특이적 프로브 세트의 정보를 시그널 올리고뉴클레오티드로 전사한다.
첫 번째 적용 변형에서, 분석 물질 또는 표적은 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA이며, 프로브 세트는 검출할 핵산 서열의 전체 서열 또는 하위 서열에 부분적으로 또는 완전히 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다(도 1). 핵산 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브 세트는 분석 물질-특이적 프로브들(1)을 포함하고, 이 분석 물질-특이적 프로브들은 검출할 표적 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 결합 요소(S)와, 상기 세트의 분석 물질-특이적 프로브에 고유한 뉴클레오티드 서열(고유 식별자 서열)을 포함하는 식별자 요소(T)를 포함한다.
두 번째 적용 변형에서, 분석 물질 또는 표적은 단백질이고, 프로브 세트는 하나 이상의 단백질, 예를 들어, 항체를 포함한다(도 2). 단백질 특이적 프로브 세트는 분석 물질-특이적 프로브들(1)을 포함하고, 이 분석 물질-특이적 프로브들은 단백질 특이적 검출하고자 하는 표적 단백질과 특이적으로 상호작용하는 항체의 (초)가변 영역과 같은 결합 요소(T)와, 식별자 요소(T)를 포함한다.
세 번째 적용 변형에서, 적어도 하나의 분석 물질은 핵산이고, 적어도 제2의 분석 물질은 단백질이고, 적어도 제1 프로브 세트는 핵산 서열에 결합하고, 적어도 제2 프로브 세트는 단백질 분석 물질에 특이적으로 결합한다. 다른 조합도 가능하다.
2.
본 발명에 따른 일반적인 방법
워크플로를 보다 자세히 설명하기 위해 다음 워크플로는 첫 번째 적용 변형에서 제한된. 잘 훈련된 사람은 예시적인 워크플로를 다른 적용에 쉽게 적용할 수 있다. 방법 단계는 도 3의 순서도에 도시되어 있다.
단계 1: 분석 물질-특이적 또는 표적-특이적 프로브 세트 적용. 표적 핵산 서열은 표적 핵산에 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성된 프로브 세트와 함께 인큐베이션된다. 이러한 실시예에서, 각각 표적 핵산 서열(S1 내지 S5)의 개별 하위서열에 상보적인 서열 요소를 포함하는 5개의 상이한 프로브의 프로브 세트가 도시되어 있다. 이러한 실시예에서, 영역은 겹치지 않는다. 동일한 핵산 서열을 표적화하는 각각의 올리고뉴클레오티드는 각각 식별자 요소 또는 고유한 식별자 서열(T)을 포함한다.
단계 2: 프로브 세트의 혼성화. 프로브 세트는 특정 혼성화를 허용하는 조건 하에 표적 핵산 서열에 혼성화된다. 인큐베이션 후, 프로브들은 해당 표적 서열에 혼성화되고 다음 단계를 위한 식별자 요소(T)를 제공한다.
단계 3: 결합되지 않은 프로브 제거. 혼성화 후, 결합되지 않은 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 세척 단계로 제거된다.
단계 4: 디코딩 올리고뉴클레오티드 적용. 적어도 2개의 서열 요소 (t) 및 (c)로 구성된 디코딩 올리고뉴클레오티드가 적용된다. 서열 요소(t)가 고유 식별자 서열(T)에 상보적인 반면, 서열 요소(c)는 신호 올리고뉴클레오티드(번역기 요소)의 후속 혼성화를 위한 영역을 제공한다.
단계 5: 디코딩 올리고뉴클레오티드의 혼성화. 디코딩 올리고뉴클레오티드는 이들의 상보적인 첫 번째 서열 요소(t)를 통해 프로브(T)의 고유한 식별자 서열과 혼성화된다. 인큐베이션 후, 디코딩 올리고뉴클레오티드는 후속 혼성화 단계를 위해 번역기 서열 요소(c)를 제공한다.
단계 6: 과량의 디코딩 올리고뉴클레오티드 제거. 혼성화 후, 결합되지 않은 디코딩 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 세척 단계로 제거된다.
단계 7: 신호 올리고뉴클레오티드 적용. 신호 올리고뉴클레오티드가 적용된다. 신호 올리고뉴클레오티드는 번역기 서열 요소(c)에 본질적으로 상보적인 적어도 하나의 제2 커넥터 요소(C) 및 검출 가능한 신호(F)를 제공하는 적어도 하나의 신호 요소를 포함한다.
단계 8: 신호 올리고뉴클레오티드의 혼성화. 신호 올리고뉴클레오티드는 상보적 서열 커넥터 요소(C)를 통해 디코딩 올리고뉴클레오티드의 번역기 요소(c)에 혼성화된다. 인큐베이션 후, 신호 올리고뉴클레오티드는 상응하는 디코딩 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고 검출될 수 있는 신호(F)를 제공한다.
단계 9: 과도한 신호 올리고뉴클레오티드 제거. 혼성화 후, 결합되지 않은 신호 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 세척 단계로 제고된다.
단계 10: 신호 검출. 신호 올리고뉴클레오티드에 의해 제공된 신호가 검출된다.
마지막 검출 라운드에는 다음 단계(단계 11 및 단계 12)가 필요하지 않다.
단계 11: 선택적 변성. 디코딩 올리고뉴클레오티드의 고유 식별자 서열(T)과 첫 번째 서열 요소(t) 간의 혼성화는 용해된다. 불안정화는, 예를 들어, 온도 상승, 변성제 등과 같이 숙련된 사람에게 잘 알려진 다양한 메커니즘을 통해 달성할 수 있다. 표적- 또는 분석 물질-특이적 프로브들은 이 단계의 영향을 받지 않는다.
단계 12: 변성 디코딩 올리고뉴클레오티드 제거. 변성된 디코딩 올리고뉴클레오티드 및 신호 올리고뉴클레오티드는 제거(예를 들면, 세척 단계에 의해)되어 다음 라운드의 혼성화 및 검출(단계 4에서 단계 10까지)에 재사용할 수 있는 자유 고유 식별자 서열이 있는 특이적 프로브 세트들을 남긴다. 이 검출 주기(단계 4에서 단계 12까지)는 계획된 인코딩 체계가 완료될 때까지 'n'번 반복된다.
매번의 검출 라운드에서 특정 고유 식별자가 제공하는 신호 유형은 특정 디코딩 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제어된다. 그 결과, 검출 주기에 적용된 디코딩 올리고뉴클레오티드의 서열은 프로브 세트의 결합 특이성을 고유한 신호 서열로 전사한다.
3.
디코딩- 및 신호 올리고뉴클레오티드 적용을 위한 선택적 옵션
올리고뉴클레오티드 혼성화를 디코딩하는 단계(단계 4 내지 단계 6) 및 신호 올리고뉴클레오티드 혼성화(단계 7 내지 단계 9)는 도 4에 도시된 바와 같이 두 가지 대안적인 방식으로 결합될 수도 있다.
옵션 1: 동시 혼성화. 도 3의 단계 4 내지 단계 9 대신에, 디코딩 올리고뉴클레오티드 및 신호 올리고뉴클레오티드의 특이적 혼성화도 동시에 수행될 수 있으며, 이로 인해 과잉 디코딩 및 신호 올리고뉴클레오티드를 제거한 후, 도 3의 단계 9에 나타낸 것과 동일한 결과를 유도한다.
옵션 2: 사전 인큐베이션. 도 3의 옵션 1에 추가로, 디코딩 및 신호 올리고뉴클레오티드는 이미 결합된 특이적 프로브 세트와 함께 표적 핵산에 적용되기 전에 별도의 반응에서 사전 인큐베이션될 수 있다.
4.
2개의 상이한 신호 유형 및 3개의 검출 라운드에 의한 3개의 상이한 핵산 서열의 신호 인코딩의 예
도 3은 올리고뉴클레오티드를 디코딩함으로써 매개되는 특정 신호의 생성 및 검출의 일반적인 개념을 보여준다. 이러한 절차로 얻을 수 있는 인코딩의 일반적인 개념을 보여주지 않는다. 인코딩 체계의 생성을 위해 도 3에 나타낸 프로세스의 사용을 설명하기 위해 도 5는 세 가지 다른 핵산 서열을 사용한 다중 라운드 인코딩 실험의 일반적인 예를 보여준다. 본 실시예에서, 인코딩 체계에는 오류 검출이 포함된다.
단계 1: 표적 핵산. 본 실시예에서, 3개의 다른 표적 핵산 (A), (B), 및 (C)는 2개의 다른 유형의 신호만을 사용하여 검출 및 분화되어야 한다. 실험을 시작하기 전에 특정 인코딩 체계가 설정된다. 본 실시예에서, 3개의 상이한 핵산 서열은 2개의 상이한 신호 (1) 및 (2) 및 오류 검출을 허용하기 위해 2인 결과적인 해밍 거리로 3 라운드의 검출에 의해 인코딩된다. 계획된 코드 단어는 다음과 같다:
서열 A: (1) - (2) - (2);
서열 B: (1) - (1) - (1);
서열 C: (2) - (1) - (2).
단계 2: 프로브 세트들의 혼성화. 각각의 표적 핵산에 대해, 원하는 해당 핵산 서열에 특이적으로 혼성화하는 고유한 프로브 세트가 적용된다. 각 프로브 세트는 고유한 식별자 서열 (T1), (T2), 또는 (T3)을 제공한다. 이렇게 하면 각각의 다른 표적 핵산이 고유하게 표지된다. 본 실시예에서, 서열 (T)는 (T1)로, 서열 (B)는 (T2)로, 서열 (C)는 (T3)으로 표지된다. 그림은 도 3의 단계 1 내지 단계 3을 요약한 것이다.
단계 3: 디코딩 올리고뉴클레오티드의 혼성화. 존재하는 각각의 고유 식별자에 대해, 특정 디코딩 올리고뉴클레오티드가 첫 번째 서열 요소에 의해 해당 고유 식별자 서열에 특이적으로 혼성화되도록 적용된다(여기서 (t1)이 (T1)에, (t2)가 (T2)에, 그리고 (t3)이 (T3)에). 각각의 디코딩 올리고뉴클레오티드는 신호 올리고뉴클레오티드의 혼성화 후에 생성될 신호를 정의하는 번역기 요소를 제공한다. 여기서 핵산 서열 (A) 및 (B)는 번역기 요소 (c1)로 표지되고, 서열 (C)는 (c2)로 표지된다. 그림은 도 3의 단계 4 내지 단계 6을 요약한 것이다.
단계 4: 신호 올리고뉴클레오티드의 혼성화. 각 유형의 번역기 요소에 대해 다른 신호 올리고뉴클레오티드의 신호와 구별되는 특정 신호(2)를 갖는 신호 올리고뉴클레오티드가 적용된다. 이 신호 올리고뉴클레오티드는 해당 번역기 요소에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 그림은 도 3의 단계 7 내지 단계 9를 요약한 것이다.
단계 5: 인코딩 체계에 대한 신호 검출. 다른 신호가 검출된다. 본 실시예에서 핵산 서열 (C)는 그것이 제공하는 고유한 신호 (2)에 의해 다른 서열과 구별될 수 있는 반면, 서열 (A)와 서열 (B)는 동일한 종류의 신호 (1)을 제공하며 첫 번째 검출 주기 후에 구별된다. 이것은 검출될 상이한 핵산 서열의 수가 이용 가능한 상이한 신호의 수를 초과한다는 사실 때문이다. 그림은 도 3의 단계 10에 해당한다.
단계 6: 선택적 변성. 검출될 모든 핵산 서열의 디코딩(및 신호) 올리고뉴클레오티드는 도 3의 단계 11 및 12에 기재된 바와 같이 선택적으로 변성되고 제거된다. 그 후에 다른 프로브 세트들의 고유한 식별자 서열을 다음 라운드의 혼성화 및 검출에 사용할 수 있다.
단계 7: 검출의 두 번째 라운드. 다음 라운드의 혼성화 및 검출은 단계 3 내지 단계 5에 설명한 대로 수행된다. 이 새로운 라운드에서는 다른 디코딩 올리고뉴클레오티드의 혼합이 변경된다. 예를 들어, 첫 번째 라운드에서 사용된 핵산 서열(A)의 디코딩 올리고뉴클레오티드는 서열 요소(t1) 및 (c1)로 구성되는 반면 새로운 디코딩 올리고뉴클레오티드는 서열 요소(t1) 및 (c2)로 구성된다. 이제 첫 번째 및 두 번째 라운드 신호의 고유한 조합으로 인해 세 가지 서열을 모두 명확하게 구분할 수 있다.
단계 8: 검출의 세 번째 라운드. 다시 말하지만, 디코딩 올리고뉴클레오티드의 새로운 조합이 사용되어 새로운 신호 조합이 생성된다. 신호 검출 후, 3개의 상이한 핵산 서열에 대한 결과적인 코드 워드는 고유하고 따라서 구별 가능할 뿐만 아니라 다른 코드 워드에 대해 2인 해밍 거리를 포함한다. 해밍 거리로 인해 신호 검출 오류(신호 교환)로 인해 유효한 코드 워드가 생성되지 않아 검출될 수 있다. 이러한 방식으로, 3가지 다른 핵산을 2가지 다른 신호로 3번의 검출 라운드에서 구별할 수 있어 오류 검출이 가능한다.
5.
선행 기술에 비한 장점
코딩 전략
최신 방법과 비교하여, 본 발명에 따른 방법의 한 가지 특별한 이점은 표적 특이적 프로브와 신호 올리고뉴클레오티드 사이의 의존성을 깨뜨리는 올리고뉴클레오티드를 디코딩하는 것을 사용한다는 것이다.
