JP2004329096A - 相補性試験方法及びそれに用いる金粒子 - Google Patents
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Abstract
【課題】ハイブリダイゼーションの検出感度を向上させた相補性試験方法及びそれに用いる手段を提供する。
【解決手段】基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置いて、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法。表面に核酸を固定化した粒子（但し、表面に固定化された核酸は、前記ターゲット核酸の一部の配列と相補的な配列を有する）の共存下で、前記基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置くか、または前記ハイブリダイゼーション可能な状態に置いた後の前記基板表面を前記粒子に暴露する方法。表面にＤＮＡ鎖を固定化した金粒子であって、前記ＤＮＡ鎖は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって前記二重鎖部分側が金粒子の表面に固定化されている、金粒子。
【選択図】図１
【解決手段】基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置いて、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法。表面に核酸を固定化した粒子（但し、表面に固定化された核酸は、前記ターゲット核酸の一部の配列と相補的な配列を有する）の共存下で、前記基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置くか、または前記ハイブリダイゼーション可能な状態に置いた後の前記基板表面を前記粒子に暴露する方法。表面にＤＮＡ鎖を固定化した金粒子であって、前記ＤＮＡ鎖は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって前記二重鎖部分側が金粒子の表面に固定化されている、金粒子。
【選択図】図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、相補性試験方法及びこの相補性試験方法に用いる金粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決すべき課題】
遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、ある種の核酸（標的核酸）を検出する目的で核酸プローブが用いられる。核酸プローブとしては、ＤＮＡ合成機により容易に合成できるという理由から、ＤＮＡプローブが主に使用されている。そして、近年、多数の核酸プローブを基材に固定したＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレーが実用されるようになり、ターゲット核酸の検出に使用されている。
【０００３】
基材に固定した核酸プローブはターゲット核酸と接触条件下に置かれ、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリダイズの有無を検出する。ハイブリダイズの有無の検出には、例えば、核酸プローブが有する、蛍光標識等の標識を用いて検知する。蛍光標識以外に、ＲＩなどが用いられる場合もある。
【０００４】
これまでターゲット核酸とハイブリダイズした核酸プローブを検知しやすいという観点から、蛍光標識が用いられることが多かった。しかし、蛍光標識を用いる場合、ターゲット核酸を蛍光プローブ等で修飾する必要があるが、この操作は煩雑である。今後、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレーが、より広汎に実用されるためには、より簡便に上記ハイブリダイゼーションを検出できる手段が必要である。それに加えて、より微量のターゲット核酸を対象にした場合にも、上記ハイブリダイゼーションの検出が容易にできる、より高感度な検出を可能にする手段が必要である。
【０００５】
そこで本発明の目的は、ハイブリダイゼーションの検出感度を向上させた相補性試験方法及びそれに用いる手段を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本発明は以下のとおりである。
（１）基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置いて、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法であって、
表面に核酸を固定化した粒子（但し、表面に固定化された核酸は、前記ターゲット核酸の一部の配列と相補的な配列を有する）の共存下で、前記基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置くか、または前記ハイブリダイゼーション可能な状態に置いた後の前記基板表面を前記粒子に暴露することを特徴とする方法。
（２）基板に固定化された核酸がＤＮＡである（１）に記載の方法。
（３）前記ＤＮＡは、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であり、かつ前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化されている（２）に記載の方法。
（４）基板に固定化された核酸の基板表面から遠い側の配列の少なくとも一部は、ターゲット核酸の一方の端部付近の核酸配列と相補的な配列を有する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）粒子の表面に固定化された核酸は、一本鎖のＤＮＡであるか、または、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって前記二重鎖部分側が粒子の表面に固定化されているＤＮＡ鎖である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記粒子が、金粒子であり、金粒子の平均粒子径が５〜５０ｎｍの範囲である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの有無を表面プラズモン共鳴法または水晶振動子法により検出する（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出するための（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（９）核酸を固定化した基板表面へのターゲットＤＮＡの吸着、一価または二価の金属イオンの存在下で行う（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）２価金属イオンがマグネシウムイオンまたはナトリウムイオンである（９）に記載の方法。
