CN113355394A - 基于质谱技术的核酸检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了基于质谱技术的核酸检测方法，所述基于质谱技术的核酸检测方法为：根据待测核酸设计对应的核酸探针；使用金属离子标记所述核酸探针；标记有金属离子的核酸探针进入细胞内，与细胞内的待测核酸片段杂交；使用质谱技术检测单细胞，获得细胞中金属离子的含量，得到待测核酸的信息。本发明具有检测准确度高、快速等优点。

Description

基于质谱技术的核酸检测方法

技术领域

本发明涉及核酸检测，特别涉及基于质谱技术的核酸检测方法。

背景技术

基因支持着生命的基本构造和性能，储存着生物体的全部遗传信息，生物的各种性状几乎都是基因相互作用的结果。基因虽然十分稳定，但这种稳定性是相对的，在一定条件或外在环境影响下，基因序列可能会发生改变。比如常见的病毒感染，当病毒侵入人体细胞时，就会利用人体细胞内的营养和遗传物质，将其基因组整合于细胞的基因组完成复制和增殖，因此及时检测病毒感染对于疾病的早期筛查、诊断及预后具有重要意义。

目前最常用的病毒核酸检测方法为荧光定量PCR，需要提取细胞内DNA，再进行PCR扩增，样本前处理繁杂，时间成本高。流式荧光原位杂交技术，不需要进行DNA提取和PCR扩增，实验周期短，能迅速得到检测结果。但其需要使用各种荧光基团作为待测物标签，检测过程中不同通道之间容易出现荧光串色问题，这导致流式荧光技术的检测通道受到限制，且在进行多参数检测时，调节荧光补偿则变得异常复杂。

发明内容

为解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种基于质谱技术的核酸检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

基于质谱技术的核酸检测方法，所述基于质谱技术的核酸检测方法为：

根据待测核酸设计对应的核酸探针；

使用金属离子标记所述核酸探针；

标记有金属离子的核酸探针进入细胞内，与细胞内的待测核酸片段杂交；

使用质谱技术检测单细胞，获得细胞中金属离子的含量，得到待测核酸的信息。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：

1.检测准确度高、分辨率高；

使用了质谱技术，如ICP-TOF-MS技术，检测各个单细胞的的金属离子含量，显著地提高了金属离子的检测准确度，也即提高了核酸检测的准确度；

在调试中，精准地同步调节竖直炬管和线圈的空间位置，达到每个工况下的最佳位置，获得最准确的检测数据；

实现炬管在三个维度上微调，三个方向的位置精度和重复精度可以达到0.01mm，实现炬管火焰与锥口达到最佳位置；

本发明的飞行时间质谱分析器可对更宽的离子初始位置分散实现二阶时间聚焦，质量分辨率显著提升；

2.检测效率高、灵敏度高；

无需提取DNA和扩增PCR，提高了检测效率；

采用双脉冲推斥技术可以减小对高压脉冲的技术要求；本发明专利采用正脉冲推(推斥电极)和负脉冲拉(牵引电极)的双推斥方式，高压的需求会降低一半，故上升沿较陡和脉冲波形均可得到改善；

在双脉冲推斥中间增加等电势的第一栅网和第二栅网，可减小加速区对离子调制区的电场渗透效应；

第一栅网和第二栅网直接接地，没有额外增加电压，调节难度小；

可实现对较宽的调制区，提高离子通量与灵敏度；

3.可靠性好；

炬管为竖直设置，且和线圈保持相对静止，炬管和线圈同步移动，防止炬管移动时与线圈靠的过近而烧坏炬管，解决了采样锥被烧变形的问题；

利用转换模块和转换件，使得马达的转动可靠地转换为转换件的竖直移动，多个导向件的使用，使得承载件及转换件仅有竖直方向移动，有效地防止了承载件倾斜，确保了炬管定位的准确度和可靠性；

附图说明

参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：

图1是根据本发明实施例的基于质谱技术的核酸检测方法的流程图；

图2是根据本发明实施例的质谱仪的结构示意图；

图3是根据本发明实施例的承载单元的结构示意图；

图4是根据本发明实施例的飞行时间质量分析器的结构示意图；

图5是根据本发明实施例的飞行时间质量分析器的结构示意图。

具体实施方式

图1-5和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了解释本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。