표적 특이적 프로브와 신호 생성을 분리하지 않으면 두 개의 다른 분자 태그를 사용하는 경우 특정 표적에 대해서만 두 개의 다른 신호가 생성될 수 있다. 이러한 분자 태그들 각각은 한 번만 사용할 수 있다. 동일한 분자 태그의 다중 판독은 대상에 대한 정보를 증가시키지 않는다. 인코딩 체계를 생성하려면 각 라운드 후에 표적 특이적 프로브 세트를 변경해야 하거나(SeqFISH) 동일한 프로브 세트에 여러 분자 태그(예를 들어, merFISH, intronSeqFISH)가 있어야 한다.
본 발명에 따른 방법에 따라, 동일한 고유 식별자(분자 태그) 및 소수의 상이한, 대부분 비용 집약적 신호 올리고뉴클레오티드를 재사용하는 상이한 디코딩 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 상이한 신호가 달성된다. 이것은 다른 방법과 대조적으로 몇 가지 이점을 제공한다.
(1)
인코딩 체계는 선행 기술의 다른 방법의 경우와 같이 표적 특이적 프로브 세트에 의해 한정되지 않는다. 여기에서 인코딩 체계는 디코딩 올리고뉴클레오티드에 의해 전사된다. 이것은 라운드 수와 코드워드에 대한 신호 선택의 자유와 관련하여 훨씬 더 높은 유연성을 가져온다. 선행 기술의 방법을 살펴보면(예를 들어, merFISH 또는 intronSeqFISH), 모든 표적 서열에 대한 인코딩 체계(검출 가능한 신호의 수, 유형 및 서열)는 특이적 프로브 세트들에 서로 다른 태그 서열이 존재하는 것(merFISH의 경우 프로브 세트당 서로 다른 태그 16개 중 4개 및 인트론 FISH의 경우 서로 다른 태그 60개 중 5개)에 의해 사전에 정의된다. 프로브 세트 당 충분한 수의 상이한 태그를 생성하기 위해, 방법은 하나의 표적 특이적 올리고뉴클레오티드에 존재하는 여러 태그가 있는 다소 복잡한 올리고뉴클레오티드 디자인을 사용한다. 특정 표적 핵산에 대한 인코딩 체계를 변경하려면 특이적 프로브 세트를 교체해야 한다. 본 발명에 따른 방법은 새로운 정보를 생성하기 위해 매번의 검출 라운드에서 재사용될 수 있기 때문에 분석 물질 당 단일 고유 태그 서열(고유 식별자)의 사용을 기재한다. 인코딩 체계는 검출 라운드에 사용된 올리고뉴클레오티드를 디코딩하는 순서로 정의된다. 따라서 인코딩 체계는 특이적 프로브(또는 고유한 태그 서열)에 의해 사전에 정의되지 않지만 실험 중에도 다양한 요구에 맞게 조정할 수 있다. 이것은 단순히 검출 라운드에 사용된 디코딩 올리고뉴클레오티드를 변경하거나 추가 검출 라운드를 추가함으로써 달성된다.
(2)
상이한 신호 올리고뉴클레오티드의 수는 선행 기술의 방법과 함께 상이한 태그 서열의 수(merFISH의 경우 16개 및 intronSeqFISH의 경우 60개)와 일치해야 한다. 본 발명에 따른 방법을 사용하여, 상이한 신호 올리고뉴클레오티드의 수는 사용된 상이한 신호의 수와 일치한다. 이로 인해 신호 올리고뉴클레오티드의 수는 여기에 설명된 방법에 대해 일정하게 유지되고 서로 다른 신호의 수를 결코 초과하지 않지만 선행 기술의 방법에서 인코딩 체계의 복잡성에 따라 증가한다(더 많은 검출은 더 많은 다른 신호 올리고뉴클레오티드가 필요함). 결과적으로, 여기에 설명된 방법은 훨씬 더 낮은 복잡성(신호 올리고뉴클레오티드와 환경 또는 서로 간의 의도하지 않은 상호 작용)을 유도하고 주요 비용 요소가 신호 올리고뉴클레오티드이기 때문에 분석 비용을 크게 줄인다.
(3)
종래 기술의 방법에서, 표적 특이적 프로브 세트에 의해 생성된 상이한 신호의 수는 프로브 세트가 제공할 수 있는 상이한 태그 서열의 수에 의해 제한된다. 각각의 추가 태그 서열은 표적 특이적 프로브의 전체 크기를 증가시키기 때문에 단일 프로브가 제공할 수 있는 서로 다른 태그의 수에는 제한이 있다. 이러한 제한은 여러 문제(의도하지 않은 분자 간 및 분자 내 상호작용, 비용, 확산 속도, 안정성, 합성 중 오류 등)의 크기 의존적 증가에 의해 주어진다. 또한 특정 분석 물질에 적용할 수 있는 표적 특이적 프로브의 총 수에는 제한이 있다. 핵산의 경우, 이러한 제한은 표적 서열의 길이와 적절한 결합 부위의 비율에 의해 주어진다. 이러한 요인으로 인해 프로브 세트가 제공할 수 있는 다양한 신호(merFISH의 경우 4개 신호 및 intronSeqFISH의 경우 5개 신호)의 수에 심각한 제한이 있다. 이러한 제한은 특정 수의 검출 라운드로 생성할 수 있는 서로 다른 코드 단어의 수에 실질적으로 영향을 준다. 본 발명의 접근 방식에서는 단 하나의 태그만 필요하고 매번의 검출 라운드에서 자유롭게 재사용될 수 있다. 이것은 낮은 올리고뉴클레오티드 복잡성/길이와 동시에 가능한 최대 인코딩 효율(색상 수라운드 수)로 이어진다. 다른 방법과 비교하여 본 방법의 코딩 능력의 큰 차이는 도 1과 5에 나타나 있다. 본 발명의 접근 방식으로 인해 동일한 양의 정보를 생성하기 위해 훨씬 더 적은 수의 검출 라운드가 필요하다. 더 적은 수의 검출 라운드는 더 낮은 비용, 더 낮은 실험 시간, 더 낮은 복잡성, 더 높은 안정성 및 성공률, 더 적은 양의 수집 및 분석할 데이터 및 더 높은 결과 정확도와 연결된다.
코딩 능력
하기 표 1에서 비교한 세 가지 방법 모두 서로 다른 검출 라운드 간에 변성되지 않은 특이적 프로브 세트들을 사용한다. intronSeqFISH의 경우 한 코딩 라운드의 의사 색상을 생성하는 데 필요한 4개의 검출 라운드가 있으므로 데이터는 라운드 4, 8, 12, 16, 및 20에 대해서만 제공된다. merFISH 방식은 4개의 일정한 수의 신호를 사용하므로 데이터는 가능한 가장 적은 수의 라운드로 시작한다. 8번의 검출 라운드 후 본 방법은 20번의 merFISH로 도달한 최대 코딩 능력(별표 1개로 표시됨)을 초과하고 12번의 검출 라운드 후 intron FISH의 최대 코딩 능력이 초과되었다(별표 2개로 표시됨). 본 발명에 따른 방법의 경우 3개의 다른 신호의 사용을 가정한다(intronSeqFISH에서와 같이).
[표 1]
도 6에 나타나 있는 것과 같이, merFISH에 대한 코드워드의 수는 검출 주기의 수에 따라 기하급수적으로 증가하지 않지만 각 라운드가 추가될 때마다 효율이 떨어진다. 대조적으로, 본 발명에 따른 방법에서 intronSeqFISH에 대한 코드워드의 수는 기하급수적으로 증가한다. 제안된 방법의 곡선 기울기는 intron FISH보다 훨씬 높기 때문에 20번의 탐지 라운드 후에 사용할 수 있는 코드 워드가 10,000배 이상 더 많다.
코딩 능력의 최대 효율은 seqFISH의 경우에도 도달하며, 여기서 특이적 프로브들은 매번의 검출 라운드 후에 변성되고 새 프로브 세트는 각 검출 라운드의 표적 서열에 특이적으로 혼성화된다. 그러나 이 방법은 인코딩 체계(다른 모든 방법)에 대해 하나의 특이적 혼성화만 사용하는 기술에 대한 주요 단점이 있다:
(1)
특이적 프로브의 효율적인 변성을 위해서는 다소 조악한 조건(고온, 높은 농도의 변성제, 긴 배양 시간)을 사용해야 하므로 분석 물질의 손실 또는 손상 가능성이 훨씬 높아진다.
(2)
각 라운드의 검출에 대해 모든 표적 핵산 서열에 대해 자체 프로브 세트를 사용해야 한다. 따라서 실험에 필요한 특이적 프로브의 수는 인코딩 체계에 필요한 서로 다른 신호의 수에 따라 달라진다. 이것은 분석의 복잡성과 비용을 크게 증가시킨다.
(3)
모든 표적 핵산 분자의 혼성화 효율은 일부 확률적 효과의 영향을 받기 때문에 다른 검출 라운드 사이의 신호 강도 변동은 하나의 특정 혼성화 이벤트만 사용하는 방법보다 훨씬 더 높아 완전한 코드의 비율이 감소한다.
(4)
특정 혼성화에 필요한 시간은 신호 올리고뉴클레오티드 또는 디코딩 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 있어서(intronSeqFISH, merFISH 및 seqFISH 간행물의 방법 부분에서 볼 수 있음)보다 훨씬 더 길어 실험을 완료하는 데 필요한 시간이 크게 늘어난다.
이러한 이유 때문에 다른 모든 방법은 단일 특이적 혼성화 이벤트를 사용하고 더 낮은 코드 복잡성의 주요 단점을 수용하므로 더 많은 검출 라운드와 더 높은 올리고뉴클레오티드 설계 복잡성이 필요하다.
본 발명에 따른 방법은 seqFISH의 장점(주로 인코딩 체계와 관련한 완전한 자유)과 단 하나의 특정 혼성화 이벤트를 사용하는 방법의 모든 장점을 결합하면서 이러한 방법의 주요 문제를 제거한다.
20 라운드 후에 생성된 많은 수의 코드 워드는 다른 코드워드 사이에 더 높은 해밍 거리(차이)를 도입하는 데 사용될 수 있으므로 1, 2 또는 그 이상의 오류 검출 및 오류 수정까지 가능하다. 따라서 매우 높은 코딩 능력도 여전히 실질적으로 관련이 있다.
6.
선택적 변성, 올리고뉴클레오티드 조립 및 고유 식별자 재사용이 놀랍도록 효율적임
본 발명에 따른 방법의 핵심 요소는 올리고뉴클레오티드 결합, 신호 올리고뉴클레오티드 결합, 신호 검출 및 선택적 변성을 디코딩하는 연속적인 과정이다. 인코딩 체계를 생성하려면 이 과정을 여러 번 반복해야 한다(코드 워드의 길이에 따라 다름). 동일한 고유 식별자가 매번의 검출 주기에서 재사용되기 때문에 첫 번째 검출 주기부터 마지막 검출 주기까지의 모든 이벤트는 서로 종속된다. 또한 선택적 변성은 두 가지 다른 이벤트에 따라 달라지며: 디코딩 올리고뉴클레오티드는 고유한 식별자에서 최고의 효율로 용해되어야 하지만 특이적 프로브들은 최고의 효율로 혼성화된 상태를 유지해야 한다.
이로 인해 전체 인코딩 프로세스의 효율 E는 하기 식으로 설명될 수 있다:
이러한 식을 기반으로 각 단일 단계의 효율은 방법의 소정의 총 효율에 대해 추정할 수 있다. 계산은 각 프로세스가 동일한 효율을 갖는다는 가정을 기반으로 한다. 총 효율은 존재하는 총 신호들 중 성공적으로 디코딩 가능한 신호의 부분을 설명한다.
이 방법의 총 효율은 상기 식으로 설명된 여러 요인의 각 단일 단계의 효율에 따라 달라진다. 균등하게 분포된 효율을 가정하면 도 7과 같이 단일 단계 효율에 대해 전체 효율을 표시할 수 있다. 알 수 있는 바와 같이, 5개의 검출 주기를 갖는 인코딩 체계에 대해 실질적으로 관련된 총 효율은 90%를 분명히 넘는 단일 단계 효율로만 달성할 수 있다. 예를 들어, 50%의 총 효율을 달성하려면 각 단일 단계 내에서 97.8%의 평균 효율이 필요하다. 이 계산은 신호 검출 및 분석 효율을 100%로 가정한 것에 기초한 것이다. 다양한 서열의 올리고뉴클레오티드의 넓은 DNA 용융 곡선으로 인해, 본 발명자들은 실험 이전에 선택적 변성이 디코딩 올리고뉴클레오티드의 변성에 덜 효율적이고 서열 특이적 결합 프로브들이 충분히 안정적이지 않다고 가정한다. 이 가정과 대조적으로, 우리는 선택적 변성 동안 모든 단계의 놀라운 효과와 서열 특이적 프로브의 높은 안정성을 발견했다.
실험적으로, 본 발명자들은 5개의 검출 주기를 기준으로 약 30% 내지 65%의 총 디코딩 효율을 달성하였다. 위에 주어진 공식에 의해 각 단일 단계(Bsp, Bde, Bsi, Ede, Ssp)의 효율을 계산하면 약 94.4% 내지 98%의 평균 효율을 나타냈다. 이러한 높은 효율은 매우 놀랍고, 이 분야에서 잘 훈련된 사람이 쉽게 예상할 수 없다.
7.
실험 데이터
배경
실험은 단일 분자 분해능과 병행하여 10 내지 50개의 서로 다른 mRNA 종의 특이적 검출을 보여준다. 5개의 검출 주기, 3개의 서로 다른 형광 신호, 신호 간격이 없는 인코딩 체계 및 2인 해밍 거리(오류 검출)를 기반으로 한다. 실험은 본 발명에 따른 방법의 가능 및 기능을 증명한다.
