JP2022537048A - 試料中の分析物のシグナルコード化方法 - Google Patents

Abstract

【解決手段】 本発明は、試料中の分析物を逐次的にシグナルコードする方法、試料中の分析物を逐次的にシグナルコードするための解読オリゴヌクレオチドのセットの使用、及び試料中の分析物を逐次的にシグナルコードするためのキットに関する。【選択図】なし

Description

本発明は、試料中の分析物を逐次的にシグナルコードする方法、試料中の分析物を逐次的にシグナルコードするための解読オリゴヌクレオチドのセットの使用、及び試料中の分析物を逐次的にシグナルコードするためのキットに関する。

本発明は、分子生物学の分野、より具体的には、試料中の分析物の検出、好ましくは、生物学的試料中の核酸分子及び／又はタンパク質などの生体分子の検出に関する。

生物学的及び非生物学的試料中の少量の分析物の分析及び検出は、臨床及び分析環境において日常的な業務となっている。この目的のために多数の分析方法が確立されている。それらのいくつかは、特定の第２の分析物に割り当てられたコードとは異なる特定の第１の分析物に特定の可読コードを割り当てるコード化技術を使用する。

この分野における従来技術の１つは、試料中のｍＲＮＡ分子を検出するために本質的に開発された、いわゆる「単一分子蛍光インサイチュハイブリダイゼーション」（ｓｍＦＩＳＨ）である。Ｌｕｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｂｙ ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１１（４），ｐ．３６０－３６１では、目的のｍＲＮＡは、特異的な直接標識プローブセットを介して検出される。１ラウンドのハイブリダイゼーション及び検出の後、ｍＲＮＡ特異的プローブのセットをｍＲＮＡから溶出し、他の（又は同じ）蛍光標識を有するプローブの同じセットを次のラウンドのハイブリダイゼーション及びイメージングで使用して、遺伝子特異的カラーコードスキームを数ラウンドにわたって生成する。この技術は、転写物ごとにいくつかの異なるタグ付きプローブセットを必要とし、各検出ラウンドごとにこれらのプローブセットを変性させる必要がある。

この技術の更なる発展は、直接標識されたプローブセットを使用しない。代わりに、プローブセットのオリゴヌクレオチドは、シグナル増幅を可能にする技術であるハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）の開始剤として機能する核酸配列を提供し、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｉｎ ｓｉｔｕ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｐａｔｉａｌ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ，Ｎｅｕｒｏｎ ９２（２），ｐ．３４２－３５７を参照されたい。

「多重化エラーロバスト蛍光インサイチュハイブリダイゼーション」（ｍｅｒＦＩＳＨ）と呼ばれる別の技術は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５），ＲＮＡ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｓｐａｔｉａｌｌｙ ｒｅｓｏｌｖｅｄ，ｈｉｇｈｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｉｎ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４８（６２３３）：ａａａ６０９０に記載されている。そこで、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのその後の特異的ハイブリダイゼーションのための追加の配列要素を提供する特異的プローブセットを介して、目的のｍＲＮＡが検出される。各プローブセットは、合計１６個の配列要素のうちの４つの異なる配列要素を提供する。特異的プローブセットと目的のｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション後、いわゆる読み出しハイブリダイゼーションが行われる。各読み出しハイブリダイゼーションにおいて、配列要素の１つに相補的な１６個の蛍光標識オリゴヌクレオチドの１つがハイブリダイズする。全ての読み出しオリゴヌクレオチドは、同じ蛍光色を使用する。画像化後、蛍光シグナルは照射によって破壊され、次のラウンドの読み出しハイブリダイゼーションは変性ステップなしで行われる。結果として、各ｍＲＮＡ種についてバイナリコードが生成される。特異的プローブセットを目的のｍＲＮＡに結合させるための単一のハイブリダイゼーションラウンドのみを使用し、続いて単一の蛍光色で標識された読み出しオリゴヌクレオチドの１６ラウンドのハイブリダイゼーションを使用して、１６ラウンドの４つのシグナルの固有のシグナルシグネチャが作成される。

この技術の更なる開発は、２つの異なる蛍光色を使用することによってスループットを改善し、読み出しオリゴヌクレオチドと蛍光標識との間のジスルフィド切断と代替ハイブリダイゼーション緩衝液を介してシグナルを除去し、Ｍｏｆｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｅｒｒｏｒ－ｒｏｂｕｓｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．１１３（３９），ｐ．１１０４６－１１０５１を参照されたい。

「イントロンｓｅｑＦＩＳＨ」と称される技術は、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１８），Ｄｙｎａｍｉｃｓ ａｎｄ ｓｐａｔｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｓｃｅｎｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｂｙ ｉｎｔｒｏｎ ｓｅｑＦＩＳＨ，Ｃｅｌｌ １１７（２），ｐ．３６３－３７６に記載されている。そこで、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのその後の特異的ハイブリダイゼーションのための追加の配列要素を提供する特異的プローブセットを介して、目的のｍＲＮＡが検出される。各プローブセットは、色分けラウンドごとに１２個の可能な配列要素（使用される１２個の「擬似カラー」を表す）の１つを提供する。各色分けラウンドは、４つの連続ハイブリダイゼーションからなる。これらの連続ハイブリダイゼーションの各々において、各々が異なるフルオロフォアで標識された３つの読み出しプローブは、ｍＲＮＡ特異的プローブセットの対応する要素にハイブリダイズする。画像化後、５５％ホルムアミド緩衝液によって読み出しプローブを除去し、次のハイブリダイゼーションが続く。各々４回の連続ハイブリダイゼーションによる５ラウンドの色分けの後、色分けが完了する。

欧州特許第０ ６１１ ８２８号は、分析物に特異的に結合するプローブにシグナル発生要素を補充するための架橋要素の使用を開示している。より具体的な記述は、架橋核酸分子を補充する特異的プローブを介した核酸の検出について記載する。この架橋核酸は、最終的にシグナル生成核酸を補充する。この文献はまた、分岐ＤＮＡのようなシグナル増幅のためのシグナル発生要素のための２つ以上の結合部位を有する架橋要素の使用を記載している。

Ｐｌａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｐｙ ｇｅｎｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｂｒａｎｃｈｅｄ ＤＮＡ （ｂＤＮＡ） ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４９（５），ｐ．６０３－６１１は、目的の核酸が、追加の配列要素を提供する特異的プローブセットを介して検出される方法を記載している。第２のステップでは、プレ増幅器オリゴヌクレオチドは、この配列要素にハイブリダイズする。このプレ増幅器オリゴヌクレオチドは、後続のステップでハイブリダイズする増幅器オリゴヌクレオチドのための複数の結合部位を含む。これらの増幅器オリゴヌクレオチドは、標識オリゴヌクレオチドの複数の配列要素を提供する。このようにして、シグナルの増幅をもたらす分岐オリゴヌクレオチドツリーが構築される。

この方法の更なる開発は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２），ＲＮＡｓｃｏｐｅ：ａ ｎｏｖｅｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ＲＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ，ｐａｒａｆｆｉｎ－ｅｍｂｅｄｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１４（１），ｐ．２２－２９に記載され、これは、ｍＲＮＡ特異的プローブの別の設計を使用する。ここで、ｍＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドのうちの２つは、プレ増幅器オリゴヌクレオチドを補充することができる配列を提供するために、近接してハイブリダイズする必要がある。この方法では、偽陽性シグナルの数を低減することによって、方法の特異性が高められる。

Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（１１），ｐ．１２０８－１２１２は、「ＨＣＲハイブリダイゼーション連鎖反応」として知られている方法を開示している。目的のｍＲＮＡは、追加の配列要素を提供する特異的プローブセットを介して検出される。追加の配列要素は、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始するための開始剤配列である。基本的に、ハイブリダイゼーション連鎖反応は、第１のヘアピンが開始剤配列を介して開かれた後に、ポリマーに自己集合する準安定性オリゴヌクレオチドヘアピンに基づく。

本技術の更なる発展は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ技術と同様に、ＨＣＲの開始剤配列を形成するために近接してハイブリダイズしなければならない、いわゆる分割開始剤プローブを使用し、これにより偽陽性シグナルの数を減少させ、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８），Ｔｈｉｒｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｖｅｒｓａｔｉｌｅ，ｒｏｂｕｓｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５（１２）を参照されたい。

Ｍａｔｅｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ＤＮＡ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｓ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｖｏｌ，５６８，ｐ．４９ｆｆ．は、クロマチン構造の光学的再構築（ＯＲＣＡ）と呼ばれる方法を開示している。この方法は、染色体ラインを可視化することを意図している。

しかし、当該技術分野で公知の方法は、多数の欠点を有する。特に、それらは柔軟性がなく、高価で、複雑で、時間がかかり、不正確な結果をもたらすことが非常に多い。特に、既存の方法のコード化能力は低く、現代の分子生物学及び医学の要件を満たしていない。

この背景に対して、本発明の根底にある目的は、従来技術の方法の欠点を低減又は回避することができる方法を提供することである。

本発明は、これら及び他の必要性を満たす。

本発明は、試料中の分析物を逐次的にシグナルコードする方法を提供し、方法は、以下のステップ、
（１）分析物特異的プローブのセットを提供するステップであって、各分析物特異的プローブが、
－コード化される分析物のうちの１つと特異的に相互作用する結合要素（Ｓ）と、
－分析物特異的プローブのセットに固有のヌクレオチド配列（固有の識別子配列）を含む識別子要素（Ｔ）と、を含むステップと、
（２）分析物特異的プローブのセットを試料とインキュベートし、それによってコード化される分析物への分析物特異的プローブの特異的結合を可能にするステップと、
（３）試料から非結合プローブを除去するステップと、
（４）解読オリゴヌクレオチドのセットを提供するステップであって、各解読オリゴヌクレオチドが、
－固有の識別子配列の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のコネクタ要素（ｔ）と、
－シグナルオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を含むトランスレータ要素（ｃ）と、を含むステップと、
（５）解読オリゴヌクレオチドのセットを試料とインキュベートし、それによって固有の識別子配列への解読オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするステップと、
（６）試料から非結合解読オリゴヌクレオチドを除去するステップと、
（７）シグナルオリゴヌクレオチドのセットを提供するステップであって、各シグナルオリゴヌクレオチドが、
－トランスレータ要素（ｃ）のヌクレオチド配列の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のコネクタ要素（Ｃ）と、
－シグナル要素と、を含むステップと、
（８）シグナルオリゴヌクレオチドのセットを試料とインキュベートし、それによってトランスレータ要素（ｃ）へのシグナルオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするステップと、を含む。