实施例1：

图1给出了本发明实施例的基于质谱技术的核酸检测方法的流程图，如图1所示，所述基于质谱技术的核酸检测方法为：

根据待测核酸设计对应的核酸探针；

使用金属离子标记所述核酸探针；

标记有金属离子的核酸探针进入细胞内，与细胞内的待测核酸片段杂交；

使用质谱技术检测单细胞，获得细胞中金属离子的含量，得到待测核酸的信息。

为了提高检测准确度，进一步地，标记所述核酸探针的方式为：

在交联剂的作用下，金属离子和金属螯合剂集合；对核酸探针进行巯基修饰；

在缓冲液作用下，结合了金属螯合剂的金属离子与巯基修饰后的核酸探针结合。

为了提高检测准确度，进一步地，所述细胞的获得方式为：

获得血样，分离后选取外周血细胞，制成单细胞悬液；

对细胞进行固定，细胞保持完整形态；

对细胞进行通透，提高细胞膜的通透性。

为了提高检测准确度，进一步地，所述细胞的获得方式还包括：

通透后的细胞中加入封闭剂，之后去除封闭剂。

为了提高检测准确度，进一步地，核酸探针和待测核酸片段的杂交方式为：

在杂交缓冲液作用下，标记金属离子的核酸探针与待测核酸片段杂交；

使用包含柠檬酸钠的缓冲液洗涤杂交后的细胞，去除非特异性杂交，之后使用PBS重悬细胞。

为了提高检测准确度，进一步地，在单细胞的质谱检测中，离子化单细胞的具体方式为：

马达转动，转换模块将马达的转动转换为滑动件的直线移动；

将所述滑动件的直线移动转换为转换件的竖直移动，从而带动与所述转换件连接的承载件沿着多个导向件竖直移动，设置在所述承载件上的承载单元随着所述承载件竖直移动；炬管竖直地设置在所述承载单元上，线圈固定在所述承载单元上，并与所述炬管保持相对静止；

在水平方向上二维调节所述承载单元的位置，所述承载单元设置在二维调节单元上，所述二维调节单元设置在所述承载件上；

细胞逐个进入所述炬管内，通过所述线圈激发成等离子体，从而形成离子；

所述离子穿过采样锥后进入质谱分析单元。

为了提高检测准确度，进一步地，在单细胞的质谱检测中，使用飞行时间质量分析器，所述飞行时间质量分析器包括推斥极、无场飞行区和检测器，所述无场飞行区包括第一入射栅网；所述飞行时间质量分析器还包括：

牵引电极，所述牵引电极和所述第一入射栅网间形成第一离子加速区；

第一栅网和第二栅网，所述第一栅网和第二栅网间电势差为零；所述推斥极和第一栅网间，以及第二栅网和牵引电极间形成第二离子加速区；离子依次穿过第一栅网、第二栅网、牵引电极、第一入射栅网和无场飞行区，被所述检测器接收。

所述飞行时间质量分析器还包括：

反射区，所述反射区包括第一反射场和第二反射场，所述第一反射场包括第二入射栅网和反射电极，第二反射场包括所述反射电极和反射板；从所述无场飞行区出射的离子被所述反射区反射，之后被所述检测器接收。

为了实现二阶聚焦，所述第二离子加速区和第一反射场、第二反射场满足：

E₁、E₃、E₄、E₅分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区、第一反射场和第二反射场的电场强度，z₀、d_G、d₂、d₃、d₄、d₅分别是入射离子和所述第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离、第二入射栅网和反射电极间的距离、反射电极和反射板间的距离；L是离子在第一入射栅网和检测器间无场区中飞行的长度。

为了实现二阶聚焦，所述第一栅网与第二栅网的距离和无场飞行区满足：

E₁、E₃分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区的电场强度，z₀、d_G、d₂、d₃分别是入射离子和所述第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离；L是离子在第一入射栅网和检测器间无场区中飞行的长度。