올리고뉴클레오티드 및 이들의 서열
실험에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드 서열(표적 특이적 프로브, 디코딩 올리고뉴클레오티드, 신호 올리고뉴클레오티드)은 부록의 서열 목록에 나열되어 있다.신호 올리고뉴클레오티드 R:ST05*O_Atto594는 biomers.net GmbH에서 주문했다. 다른 모든 올리고뉴클레오티드는 Integrated DNA Technologies에서 주문했다. 올리고뉴클레오티드를 물에 용해시켰다. 스톡 용액(100 μM)을 -20℃로 보관하였다.
실험 개요
50개의 다른 표적 특이적 프로브 세트들은 5개의 그룹으로 나누어진다. 검출할 전사체의 이름과 표적 특이적 프로브 세트의 이름은 동일하다(www.ensemble.org의 전사체 변종 이름). "새로운"이라는 용어는 수정된 프로브 디자인을 나타낸다. 프로브 세트들의 모든 올리고뉴클레오티드 서열은 서열 목록에서 찾을 수 있다. 표에는 프로브 세트의 고유 식별자 이름과 다양한 검출 주기에 사용된 디코딩 올리고뉴클레오티드의 이름이 나열되어 있다. 결과 코드는 5개의 검출 주기 동안 생성된 형광 신호의 서열을 보여준다(G(reen)=Alexa Fluor 488, O(range)= Atto 594, Y(ellow)= Alexa Fluor 546).
[표 2]
실험 변형
실험 변형 일부를 수행하였다. 실험 1 내지 실험 4는 주로 동시에 검출된 전사체의 수가 다르다. 표적 특이적 프로브 세트들로 나열된 그룹은 표 6을 참조한다. 실험 5 내지 실험 8은 디코딩된 신호와 비교하기 위한 단일 라운드, 단일 표적 제어이다.
[표 3]
실험 세부 정보
A.
세포 시딩 및 배양
HeLa 세포는 HeLa 세포 배양 배지에서 거의 100% 컨플루언스가 될 때까지 성장시켰다. HeLa 세포 배양 배지는 10% FCS(Biochrom, Cat.: S0415), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Sigma-Adrich, Cat.: P0781) 및 1% MEM 비-필수 아미노산 용액(Thermo Fisher, Cat.: 11140035)이 포함된 DMEM(Thermo Fisher, Cat.: 31885)을 포함한다. 세포 배양 배지를 흡인 제거한 후, PBS(pH 7,4 수 중의 1,424 g/l Na2HPO4*2H2O, 0,276 g/l, NaH2PO4*2H2O, 8,19 g/l NaCl)에 의한 세척 단계 후 트립신 EDTA 용액(Sigma-Aldrich, Cat.: T3924)과 함께 37℃에서 5분 동안 배양하여 세포를 트립신 처리했다. 그런 다음 세포를 μ-Slide 8 Well ibidiTreat(Ibidi, Cat.: 80826)의 웰에 시딩했다. 웰 당 세포 수는 세포 부착 후 약 50% 컨플루언스에 도달하도록 조정하였다. 세포를 웰 당 200 μl의 HeLa 세포 배양 배지와 함께 밤새 인큐베이션하였다.
B.
세포 고정
세포 배양 배지의 흡인 제거 및 웰 당 200 μl의 37℃ 따뜻한 PBS에 의한 2회 세척 단계 후, 세포를 -20℃에서 10분 동안 200 μl의 미리 냉각된 메탄올(-20℃, Roth, Cat.: 0082.1)로 고정하였다.
C.
수단 블랙을 사용한 대조염색
메탄올을 흡인 제거하고, 70% 에탄올에 희석한 0.2% 수단 블랙 용액 150 μl를 각 웰에 첨가하였다. 웰은 실온의 암실에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 세포를 웰 당 400 μl의 70% 에탄올로 3회 세척하여 과잉의 수단 블랙 용액을 제거하였다.
D.
분석 물질/표적 특이적 프로브의 혼성화
혼성화 전에 세포를 200 μl sm-세척-완충액으로 평형화시켰다.sm-세척-완충액은 30 mM Na3시크레이트, 300 mM NaCl, pH7, 10% 포름아미드(Roth, Cat.:P040.1) 및 5 mM 리보뉴클레오사이드 바나딜 복합체(Ribonucleoside Vanadyl Complex)(NEB, Cat.: S1402S)를 포함한다. 각 표적-특이적 프로브 세트에 대해, 100 μM 올리고뉴클레오티드 스톡 용액 1 μl를 혼합물에 첨가했다. 올리고뉴클레오티드 스톡 용액은 상응하는 표적 특이적 프로브 세트의 모든 표적 특이적 올리고뉴클레오티드의 등몰량을 포함한다. 혼합물의 총 부피는 물로 100 μl로 조정하고 100 μl의 2x 농축된 혼성화 완충 용액과 혼합하였다. 2x 농축된 혼성화 완충액은 120 mM Na3시트레이트, 1200 mM NaCl, pH7, 20% 포름아미드 및 20 mM 리보뉴클레오사이드 바나딜 복합체를 포함한다. 수득된 200 μl 혼성화 혼합물을 상응하는 웰에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 37℃에서 표적 프로브 세척 완충액으로 10분 동안 웰 당 200 μl로 3회 세척하였다. 표적 프로브 세척 완충액은 30 mM Na3시트레이트, 300 mM NaCl, pH7, 20% 포름아미드 및 5 mM 리보뉴클레오사이드 바나딜 복합체를 포함한다.
E.
디코딩 올리고뉴클레오티드의 혼성화
혼성화 전에 세포를 200 μl sm-세척-완충액으로 평형화시켰다. 각 디코딩 올리고뉴클레오티드에 있어서, 5 μM 스톡 용액 1.5 μl를 혼합물에 첨가했다. 혼합물의 총 부피는 물로 75 μl로 조정하고 75 μl의 2x 농축된 혼성화 완충액과 혼합하였다. 수득된 150 μl 디코딩 올리고뉴클레오티드 혼성화 혼합물을 상응하는 웰에 첨가하고 실온에서 45분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 실온에서 sm-세척-완충액으로 2분 동안 웰 당 200 μl로 3회 세척하였다.
F.
신호 올리고뉴클레오티드의 혼성화
혼성화 전에 세포를 200 μl sm-세척-완충액으로 평형화시켰다. 신호 올리고뉴클레오티드 혼성화 혼합물은 실험 1 내지 실험 4의 모든 라운드에 대해 동일했으며, 1x 농축된 혼성화 완충 용액에 0.3 μM의 각 신호 올리고뉴클레오티드를 포함했다(표 A3 참조). 각 라운드에서 이 용액 150 μl를 웰 당 첨가하고 45분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 절차는 각 신호 올리고뉴클레오티드의 최종 농도가 0.15 μM인 것을 제외하고는 실험 5 내지 실험 8에서 동일했다. 그 후 세포를 실온에서 sm-세척-완충액으로 2분 동안 웰 당 200 μl로 3회 세척하였다.
G.
형광 및 백색광 이미징
세포는 실온에서 웰 당 200 μl의 이미징 완충액으로 한 번 세척하였다. 트롤록스(Trolox)가 없는 실험에서(표 7, 마지막 열 참조), 이미징 완충액은 30 mM Na3시트레이트, 300 mM NaCl, pH 7 및 5 mM 리보뉴클레오사이드 바나딜 복합체를 포함한다. 트롤록스를 사용한 실험에서, 이미징 완충액에는 10% VectaCell Trolox Antifade Reagent(Vector labs, Cat.: CB-1000)가 추가로 포함되어 최종 트롤록스 농도가 10 mM이 된다.
1.4의 개구수를 갖는 63x 액침 오일 대물렌즈(Zeiss, apochromat), pco.edge 4.2 CMOS 카메라(PCO AG) 및 LED 광원(Zeiss, colibri 7)이 있는 Zeiss Axiovert 200M 현미경은 영역의 이미징을 위해 사용하였다. 필터 세트들과 LED-파장은 사용된 형광단의 다른 최적값으로 조정하였다. 이미지 당 조명 시간은 Alexa Fluor 546 및 Atto 594의 경우 1000 ms, Alexa Fluor 488의 경우 400 ms였다.
각 실험에서, 이미징을 위해 3개의 영역이 무작위로 선택되었다. 각 영역에 대해, 350 nm의 z-스텝 크기로 32개 이미지의 z-스택이 검출되었다. 또한 해당 영역에서 하나의 백색광 이미지를 촬영했다. 하나 초과의 검출 주기가 있는 실험에서, 첫 번째 검출 라운드 영역이 다시 발견되어 후속하는 매번의 라운드에서 이미지화하였다.
H.
선택적 변성
선택적 변성을 위해 모든 웰은 42℃에서 6분 동안 200 μl의 sm-세척-완충액과 함께 배양했다. 이 절차를 6회 반복했다.
실험 1 내지 실험 4에서 단계 (E)에서 단계 (H)까지를 5회 반복하였다. 5번째 검출 주기에서는 단계 (H)를 생략했다.
I.
분석
맞춤형 ImageJ 플러그인을 기반으로, 원시 데이터의 반자동 분석을 수행하여 특정 형광 신호를 배경과 구별했다. 3개의 모든 형광 채널의 수득된 3D-포인트 클라우드는 맞춤형 VBA 스크립트를 사용하여 인실리코(in silico)로 결합하였다. 5개 검출 주기의 수득된 결합 3D-포인트 클라우드는 VBA 스크립트를 기반으로 서로 정렬하였다. 수득된 정렬은 검출된 각 고유 신호에 대한 코드 단어를 나타낸다. 성공적으로 디코딩된 신호는 맞춤형 VBA-스크립트 및 ImageJ-플러그인을 기반으로 하는 실험의 양적 및 공간적 분석에 사용되었다.
결과
1.
디코딩된 신호의 절대 수
모든 전사체에 대해 성공적으로 디코딩된 신호의 절대 수는 하기 표 4에 각 실험의 각 영역에 대해 나열되어 있다. 요약하면, 올바른 코드의 합은 해당 실험에서 검출할 수 있는 전사체에 할당된 디코딩된 신호의 총 수를 나타내는 반면 잘못된 코드의 합은 해당 실험에서 검출할 수 없는 디코딩된 신호의 총 수를 나타낸다. 신호의 총 수는 성공적으로 디코딩된 신호와 성공적으로 디코딩되지 않은 신호를 포함한다.
[표 4]
표 4는 올바르게 디코딩된 신호의 수에 비해 매우 낮은 수의 잘못된 디코딩된 신호를 보여준다. 특정 전사체의 디코딩된 신호에 대한 절대값은 한 실험의 다른 영역 간에 매우 유사하다. 성공적으로 디코딩될 수 있는 총 신호 수의 비율은 27.1%에서 64.5% 사이이다. 이러한 비율은 전사체의 수 및/또는 해당 지역/실험에 존재하는 신호의 총 수에 따라 다르다.
결론
본 발명에 따른 방법에 의하면 부정확하게 할당된 코드 워드가 적은 양으로 생성되므로 특이적이라고 간주할 수 있다. 성공적으로 디코딩 가능한 신호의 비율은 영역 당 매우 많은 수의 신호와 함께 검출된 매우 많은 수의 전사체에도 불구하고 매우 높다. 할당 가능한 신호의 높은 비율과 높은 특이성으로 상기 방법은 실질적으로 유용하다.
2.
서로 다른 실험 사이의 상대적 전사체 존재비 비교
두 비교(A 및 B)에 대해 도 8에 나타낸 바와 같이, 실험 간에 검출된 전사체의 중첩이 분석에 사용된다. 각 막대는 세 영역 모두의 실험 평균의 존재비를 나타낸다. 이러한 영역 사이의 표준 편차도 나타나 있다.
3.
서로 다른 실험 사이의 상대적 전사체 존재비의 상관관계
도 9에서 볼 수 있듯이 실험 1의 전사체의 평균 상대적 존재비는 실험 3, 4 및 2의 중복 전사체의 존재비와 상관관계가 있다. 상관계수뿐만 아니라 선형회귀 공식도 각 상관관계에 대해 나타나 있다.
도 8은 한 실험의 서로 다른 영역 사이의 상대적 존재비의 낮은 변동을 나타내는 낮은 표준 편차를 보여준다. 다른 실험의 전사체 사이의 상대적 존재비의 차이도 매우 낮다. 이것은 실험 1, 2 및 3에서 검출된 그룹 1(도 8a)의 전사체를 비교한 경우이다. 실험 1, 2, 및 4 사이에 중복되는 그룹 2, 3, 및 4의 전사체를 비교하는 경우에도 마찬가지이다. 이러한 존재비의 매우 높은 상관 관계는 도 9에서도 볼 수 있다. 실험 1의 전사체의 존재비는 다른 다중 라운드 실험의 존재비와의 연관성이 매우 높다. 상관계수는 0.88 내지 0.91이고, 선형회귀의 기울기는 0.97 내지 1.05이다.
결론
전사체의 상대적인 존재비는 한 실험의 다른 영역 사이에서 뿐만 아니라 다른 실험 사이에서도 연관성이 매우 높다. 이는 도 3과 4를 비교하면 명확하게 알 수 있다. 실험 사이의 주요 차이점은 서로 다른 대상의 수와 검출된 신호의 총 수이다. 따라서, 검출된 전사체의 수와 신호의 수 및 밀도는 전사체의 수를 정확하게 정량화하는 방법의 능력을 방해하지 않는다. 매우 우수한 상관관계는 신호 수가 매우 많은 경우에도 방법의 특이성과 안정성을 추가로 지원한다.