（１１）表面にＤＮＡ鎖を固定化した金粒子であって、前記ＤＮＡ鎖は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって前記二重鎖部分側が金粒子の表面に固定化されている、金粒子。
（１２）金粒子の平均粒子径が５〜５０ｎｍの範囲である（１１）に記載の金粒子。
（１３）前記二重鎖部分の塩基数は１０〜８０の範囲であり、前記一重鎖部分の塩基数は２０〜９０の範囲である（１１）または（１２）に記載の金粒子。
（１４）前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前記金粒子の表面にさらに固定化されている（１１）〜（１３）のいずれかに記載の金粒子。
（１５）前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖と前記二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定化数の割合は、９９：１〜１：９９の範囲である（１４）に記載の金粒子。
（１６）前記金粒子表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化されている（１１）〜（１５）のいずれかに記載の金粒子。
【０００７】
【発明の実施の形態】
［相補性試験方法］
本発明の相補性試験方法は、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置いて、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法である。
この方法に用いる、表面に核酸を固定化した基板、基板に固定化される核酸、ターゲット核酸、並びにハイブリダイゼーションの一般的方法及び条件は、公知の物、方法及び条件をそのまま利用できる。
【０００８】
基板に固定化された核酸は、例えば、ＤＮＡであることができ、さらに、ＤＮＡは、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であり、かつ二重鎖部分側が基板表面に固定化されているものであることができる。
【０００９】
本発明では、一本鎖のＤＮＡを固定化した基板を用いることは、勿論できるが、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖を固定化した基板（例えば、特開平２００３−４３０３７号公報）を用いることが好ましい。このＤＮＡ鎖は、一方の鎖が他方の鎖よりも長く、ある部分は二重鎖であり、残りの部分が一重鎖である。そして、二重鎖部分から始まり、途中から最後まで一重鎖部分である。二重鎖部分の塩基数及び一重鎖部分の塩基数には特に制限や限定はないが、二重鎖部分の塩基数は、例えば、二重鎖部分の安定性という観点から１０〜８０の範囲とすることができ、一重鎖部分の塩基数は、一重鎖部分の動きやすさという観点から２０〜９０の範囲であることができる。
上記のようなＤＮＡ鎖は、長さが異なる２本の一本鎖であって、短鎖の一本鎖ＤＮＡは、塩基配列が、長鎖の一本鎖ＤＮＡのいずれかの端からの塩基配列と、相補的である、２本の一本鎖をハイブリダイズすることで作製することができる。
【００１０】
上記基板では、上記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖が、二重鎖部分側で基板表面に固定化されている。このような構造を有することで、基板表面寄りには、二重鎖部分があるが、基板表面から離れた場所では、ＤＮＡ鎖は一重鎖部分となり、一重鎖部分の周囲にはある程度の空間が生じ、一重鎖部分をハイブリダイズ用の配列として利用し易くなり、かつ基板表面に近い場所では二重鎖部分を密に存在させて、ＤＮＡ鎖の横倒れを防止できるという利点がある。
【００１１】
ＤＮＡ鎖の基板表面への固定化は、例えば、基板が金属基板または金属被覆を有する基板である場合、基板の金属表面にＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化させることができる。金属基板としては、例えば、金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジウム等の金属製の基板を挙げることができる。また、金属被覆を有する基板としては、ガラス、マイカ（雲母）等の基板の表面に、金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジウム等の金属被覆を設けた基板を挙げることができる。
基板の金属表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての固定化については基板の製造方法において詳述する。
【００１２】
また、ＤＮＡ鎖の基板表面への固定化は、例えば、基板がガラス基板またはシリコン基板である場合、基板の表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化させることができる。ガラス基板としては、一般的なスライドガラス等のガラス基板を挙げることができる。また、シリコン基板は、シリコンウエハ等であることができる。
基板の表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての固定化については基板の製造方法において詳述する。
【００１３】
上記基板は、前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前記基板の表面にさらに固定化されているものであることもできる。基板の表面に二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖をさらに固定化することで、基板表面から離れた場所での一重鎖部分の周囲にある空間がより広がり、一重鎖部分をハイブリダイズ用の配列としてより利用し易くなるとともに、基板表面に近い場所では二重鎖部分をさらに密に存在させて、ＤＮＡ鎖の横倒れを防止できるという利点がある。
【００１４】
上記基板は、例えば、金属基板または金属被覆を有する基板であることができ、その場合、基板の金属表面には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖も硫黄原子を介して固定化される。また、上記基板は、ガラス基板またはシリコン基板であることもでき、その場合、かつ基板の表面には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化される。
【００１５】
上記のように二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖も基板表面に固定化する場合、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖と二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定化数の割合は、ハイブリダイズ用の配列である一重鎖部分の密度（密集度）を考慮して適宜決定できるが、例えば、９９：１〜１：９９の範囲、好ましくは９９：１〜２５：７５の範囲であることが適当である。
【００１６】