实施例2：

根据本发明实施例1的基于质谱技术的核酸检测方法在新型冠状病毒检测中的应用例。

在该应用例中，基于质谱技术的核酸检测方法：

试剂准备阶段：根据新型冠状病毒的核酸序列，设计合成相应探针序列；

使用金属离子标记所述核酸探针，具体方式为：在交联剂的作用下，金属离子和金属螯合剂集合；使用TCEP对核酸探针进行巯基修饰；

在适当缓冲液作用下，结合了金属螯合剂的金属离子与巯基修饰后的核酸探针结合；

样本准备阶段：采集病人学样，使用Ficoll法对血样进行分离，选取外周血细胞，制备成单细胞悬液；

使用4％的多聚甲醛对细胞进行固定，保持细胞完成的形态；

使用Triton X-100对细胞进行通透，能溶解脂质，增加细胞膜的通透性；

在通透好的细胞中加入封闭剂，37度下封闭30分钟，离心去除封闭剂；

杂交阶段：在杂交缓冲液作用下，加入标记金属离子的核酸探针与新型管状病毒杂交，在37度环境下持续杂交30分钟；

使用包含柠檬酸钠的缓冲液洗涤杂交后的细胞，去除非特异性杂交，之后使用PBS重悬细胞；

检测阶段：将上述处理好的细胞悬液送入ICP-TOF-MS中检测，细胞被流式细胞仪分隔为单细胞，并逐个离子化，使标签金属离子得以释放并被进一步送入飞行时间检测室中进行检测，核酸探针所携带的金属标记可以区别出所检测的不同类型的基因，而细胞中金属标签的含量，可以间接反映各个目标基因的相对表达量。检测器会精确记录设计并换算为各种标签同位素的精确含量，并通过适配软件分析输出数据；

ICP-TOF-MS的具体结构为：

如图2所示，炬管101和线圈102分别设置在承载单元的不同部件上，炬管101和线圈102保持相对静止；

如图3所示，承载单元包括固定部301、第一安装部302、第二安装部303和连接部304；第二安装部303水平地固定在第一调节单元201上，固定部301固定在所述第二安装部303上侧，连接部304竖直设置，下端固定在第二安装部303上，上端固定水平设置的第一安装部302；炬管101竖直地设置在所述第一安装部302上，线圈102的一端固定在所述固定部301上，另一端环绕炬管101；

如图2所示，第二调节单元固定在底盘100上，包括电机401、螺杆402、螺母、导轨404、滑动件405和轴承，电机401驱动水平设置的螺杆402转动，螺母利用螺纹套在所述螺杆402上，滑动件405设置在与螺杆402平行设置的导轨404上，螺母连接滑动件405，使得单元螺杆402转动时，驱动滑动件405沿着导轨404水平直线移动；轴承设置在滑动件405的顶端；承载件503的四个角分别具有允许竖直设置的导向件504穿过的通孔，通孔的内径和导向件504的外径差别很小，使得承载件503仅能沿着导向件504竖直移动；转换件具有竖直部分501和倾斜部分502，竖直部分501的下端连接所述承载件503，上端连接倾斜部分502，所述倾斜部分502被所述轴承顶着，滑动件405在倾斜部分502下侧水平直线移动，使得倾斜部分502仅有竖直移动；

第一调节单元201采用电动二维移动平台，实现在水平方向的二维调节，设置在所述承载件503上；

图4给出了本发明实施例的飞行时间质量分析器的结构示意图，如图4所示，所述飞行时间质量分析器包括：

推斥极11、无场飞行区30和检测器51，所述无场飞行区30包括第一入射栅网31；

牵引电极12，所述牵引电极12和所述第一入射栅网31间形成第一离子加速区；

第一栅网21和第二栅网22，所述第一栅网21和第二栅网22间电势差为零；所述推斥极11和第一栅网21间，以及第二栅网22和牵引电极12间形成第二离子加速区；所述牵引电极12具有允许离子穿过的槽孔，或者具有允许离子穿过的栅网结构；离子依次穿过第一栅网21、第二栅网22、牵引电极12、第一入射栅网31和无场飞行区30，被所述检测器51接收；第一栅网21和第二栅网22接地，保证了第一栅网21和第二栅网22等电势；