4.
신호의 세포간 분포의 비교
도 10에는 이미지 스택의 최대 투영이 나타나 있다. A: 실험 7의 영역 1(SPOCK1을 검출하는 단일 라운드, 단일 전사체 실험), B: 실험 1에서 선택된 모든 신호의 2D-투영, SPOCK1에 할당된 영역 1, C: 실험 8의 영역 1(THRAP3을 검출하는 단일 라운드, 단일 전사체 실험), D: THRAP3에 할당된 영역 1, 실험 1에서 선택된 모든 신호의 2D-투영.
5.
신호의 세포내 분포의 비교
도 11에는 이미지 스택의 최대 투영이 나타나 있다. 해당 영역의 하위 영역이 확대되어 나타나 있다. A: 실험 8의 영역 1(THRAP3을 검출하는 단일 라운드, 단일 전사체 실험), B: 실험 1에서 선택된 모든 신호의 2D-투영, THRAP3에 할당된 영역 1, C: 실험 5의 영역 1(DDX5를 검출하는 단일 라운드, 단일 전사체 실험), D: DDX5에 할당된 영역 1, 실험 1에서 선택된 모든 신호의 2D-투영.
도 10은 서로 다른 전사체 사이의 세포간 분포의 차이가 큰 것을 보여준다. SPOCK1은 일부 세포에서는 매우 풍부한 것으로 보이지만, 다른 세포에서는 거의 존재하지 않는다(도 10a). THRAP3는 영역의 모든 세포에 걸쳐 보다 균일한 분포를 보여준다(도 10c). 이러한 공간 분포 패턴은 실험 1의 해당 전사체에 할당된 포인트 클라우드에서도 명확하게 관찰할 수 있다(도 10b 및 도 10d).
도 11은 서로 다른 전사체 사이의 세포내 분포의 차이가 큰 것을 보여준다. THRAP3은 주로 세포의 주변(세포질)에서 관찰될 수 있는 반면(도 11a), DDX5는 세포의 중심(핵)에서 더 높은 존재비를 나타낸다(도 11c). 이러한 세포내 분포는 THRAP3 및 DDX5에 할당된 실험 1의 포인트 클라우드에서도 관찰할 수 있다(도 11b 및 도 11d).
결론
정량화의 신뢰성 다음에, 다중 라운드 실험의 포인트 클라우드는 또한 전사체의 동일한 세포내 및 세포간 분포 패턴을 보여준다. 이것은 할당된 포인트 클라우드를 단 하나의 특징적인 mRNA 종만 검출하는 단일 라운드 실험의 신호와 직접 비교함으로써 명확하게 입증된다.
6.
상이한 세포 주기 의존성 전사체의 분포 패턴
도 12의 모든 이미지는 실험 1의 영역 1을 보여준다. 각 이미지에는 특정 전사체, A: CCNA2, B: CENPE, C: CCNE1, D: 모든 전사체에 할당된 포인트 클라우드가 나타나 있다. 도 12는 3개의 상이한 세포 주기 의존성 단백질의 전사체를 보여준다. CENPE(도 12b)는 동원체(Centromere) 단백질 E로도 알려져 있으며 G2 단계에서 축적된다. 그것은 방추 신장과 염색체 운동을 담당하는 것으로 알려져 있다. 간기 중에는 존재하지 않는다. CCNA2(도 12a)는 사이클린 A2로도 알려져 있다. 이는 G2에서 M-기로 전환하는 동안 CDK1과 상호작용하여 세포 주기 진행을 조절한다. 흥미롭게도 두 mRNA 종의 명백한 공존(colocalization)이 있다. 이들은 주로 영역 1의 3개의 중앙 세포에 존재한다. CCNE1(도 12c)은 사이클린 E1로도 알려져 있다. 이러한 사이클린은 CDK2와 상호작용하며 G1에서 S기로의 전환을 담당한다. 도 12는 이러한 유전자의 전사체가 세 개의 중앙 세포에 존재하지 않고 다른 세포에 상당히 균등하게 분포되어 있음을 분명히 보여준다. 따라서 다른 두 전사체에 대한 반편재화(anti-localization)를 보여준다. 해당 포인트-클라우드에 대한 데이터는 포인트 수가 매우 많고 포인트 밀도가 매우 높은 포인트 클라우드에서 유래된다(도 12d는 인상적임).
결론
도 12에 나타나 있는 세 개의 디코딩된 세포 주기 의존성 단백질의 포인트 클라우드는 이들의 상응하는 기능으로 설명할 수 있는 분포 패턴을 보여준다. 이러한 데이터는 우리의 방법이 세포 당 신호 수가 적고(도 12c), 매우 높은 신호 밀도(도 12d)에서도 생물학적 관련 데이터를 안정적으로 생성한다는 것을 강력하게 시사한다.
서열 목록
첨부된 서열 목록에서, 서열 번호 1 내지 1247은 예시적인 표적-특이적 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 나열된 올리고뉴클레오티드는 표적 특이적 결합 부위(5'-말단) 스페이서/링커 서열(gtaac 또는 tagac) 및 고유 식별자 서열로 구성되며, 이는 하나의 프로브 세트의 모든 올리고뉴클레오티드에 대해 동일하다.
첨부된 서열 목록에서, 서열 번호 1248 내지 1397은 예시적인 디코딩 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
첨부된 서열 목록에서, 서열 번호 1398 내지 1400은 예시적인 신호 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각 신호 올리고뉴클레오티드에 대해 상응하는 형광단은 두 번 존재한다. 하나의 형광단은 5'-말단에 공유 결합되어 있고, 하나의 형광단은 3'-말단에 공유 결합되어 있다. 서열 번호 1398은 이의 5' 말단에 "5Alex488N", 및 이의 3' 말단에 "3AlexF488N"을 포함한다. 서열 번호 1399는 이의 5' 말단에 "5Alex546", 및 이의 3' 말단에 3Alex546N을 포함한다. 서열 번호 1400은 이의 5' 말단 및 이의 3' 말단에 "Atto594"를 포함한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Apollo Life Sciences GmbH
<120> Method of signal encoding of analytes in a sample
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aaccttaggt cgggtataga gaggtaaccc taattatggg aatc 44
<210> 60
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 60
gaagcactta gacactgtaa ggcgtaaccc taattatggg aatc 44
<210> 61
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 61
aataatcacc ggcagtaacg ggtaacccta attatgggaa tc 42
<210> 62
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 62
aggaagaaac ctatggcaga cagtaaccct aattatggga atc 43
<210> 63
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 63
catgtgttat tacgatgttc tttgtgtaac cctaattatg ggaatc 46
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 64
actactgttt ggtacttgta tctggtaacc ctaattatgg gaatc 45
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 65
aaatcagtgg cggacagtag cgtaacccta attatgggaa tc 42
<210> 66
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 66
caggcaatgc cgactggatt gtaaccctaa ttatgggaat c 41
<210> 67
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 67
tcttatctaa gaccaactat aggtatggta accctaatta tgggaatc 48
<210> 68
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 68
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<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 69
attacaatct ttagtactca tggaaagtaa ccctaattat gggaatc 47
<210> 70
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 70
aaggtattct catgcctaga atattgtaac cctaattatg ggaatc 46
<210> 71
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 71
tggacagaca cgttgtcatt tggtaaccct aattatggga atc 43
<210> 72
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 72
ctctcattac aatgctatac atttaacgta accctaatta tgggaatc 48
<210> 73
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 73
tgcagctcgc aacggaacaa gtaacggatt ttacaacttt a 41
<210> 74
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 74
gagtccatcc ggacattgac ctgtaacgga ttttacaact tta 43
<210> 75
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 75
cttgaacggc ctcgacgagg gtaacggatt ttacaacttt a 41
<210> 76
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 76
cctcctcggt tatattggcc ccgtaacgga ttttacaact tta 43
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 77
accgagactt cgaaaatgaa cgagtaacgg attttacaac ttta 44
<210> 78
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 78
cctctggctc gaaactgaaa gggtaacgga ttttacaact tta 43
<210> 79
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 79
tgctatggac tagatctcgg caagtaacgg attttacaac ttta 44
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 80
gccttgaccg gtcagaagac ggtaacggat tttacaactt ta 42
<210> 81
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 81
taccacagag atcgcagctg cgtaacggat tttacaactt ta 42
<210> 82
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 82
accagcccga acctcgcccg taacggattt tacaacttta 40
<210> 83
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 83
actgtatgct tgccggtaat tctgtaacgg attttacaac ttta 44
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 84
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 85
caggaatccc gtcaagggtg ggtaacggat tttacaactt ta 42
<210> 86
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 87
agaaccatgg tcgaactgac ctgtaacgga ttttacaact tta 43
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 88
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 89
aagcctctgt tacgcccacg gtaacggatt ttacaacttt a 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 90
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<210> 91
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 91
cctcggaaat cccgattctg atagtaacgg attttacaac ttta 44
<210> 92
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 92
ggcccctact cggttgtggg gtaacggatt ttacaacttt a 41
<210> 93
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 93
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<210> 94
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 94
ctgggtcgtg cgaggtcctg taacggattt tacaacttta 40
<210> 95
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 95
cacggggcta ggacggggtg taacggattt tacaacttta 40
<210> 96
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 96
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<210> 97
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 97
gatcagatca gaatccgagg tggtaaccct tattcggtac ta 42
<210> 98
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 98
ggttgtactc gcgacagttg gtaaccctta ttcggtacta 40
<210> 99
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 99
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<210> 100
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 100
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<210> 101
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 101
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<210> 102
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 102
gacagagctg cacgcttggg taacccttat tcggtacta 39
<210> 103
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 103
ctgggcctgt ttgcgctcag taacccttat tcggtacta 39
<210> 104
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 104
tccttaggca tgcgcggcgt aacccttatt cggtacta 38
<210> 105
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 105
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<210> 106
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 106
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<210> 107
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 107
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<210> 108
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 108
ctttgagagc tcgaacatcg tgtaaccctt attcggtact a 41
<210> 109
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 109
ttccagtagt taaggcagag cagtaaccct tattcggtac ta 42
<210> 110
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 110
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<210> 111
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 111
acatgagtgg tttcgtagcg ggtaaccctt attcggtact a 41
<210> 112
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 112
tgccgatgac atggaactcg gtaaccctta ttcggtacta 40
<210> 113
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 113
tggtgtaatt gaccttgtag gtagtaaccc ttattcggta cta 43
<210> 114
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 114
cattggccga aagcaggctg taacccttat tcggtacta 39
<210> 115
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 115
gagacctctg ccgaaactgg gtaaccctta ttcggtacta 40
<210> 116
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 116
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<210> 117
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 117
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<210> 118
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 118
gtaacggtga aaatggaccg ggtaaccctt attcggtact a 41
<210> 119
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 119
tccctctaag ggattaatgc cagtaaccct tattcggtac ta 42
<210> 120
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 120
agttcaagta tcccgcgact agtaacaatt agagtgaaat acc 43
<210> 121
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 121
gaacgcaggc tgtttactgt tgtaacaatt agagtgaaat acc 43
<210> 122
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 122
ggtccaggta aactaatggc tggtaacaat tagagtgaaa tacc 44
<210> 123
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 123
ctctgttgag tttacctcgc aagtaacaat tagagtgaaa tacc 44
<210> 124
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 124
tacttcaact aaccagtcca cggtaacaat tagagtgaaa tacc 44
<210> 125
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 125
ccatgagaca aggcttaaga ctgtaacaat tagagtgaaa tacc 44
<210> 126
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 126
cggccaaaga atagtcgtag cgtaacaatt agagtgaaat acc 43
<210> 127
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 127
ccatttccct aaggtatgtg tgagtaacaa ttagagtgaa atacc 45
<210> 128
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 128
ctctcatact gttagtgatg tctggtaaca attagagtga aatacc 46
<210> 129
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 129
cagctttgtc ccgtgactgt gtaacaatta gagtgaaata cc 42
<210> 130
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 130
tgctgcaatg ctagcagcgg taacaattag agtgaaatac c 41
<210> 131
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 131
aagacaggaa cctatcaatg tagtgtaaca attagagtga aatacc 46
<210> 132
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 132
tagattagat tatgcccaag tcaggtaaca attagagtga aatacc 46
<210> 133
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 133
catgtaaccc actttaggtt tacagtaaca attagagtga aatacc 46
<210> 134
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 134
ccagtctttc gtattaatga ttcaggtaac aattagagtg aaatacc 47
<210> 135
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 135
tgcaacccgt ctcgtcttcg gtaacaatta gagtgaaata cc 42
<210> 136
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 136
gtgtaggtat catctgtaat gtacagtaac aattagagtg aaatacc 47
<210> 137
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 137
tcccggactt cagtaccgcg taacaattag agtgaaatac c 41
<210> 138
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 138
cgaggaggtt gcgaaaggcg taacaattag agtgaaatac c 41
<210> 139
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 139
tatacatata ctcaacactt atagagggta acaattagag tgaaatacc 49
<210> 140
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 140
gtaatagata ccataatttg tacttgggta acaattagag tgaaatacc 49
<210> 141
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 141
tgctgctgcg ctagacccgt aacaattaga gtgaaatacc 40
<210> 142
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 142
gcgtggcgag ccaaagacgt aacaattaga gtgaaatacc 40
<210> 143
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 143
tccgcggttg ttggacgggt aacaattaga gtgaaatacc 40
<210> 144
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 144
ctgtcacata cgcaaactgg tgtaacatcg ttatagctag a 41
<210> 145
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 145
tcgccatata ccggtcaaag agtaacatcg ttatagctag a 41
<210> 146
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 146
tggatggtgc aataatccga gggtaacatc gttatagcta ga 42
<210> 147
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 147
agtgctgatc ccttaagtat gtcgtaacat cgttatagct aga 43
<210> 148
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 148
acctccatta accaatccag aaggtaacat cgttatagct aga 43
<210> 149
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 149
tggtgtactt gacccactta tttgtaacat cgttatagct aga 43
<210> 150
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 150
cagaagagaa cgtggagcag ggtaacatcg ttatagctag a 41
<210> 151
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 151
tccctgtgaa gtttatagac ttcagtaaca tcgttatagc taga 44
<210> 152
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 152
tgtaaaagca aacgcacgcc gtaacatcgt tatagctaga 40
<210> 153
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 153
attcagatga cgagaaatga tacagtaaca tcgttatagc taga 44
<210> 154
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 154
tggtcacgcc atttccggcg taacatcgtt atagctaga 39
<210> 155
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 155
agcaagtata ccataaggaa attcagtaac atcgttatag ctaga 45
<210> 156
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 156
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<210> 157
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 157
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<210> 158
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 158
tattttgttc agacaacatg gctgtaacat cgttatagct aga 43
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 159
ccacttggta caacggagcc gtaacatcgt tatagctaga 40
<210> 160
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 160
cagaacacct gcgaggagag gtaacatcgt tatagctaga 40
<210> 161
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 161
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<210> 162
<211> 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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cctgcaaaaa aacggtcacg tgtaacatcg ttatagctag a 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 163
tgtgggagtc ccttaggtca agtaacatcg ttatagctag a 41
<210> 164
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 164
gcatcgggag cacgcactgt aacatcgtta tagctaga 38
<210> 165
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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ggctctgcac aacgcttgcg taacatcgtt atagctaga 39
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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agccaggaca caatagtcag ggtaacatcg ttatagctag a 41
<210> 167
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 167
agccaggaca caatagtcag ggtaacatcg ttatagctag a 41
<210> 168
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 168
ttgcacatcc tacggtcttc tgtaacttac tacggagtta ac 42
<210> 169
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 169
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<210> 170
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 170
cctttaagcg cgtcgtgtcc gtaacttact acggagttaa c 41
<210> 171
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 171
cctcgacgca tgatgccggt aacttactac ggagttaac 39
<210> 172
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 172
gccccatggc tcgtgtaggg taacttacta cggagttaac 40
<210> 173
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 173
ccaattgtgt tccggcaagt tgtaacttac tacggagtta ac 42
<210> 174
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 174
gataggattt ggtcggaaac ctgtaactta ctacggagtt aac 43
<210> 175
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 175
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<210> 176
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 176
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<210> 177
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 177
ctcgcagcga taggaaccat gtaacttact acggagttaa c 41
<210> 178
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 178
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 180
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<210> 181
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 181
tctccgctga tacccgggtg taacttacta cggagttaac 40
<210> 182
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 182
ggccagtcac cgaaatttca tgtaacttac tacggagtta ac 42
<210> 183
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 183
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 184
cacattcccg tacgtttgct ggtaacttac tacggagtta ac 42
<210> 185
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 185
agtgagtccc tatgtatcct ttctgtaact tactacggag ttaac 45
<210> 186
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 186
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 187
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 188
taaaaaatag cacgattaca gtatacgtaa cttactacgg agttaac 47
<210> 189
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 189
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<210> 190
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 190
cggtttctcg cgagagaaat agtaacttac tacggagtta ac 42
<210> 191
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 191
cttcccatct cgtgtaacat gagtaactta ctacggagtt aac 43
<210> 192
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 192