さらに本発明では、基板に固定化された核酸の基板表面から遠い側の配列の少なくとも一部が、ターゲット核酸の一方の端部付近の核酸配列と相補的な配列を有することが、ハイブリダイゼーションを容易に生じさせるという観点から好ましい。相補的な配列の塩基数には特に制限はないが、安定したハイブリダイゼーションが得られるという観点からは、１０〜３０の範囲である。即ち、塩基数が１０未満では二重鎖の熱的安定性が低く、３０を超えると塩基ミスマッチの検出が困難になる傾向があるためである。
【００１７】
上記基板は、例えば、基板が、金属基板または金属被覆を有する基板の場合、これら基板の金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定化させることで製造することができる。二重鎖部分及び一重鎖部分を有する二本鎖ＤＮＡは、前述のように、長さが異なる２本の一本鎖であって、短鎖の一本鎖ＤＮＡは、塩基配列が、長鎖の一本鎖ＤＮＡのいずれかの端からの塩基配列と、相補的である、２本の一本鎖をハイブリダイズすることで作製することができる。そして、例えば、短鎖の一本鎖ＤＮＡの５’端にチオール基を導入し、この短鎖の一本鎖ＤＮＡの配列と３’端側が相補的配列である長鎖の一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせれば、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖が得られる。一本鎖ＤＮＡの５’端へのチオール基の導入は、例えば、公知のＣ６合成方法を用いて行うことができる。（例えば、化学と生物実験ライン２２、丹羽峰雄著、”ＤＮＡの化学合成”３８〜４３頁、廣川書店参照）
また、短鎖の一本鎖ＤＮＡの配列と３’端側が相補的配列である長鎖の一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズも通常の方法と条件で適宜行うことができる。
【００１８】
基板の金属表面へのＤＮＡ鎖の固定化は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を金属表面と接触させることが行うことができる。チオール基を有するＤＮＡ鎖の金属表面への固定化は例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，９７８７−９７９２に記載され、公知の方法である。
【００１９】
さらに、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖の所定割合の混合物を金属基板または金属被覆を有する基板の金属表面に、上記と同様に接触させることで、所定の割合で二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖及び二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を金属表面に固定化させることもできる。
【００２０】
上記基板は、基板がガラス基板またはシリコン基板の場合、例えば、これらの基板の表面をヘテロ２官能性架橋剤で表面処理し、表面処理した表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記表面にさせることで製造できる。二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖は上記の方法で製造することができる。
【００２１】
上記のように、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の二重鎖部分の末端にチオール基を導入するが、チオール基を導入する鎖は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の短鎖であっても、長鎖であっても良い。但し、二重鎖部分のみを構成する短鎖にチオール基を導入することが好ましい。何故なら、ハイブリダイゼーションに関与することになる一重鎖部分を有する長鎖を、短鎖とハイブリダイゼーションさせる以外の処理することなく、使用できるという利点があるからである。
【００２２】
この固定化方法は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９６， Ｖｏｌ．２４， Ｎｏ．１５， ３０３１−３０３９に記載されている。
上記ヘテロ２官能性架橋剤は、スクシンイミジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋剤であることができる。
【００２３】
さらに、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を、ヘテロ２官能性架橋剤を表面処理したガラス基板またはシリコン基板の表面に接触させることで、前記２種のＤＮＡ鎖を所定割合で表面に固定化させることができる。
【００２４】
上記基板の金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖、または二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定化させる方法においては、前記ＤＮＡ鎖の金属表面への接触を、２価金属イオンの存在下で行うことが好ましい。２価金属イオンの存在下で行うことで、二重鎖部分の安定性が増加し、さらに二重鎖部分が凝集し、基板上で安定に存在するという利点がある。
また、２価金属イオンとしては、例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、コバルトイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等を挙げることができる。これら２価金属イオンの濃度は、例えば、１〜１０００ｍＭの範囲とすることが適当である。
【００２５】
同様に、上記ヘテロ２官能性架橋剤で表面処理した基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖、または二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記表面に固定化させる方法においても、前記ＤＮＡ鎖の表面への接触を、上記と同様の２価金属イオンの存在下で行うことが、上記と同様の理由で好ましい。
【００２６】
本発明の相補性試験方法は、表面に核酸を固定化した粒子の共存下で、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置くか、またはハイブリダイゼーション可能な状態に置いた後の基板表面を粒子に暴露する。上記金粒子表面に固定化された核酸は、ターゲット核酸の一部の配列と相補的な配列を有するものである。そのため、上記粒子に固定化された核酸とターゲット核酸とはハイブリダイズし、かつ、ターゲット核酸と基板表面に固定化された核酸とが相補的配列である場合、ターゲット核酸と基板表面に固定化された核酸とがハイブリダイズする。その結果、基板表面に固定化された核酸とハイブリダイズしたターゲット核酸は、粒子の存在を検知することで検出できる。粒子の存在を適当な手段で検出して、相補性を試験する。
【００２７】