本発明者らは、この新規の方法が、特異的ハイブリダイゼーションを介して試料中の異なる分析物又は異なる単一分析物分子の特異的な定量的及び／又は空間的検出又は計数を並行して可能にするプロセスを設定するのに必要な必須のステップを提供することを認識した。技術は、利用可能な異なるシグナルよりも多数の分析物を区別することを可能にする。他の最新技術の方法とは対照的に、検出可能なシグナルを提供するオリゴヌクレオチドは、試料特異的核酸配列と直接相互作用しないが、いわゆる「解読オリゴヌクレオチド」によって媒介される。この機構は、分析物特異的オリゴヌクレオチドとシグナルオリゴヌクレオチドとの間の依存性を切り離し、したがって、コード化能力の劇的な増加をもたらす。

本発明の別の主題は、試料中の分析物を逐次的にシグナルコードするための解読オリゴヌクレオチドのセットの使用であって、各解読オリゴヌクレオチドは、
－分析物特異的プローブのセットに固有であるヌクレオチド配列（固有の識別子配列）の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のコネクタ要素（ｔ）と、
－シグナルオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を含む、トランスレータ要素（ｃ）と、を含む。

本発明の更なる主題は、試料中の分析物を逐次的にシグナルコードするためのキットであって、
－分析物特異的プローブのセットであって、各分析物特異的プローブが、
－コード化される分析物のうちの１つと特異的に相互作用する結合要素（Ｓ）と、
－分析物特異的プローブのセットに固有のヌクレオチド配列（固有の識別子配列）を含む識別子要素（Ｔ）と、を含むセットと、及び
－解読オリゴヌクレオチドのセットであって、各解読オリゴヌクレオチドが、
－固有の識別子配列の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のコネクタ要素（ｔ）と、
－シグナルオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を含む、トランスレータ要素（ｃ）と、を含むセットと、好ましくは、
－シグナルオリゴヌクレオチドのセットであって、各シグナルオリゴヌクレオチドが、
－トランスレータ要素（ｃ）のヌクレオチド配列の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のコネクタ要素（Ｃ）と、
－シグナル要素と、を含むセットと、を含む。

解読オリゴヌクレオチドの使用は、はるかに高い柔軟性を可能にしながら、必要とされる異なるシグナルオリゴヌクレオチドの数を劇的に減少させ、それにより、達成されるコード化能力を増加させる。解読オリゴヌクレオチドの利用は、他の方法よりも柔軟で、安価で、単純で、高速で、及び／又はより正確な逐次的にシグナルコードする技術をもたらす。特に、本発明は、従来技術の方法と比較して、コード化能力の有意な増加をもたらす。

解読オリゴヌクレオチドの使用は、標的特異的プローブとシグナルオリゴヌクレオチドとの間の依存性を破壊する。最新技術の方法のように標的特異的プローブ及びシグナル生成を分離することなく、２つの異なる分子タグを使用する場合、２つの異なるシグナルを特定の標的についてのみ生成することができる。これらの分子タグの各々は、１回のみ使用することができる。同じ分子タグの複数回の読み出しは、標的に関する情報を増加させない。コード化スキームを作成するために、各ラウンド後の標的特異的プローブセットの変更が必要であるか（ＳｅｑＦＩＳＨ）又は複数の分子タグが同じプローブセットに存在しなければならない（ｍｅｒＦＩＳＨ、イントロンＳｅｑＦＩＳＨなど）。当技術分野におけるこれらの制限は非常に関連性があり、柔軟性、コード化能力、精度、再現性を低下させ、実験のコストを増加させる。

本発明によれば、「分析物」は、試料中に存在する又は存在しないとして特異的に検出され、それが存在する場合、コード化する対象である。分析物は、目的のタンパク質又は核酸分子（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を含む任意の種類の実体であり得る。分析物は、分析物特異的プローブとの特異的結合のための少なくとも１つの部位を提供する。本明細書では、「分析物」という用語は、「標的」に置き換えることがある。本発明による「分析物」は、対象の複合体、例えば、少なくとも２つの個々の核酸、タンパク質、又はペプチド分子を含む。本発明の一実施形態では、「分析物」は、染色体を除外する。本発明の別の実施形態では、「分析物」は、ＤＮＡを除外する。

本明細書で言及される「試料」は、コード化される分析物を含むことが疑われる液体又は固体形態の組成物である。

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、又はＲＮＡなどの短い核酸分子を指す。オリゴヌクレオチドの長さは、連続する配列要素の数に応じて、４～２００ヌクレオチド（ｎｔ）、好ましくは６～８０ヌクレオチド、より好ましくは８～６０ヌクレオチド、より好ましくは１０～５０ヌクレオチド、より好ましくは１２～３５の範囲内である。核酸分子は、完全に又は部分的に一本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、直鎖であってもよく、又はヘアピン若しくはループ構造を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、ビオチン、標識部分、ブロッキング部分、又は他の修飾などの修飾を含んでもよい。

「分析物特異的プローブ」は、少なくとも２つの要素、すなわち、分析物のうちの１つと特異的に相互作用するいわゆる結合要素（Ｓ）、及び「固有の識別子配列」を含むいわゆる識別子要素（Ｔ）からなる。結合要素（Ｓ）は、ハイブリダイゼーション配列又はアプタマーなどの核酸、又は抗体などのペプチド構造であってもよい。分析物特異的プローブに含まれる「固有の識別子配列」は、他の固有の識別子と比較して、その配列が固有である。この文脈における「固有の」は、それがサイクリンＡ、サイクリンＤ、サイクリンＥなどの１つの分析物のみを特異的に同定すること、又は代替的に、分析物の群が遺伝子ファミリーを含むか否かとは無関係に、分析物の群のみを特異的に同定することを意味する。したがって、この固有の識別子によってコード化される分析物又は分析物の群は、識別子要素（Ｔ）の固有の識別子配列に基づいてコード化される他の全ての分析物又は分析物の群と区別することができる。又は言い換えれば、特定の分析物又は分析物の群に対してただ１つの「固有の識別子配列」が存在するが、１つ以下、すなわち２つでさえない。固有の識別子配列の固有性により、識別子要素（Ｔ）は、正確に１種類の解読オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。固有の識別子配列の長さは、並行してコードされる分析物の数及び必要とされる相互作用の安定性に応じて、８～６０ｎｔ、好ましくは１２～４０ｎｔ、より好ましくは１４～２０ｎｔの範囲内である。固有の識別子は、直接又はリンカー、共有結合若しくは高親和性結合様式、例えば抗体－抗原相互作用、ストレプトアビジン－ビオチン相互作用などによって結合された、分析物特異的プローブの配列要素であってもよい。「分析物特異的プローブ」という用語は、各プローブが同じ分析物に結合するが、その異なる部分、例えばコードされる核酸分子に含まれるヌクレオチド配列の異なる（例えば、隣接する）又は重複部分に結合するように、それらの結合要素（Ｓ）が異なってもよい複数のプローブを含むことが理解される。しかし、複数のプローブの各々は、同じ識別子要素（Ｔ）を含む。

「解読オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの配列要素からなる。固有の識別子配列に特異的に結合することができる１つの配列要素は、「第１のコネクタ要素」（ｔ）と呼ばれ、シグナルオリゴヌクレオチドに特異的に結合する第２の配列要素は、「トランスレータ要素」（ｃ）と呼ばれる。配列要素の長さは、並行してコード化される分析物の数、必要とされる相互作用の安定性及び使用される異なるシグナルオリゴヌクレオチドの数に応じて、８～６０ｎｔ、好ましくは１２～４０ｎｔ、より好ましくは１４～２０ｎｔの範囲内である。２つの配列要素の長さは、同じであっても、そうでなくてもよい。

本明細書で使用される「シグナルオリゴヌクレオチド」は、２つの要素、すなわち、解読オリゴヌクレオチドのトランスレータ要素（ｃ）のヌクレオチド配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を有するいわゆる「第２のコネクタ要素」（Ｃ）、及び検出可能なシグナルを提供する「シグナル要素」を含む。この要素は、検出可能なシグナルを能動的に生成するか、又は操作、例えば蛍光励起を介してそのようなシグナルを提供することができる。典型的なシグナル要素は、例えば、検出可能な反応を触媒する酵素、フルオロフォア、放射性元素、又色素である。

「セット」は、複数の部分又は対象、例えば、分析物特異的プローブ又は解読オリゴヌクレオチドを指し、複数のメンバーが互いに同一であるか異なるかを問わない。本発明の一実施形態では、単一のセットは、複数のオリゴヌクレオチドを指す。

「分析物特異的プローブセット」は、複数の部分又は対象、例えば、互いに異なり、分析物の独立した領域に結合する分析物特異的プローブを指す。単一の分析物特異的プローブセットは、同じ固有の識別子によって更に特徴付けられる。

「解読オリゴヌクレオチドセット」は、コードワードの長さとは無関係にコード化を実現するために必要な特定の固有の識別子に特異的な複数の解読オリゴヌクレオチドを指す。「解読オリゴヌクレオチドセット」に含まれる解読オリゴヌクレオチドの各々及び全ては、分析物特異的プローブの同じ固有の識別子要素（Ｔ）に結合する。

「本質的に相補的」とは、２つのヌクレオチド配列を指す場合、両方の配列がストリンジェントな条件下で互いに特異的にハイブリダイズし、それによって、水素結合（ワトソン－クリック塩基対）を介して互いに連結されたセンス及びアンチセンス鎖を有するハイブリッド核酸分子を形成することができることを意味する。「本質的に相補的」は、鎖全体に沿った完全な塩基対形成、すなわち完全な相補的配列だけでなく、不完全な相補的配列も含むが、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズする能力を依然として有する。専門家の中では、「本質的に相補的な」配列は、完全に又は完璧に相補的な配列に対して少なくとも８８％の配列同一性を有することが十分に認められている。