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<210> 193
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 193
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<210> 194
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 194
gaagtggaaa tacgaccttt gcgtaacttc gaaacggaaa c 41
<210> 195
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 195
gctggtccct tgcgtaacat gtaacttcga aacggaaac 39
<210> 196
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 196
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 198
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 199
<211> 42
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 199
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<210> 200
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 200
aggcaacagt cgaaccattc tgtaacttcg aaacggaaac 40
<210> 201
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 201
gcttcatttg cgactgctct tgtaacttcg aaacggaaac 40
<210> 202
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 202
catcaggacg cttgtattgg tggtaacttc gaaacggaaa c 41
<210> 203
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 203
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<210> 204
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 204
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<210> 205
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 205
gaacacctta cttacaacac ctggtaactt cgaaacggaa ac 42
<210> 206
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 206
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<210> 207
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 208
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 208
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 209
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<210> 210
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 210
acgaagaaat cgagtaggtc tagggtaact tcgaaacgga aac 43
<210> 211
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 211
gaatcattga gtcgaccctt cagtaacttc gaaacggaaa c 41
<210> 212
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 212
tgatgtgctt aagtagtgca gcgtaacttc gaaacggaaa c 41
<210> 213
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 213
tccacggcat gatacataca acgtaacttc gaaacggaaa c 41
<210> 214
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 214
tctcagagca tcccgaatcc agtaacttcg aaacggaaac 40
<210> 215
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 215
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<210> 216
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 216
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<210> 217
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 217
gagcttgtta ctcgtgcctt ggtaacctcg tcggatca 38
<210> 218
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 218
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<210> 219
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 219
caatacctat tccgttacac acttgtaacc tcgtcggatc a 41
<210> 220
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 220
gctccttcag tccggtttta ttgtaacctc gtcggatca 39
<210> 221
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 221
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<210> 222
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 222
gactgctaag gcataggaat tttcgtaacc tcgtcggatc a 41
<210> 223
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 223
caccacataa ttacggggac acgtaacctc gtcggatca 39
<210> 224
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 224
cggcaaggcc cttcgcagta acctcgtcgg atca 34
<210> 225
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 225
tccatctggt acgtggtggg gtaacctcgt cggatca 37
<210> 226
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 226
gtcctgccgc gtatgatttc tgtaacctcg tcggatca 38
<210> 227
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 227
tgttcaggct gacgactgca gtaacctcgt cggatca 37
<210> 228
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 228
gcatggaggt ccgtcctgtg taacctcgtc ggatca 36
<210> 229
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 229
ttgagggagc gtaatcccaa ggtaacctcg tcggatca 38
<210> 230
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 230
ccggcgtctg cgtacttccg taacctcgtc ggatca 36
<210> 231
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 231
cgactatctg cgtctatcat ccgtaacctc gtcggatca 39
<210> 232
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 232
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<210> 233
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 233
tggcctgtcg tccggtctgt aacctcgtcg gatca 35
<210> 234
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 234
cagggattcc gtcatatggc tgtaacctcg tcggatca 38
<210> 235
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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agacatcgat ggtacatatg ggtgtaacct cgtcggatca 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 237
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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tcttaggccc attcgttgga gtaacctcgt cggatca 37
<210> 238
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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ttatacaccg tgccgaacgc gtaacctcgt cggatca 37
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<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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atgccctttg cgatctgcac gtaacctcgt cggatca 37
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 240
ggcagaattc cgaagttcag cgtaacataa tcgtagtttc gg 42
<210> 241
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 241
gtttccttca cgacaggtgt ggtaacataa tcgtagtttc gg 42
<210> 242
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 242
ctggtagaaa tgcgactaaa gacgtaacat aatcgtagtt tcgg 44
<210> 243
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 243
tgaccagcat cgtttcatct aatgtaacat aatcgtagtt tcgg 44
<210> 244
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 244
ttcgaagttc aaccgagtga cgtaacataa tcgtagtttc gg 42
<210> 245
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 245
ccaccaatcc aatgcggaat tgtaacataa tcgtagtttc gg 42
<210> 246
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 246
agactcggtg ccattcgtat tgtaacataa tcgtagtttc gg 42
<210> 247
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 247
ataactgcta actgcgcaac cgtaacataa tcgtagtttc gg 42
<210> 248
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 248
gtagtgaggc cgcttataac cagtaacata atcgtagttt cgg 43
<210> 249
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 249
ggtgatgatt cgatggagtg aagtaacata atcgtagttt cgg 43
<210> 250
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 250
ctgctgcttt acgtttggtg cgtaacataa tcgtagtttc gg 42
<210> 251
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 251
tcatcaacca cgtctttgga tagtaacata atcgtagttt cgg 43
<210> 252
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 252
aggcagatct taaagtgttg gttgtaacat aatcgtagtt tcgg 44
<210> 253
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 253
tgagggctta tacgaaagca aggtaacata atcgtagttt cgg 43
<210> 254
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 254
gctcagtact gactttggta tgtgtaacat aatcgtagtt tcgg 44
<210> 255
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 255
cagtcaatca ttagatccac atctgtaaca taatcgtagt ttcgg 45
<210> 256
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 256
ggaagctgct cgtcgaagcg taacataatc gtagtttcgg 40
<210> 257
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 257
gagaagatac ttatagcttc ttgtctgtaa cataatcgta gtttcgg 47
<210> 258
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 258
tcaatgctat ctaactgatg aagagtaaca taatcgtagt ttcgg 45
<210> 259
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 259
atcttcccaa ttgatgtaag tacttgtaac ataatcgtag tttcgg 46
<210> 260
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 260
catcacagtc cgagacgccg taacataatc gtagtttcgg 40
<210> 261
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 261
cattccaccg gcctgtgcgg taacataatc gtagtttcgg 40
<210> 262
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 262
ggacagcact actctagagt aaggtaacat aatcgtagtt tcgg 44
<210> 263
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 263
tgccaagtaa cttagcacac ccgtaacata atcgtagttt cgg 43
<210> 264
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 264
gtgccacctt tcaccgtgag taaccggtag aattacgg 38
<210> 265
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 265
ccgcaggtac gacttgcctg taaccggtag aattacgg 38
<210> 266
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 266
tgggcttcaa tcagatggtc agtaaccggt agaattacgg 40
<210> 267
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 267
agaacaccag ggtacgcata gtgtaaccgg tagaattacg g 41
<210> 268
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 268
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<210> 269
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 269
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<210> 270
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 270
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<210> 271
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 271
ggttcagtcg tttgcgaaca gtaaccggta gaattacgg 39
<210> 272
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 272
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<210> 273
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 273
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<210> 274
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 274
ggagctgaac ttgacgccag gtaaccggta gaattacgg 39
<210> 275
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 275
taatggatgt actcgttggg cgtaaccggt agaattacgg 40
<210> 276
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 276
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<210> 277
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 277
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<210> 278
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 278
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<210> 279
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 279
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<210> 280
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 280
gaattcatca gctagattgg caagtaaccg gtagaattac gg 42
<210> 281
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 281
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<210> 282
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 282
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<210> 283
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 283
ctcaatggtg gcgcggatcg taaccggtag aattacgg 38
<210> 284
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 284
aaccactcaa tctgcgtctc ggtaaccggt agaattacgg 40
<210> 285
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 285
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 286
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 287
caaagtggct catcgccacc gtaaccggta gaattacgg 39
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 288
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<210> 289
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 289
ctatgaaact tcgtggtcac tccgtaacgc ttctcataac act 43
<210> 290
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 290
aactaactca tctgcagtac catgtaacgc ttctcataac act 43
<210> 291
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 291
aaaacctgct tgatccacat tctgtaacgc ttctcataac act 43
<210> 292
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 292
acattaacaa atcactcttg attcagtaac gcttctcata acact 45
<210> 293
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 293
ttttgcttag ctcatggtaa acagtaacgc ttctcataac act 43
<210> 294
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 294
gaggagctgt tggataaata attttgtaac gcttctcata acact 45
<210> 295
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 295
aagcaggcag gtattgtatg attgtaacgc ttctcataac act 43
<210> 296
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 296
gcaacttata tatcagtggt gaatggtaac gcttctcata acact 45
<210> 297
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 297
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<210> 298
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 298
gatcatgact ctccttatgg ttaatgtaac gcttctcata acact 45
<210> 299
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 299
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<210> 300
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 300
aataagatta gctactgtct acagtggtaa cgcttctcat aacact 46
<210> 301
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 301
taaacaaata gtgatacatc cacacgtaac gcttctcata acact 45
<210> 302
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 302
ttcagtcatc taacaatgta ttcctgtaac gcttctcata acact 45
<210> 303
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 303
agctgtggga aagtctttaa ctcgtaacgc ttctcataac act 43
<210> 304
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 304
atagatgaac tattgatgta cacaacgtaa cgcttctcat aacact 46
<210> 305
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 305
tacagatgaa attgagacct aaaacgtaac gcttctcata acact 45
<210> 306
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 306
agcaatttgg gttaacagaa atagagtaac gcttctcata acact 45
<210> 307
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 307
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<210> 308
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 308
aatgttattc cgtggaaaat tacatgtaac gcttctcata acact 45
<210> 309
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 309
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<210> 310
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 310
atcagagagg cgctatgcct gtaacgcttc tcataacact 40
<210> 311
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 311
cggcgacacg atacagcggt aacgcttctc ataacact 38
<210> 312
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 312
cacttcaaat gcgcaacaag cgtaacgtcg ctgaaaaatc 40
<210> 313
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 313
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<210> 314
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 314
gtgatgagct cgacaggata ttgtaacgtc gctgaaaaat c 41
<210> 315
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 315
atggcgtcgt cggcacacgt aacgtcgctg aaaaatc 37
<210> 316
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 316
tttacaacag cgtggcaagt ggtaacgtcg ctgaaaaatc 40
<210> 317
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 317
aggcatgaag tgagacaatg cgtaacgtcg ctgaaaaatc 40
<210> 318
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 318
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<210> 319
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 319
gctgatgatg ttcaagcgca gtaacgtcgc tgaaaaatc 39
<210> 320
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 320
ctgccagtta gttaggcaag ttgtaacgtc gctgaaaaat c 41
<210> 321
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 321
gcagctccgg gctacaagtg taacgtcgct gaaaaatc 38
<210> 322
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 322
tggcagctgt ctaactggag cgtaacgtcg ctgaaaaatc 40
<210> 323
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 323
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<210> 324
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 324
agctccacga aggatgccag taacgtcgct gaaaaatc 38
<210> 325
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 326
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 326
gtcttgagac ccggtcttgg gtaacgtcgc tgaaaaatc 39
<210> 327
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 327
agtggtctgg atcggtgcgg taacgtcgct gaaaaatc 38
<210> 328
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 328
tccattctgg gtcgagtgga gtaacgtcgc tgaaaaatc 39
<210> 329
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 329
ggaccccaag gtgttccaag gtaacgtcgc tgaaaaatc 39
<210> 330
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 331
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<210> 332
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 332
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<210> 333
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 333
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<210> 334
<211> 37
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 334
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<210> 335
<211> 37
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 335
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 336
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 401
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<210> 420
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 420
gtaaggatca ctggatccta ctgtagaccc gttataagtg ttg 43
<210> 421
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 421
gacctcattc agttgatgag aggtagaccc gttataagtg ttg 43
<210> 422
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 422
gcataacaga cggttgcaag ttagacccgt tataagtgtt g 41
<210> 423
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 423
acctaaagcg agttgctgag ttagacccgt tataagtgtt g 41
<210> 424
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 424
gagtcagaaa cacgcatgga atagacccgt tataagtgtt g 41
<210> 425
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 425
agcaactctg ataggctcac actagacccg ttataagtgt tg 42
<210> 426
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 426
ccatacccac tacggataaa gatgtagacc cgttataagt gttg 44
<210> 427
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 427
gctttctgta cgactcaggt tttagacccg ttataagtgt tg 42
<210> 428
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 428
caatgttgag ccactaaacc actagacccg ttataagtgt tg 42
<210> 429
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 429
atgcttggat taggtccaaa gctagacccg ttataagtgt tg 42
<210> 430
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 430
cccggtgatg gattagtttg gtagacccgt tataagtgtt g 41
<210> 431
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 431
ccatggccat accctggaat ttagacccgt tataagtgtt g 41
<210> 432
