JP5777269B2 - 元素分析によって実施される遺伝子発現アッセイ - Google Patents
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Description
ワークフローチャートを図5で提示する一実施形態では、ICP−MS検出のためのin situハイブリダイゼーションは、先ず、標的の染色体および染色体外の核酸を相補的プローブとのハイブリダイゼーションに利用できるようにするような方法で組織または細胞試料を処理し(固定/透過化処理);次に、試料を、異なる元素タグで標識し、対象の遺伝子に相補的なプローブまたは複数のプローブに曝露させ;第3に、試料を洗浄して過剰な未結合の非特異的に相互作用するプローブを除去し;最後に、試料を粒子または溶液元素分析にかけることによって実施される。
ICP−MSによる元素標識されたビーズ遺伝子分析(ワークフローチャートを図6で示す)のために、総RNAを生体試料から単離し、オリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートした特有に標識されたビーズとハイブリダイズさせ、元素タグ付きオリゴ(dT)20プローブを混合物に加え、最後に、ビーズを単一粒子ICP−MS分析にかける。
他の実施形態では、第1の一連の実施例を、検出器として従来のICP−MS測定器を用い、および市販の金属(ランタニド)含有親和性試薬を用いて実施した。他の金属を用いることができること、および、元素分析のための他の機器を用いることができることを理解されたい。ヒト白血病細胞の特定の疾患関連遺伝子とin situでハイブリダイズするように設計されたビオチン化アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを使用した実験を用いた。プローブは、ランタニド標識ストレプトアビジンとの結合によって特定した(図2Aを参照)。
次の実施形態は、ICP−MS検出によるin situハイブリダイゼーションが、中程度に豊富な白血病特異的遺伝子種を検出するのに十分高感度であることを証明する。この目的のために、b3a2遺伝子によってコードされるBCR/Abl発癌性キナーゼを発現することが知られているヒト慢性骨髄性白血病細胞系(K562)およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた。実験の概略図を図2Aに示す。我々は、5’−ビオチン化BCR/Abl特異的アンチセンスプローブ(BCR/ABL)、5’−ビオチン化28S rRNAプローブ(陽性対照)およびビオチン化ナンセンスプローブ(B/A)を用いて、K562細胞およびKG−1A細胞(急性骨髄性白血病モデル細胞系、BCR/Abl転写産物を発現しない)でb3a2融合遺伝子の発現を比較した。図1で記載されているように細胞を固定、透過化し、次に、別々の細胞試料を、ビオチン化BCR/Abl、28S rRNA、ナンセンスプローブまたはプローブなしを含有するハイブリダイゼーション溶液でインキュベートした。洗浄およびブロッキングの後、ストレプトアビジン−Tbを加えた。標識細胞をHCl/Irで溶解し、全試料(試料につき0.3e6 KG1a細胞および3e6 K562細胞)を従来のICP−MS機器による元素分析にかけた、溶液元素分析によって分析を行った。結果を図2Bに示す。左のグラフは、KG−1a細胞の28S rRNAのレベルは非常に高いが、BCR/Ablプローブからのシグナルはナンセンス(B/A)および陰性対照(ctrl)応答のレベルにあることを証明する。他方、K562細胞(図2Bの右のグラフ)は、BCR/Ablプローブと強くハイブリダイズし、その強さは28S rRNAとよりも約14倍弱い。ゆえに、ICP−MSは、K562細胞でBCR/Abl遺伝子レベルを確実に検出する。
他の実施形態では、粘着性A431ヒト表皮癌細胞を用いてin situハイブリダイゼーション実験を実施した。これらの細胞は、上皮成長因子受容体(EGFR)を過剰発現させることが知られている。細胞を組織培養グレードの96多重ウェルプレートに播種し、2日間付着および増殖させた(ウェルにつき約75e3細胞)。図1の凡例の方法(4)に従って細胞を固定、透過化し、洗浄し、ビオチン、28S rRNA、EGFR、D−サイクリンおよびB/Aで5’標識したアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとウェル内でハイブリダイズさせた。各プローブのために、3反復のウェルを設定した。プローブを、ストレプトアビジン−Tbと反応させた。洗浄後、細胞をHCL/Irで溶解し、溶液ICP−MSによって分析した。図3から明白であるように、A431細胞は大量のEGFR mRNA、相当低いレベルのD−サイクリン(全ての細胞が増殖したわけではない)を発現させ、陽性プローブ28S rRNAに対して頑健な応答を示す。