次に、「配列同一性パーセント」又は「同一性パーセント」は、比較される配列（「比較配列」）と、記載又は特許請求される配列（「参照配列」）とのアライメント後に、配列が特許請求又は記載される配列と比較されることを意味する。次いで、以下の式に従って同一性パーセントを決定し、同一性パーセント＝１００［１－（Ｃ／Ｒ）］
式中、Ｃは、参照配列と比較配列との間のアライメントの長さにわたる参照配列と比較配列との間の差異の数であり、
（ｉ）比較配列中の対応する整列された塩基又はアミノ酸を有さない参照配列中の各塩基又はアミノ酸、及び
（ｉｉ）参照配列内の各ギャップ、及び
（ｉｉｉ）比較配列中の整列された塩基又はアミノ酸とは異なる参照配列中の各アライメントされた塩基又はアミノ酸は、差違を構成し、（ｉｉｉｉ）アライメントは、整列された配列の１位で開始する必要があり、
Ｒは、比較配列とのアライメントの長さにわたる参照配列中の塩基又はアミノ酸の数であり、参照配列中に作成された任意のギャップも塩基又はアミノ酸としてカウントされる。

上記で計算された同一性パーセントがおおよそ特定の最小同一性パーセント以上である比較配列と参照配列との間にアライメントが存在する場合、本明細書で上記で計算された同一性パーセントが特定の同一性パーセント未満であるアライメントが存在し得るとしても、比較配列は、参照配列に対して特定の最小同一性パーセントを有する。

本明細書で理解される「インキュベーション」ステップでは、プローブ又はオリゴヌクレオチドなどの各々の部分又は対象を、特異的結合又はハイブリダイゼーション反応を可能にする当業者に公知の条件下、例えば、ｐＨ、温度、塩条件などで互いに接触させる。したがって、そのようなステップは、好ましくは、当技術分野で公知の緩衝系などの液体環境で行われてもよい。

本発明による「除去」ステップは、当技術分野で公知のように、特定の条件、例えば、ｐＨ、温度、塩条件などによって、プローブ又はオリゴヌクレオチドなどの除去される部分又は対象の洗浄を含んでもよい。

本発明による方法の一実施形態では、複数の分析物を並行してコード化することができることが理解される。これは、ステップ（１）における異なるセットの分析物特異的プローブの使用を必要とする。特定のセットの分析物特異的プローブは、別のセットの分析物特異的プローブとは異なる。これは、セット１の分析物特異的プローブが分析物１に結合し、セット２の分析物特異的プローブは分析物２に結合し、セット３の分析物特異的プローブは分析物３に結合することなどを意味する。この実施形態では、異なるセットの解読オリゴヌクレオチドの使用もステップ（４）で必要とされる。特定のセットの解読オリゴヌクレオチドは、別のセットの解読オリゴヌクレオチドとは異なる。これは、セット１の解読オリゴヌクレオチドが上記の分析物特異的プローブのセット１の分析物特異的プローブに結合し、セット２の解読オリゴヌクレオチドが上記の分析物特異的プローブのセット２の分析物特異的プローブに結合し、セット３の解読オリゴヌクレオチドが上記の分析物特異的プローブのセット３の分析物特異的プローブに結合することなどを意味する。複数の分析物が並行してコード化されるこの実施形態では、分析物特異的プローブの異なるセットが、分析物特異的プローブの異なるセットの予備混合物としてステップ（１）で提供されてもよく、及び／又は解読オリゴヌクレオチドの異なるセットが解読オリゴヌクレオチドの異なるセットの予備混合物としてステップ（４）で提供されてもよい。各混合物は、単一のバイアルに含まれてもよい。或いは、分析物特異的プローブの異なるセット及び／又は解読オリゴヌクレオチドの異なるセットは、ステップ（１）及び／又は（４）において単独で提供されてもよい。

「キット」は、本発明の使用及び／又は方法を実行するのに有用な個々の要素の組み合わせであり、要素は、方法で一緒に使用するために最適化されている。キットはまた、本発明による方法を実行するのに有用であってもよい追加の試薬、化学物質、緩衝液、反応バイアルなどを含んでもよい。そのようなキットは、本発明による方法を実施するために必要な全ての本質的な要素を統合し、したがって、エラーのリスクを最小限に抑える。したがって、そのようなキットはまた、半熟練の実験スタッフが本発明による方法を実施することを可能にする。

本明細書で特定される特徴、特性、利点、及び実施形態は、具体的に示されていなくても、本発明による方法、使用、及びキットに適用される。

本発明の一実施形態では、試料は、生物学的試料であり、好ましくは生物学的組織を含み、更に好ましくは生物学的細胞を含む。生物学的試料は、器官、オルガノイド、細胞培養物、幹細胞、細胞懸濁液、初代細胞、ウイルス、細菌又は真菌に感染した試料、真核生物又は原核生物試料、塗抹、疾患試料、組織切片に由来してもよい。

この方法は、生物学的試料、すなわち、当該分析物として核酸又はタンパク質を含む試料中の分析物又は単一の分析物分子をコード化、同定、検出、計数又は定量するのに特に適している。生物学的試料は、その天然の環境にあるような形態（すなわち、液体、半液体、固体など）であってもよいか、又は例えば、方法が実施される前に再液化されてもよい装置の表面上の乾燥フィルムとして処理されてもよいことが理解される。

本発明の別の実施形態では、ステップ（２）の前に、生物学的組織及び／又は生物学的細胞が固定されている。

この測定は、コード化される分析物、例えば、核酸又はタンパク質が固定化され、逃げることができないという利点を有する。そうすることで、分析物は、本発明による方法によってより良好な検出又はコード化のために調製される。試料の固定は、例えば、ホルマリン、エタノール、メタノール、又は当業者に公知の他の成分によって実行することができる。

なお更なる実施形態では、分析物特異的プローブのセット内で、個々の分析物特異的プローブは、コード化される分析物の１つの異なるサブ構造と特異的に相互作用する結合要素（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５）を含む。

この手段により、方法又はサイクルの終わりに得られるシグナル強度がそれぞれ増加するため、方法は更により堅牢で信頼性が高くなる。セットの個々のプローブは、同じ分析物に結合するが、分析物における又は分析物上のそれらの結合位置又は結合部位が異なることが理解される。したがって、第１、第２、第３、第４、第５などの分析物特異的プローブの結合要素Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５などは、異なる位置に結合するが、重複してもしなくてもよい。

本発明による方法の別の実施形態では、以下の追加のステップ、
（９）当該試料から非結合シグナルオリゴヌクレオチドを除去するステップと、
（１０）シグナルを検出するステップと、を含む。

この手段により、方法は、シグナル要素を可視化するように適合された任意の手段によって、コード化された分析物を検出することができる程度まで更に開発される。検出可能な物理的特徴の例としては、例えば、光、化学反応、分子量、放射能などが挙げられる。

本発明による方法の更なる実施形態では、以下の追加のステップ、
（１１）試料から解読オリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドを選択的に除去し、それによってコード化される分析物への分析物特異的プローブの特異的結合を本質的に維持するステップが実行される。

この手段により、同じ分析物特異的プローブへの更なる解読オリゴヌクレオチドを結合させる別のラウンドの必要性が確立され、したがって最終的に２つ以上のシグナルを含むコード又はコード化スキームが得られる。このステップは、当業者に公知の条件及び因子、例えば、ｐＨ、温度、塩条件、オリゴヌクレオチド濃度、ポリマーなどを適用することによって実現される。

本発明の別の実施形態では、方法は、以下のステップ、
（１２）ステップ（４）～（１１）を少なくとも１回［（４_２）～（１１_２）］繰り返して、少なくとも２つのシグナルからなるコード化スキームを生成するステップを含む。

この手段により、２つ以上のシグナルのコードが設定され、すなわち、ユーザによって実行される２つの［（４_２）－（１１_２）］、３つの［（４_３）－（１１_３）］、４つの［（４_４）－（１１_４）］、５つの［（４_５）－（１１_５）］など［（４_ｎ）－（１１_ｎ）］ラウンドの場合、２つ、３つ、４つ、５つなどのシグナルのコードが設定され、ここで「ｎ」はラウンドの数を表す整数である。本発明による方法のコード化能力は、分析物の性質及びオペレータの必要性に応じて増加する。

本発明の一実施形態では、当該コード化スキームは、予め決定され、コード化される分析物に割り当てられる。

この手段は、使用される解読オリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドの適切な連続的順序を提供することによって正確な実験設定を可能にし、したがって、それぞれのコード化スキームへの特定の分析物の正しい割り当てを可能にする。

反復ステップ（４_２）～（１１_２）で使用される解読オリゴヌクレオチドは、前のステップ（４）～（１１）で使用された解読オリゴヌクレオチドのトランスレータ要素（ｃ１）と同一であるトランスレータ要素（ｃ２）を含んでもよい。本発明の別の実施形態では、解読オリゴヌクレオチドは、前のステップ（４）～（１１）で使用された解読オリゴヌクレオチドのトランスレータ要素（ｃ１）とは異なるトランスレータ要素（ｃ２）を含む反復ステップ（４_２）～（１１_２）で使用される。

解読要素は、ラウンドごとに、すなわち、トランスレータ要素ｃ２を含む第２のラウンド（４_２）～（１１_２）、トランスレータ要素ｃ３を含む第３のラウンド（４_３）～（１１_３）、トランスレータ要素ｃ４を含む第４のラウンド（４_４）～（１１_４）、トランスレータ要素ｃ５を含む第５のラウンド、トランスレータ要素ｃｎを含む「ｎ」ラウンド（４_ｎ）～（１１_ｎ）などで変更されてもされなくてもよく、「ｎ」はラウンドの数を表す整数であることを理解されたい。