所述牵引电极12和第一入射栅网31间具有允许离子穿过的多片电极，并利用分压电阻对多片电极分压；牵引电极12和第一入射栅网31间具有允许离子穿过的多片电极，并利用分压电阻对多片电极分压，使得第一离子加速区的电场强度均匀；电源给推斥极11施加正脉冲电压，给牵引电极12施加负脉冲电压。

为了实现二阶聚焦，所述第一栅网与第二栅网的距离和无场飞行区满足：

E₁、E₃分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区的电场强度，z₀、d_G、d₂、d₃分别是入射离子和第一栅网21间的距离、第一栅网21和第二栅网22间的距离、第二栅网21和牵引电极12间的距离、牵引电极12和第一入射栅网31间的距离；L是离子在第一入射栅网31和检测器51间无场区中飞行的长度。

上述单细胞离子化的方式为：

马达转动，驱动螺母携带滑动件405在导轨404上水平直线移动；

滑动件405在转换件的倾斜部分502下侧水平直线移动，从而转换为转换件的竖直移动(转换件仅有竖直移动)，从而带动与所述转换件连接的承载件503沿着多个导向件504竖直移动(承载件503仅有竖直移动)，设置在所述承载件503上的承载单元随着所述承载件503竖直移动；炬管101竖直地设置在所述承载单元的第一安装部302上，线圈102固定在所述承载单元的固定部301上，并与所述炬管101保持相对静止；

利用第一调节单元201，在水平方向上二维调节所述承载单元的位置，所述承载单元设置在第一调节单元201上，所述第一调节单元201设置在所述承载件503上；可见，在承载单元的三维调节中，所述炬管101和线圈102保持相对静止；

样品在进入所述炬管101内，通过所述线圈102激发成等离子体，从而形成离子；

所述离子穿过采样锥103后进入质谱分析单元。

实施例3：

根据本发明实施例1的基于质谱技术的核酸检测方法在新型冠状病毒检测中的应用例。

在飞行时间质量分析器中，如图5所示，第一栅网21和第二栅网22接地，保证了第一栅网21和第二栅网22等电势；牵引电极12和第一入射栅网31间具有允许离子穿过的多片电极，并利用分压电阻对多片电极分压，使得第一离子加速区的电场强度均匀；电源给推斥极11施加正脉冲电压，给牵引电极12施加负脉冲电压；

反射区包括第一反射场和第二反射场，所述第一反射场包括第二入射栅网32和反射电极41，第二反射场包括所述反射电极41和反射板42；从所述无场飞行区30出射的离子被所述反射区反射，之后被所述检测器51接收；反射电极41具有允许离子穿过的槽孔，或者具有允许离子穿过的栅网结构；

在第一离子加速区以及第一反射场和第二反射场内，设置允许离子穿过的多片电极，并利用分压电阻对多片电极分压，使得第一离子加速区、第一反射场和第二反射场内的电场强度均匀；

为了实现二阶聚焦，所述第二离子加速区和第一反射场、第二反射场满足：

E₁、E₃、E₄、E₅分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区、第一反射场和第二反射场的电场强度，z₀、d_G、d₂、d₃、d₄、d₅分别是入射离子和第一栅网21间的距离、第一栅网21和第二栅网22间的距离、第二栅网22和牵引电极12间的距离、牵引电极12和第一入射栅网31间的距离、第二入射栅网32和反射电极41间的距离、反射电极41和反射板42间的距离；L是离子在第一入射栅网31和检测器51间无场区中飞行的长度。

在ICP中，与实施例2不同是：

1.不再设置第二安装部和连接部，固定部直接固定在第一调节单元上，第一安装部水平地固定在固定部上；

2.螺杆和导轨间保持平行，且相对水平面倾斜设置；

3.转换件包括水平部分和竖直部分，水平部分被滑动件支撑；当倾斜直线移动的滑动件在转换件的水平部分下侧移动时，转换件随之竖直移动，且仅有竖直移动。

Claims (10)