以下の実験は、同じ細胞でタンパク質および遺伝子の発現を同時に検出する出願人の教示の特異な能力を例示する(図7を参照)。この目的のために、高レベルのp210 BCR/Ablタンパク質を発現させるK562モデル細胞系を用いた。BCR/Ablタンパク質を認識する一次抗体(Cell Signalling Technol.社)またはアイソタイプ対照IgGを、PermFlow溶液(InVirion社)で固定、透過化した細胞に適用した。次に、細胞をPBSで洗浄し、二次的抗ウサギEuコンジュゲート体(DELFIA、Perkin Elmer)と反応させた(図4Bを参照)。免疫標識後、細胞をDAKO in situハイブリダイゼーション溶液(DAKO社)でプレハイブリダイズさせ、5’−ビオチン化−28SリボソームRNAアンチセンスプローブと、または陰性対照として5’−ビオチン化−B/Aナンセンスプローブと室温で2時間ハイブリダイズさせた。非特異的ハイブリダイゼーションを最小にするために、4×SSC、2×SSC、0.2×SSCおよびPBSによるストリンジェントな洗浄を実施した。最後に、細胞をストレプトアビジン−Tbコンジュゲート体(DELFIA)と一緒にインキュベートし、HCl/Irで溶解した(図4A)。図4Aおよび図4Bの比較から明白であるように、BCR/Ablタンパク質発現(Eu)のために染色し、リボソーム遺伝子発現(Tb)のために探査した細胞は、IgG対照およびB/Aプローブのために染色した細胞よりも有意に強いシグナルを与えた。
本発明は、本発明の方法を実施するための成分を含むキットも提供する。
(a)in situ増幅試薬
(b)核酸精製試薬およびデバイス
(c)in situハイブリダイゼーション緩衝液
(d)固定および透過化溶液
(e)洗浄溶液
(f)溶解試薬
(a)多重化
(b)タンパク質および遺伝子の発現の同時分析
(c)増幅ステップを含む、または含まない方法
(d)高コストのポリメラーゼ酵素が不要の低コスト分析
(e)単細胞の遺伝子分析
(f)遺伝子発現の絶対定量化
を可能にする。
Claims (31)
- 試料中の標的核酸の存在を検出するための方法であって、
(a)細胞または細胞性粒子を提供するステップと、
(b)細胞または細胞性粒子を固定および透過化するステップと、
(c)細胞または細胞性粒子を標的核酸に特異的なプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートするステップであって、前記プローブは遷移元素タグの1種で標識された前記プローブの1種が、異なる種類の遷移元素タグで標識された他の任意の種類の前記プローブと、誘導結合プラズマ元素分析または誘導結合プラズマ原子発光スペクトルのうちの一つを用いる元素分析によって識別可能であるように遷移元素タグで標識されるステップと、
(d)ストリンジェントな洗浄条件によって、ハイブリダイズしなかったプローブを、前記標的核酸にハイブリダイズしたプローブから分離するステップと、
(e)細胞または細胞性粒子を誘導結合プラズマ元素分析または誘導結合プラズマ原子発光スペクトルのうちの一つを用いる元素分析によって分析して、プローブを特定し、遷移元素を検出および/または測定することによって前記標的核酸に結合したプローブを定量するステップと
を含み、
表面および/または細胞内タンパク質分子の同時分析をさらに含むことを特徴とする方法。 - 試料中の標的核酸の存在を検出するための方法であって、
(a)細胞または細胞性粒子を提供するステップと、
(b)細胞または細胞性粒子を固定および透過化するステップと、
(c)細胞または細胞性粒子を標的核酸に特異的なプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートするステップであって、前記プローブは遷移元素タグの1種で標識された前記プローブの1種が、異なる種類の遷移元素タグで標識された他の任意の種類の前記プローブと、誘導結合プラズマ元素分析または誘導結合プラズマ原子発光スペクトルのうちの一つを用いる元素分析によって識別可能であるように遷移元素タグで標識されるステップと、
(d)ストリンジェントな洗浄条件によって、ハイブリダイズしなかったプローブを、前記標的核酸にハイブリダイズしたプローブから分離するステップと、
(e)細胞または細胞性粒子を誘導結合プラズマ元素分析または誘導結合プラズマ原子発光スペクトルのうちの一つを用いる元素分析によって分析して、プローブを特定し、遷移元素を検出および/または測定することによって前記標的核酸に結合したプローブを定量するステップと
を含み、
表面および/または細胞内脂質分子の同時分析をさらに含むことを特徴とする方法。 - 試料中の標的核酸の存在を検出するための方法であって、
(a)細胞または細胞性粒子を提供するステップと、
(b)細胞または細胞性粒子を固定および透過化するステップと、