反復ステップ（４_２）～（１１_２）で使用されるシグナルオリゴヌクレオチドは、前のステップ（４）～（１１）で使用された解読オリゴヌクレオチドのシグナル要素と同一であるシグナル要素を含んでもよい。本発明の更なる実施形態では、シグナルオリゴヌクレオチドは、前のステップ（４）～（１１）で使用された解読オリゴヌクレオチドのシグナル要素とは異なるシグナル要素を含む反復ステップ（４_２）～（１１_２）で使用される。

この手段により、同一又は異なるシグナルが各ラウンドに提供され、多数の異なるシグナルからなるシグナル配列を特徴とするコード化スキームが得られる。この手段は、コード化スキームの他の全てのコードワードとは異なる固有のコード又はコードワードの作成を可能にする。

本発明の別の実施形態では、分析物特異的プローブの結合要素（Ｓ）は、コード化される分析物への特異的結合、好ましくはコード化される分析物への特異的ハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

この手段は、特定のＤＮＡ分子、例えばゲノムＤＮＡ、核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、細菌ＤＮＡ、細胞外若しくは細胞内ＤＮＡなど、又は特定のｍＲＮＡ分子、例えばｈｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、細胞外若しくは細胞内ＲＮＡなど、核酸分析物をコードするための条件を作り出す。

本発明の代替実施形態では、分析物特異的プローブの結合要素（Ｓ）は、コード化される分析物への特異的結合を可能にするアミノ酸配列を含み、好ましくは結合要素は抗体である。

この手段は、ｍＲＮＡ、例えば特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡなどの核酸分析物をコードするための条件を作り出す。

別の実施形態では、コード化又は検出される分析物は、核酸、好ましくはＤＮＡ若しくはＲＮＡ、更に好ましくはｍＲＮＡであり、及び／又は代替的に、解読される分析物は、ペプチド又はタンパク質である。

この手段により、本発明は、臨床ルーチン又は生物学的問題の焦点において最も重要であるこのような種類の分析物の検出に適合される。

前述の特徴及び以下で言及される特徴は、それぞれの場合に示される組み合わせで使用することができるだけでなく、本発明の目的から逸脱することなく、他の組み合わせ又は分離された方法でも使用することができることを理解されたい。

ここで、本発明を、本発明の更なる特徴、特性及び利点をもたらす実施形態によって更に説明する。実施形態は、純粋な例示的な性質のものであり、本発明の目的又は範囲を限定するものではない。特定の実施形態で言及される特徴は、特定の実施形態に適用可能であるだけでなく、本発明の任意の実施形態の文脈において、分離された方法でも適用可能な本発明の一般的な特徴である。

以下の非限定的な例及び図面を参照することによって、本発明を更に詳細に記述及び説明する。
図１は、分析物が核酸であり、プローブセットが、分析物に特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む、実施形態。プローブは、解読オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする固有の識別子配列を含む。 図２は、分析物がタンパク質であり、プローブセットが分析物に特異的に結合するタンパク質（ここで、抗体）を含む実施形態。プローブは、解読オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にする固有の識別子配列を含む。 図３は、本発明による方法のフローチャート。 図４は、解読オリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドを適用するための代替選択肢。 図５は、２つの異なるシグナルタイプ及び３つの検出ラウンドによる３つの異なる核酸配列のシグナルコード化の例。この例では、コード化スキームは、エラー検出を含む。 図６は、検出サイクル数に対する生成されたコードワードの数（対数スケール）。 図７は、単一ステップの効率に基づく５ラウンドコード化スキームの計算された総効率。 図８は、異なる実験間の相対転写物存在量の比較。 図９は、異なる実験間の相対転写物存在量の相関。 図１０は、シグナルの細胞間分布の比較。 図１１は、シグナルの細胞内分布の比較。 図１２は、異なる細胞サイクル依存転写物の分布パターン。

例
１．序論
本明細書に開示される方法は、多くの異なる分析物を並行して特異的に検出するために使用される。技術は、異なるシグナルが利用可能であるよりも多数の分析物を区別することを可能にする。プロセスは、好ましくは、少なくとも２回の連続するラウンドの特異的結合、シグナル検出及び選択的変性（次のラウンドが必要な場合）を含み、最終的にシグナルコードを生成する。分析物特異的結合と検出可能なシグナルを提供するオリゴヌクレオチドとの間の依存性を分離するために、いわゆる「解読」オリゴヌクレオチドが導入される。解読オリゴヌクレオチドは、分析物特異的プローブセットの情報をシグナルオリゴヌクレオチドに転写する。

第１の適用変形例では、分析物又は標的は、核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであり、プローブセットは、検出される核酸配列の配列全体又は部分配列に部分的又は完全に相補的なオリゴヌクレオチドを含む（図１）。検出される標的核酸配列に特異的にハイブリダイズする結合要素（Ｓ）、及び当該分析物特異的プローブのセットに固有のヌクレオチド配列（固有の識別子配列）を含む識別子要素（Ｔ）を含む分析物特異的プローブ（１）を含む核酸配列特異的オリゴヌクレオチドプローブセット。

第２の適用変形例では、分析物又は標的は、タンパク質であり、プローブセットは１つ又は複数のタンパク質、例えば抗体を含む（図２）。検出される標的タンパク質と特異的に相互作用する抗体の（超）可変領域などの結合要素（Ｔ）及び識別子要素（Ｔ）を含む分析物特異的プローブ（１）を含むタンパク質特異的プローブセット。

第３の適用変形例では、少なくとも１つの分析物は、核酸であり、少なくとも第２の分析物は、タンパク質であり、少なくとも第１のプローブセットは、核酸配列に結合し、少なくとも第２のプローブセットは、タンパク質分析物に特異的に結合する。他の組み合わせも可能である。

２．本発明による一般的な方法
ワークフローをより深く解明するために、以下のワークフローが第１の適用変形例で制限される。熟練者は、例示的なワークフローを他の適用に容易に適合させることができる。方法ステップは、図３のフローチャートに示されている。

ステップ１：分析物又は標的特異的プローブセットの適用。標的核酸配列を、標的核酸に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプローブセットと共にインキュベートする。この例では、５つの異なるプローブのプローブセットが示され、各々は、標的核酸配列（Ｓ１～Ｓ５）の個々の部分配列に相補的な配列要素を含む。この例では、領域は重複しない。同じ核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチドの各々は、それぞれ、識別子要素又は固有の識別子配列（Ｔ）を含む。

ステップ２：プローブセットのハイブリダイゼーション。プローブセットは、特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で標的核酸配列にハイブリダイズする。インキュベーション後、プローブをそれらの対応する標的配列にハイブリダイズさせ、次のステップの識別子要素（Ｔ）を提供する。

ステップ３：非結合プローブの除去。ハイブリダイゼーション後、例えば、洗浄ステップによって、非結合オリゴヌクレオチドを除去する。

ステップ４：解読オリゴヌクレオチドの適用。少なくとも２つの配列要素（ｔ）及び（ｃ）からなる解読オリゴヌクレオチドを適用する。配列要素（ｔ）は、固有の識別子配列（Ｔ）に相補的であるが、配列要素（ｃ）は、シグナルオリゴヌクレオチド（トランスレータ要素）のその後のハイブリダイゼーションのための領域を提供する。

ステップ５：解読オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション。解読オリゴヌクレオチドは、それらの相補的な第１の配列要素（ｔ）を介してプローブ（Ｔ）の固有の識別子配列とハイブリダイズする。インキュベーション後、解読オリゴヌクレオチドは、その後のハイブリダイゼーションステップのために、トランスレータ配列要素（ｃ）を提供する。

ステップ６：過剰な解読オリゴヌクレオチドの除去。ハイブリダイゼーション後、例えば、洗浄ステップによって、非結合解読オリゴヌクレオチドを除去する。

ステップ７：シグナルオリゴヌクレオチドの適用。シグナルオリゴヌクレオチドを適用する。シグナルオリゴヌクレオチドは、トランスレータ配列要素（ｃ）と本質的に相補的である少なくとも１つの第２のコネクタ要素（Ｃ）と、検出可能なシグナル（Ｆ）を提供する少なくとも１つのシグナル要素とを含む。

ステップ８：シグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション。シグナルオリゴヌクレオチドは、相補的配列コネクタ要素（Ｃ）を介して、解読オリゴヌクレオチドのトランスレータ要素（ｃ）にハイブリダイズする。インキュベーション後、シグナルオリゴヌクレオチドをそれらの対応する解読オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、検出することができるシグナル（Ｆ）を提供する。

ステップ９：過剰なシグナルオリゴヌクレオチドの除去。ハイブリダイゼーション後、例えば、洗浄ステップによって、非結合シグナルオリゴヌクレオチドを除去する。

ステップ１０：シグナル検出。シグナルオリゴヌクレオチドによって提供されるシグナルが検出される。

最後の検出ラウンドでは、以下のステップ（ステップ１１及び１２）は不要である。

ステップ１１：選択的変性。固有の識別子配列（Ｔ）と解読オリゴヌクレオチドの第１の配列要素（ｔ）との間のハイブリダイゼーションが溶解される。不安定化は、例えば、温度の上昇、変性剤などの当業者に周知の異なる機構を介して達成することができる。標的又は分析物特異的プローブは、このステップの影響を受けない。

ステップ１２：変性された解読オリゴヌクレオチドの除去。変性された解読オリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドを除去し（例えば、洗浄ステップによって）、遊離の固有の識別子配列を有する特異的プローブセットを残し、ハイブリダイゼーション及び検出の次のラウンドで再利用可能にする（ステップ４～１０）。この検出サイクル（ステップ４～１２）は、計画されたコード化スキームが完了するまで「ｎ」回繰り返される。

検出の各ラウンドにおいて、特定の固有の識別子によって提供されるシグナルのタイプは、特定の解読オリゴヌクレオチドの使用によって制御されることに留意されたい。結果として、検出サイクルに適用された解読オリゴヌクレオチドの配列は、プローブセットの結合特異性を固有のシグナル配列に転写する。

３．解読及びシグナルオリゴヌクレオチドを適用するための代替選択肢
解読オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ステップ４～６）及びシグナルオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ステップ７～９）のステップはまた、図４に示すように、２つの代替的な方法で組み合わせることもできる。