粒子の存在は、例えば、表面プラズモン共鳴法または水晶振動子法により検出することができる。従って、本発明では、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの有無を、粒子を介して、即ち、粒子が増感剤として働いて、検出することができる。
【００２８】
表面プラズモン共鳴法は、基板表面にレーザ光を照射し、基板表面で生じる表面プラズモン共鳴を測定することで基板表面に存在する膜等の厚みを測定する方法であり、ターゲットＤＮＡとハイブリダイゼーションしたＤＮＡ鎖の存在の有無を膜厚の違いとして認識し、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。
本発明では、表面に核酸を固定化した粒子を併用することで、表面プラズモン共鳴法を用いて、より高感度にハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【００２９】
水晶振動子法は、水晶振動子の電極への物質の付着による振動数の減少から付着物の質量を求める方法である（例えば、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．，１９９２， ９２， １３５５−１３７９参照）。水晶振動子法を用いる場合も、表面に核酸を固定化した粒子を併用することで、より高感度にハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【００３０】
表面に核酸を固定化した粒子は、例えば、表面に核酸を固定化した金属粒子であることができ、好ましくは金粒子であることができる。表面に核酸を固定化した金粒子は、それ自体は知られている。但し、ハイブリダイゼーションの増感剤として、表面に核酸を固定化した金粒子を利用することは知られていない。表面に核酸を固定化した金粒子は、固定化すべき核酸の末端に、例えば、チオール基を導入し、この末端チオール化核酸と金粒子とを接触させることで、合成（固定化）することができる。この場合、ＤＮＡ鎖は、硫黄原子を介して金粒子表面に固定化される。核酸への末端チオール基の導入や金粒子への固定化の方法は、前記基板の調製方法で説明した方法と同様である。
【００３１】
金粒子の平均粒子径は、ターゲットＤＮＡの種類等を考慮して適宜決定できるが、検出精度、検出感度という観点からは、例えば、５〜５０ｎｍの範囲であることが好ましく、１０〜３０ｎｍの範囲であることがより好ましい。金粒子の平均粒子径が粒径５ｎｍ未満では検出感度が低下する傾向があり、粒径５０ｎｍを超えると検出精度が低下する傾向があるためである。
【００３２】
さらに、金粒子の表面に固定化された核酸は、一本鎖のＤＮＡであるか、または、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって二重鎖部分側が金粒子の表面に固定化されているＤＮＡ鎖であることもできる。二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって二重鎖部分側が金粒子の表面に固定化されているＤＮＡ鎖、及びその金粒子の表面への固定化は、基板の代わりに金粒子を用いる以外、前記基板の調製方法で説明した方法と同様にして行うことができる。
【００３３】
二重鎖部分の塩基数は１０〜８０の範囲であり、前記一重鎖部分の塩基数は２０〜９０の範囲であることができる。
さらに、前記金粒子は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前記金粒子の表面にさらに固定化されているものである事もできる。このような金粒子は、基板の代わりに金粒子を用いる以外、前記基板の調製方法で説明した方法と同様にして行うことができる。
この場合、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖と二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定化数の割合は、９９：１〜１：９９の範囲であることができる。
【００３４】
本発明の相補性試験方法では、塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出することもできる。即ち、本発明の相補性試験方法では、完全相補的なターゲットＤＮＡは、ハイブリダイゼーションをするが、一塩基ミスマッチを含むターゲットＤＮＡは、ハイブリダイゼーションをせず、その結果、一塩基ミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出することもできる。
【００３５】
本発明の相補性試験方法では、ＤＮＡ鎖を固定化した表面へのターゲットＤＮＡの接触を、２価金属イオンの存在下で行うことがハイブリダイゼーション後の二重鎖部分の安定性という観点から好ましい。２価金属イオンとしては、例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、コバルトイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等を挙げることができる。これら２価金属イオンの濃度は、例えば、１〜１０００ｍＭの範囲とすることが適当である。
【００３６】
尚、本発明では基板にＤＮＡ鎖を固定する態様について説明した。しかし、例えば、基板に固定化される核酸は、一部または全部がＲＮＡであってもよい。
また、二重鎖部のみからなる鎖のいずれかの一本鎖がＲＮＡであってもよい。
【００３７】
【実施例】
以下本発明を実施例によりさらに説明する。
参考例１
チオール化したＤＮＡオリゴマー（二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖（５０マーと２０マーとの２本鎖ＤＮＡ（１））及び二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖（２０マーと２０マーとの２本鎖ＤＮＡ（２）））を調製し、基板に固定化し、さらにハイブリダイゼーションに使用した。
【００３８】
［チオール化したＤＮＡオリゴマーの合成］
５’末端チオール化したＨＳ−５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡ−３’（２０ｍｅｒＳＨ）（配列番号１）を公知のＣ６合成方法を用いて合成した。（例えば、化学と生物実験ライン２２、丹羽峰雄著、”ＤＮＡの化学合成”３８〜４３頁、廣川書店参照）
【００３９】
［チオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマーの金表面への固定化］
上記で合成した５’末端チオール化したＨＳ−５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡ−３’（２０ｍｅｒＳＨ）と５’−ＴｇｇＡｇＡＡＣＴｇＡＴＣｇＡＣＡＣＡｇＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡｇＣＡＴｇＣＴＡＡＴｇＣＡＴｇＣＡＴ−３’（５０ｍｅｒ）（配列番号２）を緩衝溶液中で９５℃まで過熱し、徐々に冷却することによって、一部が二重らせん化した５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１）を形成させ、プローブＤＮＡとした。