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 432
attatactgt ccagcgtagg tggtagacaa ccgtcgttaa g 41
<210> 433
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 433
tcctggtaag gataggtacc atgtagacaa ccgtcgttaa g 41
<210> 434
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 434
cactgaaata ggacggaatc tgctagacaa ccgtcgttaa g 41
<210> 435
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 435
aaagtttatt ggcgcttgcc gtagacaacc gtcgttaag 39
<210> 436
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 436
gcaatgccat tagcgatacg atagacaacc gtcgttaag 39
<210> 437
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 437
tgattgaaca ccacgcgaca tagacaaccg tcgttaag 38
<210> 438
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 438
agtcttcgaa gcactattgc catagacaac cgtcgttaag 40
<210> 439
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 439
tcaatggttg atcggcctct ctagacaacc gtcgttaag 39
<210> 440
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 440
tggcatgatg tctaatagga gtctagacaa ccgtcgttaa g 41
<210> 441
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 441
ctgcggttta gccttgacgt tagacaaccg tcgttaag 38
<210> 442
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 442
cccagaggac gccatcattt tagacaaccg tcgttaag 38
<210> 443
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 443
tttcttgaaa gacgacagca gttagacaac cgtcgttaag 40
<210> 444
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 444
attaaatgtt cggaaggatg acctagacaa ccgtcgttaa g 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 445
tcttttgtca gcacggttgc tagacaaccg tcgttaag 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 446
ctggatcagc tcgaccagga tagacaaccg tcgttaag 38
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 447
accatggtcc gacttctgcc tagacaaccg tcgttaag 38
<210> 448
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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ctggatattc ggttatctgg gctagacaac cgtcgttaag 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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atccccttta cgatactctt cagtagacaa ccgtcgttaa g 41
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 450
tccagagcgg gaacagtatg tagacaaccg tcgttaag 38
<210> 451
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 451
gttgcctgca taagatgggc tagacaaccg tcgttaag 38
<210> 452
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 452
ccttttgtgc cgatgacccg tagacaaccg tcgttaag 38
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 453
gcttccgtgg actgggacgt agacaaccgt cgttaag 37
<210> 454
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 454
ccatagaagg acgaggtatt tcctagacaa ccgtcgttaa g 41
<210> 455
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 455
agaatgagtc gctgctcgat atagacaacc gtcgttaag 39
<210> 456
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 456
gcttcgacaa acgcaaagcg tagactcaat gatgataaag a 41
<210> 457
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 457
gctagttcac agaaagacca ttttagactc aatgatgata aaga 44
<210> 458
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 458
cagctcatcg aaagcgaccc tagactcaat gatgataaag a 41
<210> 459
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 459
cggctgctac aaacctcggt agactcaatg atgataaaga 40
<210> 460
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 460
aacaatttga aggccccaca atagactcaa tgatgataaa ga 42
<210> 461
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 461
gcgtctgcac cggagactta gactcaatga tgataaaga 39
<210> 462
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 462
gcgctgctca ggcattggta gactcaatga tgataaaga 39
<210> 463
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 463
ttgttgtgta acaacataat ttcaagtaga ctcaatgatg ataaaga 47
<210> 464
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 464
ctccacgtcg gcgtgcatag actcaatgat gataaaga 38
<210> 465
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 465
ctgcggggat tgtagccggt agactcaatg atgataaaga 40
<210> 466
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 466
atcttagcta ctgaccggct atagactcaa tgatgataaa ga 42
<210> 467
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 467
aagagattat acgcctcacg gatagactca atgatgataa aga 43
<210> 468
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 468
tttcgagtaa cgaaattagc tcctagactc aatgatgata aaga 44
<210> 469
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 469
gacccgcaga ttggcacgta gactcaatga tgataaaga 39
<210> 470
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 470
atggccccaa tctcgtttgg tagactcaat gatgataaag a 41
<210> 471
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 471
ccagtagcta taacgaagtc ctctagactc aatgatgata aaga 44
<210> 472
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 472
acaaattccc ggacactatg gatagactca atgatgataa aga 43
<210> 473
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 473
ttcacagagt tgataaggcc actagactca atgatgataa aga 43
<210> 474
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 474
aactttgccg gtctctttac attagactca atgatgataa aga 43
<210> 475
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 475
ttccaatgtg caagaatgat ttcttagact caatgatgat aaaga 45
<210> 476
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 476
ctccttctgg ggtatttcct gctagactca atgatgataa aga 43
<210> 477
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 477
ccacttcagt tggccggtat agactcaatg atgataaaga 40
<210> 478
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 478
tccgtcaacg tccgcagtta gactcaatga tgataaaga 39
<210> 479
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 479
agtgagatcg ccatagtgca atagactcaa tgatgataaa ga 42
<210> 480
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 480
gaaggtgacc ctataaggag tcatagacta caacaaaaga tcg 43
<210> 481
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 481
aacaccgctt gcatagttgt gtagactaca acaaaagatc g 41
<210> 482
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 482
tacagacgcg gaatcattct ctagactaca acaaaagatc g 41
<210> 483
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 483
tggaggaaat gagcatgacc ttagactaca acaaaagatc g 41
<210> 484
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 484
atggtgtaca ctcgaggctg atagactaca acaaaagatc g 41
<210> 485
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 485
ccttgtggta gacgttcagc ttagactaca acaaaagatc g 41
<210> 486
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 486
ggatcaggtt taatggtcac tatgtagact acaacaaaag atcg 44
<210> 487
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 487
cacacggtca acgctgtaca tagactacaa caaaagatcg 40
<210> 488
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 488
caggtgtttg cggaagttcc tagactacaa caaaagatcg 40
<210> 489
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 489
gtgctcatgg tcgtagagga tagactacaa caaaagatcg 40
<210> 490
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 490
aagtcaaagt acgtctcgat cattagacta caacaaaaga tcg 43
<210> 491
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 491
tcgtagcagc cgttggagat agactacaac aaaagatcg 39
<210> 492
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 492
tcgtggccag agtaggcatt agactacaac aaaagatcg 39
<210> 493
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 493
ggtactctcc aaacgctcgg tagactacaa caaaagatcg 40
<210> 494
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 494
aggtacgaat agggatgtcg tctagactac aacaaaagat cg 42
<210> 495
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 495
agggtatcgt acatcgttcc aatagactac aacaaaagat cg 42
<210> 496
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 496
caggtgatct gcgccgttgt agactacaac aaaagatcg 39
<210> 497
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 497
ccacaggcga tacaaccggt agactacaac aaaagatcg 39
<210> 498
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 498
cagcagcttc gagtgctggt agactacaac aaaagatcg 39
<210> 499
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 499
ccctcacagg acgtcgtcat agactacaac aaaagatcg 39
<210> 500
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 500
gcacgaagcc ttcggtgtct agactacaac aaaagatcg 39
<210> 501
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 501
tgggaagtgt cggctttcat gtagactaca acaaaagatc g 41
<210> 502
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 502
tgggaagtgt cggctttcat gtagactaca acaaaagatc g 41
<210> 503
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 503
tgctcgcact ttggccgcta gactacaaca aaagatcg 38
<210> 504
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 504
gtcttttggc acggtttctg ttagactgta ttcaacgtcc 40
<210> 505
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 505
tacttcttca acgcgaagag ctagactgta ttcaacgtcc 40
<210> 506
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 506
tttgaggttg tatccgctgc ttagactgta ttcaacgtcc 40
<210> 507
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 507
caagttgact aaatctcgta ctttctagac tgtattcaac gtcc 44
<210> 508
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 508
gccttattaa cggtatcttc agaatagact gtattcaacg tcc 43
<210> 509
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 509
tgttctggat ttcgcaggtc ctagactgta ttcaacgtcc 40
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 510
gctttatcag gttatgttgc atgtagactg tattcaacgt cc 42
<210> 511
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 511
gattctggct tatagggtat tcactagact gtattcaacg tcc 43
<210> 512
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 512
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<210> 513
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 514
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 515
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 518
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 520
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 521
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<210> 522
<211> 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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tttgccttcc ctagagtgct atagactgta ttcaacgtcc 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 524
atgtcccaat ggatacttaa agcctagact gtattcaacg tcc 43
<210> 525
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 525
cttccagtaa cgagatactt tccttagact gtattcaacg tcc 43
<210> 526
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 527
cagcattatt agacacttta actgttagac tgtattcaac gtcc 44
<210> 528
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 528
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 529
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<210> 530
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 530
ttcacttaca ggtaacacca agttagactc ttatattgag tggt 44
<210> 531
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 532
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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aaaggccata cgtttttcct acctagactc ttatattgag tggt 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 544
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 545
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 548
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 548
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 550
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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cccaaagtcg aacagttttg tctagactct tatattgagt ggt 43
<210> 552
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 552
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 580
atttcctcat aacggtcatg gctagacatg ttataccatg cg 42
<210> 581
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 581
ttactgccta gctagcaggt tatagacatg ttataccatg cg 42
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 583
cttgccaaac cctagcttgg atagacatgt tataccatgc g 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 590
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 591
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<210> 592
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<210> 600
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 600
ggtgagctgg taatctgacc ttagacaatc tatttaccct acg 43
<210> 601
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 601
gttgcaggca tgacgcaagt agacaatcta tttaccctac g 41
<210> 602
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 602
aaaacgccta cgcatcatgt ctagacaatc tatttaccct acg 43
<210> 603
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 603
tggtcctgcg cggatgtcta gacaatctat ttaccctacg 40
<210> 604
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 605
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 43
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 606
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 607
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 609
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 609
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<211> 44
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 610
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 611
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<210> 612
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 612
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 613
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 619
gaagaagtcg gtgacgcggt agacaatcta tttaccctac g 41
<210> 620
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 620
ggctggaaac ctcgtccact agacaatcta tttaccctac g 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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tttattagag tttaggaggt cagaaataga caatctattt accctacg 48
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 623
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 623
tccagggatg tcctacttgt cctagacaat ctatttaccc tacg 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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ggcttgagtg ggttcaccca ggtaactgaa ttgtcacttt a 41
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 635
gcaaggtatg gcaatagctg agtgtaactg aattgtcact tta 43
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 636
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 637
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 639
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 640
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<210> 641
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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ctcattggaa tggttagtag agcaagtaac tgaattgtca cttta 45
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 646
ctgagtaaag agcgtgtatt ccaggtaact gaattgtcac ttta 44
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 647
tggaggcata aagctggtag gcgtaactga attgtcactt ta 42
<210> 648
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 650
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 651
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 652
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 653
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 654
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 660
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 660
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 663
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 43
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 668
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 669
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 670
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<211> 47
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 671
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<211> 43
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 672
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 674
attaatcgtt tgcggatctg ccgtaacgat agatttatac gacg 44
<210> 675
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 675
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 676
tctgaagttt cgagccaatg ttgtaacgat agatttatac gacg 44
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 677
ccattttcac cgctgaaata gagtaacgat agatttatac gacg 44
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 678
ctggatcaca tgcgttgtca ggtaacgata gatttatacg acg 43
<210> 679
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 679
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<210> 680
<211> 45
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 681
tagaataatg gttcgtgacc ttcgtaacga tagatttata cgacg 45
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 682
acctgaaggc gacgaggagg taacgataga tttatacgac g 41
<210> 683
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 683
gcctggagtc tatcgtacaa tcgtaacgat agatttatac gacg 44
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<211> 47
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<213> Artificial Sequence
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<211> 45
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<213> Artificial Sequence
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<211> 46
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 688
acaaagacga gaactatggc aagtaacgat agatttatac gacg 44
<210> 689
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 689
aggcagacgc tctaagtcta aagtaacgat agatttatac gacg 44
<210> 690
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 690
tctcttactc atcgtgaaag gcgtaacgat agatttatac gacg 44
<210> 691
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 691
gcctcaagtt cgcattcagc gtaacgatag atttatacga cg 42
<210> 692
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 692
gaaatggaaa cgttaacagc cagtaacgat agatttatac gacg 44
<210> 693
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 693
cacctgcttc ggaatctcag tgtaacgata gatttatacg acg 43
<210> 694
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 694
gacttgtgct tcgttaatta aacagtaacg atagatttat acgacg 46
<210> 695
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 695
gctgtaatat acgcccactt tagcgtaacg atagatttat acgacg 46
<210> 696
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 696
ttccattgtg cggttgggat tgtaacttat aaaggataga catc 44
<210> 697
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 697
ctccagtaat cgcttatggt ccgtaactta taaaggatag acatc 45