選択肢１：同時ハイブリダイゼーション。図３のステップ４～９の代わりに、解読オリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションも同時に行うことができ、過剰な解読及びシグナルオリゴヌクレオチドを除去した後、図３のステップ９に示されるものと同じ結果をもたらすことができる。

選択肢２：プレインキュベーション。図３の選択肢１に加えて、既に結合した特異的プローブセット有する標的核酸に適用する前に、解読及びシグナルオリゴヌクレオチドを別個の反応でプレインキュベートすることができる。

４．２つの異なるシグナルタイプ及び３つの検出ラウンドによる３つの異なる核酸配列のシグナルコード化の例
図３は、解読オリゴヌクレオチドによって媒介される特異的シグナルの生成及び検出の一般的な概念を示す。この手順によって達成することができるコード化の一般的な概念は示されていない。コード化スキームの生成について図３に示すプロセスの使用を説明するために、図５は、３つの異なる核酸配列を用いた複数のラウンドコード化実験の一般的な例を示す。この例では、コード化スキームは、エラー検出を含む。

ステップ１：標的核酸。この例では、３つの異なる標的核酸（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）は、２つの異なるタイプのシグナルのみを使用することによって検出及び区別される必要がある。実験を開始する前に、特定のコード化スキームが設定される。この例では、３つの異なる核酸配列は、エラー検出を可能にするために、２つの異なるシグナル（１）及び（２）並びに得られるハミング距離２を用いた３回ラウンドの検出によってコードされる。計画されたコードワードは以下のとおりである。
配列Ａ：（１）－（２）－（２）、
配列Ｂ：（１）－（１）－（１）、
配列Ｃ：（２）－（１）－（２）。

ステップ２：プローブセットのハイブリダイゼーション。各標的核酸について、独自のプローブセットが適用され、特異的に対象となる核酸配列にハイブリダイズする。各プローブセットは、固有の識別子配列（Ｔ１）、（Ｔ２）又は（Ｔ３）を提供する。このようにして、各異なる標的核酸が固有に標識される。この例では、配列（Ｔ）は（Ｔ１）、配列（Ｂ）は（Ｔ２）、配列（Ｃ）は（Ｔ３）で標識される。図は、図３のステップ１～３を要約する。

ステップ３：解読オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション。存在する各固有の識別子について、特定の解読オリゴヌクレオチドが、その第１の配列要素（ここで、（ｔ１）～（Ｔ１）、（ｔ２）～（Ｔ２）、（ｔ３）～（Ｔ３））によって対応する固有の識別子配列に特異的にハイブリダイズするように適用される。解読オリゴヌクレオチドの各々は、シグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後に生成されるシグナルを定義するトランスレータ要素を提供する。ここで、核酸配列（Ａ）及び（Ｂ）は、トランスレータ要素（ｃ１）で標識され、配列（Ｃ）は、（ｃ２）で標識される。図は、図３のステップ４～６を要約する。

ステップ４：シグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション。トランスレータ要素の各タイプについて、他のシグナルオリゴヌクレオチドのシグナルと区別可能な特定のシグナル（２）を有するシグナルオリゴヌクレオチドを適用する。このシグナルオリゴヌクレオチドは、対応するトランスレータ要素に特異的にハイブリダイズすることができる。図は、図３のステップ７～９を要約する。

ステップ５：コード化スキームのシグナル検出。異なるシグナルが検出される。この例では、核酸配列（Ｃ）は、それが提供する固有のシグナル（２）によって他の配列と区別することができるが、配列（Ａ）及び（Ｂ）は同じ種類のシグナル（１）を提供し、最初の検出サイクル後には区別することができないことに留意されたい。これは、検出される異なる核酸配列の数が利用可能な異なるシグナルの数を超えるという事実に起因する。図は、図３のステップ１０に対応する。

ステップ６：選択的変性。検出される全ての核酸配列の解読（及びシグナル）オリゴヌクレオチドは、図３のステップ１１及び１２に記載されるように、選択的に変性され、除去される。その後、異なるプローブセットの固有の識別子配列を、次のラウンドのハイブリダイゼーション及び検出のために使用することができる。

ステップ７：第２ラウンドの検出。ハイブリダイゼーション及び検出の次のラウンドは、ステップ３～５に記載されているように行われる。この新しいラウンドでは、異なる解読オリゴヌクレオチドの混合が変更されることに留意されたい。例えば、第１ラウンドで使用される核酸配列（Ａ）の解読オリゴヌクレオチドは配列要素（ｔ１）及び（ｃ１）からなり、新しい解読オリゴヌクレオチドは配列要素（ｔ１）及び（ｃ２）からなる。ここで、第１及び第２ラウンドのシグナルとの固有の組み合わせにより、３つの配列全てを明確に区別できることに留意されたい。

ステップ８：第３ラウンドの検出。再び、解読オリゴヌクレオチドの新しい組み合わせが使用され、新しいシグナルの組み合わせがもたらされる。シグナル検出後、３つの異なる核酸配列の結果として得られたコードワードは、固有であり、識別可能であるだけでなく、他のコードワードに対して２のハミング距離を含む。ハミング距離に起因して、シグナルの検出（シグナル交換）のエラーは、有効なコードワードをもたらさず、したがって検出することができる。このようにして、３つの異なる核酸を２つの異なるシグナルで３回の検出ラウンドで区別することができ、エラー検出が可能になる。

５．従来技術に対する利点
コード化戦略
最新技術の方法と比較して、本発明による方法の１つの特定の利点は、標的特異的プローブとシグナルオリゴヌクレオチドとの間の依存性を破壊する解読オリゴヌクレオチドの使用である。

標的特異的プローブ及びシグナル生成を分離することなく、２つの異なる分子タグを使用する場合、２つの異なるシグナルを特定の標的についてのみ生成することができる。これらの分子タグの各々は、１回のみ使用することができる。同じ分子タグの複数回の読み出しは、標的に関する情報を増加させない。コード化スキームを作成するために、各ラウンド後の標的特異的プローブセットの変更が必要であるか（ＳｅｑＦＩＳＨ）又は複数の分子タグが同じプローブセットに存在しなければならない（ｍｅｒＦＩＳＨ、イントロンＳｅｑＦＩＳＨなど）。

本発明による方法に続いて、異なるシグナルは、同じ固有の識別子（分子タグ）及び少数の異なる、ほとんどコスト集約的なシグナルオリゴヌクレオチドを再利用する解読オリゴヌクレオチドを使用することによって達成される。これは、他の方法とは対照的に、いくつかの利点をもたらす。
（１）コード化スキームは、従来技術の他の全ての方法の場合のように、標的特異的プローブセットによって定義されない。ここで、コード化スキームは、解読オリゴヌクレオチドによって転写される。これにより、ラウンド数に関するはるかに高い柔軟性及びコードワードのシグナル選択の自由度がもたらされる。先行技術の方法（例えば、ｍｅｒＦＩＳＨ又はイントロンＳｅｑＦＩＳＨ）を見ると、全ての標的配列に対するコード化スキーム（検出可能なシグナルの数、タイプ及び配列）は、特異的プローブセット上の異なるタグ配列の存在によって事前に定義される（ｍｅｒＦＩＳＨの場合はプローブセットあたり１６個の異なるタグのうち４個、イントロンＦＩＳＨの場合は６０個の異なるタグのうち５個）。プローブセットあたり十分な数の異なるタグを作製するために、方法は、１つの標的特異的オリゴヌクレオチド上にいくつかのタグが存在するかなり複雑なオリゴヌクレオチド設計を使用する。特定の標的核酸のコード化スキームを変更するために、特異的プローブセットを交換する必要がある。本発明による方法は、新しい情報を生成するために検出ラウンドごとに再利用することができるので、分析物ごとに単一の固有のタグ配列（固有の識別子）の使用を記載する。コード化スキームは、検出ラウンドで使用される解読オリゴヌクレオチドの順序によって定義される。したがって、コード化スキームは、特異的プローブ（又は固有のタグ配列）によって事前に定義されないが、実験中でも異なる必要性に合わせて調整することができる。これは、検出ラウンドで使用される解読オリゴヌクレオチドを単に変更するか、又は追加の検出ラウンドを追加することによって達成される。
（２）異なるシグナルオリゴヌクレオチドの数は、従来技術の方法（ｍｅｒＦＩＳＨの場合は１６、イントロンＳｅｑＦＩＳＨの場合は６０）で異なるタグ配列の数と一致しなければならない。本発明による方法を使用すると、異なるシグナルオリゴヌクレオチドの数は、使用される異なるシグナルの数と一致する。これにより、シグナルオリゴヌクレオチドの数は、本明細書に記載の方法について一定のままであり、異なるシグナルの数を超えないが、従来技術の方法におけるコード化スキームの複雑さと共に増加する（より多くの検出ラウンドが、より多くの異なるシグナルオリゴヌクレオチドを必要とする）。結果として、本明細書に記載の方法は、非常に低い複雑さ（環境とのシグナルオリゴヌクレオチドの相互作用又は互いに）をもたらし、主要なコスト要因がシグナルオリゴヌクレオチドであるため、アッセイのコストを劇的に低減する。
（３）先行技術の方法では、標的特異的プローブセットによって生成される異なるシグナルの数は、プローブセットが提供することができる異なるタグ配列の数によって制限される。各追加のタグ配列は標的特異的プローブの総サイズを増加させるため、単一のプローブが提供することができる異なるタグの数に制限がある。この制限は、いくつかの問題（意図しない分子間及び分子内相互作用、コスト、拡散速度、安定性、合成中の誤差など）のサイズ依存性の増加によって与えられる。更に、特定の分析物に適用することができる標的特異的プローブの総数の制限がある。核酸の場合、この制限は、標的配列の長さ及び適切な結合部位の割合によって与えられる。これらの要因は、プローブセットが提供することができる異なるシグナルの数に深刻な制限をもたらす（ｍｅｒＦＩＳＨの場合は４つのシグナル、イントロンＳｅｑＦＩＳＨの場合は５つのシグナル）。この制限は、特定の数の検出ラウンドで生成することができる異なるコードワードの数に実質的に影響を及ぼす。本発明の手法では、１つのタグのみが必要であり、全ての検出ラウンドで自由に再利用することができる。これは、オリゴヌクレオチドの複雑度／長さを低くすると同時に、可能な最大コード効率（色の数、^{ラウンドの数}）をもたらす。他の方法と比較した本発明者らの方法のコード化能力の膨大な差を図１及び５に示す。これにより、本発明の手法では、同じ量の情報を生成するために必要な検出ラウンドの数がはるかに少なくなる。検出ラウンドの数が少ないほど、コストが低く、実験時間が短く、複雑さが低く、安定性及び成功率が高く、収集及び分析されるデータの量が少なく、結果の精度が高いことにつながる。