同様の手順により、 ５’−ＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴ−３’（２０ｍｅｒ）（配列番号３）と２０ｍｅｒＳＨの複合体２０ｍｅｒＣ／２０ｍｅｒＳＨ（２）を形成させ、混合希釈化合物として用いた。
上記５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１）及び２０ｍｅｒＣ／２０ｍｅｒＳＨ複合体（２）（比率＝１００：０）を用い、以下の条件でチオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマーの金基板表面への固定化を行った。
バッファーの種類：ＭｇＣｌ２（Ｈ２Ｏ）６を２０ｍＭの濃度に調整し、この溶液を１２０℃で２０分間滅菌した後、溶媒として使用した。
チオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマー濃度：１．３ＯＤ（約３．０マイクロモル）。
温度：２０℃
後処理： 溶媒でリンスして過剰のＤＮＡを洗い流した。
【００４０】
［核酸を固定化した金粒子の調製］
核酸を固定化した金粒子の調製は、図２に示すスキームに従って行った。
ＨＡｕＣｌ４（Ｈ２Ｏ）４ １００ｍｇ（２．５ｘ１０−４ ｍｏｌ）をクエン酸三ナトリウム２００ｍｇ （６．８ｘ１０−４ ｍｏｌ）の存在下で１０分間環流して、表面にクエン酸を有する金粒子（平均粒子径２０ｎｍ）を得た。次いで、この金粒子と末端チオー化した核酸とを混合し、室温で１５時間攪拌して、核酸を固定化した金粒子を得た。
金粒子に固定化したＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
２０ｍｅｒＳＨ：
５’−ＡＴｇＣＡＴｇＣＡＴＴＡｇＣＡＴｇＣＴＡ−３’（配列番号１）
５’末端チオール化
５０ｍｅｒＴ：
５’− ＣＴｇＴｇＴＣｇＡＴＣＡｇＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡｇＣＡＴｇＣＴＡＡＴｇＣＡＴｇＣＡＴ−３’（配列番号４）
【００４１】
［ハイブリダイゼーション実験］
上記で得られた二重鎖ＤＮＡオリゴマーを固定化した基板にターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。金粒子を用いたハイブリダイゼーションの概念図を図３に示す。
ターゲットＤＮＡとして、以下に示す５０ｍｅｒＰＭ及び５０ｍｅｒＭＭを用いた。５０ｍｅｒＰＭは、５’側の２０塩基が完全相補鎖であり、プローブ ＤＮＡ のプローブ部位へ相補的に相互作用が期待される。それに対して、５０ｍｅｒＭＭは、１塩基ミスマッチ鎖（５’側の２０塩基）であり、コントロールＤＮＡとして用いた。また、５０ｍｅｒＰＭ及び５０ｍｅｒＰＭともに、３’側の２０塩基は、前記５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１）の５０ｍｅｒの５’側の２０塩基と完全相補鎖である。
【００４２】
ターゲットＤＮＡの塩基配列
５０ｍｅｒＰＭ（完全相補鎖）
５’−ＴＣＣＡｇＡＴｇＡＡＣｇｇＴＣＴｇｇＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇｇＡｇＡＡＣＴｇＡＴＣｇＡＣＡＣＡｇ−３’（配列番号５）
５０ｍｅｒＭＭ（１塩基ミスマッチ鎖）
５’−ＴＣＣＡｇＡＴＡＡＡＣｇｇＴＣＴｇｇＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇｇＡｇＡＡＣＴｇＡＴＣｇＡＣＡＣＡｇ−３’（配列番号６）
【００４３】
ハイブリダイゼーション及び表面プラズモンの測定条件は以下の通りである。
溶媒：６．７×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）緩衝溶液（１ＭＮａＣｌ含有）（図４）
０．６７×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）緩衝溶液（０．１ＭＮａＣｌ含有）（図５）
ＤＮＡ濃度：５．０マイクロモル
金粒子濃度：６．０ナノモル
測定温度：２０℃
【００４４】
［ＤＮＡ単分子膜の評価の具体的方法］
ターゲットＤＮＡ、金粒子及び基板に固定化したプローブＤＮＡとの相互作用（ハイブリダイゼーション）は表面プラズモン共鳴によりその場観察を行なった。
【００４５】
［ハイブリダイゼーションの確認］
上記複合体を金基板表面に固定化した基板を用い、上記金粒子の共存下で、この基板にターゲットＤＮＡとして上記５０ｍｅｒＰＭをハイブリダイズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観察した。結果を図４に示す。対照として、上記金粒子の共存させない場合についても同様にハイブリダイズさせ、表面プラズモン共鳴によりその場観察した。結果を図４に示す。
５’側の２０塩基が完全相補鎖であり、３’側の２０塩基は、前記５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１）の５０ｍｅｒの５’側の２０塩基と完全相補鎖である５０ｍｅｒＰＭがターゲットＤＮＡであり、かつ上記金粒子の共存する場合、ハイブリダイゼーションが検出された。
【００４６】
また、５０ｍｅｒＰＭに代えて、 ５’側の２０塩基に１塩基ミスマッチを有する５０ｍｅｒＭＭをターゲットＤＮＡとして用い、かつ上記金粒子の共存下でハイブリダイゼーションを行った。結果を図５に示す。
図５に示すように、５’側の２０塩基が完全相補鎖である５０ｍｅｒＰＭを用いた場合は、ハイブリダイゼーションが検出されたが、５’側の２０塩基に１塩基ミスマッチを有する５０ｍｅｒＭＭを用いた場合は、上記金粒子の共存下でも、ハイブリダイゼーションは検出されなかった。この結果から、本発明の方法によれば、一塩基ミスマッチを識別できることが分かる。尚、図５の実験においてはミスマッチ検出を容易にするために、ＮａＣｌ濃度を図４の場合の１／１０に変更した。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によれば、ターゲット核酸を予め蛍光プローブ等で修飾することなく、単に、増感剤となる粒子を共存させるだけで、簡便にハイブリダイゼーションを検出できる。さらに、本発明の方法は、より高感度であり、より微量のターゲット核酸であっても、プローブ核酸とのハイブリダイゼーションの検出が容易にできる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における、チオール化したＤＮＡオリゴマー（二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖（５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１））及び二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖（２０ｍｅｒＣ／２０ｍｅｒＳＨ複合体（２））の調製、基板への固定化、及びハイブリダイゼーションのスキームを示す。