1.基于质谱技术的核酸检测方法，所述基于质谱技术的核酸检测方法为：

根据待测核酸设计对应的核酸探针；

使用金属离子标记所述核酸探针；

标记有金属离子的核酸探针进入细胞内，与细胞内的待测核酸片段杂交；

使用质谱技术检测单细胞，获得细胞中金属离子的含量，得到待测核酸的信息。

2.根据权利要求1所述的基于质谱技术的核酸检测方法，其特征在于，标记所述核酸探针的方式为：

在交联剂的作用下，金属离子和金属螯合剂集合；对核酸探针进行巯基修饰；

在缓冲液作用下，结合了金属螯合剂的金属离子与巯基修饰后的核酸探针结合。

3.根据权利要求1所述的基于质谱技术的核酸检测方法，其特征在于，所述细胞的获得方式为：

获得血样，分离后选取外周血细胞，制成单细胞悬液；

对细胞进行固定，细胞保持完整形态；

对细胞进行通透，提高细胞膜的通透性。

4.根据权利要求3所述的基于质谱技术的核酸检测方法，其特征在于，所述细胞的获得方式还包括：

通透后的细胞中加入封闭剂，之后去除封闭剂。

5.根据权利要求1所述的基于质谱技术的核酸检测方法，其特征在于，核酸探针和待测核酸片段的杂交方式为：

在杂交缓冲液作用下，标记金属离子的核酸探针与待测核酸片段杂交；

使用包含柠檬酸钠的缓冲液洗涤杂交后的细胞，去除非特异性杂交，之后使用PBS重悬细胞。

6.根据权利要求4所述的基于质谱技术的核酸检测方法，其特征在于，在单细胞的质谱检测中，离子化单细胞的具体方式为：

马达转动，转换模块将马达的转动转换为滑动件的直线移动；

将所述滑动件的直线移动转换为转换件的竖直移动，从而带动与所述转换件连接的承载件沿着多个导向件竖直移动，设置在所述承载件上的承载单元随着所述承载件竖直移动；炬管竖直地设置在所述承载单元上，线圈固定在所述承载单元上，并与所述炬管保持相对静止；

在水平方向上二维调节所述承载单元的位置，所述承载单元设置在二维调节单元上，所述二维调节单元设置在所述承载件上；

细胞逐个进入所述炬管内，通过所述线圈激发成等离子体，从而形成离子；

所述离子穿过采样锥后进入质谱分析单元。

7.根据权利要求1所述的基于质谱技术的核酸检测方法，其特征在于，在单细胞的质谱检测中，使用飞行时间质量分析器，所述飞行时间质量分析器包括推斥极、无场飞行区和检测器，所述无场飞行区包括第一入射栅网；所述飞行时间质量分析器还包括：

牵引电极，所述牵引电极和所述第一入射栅网间形成第一离子加速区；

第一栅网和第二栅网，所述第一栅网和第二栅网间电势差为零；所述推斥极和第一栅网间，以及第二栅网和牵引电极间形成第二离子加速区；离子依次穿过第一栅网、第二栅网、牵引电极、第一入射栅网和无场飞行区，被所述检测器接收。

8.根据权利要求7所述的基于质谱技术的核酸检测方法，其特征在于，所述飞行时间质量分析器还包括：

反射区，所述反射区包括第一反射场和第二反射场，所述第一反射场包括第二入射栅网和反射电极，第二反射场包括所述反射电极和反射板；从所述无场飞行区出射的离子被所述反射区反射，之后被所述检测器接收。

9.根据权利要求8所述的基于质谱技术的核酸检测方法，其特征在于，所述第二离子加速区和第一反射场、第二反射场满足：

E₁、E₃、E₄、E₅分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区、第一反射场和第二反射场的电场强度，z₀、d_G、d₂、d₃、d₄、d₅分别是入射离子和所述第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离、第二入射栅网和反射电极间的距离、反射电极和反射板间的距离；L是离子在第一入射栅网和检测器间无场区中飞行的长度。

10.根据权利要求7所述的基于质谱技术的核酸检测方法，其特征在于，所述第一栅网与第二栅网的距离和无场飞行区满足：

E₁、E₃分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区的电场强度，z₀、d_G、d₂、d₃分别是入射离子和所述第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离；L是离子在第一入射栅网和检测器间无场区中飞行的长度。

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