コード化能力
以下の表１で比較した３つの方法は全て、異なる検出ラウンド間で変性しない特異的プローブセットを使用する。イントロンＳｅｑＦＩＳＨの場合、１つのコード化ラウンドの疑似色を生成するために必要な４つの検出ラウンドがあり、したがって、データは、ラウンド４、８、１２、１６及び２０についてのみ与えられる。ｍｅｒＦＩＳＨ法は、一定数の４シグナルを使用し、したがって、データは、可能な限り少ないラウンド数で始まる。８つの検出ラウンドの後、本発明者らの方法は、２０ラウンドのｍｅｒＦＩＳＨで到達した最大コード化能力（１つのアスタリスクで示す）を超え、１２ラウンドの検出の後、イントロンＦＩＳＨの最大コード化能力（２つのアスタリスクで示す）を超える。本発明による方法では、（イントロンＳｅｑＦＩＳＨと同様に）３つの異なるシグナルの使用が想定される。

図６に示すように、ｍｅｒＦＩＳＨのコードワードの数は、検出サイクル数と共に指数関数的に増加しないが、各ラウンドを追加すると効果が低下する。対照的に、本発明による方法におけるイントロンＳｅｑＦＩＳＨのコードワードの数は、指数関数的に増加する。提案された方法の曲線の傾きは、イントロンＦＩＳＨの傾きよりもはるかに高く、２０ラウンドの検出後に使用可能な１０，０００倍を超えるコードワードをもたらす。

このコード化能力の最大効率は、ｓｅｑＦＩＳＨの場合にも達成され、この場合、特異的プローブが検出ラウンド毎に変性され、新しいプローブセットが検出ラウンド毎に標的配列に特異的にハイブリダイズされることに留意されたい。しかし、この方法は、それらのコード化スキーム（他の全ての方法）のためにただ１つの特異的ハイブリダイゼーションを使用する技術に対する大きな欠点を有する。
（１）特異的プローブの効率的な変性のためには、むしろ粗条件（高温、高濃度の変性剤、長いインキュベーション時間）を使用しなければならず、分析物の損失又は損傷の可能性がはるかに高くなる。
（２）検出の各ラウンドについて、全ての標的核酸配列に対して独自のプローブセットを使用しなければならない。したがって、実験に必要な特異的プローブの数は、コード化スキームに必要な異なるシグナルの数に比例する。これは、アッセイの複雑さ及びコストを劇的に増加させる。
（３）全ての標的核酸分子のハイブリダイゼーション効率は、いくつかの確率的効果を受けるため、異なる検出ラウンド間のシグナル強度の変動は、１つの特異的ハイブリダイゼーション事象のみを使用する方法よりもはるかに高く、完全なコードの割合を減少させる。
（４）特異的ハイブリダイゼーションに必要な時間は、シグナルオリゴヌクレオチド又は解読オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション（イントロンＳｅｑＦＩＳＨ、ｍｅｒＦＩＳＨ及びｓｅｑＦＩＳＨ刊行物の方法部分に見ることができるように）よりもはるかに長く、これは実験を完了するのに必要な時間を劇的に増加させる。

これらの理由から、全ての他の方法は、単一の特異的ハイブリダイゼーション事象を使用し、より低いコード複雑性の主な欠点、したがってより多くの検出ラウンドの必要性及びより高いオリゴヌクレオチド設計の複雑性を受け入れる。

本発明による方法は、このような方法の主要な問題を排除しながら、ｓｅｑＦＩＳＨの利点（主に、コード化スキームに関する完全な自由度）を、ただ１つの特異的ハイブリダイゼーション事象を使用する方法の全ての利点と組み合わせる。

２０ラウンド後に生成された多数のコードワードを使用して、異なるコードワード間により高いハミング距離（差）を導入することもでき、１、２、又は更により多くのエラー、更にはエラー補正のエラー検出を可能にすることに留意されたい。したがって、非常に高いコード化能力であっても、依然として実際的に適切である。

６． 選択的変性、オリゴヌクレオチドアセンブリ、及び固有の識別子の再利用は驚くほど効率的である。
本発明による方法の重要な要素は、解読オリゴヌクレオチド結合、シグナルオリゴヌクレオチド結合、シグナル検出及び選択的変性の連続的なプロセスである。コード化スキームを生成するために、このプロセスを（コードワードの長さに応じて）数回繰り返す必要がある。同じ固有の識別子が全ての検出サイクルで再使用されるため、最初の検出サイクルから最後の検出サイクルまでの全てのイベントは互いに依存している。更に、選択的変性は、２つの異なるイベントに依存する。解読オリゴヌクレオチドは、最も高い効率を有する固有の識別子から溶解されなければならないが、特異的プローブは、最高効率でハイブリダイズされたままでなければならない。

これにより、コード化プロセス全体の効率Ｅは、以下の式によって記述することができる。

この式に基づいて、各単一ステップの効率は、方法の所与の総効率について推定することができる。計算は、各プロセスが同じ効率を有することを仮定することに基づく。総効率は、存在する全シグナルのうち解読に成功可能なシグナルの部分を表す。

方法の総効率は、式によって記述される異なる因子の各単一ステップの効率に依存する。均等に分布した効率の仮定の下で、図７に示すように、総効率を単一ステップ効率に対してプロットすることができる。見て分かるように、５回の検出サイクルを有する符コード化スキームの実際に適切な総効率は、明らかに９０％を超える単一ステップ効率でのみ達成することができる。例えば、５０％の総効率を達成するために、９７．８％の各単一ステップ内の平均効率が必要である。これらの計算は、１００％シグナル検出及び分析効率の仮定に基づいている。様々な配列のオリゴヌクレオチドの広いＤＮＡ融解曲線のために、本発明者らは、実験前に、選択的変性は、解読オリゴヌクレオチドの変性に対してあまり効率的ではなく、配列特異的結合プローブは十分に安定ではないと仮定した。この仮定とは対照的に、本発明者らは、全てのステップの驚くべき有効性及び選択的変性中の配列特異的プローブの高い安定性を見出した。

実験的に、本発明者らは、５回の検出サイクルに基づいて、約３０％～６５％の総解読効率を達成した。上記の式による各単一ステップ（Ｂｓｐ、Ｂｄｅ、Ｂｓｉ、Ｅｄｅ、Ｓｓｐ）の効率の計算は、約９４．４％～９８％の平均効率を明らかにした。これらの高い効率は非常に驚くべきことであり、この分野における熟練者は容易に予想することができない。

７．実験データ
背景
この実験は、単一分子分割と並行して１０～５０の異なるｍＲＮＡ種の特異的検出を示す。これは、５回の検出サイクル、３つの異なる蛍光シグナル、及びシグナルギャップのないコード化スキーム、及び２のハミング距離（エラー検出）に基づく。実験は、本発明による方法の有効性及び機能性を証明している。

オリゴヌクレオチド及びそれらの配列
実験で使用される全てのオリゴヌクレオチド配列（標的特異的プローブ、解読オリゴヌクレオチド、シグナルオリゴヌクレオチド）は、付録の配列表に列挙されている。シグナルオリゴヌクレオチドＲ：ＳＴ０５＊Ｏ＿Ａｔｔｏ５９４は、ｂｉｏｅｒｓ．ｎｅｔ ＧｍｂＨに注文した。他の全てのオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓに注文した。オリゴヌクレオチドを水に溶解した。ストック溶液（１００μＭ）を－２０℃で保存した。

実験の概要
５０の異なる標的特異的プローブセットを５つの群に分ける。検出される転写物の名称及び標的特異的プローブセットの名称は同じである（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ｏｒｇの転写物バリアント名）。「新規」という用語は、修正されたプローブ設計を示す。プローブセットの全てのオリゴヌクレオチド配列は、配列表に見出すことができる。表には、プローブセットの固有の識別子名、並びに異なる検出サイクルで使用される解読オリゴヌクレオチドの名称が列挙されている。得られたコードは、５回の検出サイクル中に生成された蛍光シグナルの配列を示す（Ｇ（ｒｅｅｎ）＝Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、Ｏ（ｒａｎｇｅ）＝Ａｔｔｏ ５９４、Ｙ（ｅｌｌｏｗ）＝Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６）。

実験の変形
実験のいくつかの変形を行った。実験１～４は、並行して検出された転写物の数が主に異なる。標的特異的プローブセットとして列挙された群は、表６を参照する。実験５～８は、解読されたシグナルと比較するための単一ラウンドの単一の標的対照である。