<210> 698
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 698
cctcttctcc gtcaagaagt tcgtaactta taaaggatag acatc 45
<210> 699
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 699
tgattgagat ggcggtattt gagtaactta taaaggatag acatc 45
<210> 700
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 700
gccaattata agtactcggg ctgtaactta taaaggatag acatc 45
<210> 701
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 701
ccaggccagc gtatgttccg taacttataa aggatagaca tc 42
<210> 702
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 702
ctggggcaac caacacttgt gtaacttata aaggatagac atc 43
<210> 703
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 703
ggctggacaa taggctccca gtaacttata aaggatagac atc 43
<210> 704
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 704
aaagctatgg cacgaaagcc ggtaacttat aaaggataga catc 44
<210> 705
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 705
gcagtccatc taaggtggac tgtaacttat aaaggataga catc 44
<210> 706
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 706
tgtatatgga gtaccctctt gctgtaactt ataaaggata gacatc 46
<210> 707
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 707
ctggatcacc aaaacggcaa tgtaacttat aaaggataga catc 44
<210> 708
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 708
ccaggataac ctttacttgc cagtaactta taaaggatag acatc 45
<210> 709
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 709
atttccagct gcgatatcta ctcgtaactt ataaaggata gacatc 46
<210> 710
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 710
tttatagcag ctagtccttt cttggtaact tataaaggat agacatc 47
<210> 711
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 711
tgatatgaga ttttcccgga tgggtaactt ataaaggata gacatc 46
<210> 712
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 712
tgacaacagt tagggcggtg gtaacttata aaggatagac atc 43
<210> 713
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 713
ttggttcccg agtactgtct agtaacttat aaaggataga catc 44
<210> 714
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 714
gtttagttcc aacgccatct gtgtaactta taaaggatag acatc 45
<210> 715
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 715
aagagttgcg acagtatcac ccgtaactta taaaggatag acatc 45
<210> 716
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 716
gctgctggat atccctcaga agtaacttat aaaggataga catc 44
<210> 717
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 717
tgcaagacag actatgtcta tgggtaactt ataaaggata gacatc 46
<210> 718
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 718
cttcaaggac taggtcaatt gcagtaactt ataaaggata gacatc 46
<210> 719
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 719
gatatgctgc actaactagt cttggtaact tataaaggat agacatc 47
<210> 720
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 720
atctcgagca agacgttcag tgtaacggtt atcgtggaaa 40
<210> 721
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 721
ctgtccataa ttagtccatg aggagtaacg gttatcgtgg aaa 43
<210> 722
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 722
atctttggat tatactgcct gaccgtaacg gttatcgtgg aaa 43
<210> 723
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 723
cagcaagctt gcgaccttga gtaacggtta tcgtggaaa 39
<210> 724
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 724
agttaaagtt gagagatcat ctccagtaac ggttatcgtg gaaa 44
<210> 725
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 725
aggaatggat ctatcactat ttctagtaac ggttatcgtg gaaa 44
<210> 726
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 726
cagcataatg attaggtatg caaaagtaac ggttatcgtg gaaa 44
<210> 727
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 727
ttcagtctga taaaatctac agtcagtaac ggttatcgtg gaaa 44
<210> 728
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 728
tccaacactt cgtggggtcc gtaacggtta tcgtggaaa 39
<210> 729
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 729
agggctacaa tgtgatggcc gtaacggtta tcgtggaaa 39
<210> 730
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 730
tcaaggtcat aacctggttc atcgtaacgg ttatcgtgga aa 42
<210> 731
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 731
cctacaacaa acttgtctgg aatgtaacgg ttatcgtgga aa 42
<210> 732
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 732
aaacaacaat ccgcccaaag ggtaacggtt atcgtggaaa 40
<210> 733
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 733
aaagctctac taagcagatg gcgtaacggt tatcgtggaa a 41
<210> 734
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 734
actgctgaca aagattcact gggtaacggt tatcgtggaa a 41
<210> 735
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 735
ctgatagtct ataggctcat agtgcgtaac ggttatcgtg gaaa 44
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 736
atcactaatc acgacgccag ggtaacggtt atcgtggaaa 40
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 737
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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gaactctcat cttaggcttt gtagtaacgg ttatcgtgga aa 42
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 739
tcaacattac tgaaacacta ctaaagtaac ggttatcgtg gaaa 44
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 740
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<210> 741
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 741
ttcttacaga tatgagttca atgtttgtaa cggttatcgt ggaaa 45
<210> 742
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 742
aggacagaac aaaacttctt agatggtaac ggttatcgtg gaaa 44
<210> 743
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 743
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<210> 744
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 744
ggaatttgga accggcttgc gtaacggtac tttatctagc t 41
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 745
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<210> 746
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 746
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<210> 747
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 747
tccagaaata agcgaaaata gcagtaacgg tactttatct agct 44
<210> 748
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 748
atcttttgaa ctactagcta caaaatgtaa cggtacttta tctagct 47
<210> 749
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 749
taacaagctc gtaatggccc agtaacggta ctttatctag ct 42
<210> 750
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 750
catccaaacc gtgtgaaagc tgtaacggta ctttatctag ct 42
<210> 751
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 751
acaacgccat gtgcgatttg gtaacggtac tttatctagc t 41
<210> 752
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 752
ctacctacca ctaggtacct atcagtaacg gtactttatc tagct 45
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 753
aggacattta cgtgtacagc acgtaacggt actttatcta gct 43
<210> 754
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 754
cgcctgaata caacgagtta acgtaacggt actttatcta gct 43
<210> 755
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 755
cttccagatt gtcgccgtta attgtaacgg tactttatct agct 44
<210> 756
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 756
cagatttacc taaaccacca ccagtaacgg tactttatct agct 44
<210> 757
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 757
tttgagctga tctagtaggt cttcgtaacg gtactttatc tagct 45
<210> 758
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 758
tctgtagctc gatccctgga gtaacggtac tttatctagc t 41
<210> 759
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 759
caactgtcat tcggttaaac tgagtaacgg tactttatct agct 44
<210> 760
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 760
tttgcttccg ttcatcatta gtcgtaacgg tactttatct agct 44
<210> 761
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 761
acttccaata gtctggaaat cacagtaacg gtactttatc tagct 45
<210> 762
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 762
tcatctgctg gattaagcta atacgtaacg gtactttatc tagct 45
<210> 763
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 763
agataggctc ccgtatgccc gtaacggtac tttatctagc t 41
<210> 764
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 764
gcttctcggc taccacagac gtaacggtac tttatctagc t 41
<210> 765
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 765
agacttactc ttaagaccat acttcgtaac ggtactttat ctagct 46
<210> 766
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 766
gttgagaggt ggcgtttttg agtaacggta ctttatctag ct 42
<210> 767
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 767
tcaatacgtt tctgcaagag tttgtaacgg tactttatct agct 44
<210> 768
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 768
ttatggcctc tatagcatct cccgtaactc catctagacc g 41
<210> 769
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 769
cagtccgggc aactatctta ttgtaactcc atctagaccg 40
<210> 770
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 770
ttcaagatac gaataatcct ccgagtaact ccatctagac cg 42
<210> 771
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 771
gtaggcgctt agcttgattt tcgtaactcc atctagaccg 40
<210> 772
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 772
cttcaagtcg ggctcttgca gtaactccat ctagaccg 38
<210> 773
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 773
agaatgaggc acgcaaagct gtaactccat ctagaccg 38
<210> 774
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 774
ctcagcatcc gataggactt tcgtaactcc atctagaccg 40
<210> 775
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 775
aagtcactat aacacccgtc ctgtaactcc atctagaccg 40
<210> 776
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 776
ttggcatggt agatcgtcca ggtaactcca tctagaccg 39
<210> 777
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 777
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<210> 778
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 778
acaacctgta agtgtagttc tctggtaact ccatctagac cg 42
<210> 779
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 779
aaatcagata ctcgtctaca gaatggtaac tccatctaga ccg 43
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 780
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 782
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 819
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<210> 820
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 820
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 844
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 853
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 855
<211> 43
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 855
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<210> 856
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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ttccctggtt agtacggtga aggtaactca gacatgtaga tt 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 858
taagctggta tgtcctactc ccgtaactca gacatgtaga tt 42
<210> 859
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 859
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<213> Artificial Sequence
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<211> 44
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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ccatggtgac gatcctcacg gtaactaaca taaattcgat g 41
<210> 865
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 868
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 869
ttgaagcttg gtatgtcagg aggtaactaa cataaattcg atg 43
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 872
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 873
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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ctggggtcgt agtcaccata cgtaactaac ataaattcga tg 42
<210> 888
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 937
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<210> 938
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 939
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 940
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 943
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 945
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<210> 946
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 946
cagcgcctgt tacaagctct gtaactgatc ttcatattac g 41
<210> 947
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 947
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<210> 955
<211> 40
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1006
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1010
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<210> 1011
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1011
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<210> 1012
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1013
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1013
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<210> 1014
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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cttgttattg acgtcgaagg cttagacagc ccaattaaac g 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1016
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1018
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1019
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1019
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<210> 1020
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1020
gtccctgtag acgcgcgtta gacagcccaa ttaaacg 37
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1021
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<210> 1022
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1023
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1023
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<210> 1024
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1024
acacctcttt gtcgttgacc ttagacagcc caattaaacg 40
<210> 1025
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1025
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<210> 1026
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1027
tcctcggacg ctaagctcat agacagccca attaaacg 38
<210> 1028
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1028
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1029
tcccggaaca tgcggtaggt agacagccca attaaacg 38
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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tgctcgatgt cgcccactgt agacagccca attaaacg 38
<210> 1031
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1031
tgccggtgcc gcttatggta gacagcccaa ttaaacg 37
<210> 1032
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1035
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1035
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<210> 1036
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1037
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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atggaacgca gtatacctct cgtagacggt ataatactta tttcc 45
<210> 1038
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1038
cttggcttgt aatcaggcat agatagacgg tataatactt atttcc 46
<210> 1039
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1039
ctccatgaag cgccagcgta gacggtataa tacttatttc c 41
<210> 1040
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1040
ccgcttgtta gggtcgtagt tagacggtat aatacttatt tcc 43
<210> 1041
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1041
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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agaaggctat cagagtcgaa gatagacggt ataatactta tttcc 45
<210> 1045
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1047
acagggccca gtaccgtggt agacggtata atacttattt cc 42
<210> 1048
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1048
tcagcaataa ctaagagaag gggtagacgg tataatactt atttcc 46
<210> 1049
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1049
gtacggcaaa tctaacgtgt aggtagacgg tataatactt atttcc 46
<210> 1050
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1050
tgaaacaatg ttgccgcctc ctagacggta taatacttat ttcc 44
<210> 1051
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1051
taataattat ggggcattca gagatagacg gtataatact tatttcc 47
<210> 1052
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1052
tctcacctgc ctcataaggc tagacggtat aatacttatt tcc 43
<210> 1053
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1054
cactaactag ggtataaact gattggtaga cggtataata cttatttcc 49
<210> 1055
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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agaagggaca aacaagggga ctagacggta taatacttat ttcc 44
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1056
agtccgatac tcaagcgcaa atagacaata aattctaacg agc 43
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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cttgttgcgc tcacggtatg tagacaataa attctaacga gc 42
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1058
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1060
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1060
atgatgcgca cttcacgggt agacaataaa ttctaacgag c 41
<210> 1061
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1061
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1062
gcagtgtggt taggccgatg tagacaataa attctaacga gc 42
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1064
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1065
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<210> 1066
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1066
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<210> 1067
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1067
ctcttcatac tagcatgact gtcatagaca ataaattcta acgagc 46
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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agaaggcttt cgtcgttccc tagacaataa attctaacga gc 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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tccagtgcat ccgtcacatc tagacaataa attctaacga gc 42
<210> 1071
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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cactgatacc ggctctccgt tagacaataa attctaacga gc 42
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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gaacgcttgc gttccctagc tagacaataa attctaacga gc 42
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 43
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1081