【図２】核酸を固定化した金粒子の調製方法のスキームを示す。
【図３】金粒子を用いたハイブリダイゼーションの概念図を示す。
【図４】基板にターゲットＤＮＡ５０ｍｅｒＰＭを金粒子の共存下または非共存下でハイブリダイズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観察した結果。
【図５】金粒子の共存下、基板にターゲットＤＮＡ５０ｍｅｒＰＭまたは５０ｍｅｒＭＭをハイブリダイズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観察した結果。
【発明の属する技術分野】
本発明は、相補性試験方法及びこの相補性試験方法に用いる金粒子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決すべき課題】
遺伝子診断や病原菌の特定、あるいは一塩基多型の検出等、ある種の核酸（標的核酸）を検出する目的で核酸プローブが用いられる。核酸プローブとしては、ＤＮＡ合成機により容易に合成できるという理由から、ＤＮＡプローブが主に使用されている。そして、近年、多数の核酸プローブを基材に固定したＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレーが実用されるようになり、ターゲット核酸の検出に使用されている。
【０００３】
基材に固定した核酸プローブはターゲット核酸と接触条件下に置かれ、核酸プローブとターゲット核酸とのハイブリダイズの有無を検出する。ハイブリダイズの有無の検出には、例えば、核酸プローブが有する、蛍光標識等の標識を用いて検知する。蛍光標識以外に、ＲＩなどが用いられる場合もある。
【０００４】
これまでターゲット核酸とハイブリダイズした核酸プローブを検知しやすいという観点から、蛍光標識が用いられることが多かった。しかし、蛍光標識を用いる場合、ターゲット核酸を蛍光プローブ等で修飾する必要があるが、この操作は煩雑である。今後、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレーが、より広汎に実用されるためには、より簡便に上記ハイブリダイゼーションを検出できる手段が必要である。それに加えて、より微量のターゲット核酸を対象にした場合にも、上記ハイブリダイゼーションの検出が容易にできる、より高感度な検出を可能にする手段が必要である。
【０００５】
そこで本発明の目的は、ハイブリダイゼーションの検出感度を向上させた相補性試験方法及びそれに用いる手段を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本発明は以下のとおりである。
（１）基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置いて、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法であって、
表面に核酸を固定化した粒子（但し、表面に固定化された核酸は、前記ターゲット核酸の一部の配列と相補的な配列を有する）の共存下で、前記基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置くか、または前記ハイブリダイゼーション可能な状態に置いた後の前記基板表面を前記粒子に暴露することを特徴とする方法。
（２）基板に固定化された核酸がＤＮＡである（１）に記載の方法。
（３）前記ＤＮＡは、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であり、かつ前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化されている（２）に記載の方法。
（４）基板に固定化された核酸の基板表面から遠い側の配列の少なくとも一部は、ターゲット核酸の一方の端部付近の核酸配列と相補的な配列を有する（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）粒子の表面に固定化された核酸は、一本鎖のＤＮＡであるか、または、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって前記二重鎖部分側が粒子の表面に固定化されているＤＮＡ鎖である（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記粒子が、金粒子であり、金粒子の平均粒子径が５〜５０ｎｍの範囲である（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの有無を表面プラズモン共鳴法または水晶振動子法により検出する（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出するための（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（９）核酸を固定化した基板表面へのターゲットＤＮＡの吸着、一価または二価の金属イオンの存在下で行う（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）２価金属イオンがマグネシウムイオンまたはナトリウムイオンである（９）に記載の方法。
（１１）表面にＤＮＡ鎖を固定化した金粒子であって、前記ＤＮＡ鎖は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって前記二重鎖部分側が金粒子の表面に固定化されている、金粒子。
（１２）金粒子の平均粒子径が５〜５０ｎｍの範囲である（１１）に記載の金粒子。
（１３）前記二重鎖部分の塩基数は１０〜８０の範囲であり、前記一重鎖部分の塩基数は２０〜９０の範囲である（１１）または（１２）に記載の金粒子。
（１４）前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前記金粒子の表面にさらに固定化されている（１１）〜（１３）のいずれかに記載の金粒子。
（１５）前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖と前記二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定化数の割合は、９９：１〜１：９９の範囲である（１４）に記載の金粒子。
（１６）前記金粒子表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化されている（１１）〜（１５）のいずれかに記載の金粒子。
【０００７】
【発明の実施の形態】
［相補性試験方法］
本発明の相補性試験方法は、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置いて、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法である。
この方法に用いる、表面に核酸を固定化した基板、基板に固定化される核酸、ターゲット核酸、並びにハイブリダイゼーションの一般的方法及び条件は、公知の物、方法及び条件をそのまま利用できる。
【０００８】