実験の詳細
Ａ．細胞の播種及び培養
ＨｅＬａ細胞をＨｅＬａ細胞培養培地でほぼ１００％コンフルエントに増殖させた。ＨｅＬａ細胞培養培地は、１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、カタログ番号Ｓ０４１５）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ０７８１）及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号１１１４００３５）を含むＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号３１８８５）を含む。細胞培養培地を吸引した後、細胞を、ＰＢＳ（水中１，４２４ｇ／ｌのＮａ_２ＨＰＯ_４＊２Ｈ_２Ｏ、０，２７６ｇ／ｌのＮａＨ_２ＰＯ_４＊２Ｈ_２Ｏ、８，１９ｇ／ｌのＮａＣｌ、ｐＨ７，４）による洗浄ステップの後、トリプシンＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｔ３９２４）での５分間の３７℃でのインキュベーションによってトリプシン処理した。次いで、μ－Ｓｌｉｄｅ ８ Ｗｅｌｌ ｉｂｉｄｉＴｒｅａｔ（Ｉｂｉｄｉ、カタログ番号８０８２６）のウェルに細胞を播種した。ウェルあたりの細胞の数を、細胞の接着後に約５０％のコンフルエントに達するように調整した。細胞を、ウェルあたり２００μｌのＨｅＬａ細胞培養培地で一晩インキュベートした。
Ｂ．細胞の固定
細胞培養培地の吸引及びウェルあたり２００μｌの３７℃加温ＰＢＳでの２回の洗浄ステップの後、細胞を２００μｌの予冷メタノール（－２０℃、Ｒｏｔｈ、カタログ番号００８２．１）で－２０℃で１０分間固定した。
Ｃ．スダンブラックによる対比染色
メタノールを吸引し、７０％エタノール中で希釈した１５０μｌの０．２％スダンブラック溶液を各ウェルに添加した。ウェルを暗所で５分間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を、ウェルあたり４００μｌの７０％エタノールで３回洗浄して、過剰のスダンブラック溶液を除去した。
Ｄ．分析物／標的特異的プローブのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション前に、細胞を２００μｌのｓｍ洗浄緩衝液で平衡化した。ｓｍ洗浄緩衝液は、３０ｍＭクエン酸Ｎａ_３、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７、１０％ホルムアミド（Ｒｏｔｈ、カタログ番号号Ｐ０４０．１）及び５ｍＭリボヌクレオシドバナジル複合体（ＮＥＢ、カタログ番号Ｓ１４０２Ｓ）を含む。各標的特異的プローブセットについて、１μｌの１００μＭオリゴヌクレオチドストック溶液を混合物に添加した。オリゴヌクレオチドストック溶液は、対応する標的特異的プローブセットの全ての標的特異的オリゴヌクレオチドの等モル量を含む。混合物の総体積を水で１００μｌに調整し、１００μｌの２ｘ濃縮ハイブリダイゼーション緩衝液と混合した。２ｘ濃縮ハイブリダイゼーション緩衝液は、１２０ｍＭ クエン酸Ｎａ_３、１２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７、２０％ホルムアミド及び２０ｍＭリボヌクレオシドバナジル複合体を含む。得られた２００μｌのハイブリダイゼーション混合物を対応するウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、細胞をウェルあたり２００μｌで１０分間、標的プローブ洗浄緩衝液で３７℃で３回洗浄した。標的プローブ洗浄緩衝液は、３０ｍＭ クエン酸Ｎａ_３、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７、２０％ホルムアミド及び５ｍＭリボヌクレオシドバナジル複合体を含む。
Ｅ．解読オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション前に、細胞を２００μｌのｓｍ洗浄緩衝液で平衡化した。各解読オリゴヌクレオチドについて、１，５μｌの５μＭストック溶液を混合物に添加した。混合物の総体積を水で７５μｌに調整し、７５μｌの２ｘ濃縮ハイブリダイゼーション緩衝液と混合した。得られた１５０μｌの解読オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション混合物を対応するウェルに添加し、室温で４５分間インキュベートした。その後、細胞をウェルあたり２００μｌで２分間、ｓｍ洗浄緩衝液で室温で３回洗浄した。
Ｆ．シグナルオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション前に、細胞を２００μｌのｓｍ洗浄緩衝液で平衡化した。シグナルオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション混合物は、実験１～４の全てのラウンドについて同じであり、１×濃縮ハイブリダイゼーション緩衝液中に０、３μＭの各シグナルオリゴヌクレオチド（表Ａ３参照）を含んでいた。各ラウンドにおいて、ウェルあたり１５０μｌのこの溶液を添加し、室温で４５分間インキュベートした。各シグナルオリゴヌクレオチドの最終濃度が０、１５μＭであったことを除いて、手順は実験５～８と同じであった。その後、細胞をウェルあたり２００μｌで３回、室温のｓｍ洗浄緩衝液で２分間洗浄した。
Ｇ．蛍光及び白色光画像化
細胞を、室温でウェルあたり２００μｌの画像化緩衝液で１回洗浄した。トロロックスを用いない実験（表７、最後の列を参照）では、画像化緩衝液は、３０ｍＭクエン酸Ｎａ_３、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７及び５ｍＭリボヌクレオシドバナジル複合体を含む。トロロックスを用いた実験では、画像化緩衝液は、１０％ＶｅｃｔａＣｅｌｌ Ｔｒｏｌｏｘ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号ＣＢ－１０００）を更に含み、１０ｍＭの最終トロロックス濃度をもたらす。
開口数１．４の６３×液浸油対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ、ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）、ｐｃｏ．ｅｄｇｅ ４．２ ＣＭＯＳカメラ（ＰＣＯ ＡＧ）、及びＬＥＤ光源（Ｚｅｉｓｓ、ｃｏｌｉｂｒｉ ７）を備えたＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ顕微鏡を、領域の画像化のために使用した。フィルタセット及びＬＥＤ波長を、使用されるフルオロフォアの異なる最適条件に調整した。画像あたりの照射時間は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６及びＡｔｔｏ ５９４では１０００ｍｓ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８では４００ｍｓであった。
各実験では、画像化のために３つの領域をランダムに選択した。各領域について、３２個の画像のｚスタックを、３５０ｎｍのｚステップサイズで検出した。また、各領域から白色光画像を１枚撮影した。２つ以上の検出サイクルを用いた実験では、最初の検出ラウンドの領域が再び見出され、その後のラウンドごとに画像化された。
Ｈ．選択的変性
選択的変性のために、各ウェルを２００μｌのｓｍ洗浄緩衝液と共に４２℃で６分間インキュベートした。この手順を６回繰り返した。

実験１～４では、ステップ（Ｅ）～（Ｈ）を５回繰り返した。５回目の検出サイクルではステップ（Ｈ）を省略した。
Ｉ．分析
カスタムＩｍａｇｅＪプラグインに基づいて、バックグラウンドから特定の蛍光シグナルを区別するために生データの半自動分析を行った。３つの蛍光チャネル全ての得られた３Ｄ点群を、カスタムＶＢＡスクリプトとインシリコで組み合わせた。５つの検出サイクルの結果として得られた結合された３Ｄ点群を、ＶＢＡスクリプトに基づいて互いに整列させた。得られたアライメントは、検出された各固有のシグナルのコードワードを明らかにした。解読に成功したシグナルを、カスタムＶＢＡスクリプト及びＩｍａｇｅＪ－プラグインに基づく実験の定量的及び空間的分析に使用した。
結果
１．解読シグナルの絶対数
全ての転写物についての解読に成功したシグナルの絶対数を、各実験の各領域について以下の表４に列挙する。要約すると、正しいコードの合計は、対応する実験で検出可能な転写物に割り当てられた解読されたシグナルの総数を示し、誤ったコードの合計は、対応する実験で検出できない解読されたシグナルの総数を示す。信号の総数は、解読に成功したシグナル及び解読に失敗したシグナルを含む。

表４は、正しく解読されたシグナルの数と比較して非常に少ない数の誤って解読されたシグナルを示す。特定の転写物の解読されたシグナルの絶対値は、１つの実験の異なる領域間で非常に類似している。解読に成功することができるシグナルの総数の割合は、２７．１％～６４．５％である。この割合は、それぞれの領域／実験に存在する転写物の数及び／又はシグナルの総数に依存する。

結論
本発明による方法は、誤って割り当てられたコードワードを少量しか生成せず、したがって特定的であると見なすことができる。領域当たりのシグナルの数が非常に多く、並行して検出される転写物の数が非常に多い場合であっても、解読に成功可能なシグナルの割合は非常に高い。割り当て可能なシグナルの割合が高く、特異性が高いため、この方法は実用的に有用である。
２．異なる実験間の相対転写物存在量の比較
両方の比較（Ａ及びＢ）について図８に示すように、実験間で検出された転写物の重複を分析に使用する。各バーは、実験の３つ全ての領域の平均存在量を表す。これらの領域間の標準偏差も示されている。
３．異なる実験間の相対転写物存在量の相関
図９に見ることができるように、実験１の転写物の平均相対存在量は、実験３、４及び２の重複転写物の存在量と相関している。相関関係及び線形回帰の式は、各相関について示される。
図８は、低い標準偏差を示しており、１つの実験の異なる領域間の相対存在量の低い変動を示している。異なる実験からの転写物間の相対存在量の差も非常に低い。これは、実験１、２、及び３で検出された群１（図８Ａ）からの転写物の比較の場合である。また、実験１、２、及び４の間で重複した２、３、及び４群からの転写物の比較についても同様である。これらの存在量の非常に高い相関は、図９にも見ることができる。実験１からの転写物の存在量は、他のマルチラウンド実験の存在量と非常に良好に相関する。相関係数は、０．８８～０．９１であり、一方、線形回帰の勾配は、０．９７～１．０５である。