(c)細胞または細胞性粒子を標的核酸に特異的なプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートするステップであって、前記プローブは遷移元素タグの1種で標識された前記プローブの1種が、異なる種類の遷移元素タグで標識された他の任意の種類の前記プローブと、誘導結合プラズマ元素分析または誘導結合プラズマ原子発光スペクトルのうちの一つを用いる元素分析によって識別可能であるように特有の遷移元素タグで標識されるステップと、
(d)ストリンジェントな洗浄条件によって、ハイブリダイズしなかったプローブを、前記標的核酸にハイブリダイズしたプローブから分離するステップと、
(e)細胞または細胞性粒子を誘導結合プラズマ元素分析または誘導結合プラズマ原子発光スペクトルのうちの一つを用いる元素分析によって分析して、プローブを特定し、遷移元素を検出および/または測定することによって前記標的核酸に結合したプローブを定量するステップと
を含み、
表面および/または細胞内多糖類分子の同時分析をさらに含むことを特徴とする方法。 - 試料中の標的核酸の存在を検出するための方法であって、
(a)細胞または細胞性粒子を提供するステップと、
(b)細胞または細胞性粒子を固定および透過化するステップと、
(c)細胞または細胞性粒子を標的核酸に特異的なプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートするステップであって、前記プローブは遷移元素タグの1種で標識された前記プローブの1種が、異なる種類の遷移元素タグで標識された他の任意の種類の前記プローブと、誘導結合プラズマ元素分析または誘導結合プラズマ原子発光スペクトルのうちの一つを用いる元素分析によって識別可能であるように遷移元素タグで標識されるステップと、
(d)ストリンジェントな洗浄条件によって、ハイブリダイズしなかったプローブを、前記標的核酸にハイブリダイズしたプローブから分離するステップと、
(e)細胞または細胞性粒子を誘導結合プラズマ元素分析または誘導結合プラズマ原子発光スペクトルのうちの一つを用いる元素分析によって分析して、プローブを特定し、遷移元素を検出および/または測定することによって前記標的核酸に結合したプローブを定量するステップと
を含み、
ビタミン、ホルモン、ハプテンおよびヌクレオシドからなる群から選択される表面および/または細胞内の小分子の同時分析をさらに含むことを特徴とする方法。 - 特異的な元素タグで標識した2つ以上の特異的なプローブを、2つ以上の標的核酸とハイブリダイズさせることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸は、細胞内核酸分子、マトリックスRNA、マイクロRNA、遺伝子転写物前駆体RNA、メッセンジャーRNA、トランスポートRNA、リボソームRNA、染色体DNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、ウイルスDNA、ウイルスRNA、細菌DNA、細菌RNAおよびプラスミドDNAからなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヌクレオシドは、ATP、ADP、環状AMPおよびNADHからなる群から選択されることを特徴とする請求項4に記載の方法。
- ステップ(b)の後、細胞または細胞性粒子を表面または/および細胞内タンパク質に特異的な親和性試薬と反応させ、前記親和性試薬は、遷移元素タグの1種で標識された前記親和性試薬の1種が他の任意の種類の前記遷移元素タグと元素分析によって識別可能であるように支持体分子構造に結合した異なる遷移元素タグで標識されており、
その後、結合した親和性試薬を未結合の親和性試薬から分離することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記親和性試薬は、抗体、アプタマー、薬剤、ホルモン、フェロモン、糖からなる群から選択されることを特徴とする請求項8に記載の方法。
- ステップ(b)の後、細胞または細胞性粒子を表面または/および細胞内分子に特異的な親和性試薬と反応させ、前記親和性試薬は前記タグの1種で標識された前記親和性試薬の1種が他の任意の種類の前記タグと元素分析によって識別可能であるように、元素タグで標識されており、
その後、未結合の親和性試薬を結合した親和性試薬から分離することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記表面または/および細胞内分子は脂質であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記表面または/および細胞内分子は多糖類であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記表面または/および細胞内分子はビタミン、ホルモン、ハプテン、およびヌクレオシドからなる群から選択された小分子であることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記親和性試薬は、抗体、アプタマー、およびレクチンからなる群から選択されることを特徴とする請求項10に記載の方法。