基板に固定化された核酸は、例えば、ＤＮＡであることができ、さらに、ＤＮＡは、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であり、かつ二重鎖部分側が基板表面に固定化されているものであることができる。
【０００９】
本発明では、一本鎖のＤＮＡを固定化した基板を用いることは、勿論できるが、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖を固定化した基板（例えば、特開平２００３−４３０３７号公報）を用いることが好ましい。このＤＮＡ鎖は、一方の鎖が他方の鎖よりも長く、ある部分は二重鎖であり、残りの部分が一重鎖である。そして、二重鎖部分から始まり、途中から最後まで一重鎖部分である。二重鎖部分の塩基数及び一重鎖部分の塩基数には特に制限や限定はないが、二重鎖部分の塩基数は、例えば、二重鎖部分の安定性という観点から１０〜８０の範囲とすることができ、一重鎖部分の塩基数は、一重鎖部分の動きやすさという観点から２０〜９０の範囲であることができる。
上記のようなＤＮＡ鎖は、長さが異なる２本の一本鎖であって、短鎖の一本鎖ＤＮＡは、塩基配列が、長鎖の一本鎖ＤＮＡのいずれかの端からの塩基配列と、相補的である、２本の一本鎖をハイブリダイズすることで作製することができる。
【００１０】
上記基板では、上記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖が、二重鎖部分側で基板表面に固定化されている。このような構造を有することで、基板表面寄りには、二重鎖部分があるが、基板表面から離れた場所では、ＤＮＡ鎖は一重鎖部分となり、一重鎖部分の周囲にはある程度の空間が生じ、一重鎖部分をハイブリダイズ用の配列として利用し易くなり、かつ基板表面に近い場所では二重鎖部分を密に存在させて、ＤＮＡ鎖の横倒れを防止できるという利点がある。
【００１１】
ＤＮＡ鎖の基板表面への固定化は、例えば、基板が金属基板または金属被覆を有する基板である場合、基板の金属表面にＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化させることができる。金属基板としては、例えば、金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジウム等の金属製の基板を挙げることができる。また、金属被覆を有する基板としては、ガラス、マイカ（雲母）等の基板の表面に、金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル、オネジウム等の金属被覆を設けた基板を挙げることができる。
基板の金属表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての固定化については基板の製造方法において詳述する。
【００１２】
また、ＤＮＡ鎖の基板表面への固定化は、例えば、基板がガラス基板またはシリコン基板である場合、基板の表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化させることができる。ガラス基板としては、一般的なスライドガラス等のガラス基板を挙げることができる。また、シリコン基板は、シリコンウエハ等であることができる。
基板の表面へのＤＮＡ鎖の硫黄原子を介しての固定化については基板の製造方法において詳述する。
【００１３】
上記基板は、前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前記基板の表面にさらに固定化されているものであることもできる。基板の表面に二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖をさらに固定化することで、基板表面から離れた場所での一重鎖部分の周囲にある空間がより広がり、一重鎖部分をハイブリダイズ用の配列としてより利用し易くなるとともに、基板表面に近い場所では二重鎖部分をさらに密に存在させて、ＤＮＡ鎖の横倒れを防止できるという利点がある。
【００１４】
上記基板は、例えば、金属基板または金属被覆を有する基板であることができ、その場合、基板の金属表面には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖も硫黄原子を介して固定化される。また、上記基板は、ガラス基板またはシリコン基板であることもでき、その場合、かつ基板の表面には、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化される。
【００１５】
上記のように二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖も基板表面に固定化する場合、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖と二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定化数の割合は、ハイブリダイズ用の配列である一重鎖部分の密度（密集度）を考慮して適宜決定できるが、例えば、９９：１〜１：９９の範囲、好ましくは９９：１〜２５：７５の範囲であることが適当である。
【００１６】
さらに本発明では、基板に固定化された核酸の基板表面から遠い側の配列の少なくとも一部が、ターゲット核酸の一方の端部付近の核酸配列と相補的な配列を有することが、ハイブリダイゼーションを容易に生じさせるという観点から好ましい。相補的な配列の塩基数には特に制限はないが、安定したハイブリダイゼーションが得られるという観点からは、１０〜３０の範囲である。即ち、塩基数が１０未満では二重鎖の熱的安定性が低く、３０を超えると塩基ミスマッチの検出が困難になる傾向があるためである。
【００１７】
上記基板は、例えば、基板が、金属基板または金属被覆を有する基板の場合、これら基板の金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定化させることで製造することができる。二重鎖部分及び一重鎖部分を有する二本鎖ＤＮＡは、前述のように、長さが異なる２本の一本鎖であって、短鎖の一本鎖ＤＮＡは、塩基配列が、長鎖の一本鎖ＤＮＡのいずれかの端からの塩基配列と、相補的である、２本の一本鎖をハイブリダイズすることで作製することができる。そして、例えば、短鎖の一本鎖ＤＮＡの５’端にチオール基を導入し、この短鎖の一本鎖ＤＮＡの配列と３’端側が相補的配列である長鎖の一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせれば、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖が得られる。一本鎖ＤＮＡの５’端へのチオール基の導入は、例えば、公知のＣ６合成方法を用いて行うことができる。（例えば、化学と生物実験ライン２２、丹羽峰雄著、”ＤＮＡの化学合成”３８〜４３頁、廣川書店参照）
また、短鎖の一本鎖ＤＮＡの配列と３’端側が相補的配列である長鎖の一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズも通常の方法と条件で適宜行うことができる。
【００１８】