結論
転写物の相対存在量は、１つの実験の異なる領域間だけでなく、異なる実験間でも非常によく相関する。これは、図３及び図４の比較によって明確に見ることができる。実験間の主な違いは、異なる標的の数であり、したがって検出されたシグナルの総数である。したがって、検出された転写物の数並びにシグナルの数及び密度は、転写物の数を正確に定量化する方法の能力を妨げない。非常に良好な相関は、非常に多数のシグナルであっても、方法の特異性及び安定性を更に支持する。
４．シグナルの細胞間分布の比較
図１０には、画像スタックの最大投影が示されている。Ａ：実験７の領域１（ＳＰＯＣＫ１を検出する単一ラウンド単一転写実験）、Ｂ：実験１から選択された全てのシグナルの２Ｄ投影、ＳＰＯＣＫ１に割り当てられた領域１、Ｃ：実験８の領域１（ＴＨＲＡＰ３を検出する単一ラウンド単一転写実験）、Ｄ：実験１から選択された全てのシグナルの２Ｄ投影、ＴＨＲＡＰ３に割り当てられた領域１。
５．シグナルの細胞内分布の比較
図１１には、画像スタックの最大投影が示されている。対応する領域の拡大されたサブ領域が示されている。Ａ：実験８の領域１（ＴＨＲＡＰ３を検出する単一ラウンド単一転写実験）、Ｂ：実験１から選択されたシグナルの２Ｄ投影、ＴＨＲＡＰ３に割り当てられた領域１、Ｃ：実験５の領域１（ＤＤＸ５を検出する単一ラウンド単一転写実験）、Ｄ：実験１から選択された全てのシグナルの２Ｄ投影、ＤＤＸ５に割り当てられた領域１。
図１０は、異なる転写物間の細胞間分布の大きな差を示す。ＳＰＯＣＫ１は、一部の細胞では非常に豊富であるが、他の細胞ではほとんど存在しないようである（図１０Ａ）。ＴＨＲＡＰ３は、領域の全ての細胞にわたってより均一な分布を示す（図１０Ｃ）。これらの空間分布パターンはまた、実験１からの対応する転写物に割り当てられた点群（図１０Ｂ及びＤ）で明確に観察することができる。
図１１は、異なる転写物間の細胞内分布の大きな差を示す。ＴＨＲＡＰ３は主に細胞の周辺部（細胞質）で観察することができ（図１１Ａ）、ＤＤＸ５は細胞の中心（核）でより高い存在量を示す（図１１Ｃ）。これらの細胞内分布は、ＴＨＲＡＰ３及びＤＤＸ５に割り当てられた実験１の点群でも観察することができる（図１１Ｂ及びＤ）。

結論
定量の信頼性に次いで、マルチラウンド実験の点群も、転写物の同じ細胞内及び細胞間分布パターンを示す。これは、１つの特徴的なｍＲＮＡ種のみを検出する単一ラウンド実験からのシグナルと割り当てられた点群との直接比較によって明確に証明される。
６．異なる細胞サイクル依存転写物の分布パターン
図１２の全ての画像は、実験１の領域１を示す。各画像には、特定の転写物Ａ：ＣＣＮＡ２、Ｂ：ＣＥＮＰＥ、Ｃ：ＣＣＮＥ１、Ｄ：全ての転写物に割り当てられた点群が示されている。図１２は、３つの異なる細胞周期依存タンパク質の転写物を示す。ＣＥＮＰＥ（図１２Ｂ）は、セントロメアタンパク質Ｅとしても知られており、Ｇ２期の間に蓄積する。紡錘体伸長及び染色体移動を担うことが提案されている。それは相間中には存在しない。ＣＣＮＡ２（図１２Ａ）はサイクリンＡ２としても知られている。それは、Ｇ２からＭ期への移行中にＣＤＫ１と相互作用することによって細胞周期進行を調節する。興味深いことに、両方のｍＲＮＡ種の明らかな共局在が存在する。それらは、主に領域１の３つの中央細胞に存在する。ＣＣＮＥ１（図１２Ｃ）はサイクリンＥ１としても知られている。このサイクリンはＣＤＫ２と相互作用し、Ｇ１相からＳ相への移行に関与する。図１２は、この遺伝子の転写物が３つの中央細胞に存在しないが、他の細胞にわたって非常に均等に分布していないことを明確に示す。したがって、他の２つの転写物に対する抗局在化を示す。対応する点群のデータは、非常に多数の点及び非常に高い点密度を有する点群から導出される（図１２Ｄは印象を与える）。

結論
図１２に示される細胞周期依存性タンパク質の３つの解読された点群は、それらの対応する関数によって説明することができる分布パターンを示す。これらのデータは、本発明者らの方法が、細胞あたりのシグナル数が少なく（図１２Ｃ）、シグナル密度が非常に高い（図１２Ｄ）場合でも、生物学的に関連するデータを確実に生成することを強く示唆している。

配列表
添付の配列表において、配列番号１～１２４７は、例示的な標的特異的オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を指す。列挙されたオリゴヌクレオチドは、標的特異的結合部位（５’末端）、スペーサー／リンカー配列（ｇｔａａｃ及びｔａｇａｃ）及び１つのプローブセットの全てのオリゴヌクレオチドについて同じである固有の識別子配列からなる。

添付の配列表において、配列番号１２４８～１３９７は、例示的な解読オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を指す。

添付の配列表において、配列番号１３９８～１４００は、例示的なシグナルオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を指す。各シグナルオリゴヌクレオチドについて、対応するフルオロフォアは２回存在する。１つのフルオロフォアは、５’末端に共有結合しており、１つのフルオロフォアは、３’末端に共有結合している。配列番号１３９８は、その５’末端に「５Ａｌｅｘ４８８Ｎ」、及びその３’末端に「３ＡｌｅｘＦ４８８Ｎ」を含む。配列番号１３９９は、その５’末端に「５Ａｌｅｘ５４６」、及びその３’末端に３Ａｌｅｘ５４６Ｎを含む。配列番号１４００は、その５’末端及びその３’末端に「Ａｔｔｏ５９４」を含む。

Claims (15)

1. 試料中の分析物を逐次的にシグナルコードする方法であって、以下のステップ、
   （１）分析物特異的プローブのセットを提供するステップであって、各分析物特異的プローブが、
   －コード化される前記分析物のうちの１つと特異的に相互作用する結合要素（Ｓ）と、
   －前記分析物特異的プローブのセットに固有のヌクレオチド配列（固有の識別子配列）を含む識別子要素（Ｔ）と、を含むステップと、
   （２）前記分析物特異的プローブのセットを前記試料とインキュベートし、それによってコード化される前記分析物への前記分析物特異的プローブの特異的結合を可能にするステップと、
   （３）前記試料から非結合プローブを除去するステップと、
   （４）解読オリゴヌクレオチドのセットを提供するステップであって、各解読オリゴヌクレオチドが、
   －固有の識別子配列の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のコネクタ要素（ｔ）と、
   －シグナルオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を含むトランスレータ要素（ｃ）と、を含むステップと、
   （５）前記解読オリゴヌクレオチドのセットを前記試料とインキュベートし、それによって前記固有の識別子配列への前記解読オリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするステップと、
   （６）前記試料から非結合解読オリゴヌクレオチドを除去するステップと、
   （７）シグナルオリゴヌクレオチドのセットを提供するステップであって、各シグナルオリゴヌクレオチドが、
   －前記トランスレータ要素（ｃ）の前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のコネクタ要素（Ｃ）と、
   －シグナル要素と、を含むステップと、
   （８）前記シグナルオリゴヌクレオチドのセットを前記試料とインキュベートし、それによって前記トランスレータ要素（ｃ）への前記シグナルオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするステップと、を含む、方法。
2. 前記試料が、生物学的試料であり、好ましくは生物学的組織を含み、更に好ましくは生物学的細胞を含む、請求項１に記載の方法。
3. ステップ（２）の前に、前記生物学的組織及び／又は生物学的細胞が固定されている、請求項２に記載の方法。
4. 前記分析物特異的プローブのセット内で、前記個々の分析物特異的プローブが、コード化される前記分析物の１つの異なるサブ構造と特異的に相互作用する結合要素（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. （９）前記試料から非結合シグナルオリゴヌクレオチドを除去するステップと、
   （１０）前記シグナルを検出するステップと、を更に含み、任意選択で、
   （１１）前記試料から前記解読オリゴヌクレオチド及びシグナルオリゴヌクレオチドを選択的に除去し、それによってコード化される前記分析物への前記分析物特異的プローブの前記特異的結合を本質的に維持するステップと、を更に含み、任意選択で、
   （１２）ステップ（４）～（１１）を少なくとも１回［（４_２）～（１１_２）］繰り返して、少なくとも２つのシグナルからなるコード化スキームを生成するステップと、を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記コード化スキームが、予め決定され、コード化される前記分析物に割り当てられる、請求項５に記載の方法。
7. 解読オリゴヌクレオチドが、前のステップ（４）～（１１）で使用された前記解読オリゴヌクレオチドのトランスレータ要素（ｃ１）と同一であるか、又は異なるトランスレータ要素（ｃ２）を含む反復ステップ（４_２）～（１１_２）で使用される、請求項５又は６に記載の方法。
8. シグナルオリゴヌクレオチドが、前のステップ（４）～（１１）で使用された前記解読オリゴヌクレオチドのシグナル要素と同一であるか、又は異なるシグナル要素を含む反復ステップ（４_２）～（１１_２）で使用される、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記結合要素（Ｓ）が、コード化される前記分析物への特異的結合、好ましくはコード化される前記分析物への特異的ハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記結合要素（Ｓ）が、コード化される前記分析物への特異的結合を可能にするアミノ酸配列を含み、好ましくは前記結合要素が、抗体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. コード化される前記分析物が、核酸、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ、更に好ましくはｍＲＮＡである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. コード化される前記分析物が、ペプチド又はタンパク質である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 試料中の分析物を逐次的にシグナルコードするための解読オリゴヌクレオチドのセットの使用であって、各解読オリゴヌクレオチドが、
    －分析物特異的プローブのセットに固有であるヌクレオチド配列（固有の識別子配列）の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のコネクタ要素（ｔ）と、
    －シグナルオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を含む、トランスレータ要素（ｃ）と、を含む、使用。
14. 試料中の分析物を逐次的にシグナルコードするためのキットであって、
    －分析物特異的プローブのセットであって、各分析物特異的プローブが、
    －コード化される前記分析物のうちの１つと特異的に相互作用する結合要素（Ｓ）と、
    －前記分析物特異的プローブのセットに固有のヌクレオチド配列（固有の識別子配列）を含む識別子要素（Ｔ）と、を含むセットと、
    及び
    －解読オリゴヌクレオチドのセットであって、各解読オリゴヌクレオチドが、
    －前記固有の識別子配列の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第１のコネクタ要素（ｔ）と、
    －シグナルオリゴヌクレオチドの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を含む、トランスレータ要素（ｃ）と、を含むセットと、を含む、キット。
15. －シグナルオリゴヌクレオチドのセットであって、各シグナルオリゴヌクレオチドが、
    －前記トランスレータ要素（ｃ）の前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部に本質的に相補的であるヌクレオチド配列を含む第２のコネクタ要素（Ｃ）と、
    －シグナル要素と、を含む、セットを更に含む、請求項１４に記載のキット。
    

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