- 前記細胞は、動物、植物、細菌または真菌の全細胞であることを特徴とする請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞性粒子は、単離染色体、単離核、単離ミトコンドリア、単離葉緑体、単離ウイルスおよび単離細菌からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プローブは、オリゴヌクレオチドプローブ、ロックド核酸(LNA)分子、ペプチド核酸(PNA)分子、増幅DNAもしくはその断片、増幅RNAもしくはその断片、RNA断片およびゲノムDNA断片からなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 試料中の元素の検出および測定のためのキットであって、測定される元素は、対象の核酸に相補的な特異的プローブに結合した遷移元素タグであり、
(a)多数の核酸と相補的な多数の特異的プローブと、
(b)各種類のプローブを個別に標識するための多数の遷移元素タグと、
(c)i)各種の特異的プローブを前記遷移元素タグで直接的にタグ付けし;
ii)細胞または細胞性粒子を固定および透過化し;
iii)細胞または細胞性粒子を一または複数の前記元素タグ付けされたプローブと一緒にハイブリダイゼーション溶液中でインキュベートし;
iv)結合した前記プローブを未結合のプローブから分離し;
v)ハイブリダイズした物質を有する細胞または細胞性粒子を溶解し;
vi)元素タグ付きプローブを検出および測定するための説明書
と
を含み、
(i)タンパク質、脂質、多糖類および小分子からなる群から選択される、細胞内または細胞外の生体分子のための親和性試薬と、
(ii)生体分子のための親和性試薬を標識するための遷移元素タグと
(iii)(i’)生体分子のための親和性試薬をタグ付けし;
(ii’)細胞または細胞性粒子を生体分子のための親和性試薬と一緒にインキュベートし;
(iii’)結合した生体分子のための親和性試薬を未結合の生体分子のための試薬から分離し;
(iv’)結合した生体分子のための試薬を検出および測定するための説明書
をさらに含むことを特徴とするキット。 - 前記検出および測定は溶液元素分析によって行われることを特徴とする請求項18に記載のキット。
- 前記検出および測定は粒子元素分析によって行われることを特徴とする請求項18に記載のキット。
- 多数の生体分子のための多数の特異的試薬と、各種類の生体分子のための各種類の親和性試薬を特有に標識するための多数の遷移元素タグとを含むことを特徴とする請求項18に記載のキット。
- 解離溶液、核酸結合膜を有するスピンカラム、生体試料からの核酸の単離および精製のための精製カラム、精製核酸の増幅のための試薬および溶液、標準、希釈緩衝液、解離緩衝液、洗浄緩衝液、ハイブリダイゼーション緩衝液ならびにアッセイ緩衝液からなる群から選択される試薬および装置をさらに含むことを特徴とする請求項18から21のいずれか一項に記載のキット。
- 内因性の核酸は、形態学的に無傷の細胞でin situで増幅されることを特徴とする請求項18に記載のキット。
- 前記遷移元素は質量分析計を用いて測定されることを特徴とする請求項18から23のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遷移元素は同位体であることを特徴とする請求項18から24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遷移元素は、貴金属、遷移元素、希土類元素、金、銀、プラチナ、ロジウム、イリジウムおよびパラジウムからなる群から選択されることを特徴とする請求項18から25のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遷移元素は複数の元素を含むことを特徴とする請求項18から24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遷移元素は複数の同位体を含むことを特徴とする請求項18から24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記遷移元素は同位体の原子を複数含むことを特徴とする請求項18から24のいずれか一項に記載のキット。
- 前記親和性試薬は、抗体、Fab’、アプタマー、抗原、ホルモン、成長因子、受容体、タンパク質および核酸からなる群から選択されることを特徴とする請求項18から21のいずれか一項に記載のキット。
- 粒子元素分析のための説明書がさらに含まれることを特徴とする請求項18から24のいずれか一項に記載のキット。
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