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1081
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<210> 1082
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1087
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1088
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<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1101
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<211> 42
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1109
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1115
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1115
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<210> 1116
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1116
gcagaaatct cgagaggacg ctagacgacc gaatttacgg 40
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<211> 39
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<210> 1118
<211> 39
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<213> Artificial Sequence
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<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1120
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<210> 1121
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1121
cacagacaca gccgaggact agacgaccga atttacgg 38
<210> 1122
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1122
tcccaaaagc taccgctgag tagacgaccg aatttacgg 39
<210> 1123
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1123
taaggtagag tcgggcgaag tagacgaccg aatttacgg 39
<210> 1124
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1125
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1126
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1126
ggctcccaaa cgccctgata gacgaccgaa tttacgg 37
<210> 1127
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1127
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 40
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<213> Artificial Sequence
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<210> 1130
<211> 42
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1131
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1131
ttctccacgt cgcggacact agacacgaat attccaattc 40
<210> 1132
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<210> 1133
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 41
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 42
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1223
gtgtagcata tgaatcgaca tcatagactc tataaatcag cgt 43
<210> 1224
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1224
tagccttgta tggcagaatc gtagacctaa attactgtga atg 43
<210> 1225
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1225
tgaattgccc tgggtataac tcctagacct aaattactgt gaatg 45
<210> 1226
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1226
ttcctgttgc aacgtgaggg tagacctaaa ttactgtgaa tg 42
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1227
atgaaagaca cgatcaaaat tgaatagacc taaattactg tgaatg 46
<210> 1228
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1228
gtcagcacga agtgagttca atagacctaa attactgtga atg 43
<210> 1229
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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gtgcagataa tacgtgtctt tgctagacct aaattactgt gaatg 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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tccaatgagt atgacaagtc cattagacct aaattactgt gaatg 45
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1232
tgtaagaaag ctcggtcttc aaatagacct aaattactgt gaatg 45
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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ccatgtaaga tacacgtaag agaatagacc taaattactg tgaatg 46
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1234
gactcaagag catttcgtaa ttgttagacc taaattactg tgaatg 46
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<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1237
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<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
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ttaatgtatc aagagtgtta ctgaaataga cctaaattac tgtgaatg 48
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1241
tcaaatggga taccttaaca gatctagacc taaattactg tgaatg 46
<210> 1242
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1242
ataaataagc ttcgatttat attacagcta gacctaaatt actgtgaatg 50
<210> 1243
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1243
cttgtgtggt aggattaacc tggtagacct aaattactgt gaatg 45
<210> 1244
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1244
gttggtcaac tcgagcatct ttagacctaa attactgtga atg 43
<210> 1245
<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1245
tttggtttgt aggcctgtag cttagaccta aattactgtg aatg 44
<210> 1246
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1246
cattaggcag taactcttgt tcctagacct aaattactgt gaatg 45
<210> 1247
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Target Specific Oligonucleotide
<400> 1247
cttctcagat acgcttcttc ttatagacct aaattactgt gaatg 45
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1262
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<400> 1270
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<210> 1272
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1272
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<210> 1273
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1273
accttaagaa tggaatggac gttgaataca 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1277
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1282
accttaagaa tggaatcgtc gtataaatct atc 33
<210> 1283
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1284
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<210> 1285
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1285
accttaagaa tggaatgatg tctatccttt ataa 34
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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accttaagaa tggaattttc cacgataacc 30
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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accttaagaa tggaattagt accgaataag g 31
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1294
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1295
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1296
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1297
accttaagaa tggaatggat aagtcggtaa tc 32
<210> 1298
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1298
acttaacttg agtggggata agtcggtaat c 31
<210> 1299
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1299
ggctaattta ttacctggta tttcactcta att 33
<210> 1300
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1300
accttaagaa tggaatggta tttcactcta att 33
<210> 1301
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1301
acttaacttg agtggggtat ttcactctaa tt 32
<210> 1302
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1302
ggctaattta ttacctagct agataaagta cc 32
<210> 1303
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1303
accttaagaa tggaatagct agataaagta cc 32
<210> 1304
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1304
acttaacttg agtggagcta gataaagtac c 31
<210> 1305
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1305
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<210> 1306
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1306
accttaagaa tggaatccga aactacgatt at 32
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1307
acttaacttg agtggccgaa actacgatta t 31
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1308
ggctaattta ttacctcatc gaatttatgt ta 32
<210> 1309
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1309
accttaagaa tggaatcatc gaatttatgt ta 32
<210> 1310
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1310
acttaacttg agtggcatcg aatttatgtt a 31
<210> 1311
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<210> 1312
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1312
accttaagaa tggaatccgt aattctaccg 30
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<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1313
acttaacttg agtggccgta attctaccg 29
<210> 1314
<211> 29
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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ggctaattta ttacctgggt aatcgtcac 29
<210> 1315
<211> 29
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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accttaagaa tggaatgaat tggaatattc gt 32
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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accttaagaa tggaatggta ttaatcttga aga 33
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<211> 32
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1339
accttaagaa tggaatcata tacaaacggt ac 32
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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acttaacttg agtggcatat acaaacggta c 31
<210> 1341
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<210> 1351
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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accttaagaa tggaatcaac acttataacg g 31
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1354
accttaagaa tggaatggaa ataagtatta tacc 34
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<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1358
acttaacttg agtggcttaa cgacggtt 28
<210> 1359
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1359
ggctaattta ttacctgctc gttagaattt att 33
<210> 1360
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1360
accttaagaa tggaatgctc gttagaattt att 33
<210> 1361
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1361
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<210> 1362
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1362
ggctaattta ttaccttctt tatcatcatt ga 32
<210> 1363
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
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accttaagaa tggaattctt tatcatcatt ga 32
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<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1364
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<210> 1365
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
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<210> 1366
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1366
accttaagaa tggaatcgtt cgcaatttat c 31
<210> 1367
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1367
acttaacttg agtggcgttc gcaatttatc 30
<210> 1368
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1368
ggctaattta ttacctcgat cttttgttgt a 31
<210> 1369
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1369
accttaagaa tggaatcgat cttttgttgt a 31
<210> 1370
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1370
acttaacttg agtggcgatc ttttgttgta 30
<210> 1371
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1371
ggctaattta ttacctacca ctcaatataa ga 32
<210> 1372
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1372
accttaagaa tggaatacca ctcaatataa ga 32
<210> 1373
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1373
acttaacttg agtggaccac tcaatataag a 31
<210> 1374
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1374
ggctaattta ttacctccgt aaattcggtc 30
<210> 1375
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1375
accttaagaa tggaatccgt aaattcggtc 30
<210> 1376
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1376
acttaacttg agtggccgta aattcggtc 29
<210> 1377
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1377
ggctaattta ttacctcgtg agatttctga 30
<210> 1378
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1378
accttaagaa tggaatcgtg agatttctga 30
<210> 1379
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1379
acttaacttg agtggcgtga gatttctga 29
<210> 1380
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1380
ggctaattta ttacctcgaa gcatagaata g 31
<210> 1381
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1381
accttaagaa tggaatcgaa gcatagaata g 31
<210> 1382
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1382
acttaacttg agtggcgaag catagaatag 30
<210> 1383
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1383
ggctaattta ttacctaaaa tacgggagac 30
<210> 1384
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1384
accttaagaa tggaataaaa tacgggagac 30
<210> 1385
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1385
acttaacttg agtggaaaat acgggagac 29
<210> 1386
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1386
ggctaattta ttacctcgca tggtataaca t 31
<210> 1387
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1387
accttaagaa tggaatcgca tggtataaca t 31
<210> 1388
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1388
acttaacttg agtggcgcat ggtataacat 30
<210> 1389
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1389
ggctaattta ttacctacgc tgatttatag a 31
<210> 1390
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1390
accttaagaa tggaatacgc tgatttatag a 31
<210> 1391
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1391
acttaacttg agtggacgct gatttataga 30
<210> 1392
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1392
ggctaattta ttacctcgta gggtaaatag att 33
<210> 1393
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1393
accttaagaa tggaatcgta gggtaaatag att 33
<210> 1394
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1394
acttaacttg agtggcgtag ggtaaataga tt 32
<210> 1395
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1395
ggctaattta ttacctcatt cacagtaatt tag 33
<210> 1396
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1396
accttaagaa tggaatcatt cacagtaatt tag 33
<210> 1397
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Decoding Oligonucleotide
<400> 1397
acttaacttg agtggcattc acagtaattt ag 32
<210> 1398
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Signal Oligonucleotide
<400> 1398
ccactcaagt taagt 15
<210> 1399
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Signal Oligonucleotide
<400> 1399
attccattct taaggt 16
<210> 1400
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Signal Oligonucleotide
<400> 1400
aggtaataaa ttagcc 16
Claims (15)
- 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법으로서,
(1) 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들을 제공하는 단계, 각각의 분석 물질-특이적 프로브는
- 인코딩될 분석 물질들 중 하나와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소(S), 및
- 상기 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들에 고유한 뉴클레오티드 서열(고유 식별자 서열)을 포함하는 식별자 요소(T)를 포함함;
(2) 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들을 샘플과 함께 인큐베이션하여, 분석 물질로의 분석 물질-특이적 프로브들의 특이적 결합이 인코딩되도록 하는 단계;
(3) 샘플로부터 결합되지 않은 프로브를 제거하는 단계;
(4) 한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들을 제공하는 단계, 각각의 디코딩 올리고뉴클레오티드는
- 고유 식별자 서열의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 커넥터 요소(t), 및
- 신호 올리고뉴클레오티드의 특이적 혼성화를 허용하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 번역기 요소(c)를 포함함;
(5) 한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들을 샘플과 함께 인큐베이션하여, 디코딩 올리고뉴클레오티드들을 고유한 식별자 서열에 특이적으로 혼성화시키는 단계;
(6) 샘플로부터 결합되지 않은 디코딩 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계;
(7) 한 세트의 신호 올리고뉴클레오티드들을 제공하는 단계, 각각의 신호 올리고뉴클레오티드는
- 번역기 요소(c)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 커넥터 요소(C), 및
- 신호 요소를 포함함; 및
(8) 한 세트의 신호 올리고뉴클레오티드들을 샘플과 함께 인큐베이션하여, 신호 올리고뉴클레오티드들을 번역기 요소(c)에 특이적으로 혼성화시키는 단계를 포함하는, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법. - 제1항에 있어서, 샘플은, 바람직하게는 생물학적 조직을 포함하고 더 바람직하게는 생물학적 세포를 포함하는, 생물학적 샘플인, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 (2) 이전에 생물학적 조직 및/또는 생물학적 세포가 고정되는, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들 내 개별 분석 물질-특이적 프로브들이, 인코딩될 분석 물질들 중 한 물질의 상이한 하위-구조들과 특이적으로 상호작용하는 결합 요소(S1, S2, S3, S4, S5)를 포함하는, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
(9) 샘플로부터 결합되지 않은 신호 올리고뉴클레오티드를 제거하는 단계; 및
(10) 신호를 검출하는 단계를 더 포함하고, 선택적으로,
(11) 샘플로부터 디코딩 올리고뉴클레오티드 및 신호 올리고뉴클레오티드를 선택적으로 제거함으로써, 인코딩될 분석 물질로의 분석 물질-특이적 프로브들의 특이적 결합을 본질적으로 유지하는 단계를 더 포함하며, 선택적으로,
(12) 단계 (4)에서 단계 (11)까지를 적어도 한 번 반복하여[(42)-(112)] 적어도 두 개의 신호로 구성된 인코딩 체계(encoding scheme)를 생성하는 단계를 더 포함하는, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법. - 제5항에 있어서, 상기 인코딩 체계는 사전에 결정되고, 인코딩될 분석 물질에 할당되는, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 제5항 또는 제6항에 있어서, 이전의 단계 (4)에서 단계 (11)까지에 사용된 디코딩 올리고뉴클레오티드들의 번역기 요소(c1)와 동일하거나 상이한 번역기 요소(c2)를 포함하는 반복하는 단계[(42)-(112)]에 디코딩 올리고뉴클레오티드들이 사용되는, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 이전의 단계 (4)에서 단계 (11)까지에 사용된 디코딩 올리고뉴클레오티드들의 신호 요소와 동일하거나 상이한 신호 요소를 포함하는 반복하는 단계[(42)-(112)]에 신호 올리고뉴클레오티드들이 사용되는, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 요소(S)는 인코딩될 분석 물질에 특이적 결합되게 하는, 바람직하게는 인코딩될 분석 물질에 특이적 혼성화되게 하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 요소(S)는 인코딩될 분석 물질에 특이적 결합되게 하는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 결합 요소가 항체인, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩될 분석 물질은 핵산, 바람직하게는 DNA 또는 RNA, 더 바람직하게는 mRNA인, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인코딩될 분석 물질은 펩티드 또는 단백질인, 샘플 내 분석 물질들의 순차적 신호-인코딩 방법.
- 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들의 용도로서, 각각의 디코딩 올리고뉴클레오티드는
- 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들에 고유한 뉴클레오티드 서열(고유 식별자 서열)의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 커넥터 요소(t), 및
- 신호 올리고뉴클레오티드의 특이적 혼성화를 허용하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 번역기 요소(c)를 포함하는, 한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들의 용도. - 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 키트로서,
- 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들, 여기서 각각의 분석 물질-특이적 프로브는
- 인코딩될 분석 물질들 중 하나와 특이적으로 상호작용하는 결합 요소(S), 및
- 상기 한 세트의 분석 물질-특이적 프로브들에 고유한 뉴클레오티드 서열(고유 식별자 서열)을 포함하는 식별자 요소(T)를 포함함; 및
- 한 세트의 디코딩 올리고뉴클레오티드들, 여기서 각각의 디코딩 올리고뉴클레오티드는
- 고유 식별자 서열의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 커넥터 요소(t), 및
- 신호 올리고뉴클레오티드의 특이적 혼성화를 허용하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 번역기 요소(c)를 포함하는, 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 키트. - 제14항에 있어서,
- 한 세트의 신호 올리고뉴클레오티드들을 더 포함하고, 각각의 신호 올리고뉴클레오티드는
- 번역기 요소(c)의 뉴클레오티드 서열의 적어도 한 섹션에 본질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 커넥터 요소(C), 및
- 신호 요소를 포함하는, 샘플 내 분석 물질들을 순차적으로 신호-인코딩하는 키트.
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