基板の金属表面へのＤＮＡ鎖の固定化は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を金属表面と接触させることが行うことができる。チオール基を有するＤＮＡ鎖の金属表面への固定化は例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，９７８７−９７９２に記載され、公知の方法である。
【００１９】
さらに、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖の所定割合の混合物を金属基板または金属被覆を有する基板の金属表面に、上記と同様に接触させることで、所定の割合で二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖及び二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を金属表面に固定化させることもできる。
【００２０】
上記基板は、基板がガラス基板またはシリコン基板の場合、例えば、これらの基板の表面をヘテロ２官能性架橋剤で表面処理し、表面処理した表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記表面にさせることで製造できる。二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖は上記の方法で製造することができる。
【００２１】
上記のように、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の二重鎖部分の末端にチオール基を導入するが、チオール基を導入する鎖は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖の短鎖であっても、長鎖であっても良い。但し、二重鎖部分のみを構成する短鎖にチオール基を導入することが好ましい。何故なら、ハイブリダイゼーションに関与することになる一重鎖部分を有する長鎖を、短鎖とハイブリダイゼーションさせる以外の処理することなく、使用できるという利点があるからである。
【００２２】
この固定化方法は、例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９６， Ｖｏｌ．２４， Ｎｏ．１５， ３０３１−３０３９に記載されている。
上記ヘテロ２官能性架橋剤は、スクシンイミジル４−［マレイミドフェニル］ブチレート（ＳＭＰＢ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−（γ−マレイミドブチロキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、ｍ−マレイミドプロピオニックアシド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＰＳ）及びＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）からなる群から選ばれる少なくとも１種の架橋剤であることができる。
【００２３】
さらに、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を、ヘテロ２官能性架橋剤を表面処理したガラス基板またはシリコン基板の表面に接触させることで、前記２種のＤＮＡ鎖を所定割合で表面に固定化させることができる。
【００２４】
上記基板の金属表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖、または二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記金属表面に固定化させる方法においては、前記ＤＮＡ鎖の金属表面への接触を、２価金属イオンの存在下で行うことが好ましい。２価金属イオンの存在下で行うことで、二重鎖部分の安定性が増加し、さらに二重鎖部分が凝集し、基板上で安定に存在するという利点がある。
また、２価金属イオンとしては、例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、コバルトイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等を挙げることができる。これら２価金属イオンの濃度は、例えば、１〜１０００ｍＭの範囲とすることが適当である。
【００２５】
同様に、上記ヘテロ２官能性架橋剤で表面処理した基板表面に、二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖、または二重鎖部分及び一重鎖部分を有し、かつ前記二重鎖部分の末端にチオール基を有するＤＮＡ鎖及び末端にチオール基を有する二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖を所定割合で含む混合物を接触させて、前記ＤＮＡ鎖を前記表面に固定化させる方法においても、前記ＤＮＡ鎖の表面への接触を、上記と同様の２価金属イオンの存在下で行うことが、上記と同様の理由で好ましい。
【００２６】
本発明の相補性試験方法は、表面に核酸を固定化した粒子の共存下で、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置くか、またはハイブリダイゼーション可能な状態に置いた後の基板表面を粒子に暴露する。上記金粒子表面に固定化された核酸は、ターゲット核酸の一部の配列と相補的な配列を有するものである。そのため、上記粒子に固定化された核酸とターゲット核酸とはハイブリダイズし、かつ、ターゲット核酸と基板表面に固定化された核酸とが相補的配列である場合、ターゲット核酸と基板表面に固定化された核酸とがハイブリダイズする。その結果、基板表面に固定化された核酸とハイブリダイズしたターゲット核酸は、粒子の存在を検知することで検出できる。粒子の存在を適当な手段で検出して、相補性を試験する。
【００２７】
粒子の存在は、例えば、表面プラズモン共鳴法または水晶振動子法により検出することができる。従って、本発明では、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの有無を、粒子を介して、即ち、粒子が増感剤として働いて、検出することができる。
【００２８】
表面プラズモン共鳴法は、基板表面にレーザ光を照射し、基板表面で生じる表面プラズモン共鳴を測定することで基板表面に存在する膜等の厚みを測定する方法であり、ターゲットＤＮＡとハイブリダイゼーションしたＤＮＡ鎖の存在の有無を膜厚の違いとして認識し、ハイブリダイゼーションの有無を検出する。
本発明では、表面に核酸を固定化した粒子を併用することで、表面プラズモン共鳴法を用いて、より高感度にハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【００２９】
水晶振動子法は、水晶振動子の電極への物質の付着による振動数の減少から付着物の質量を求める方法である（例えば、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．，１９９２， ９２， １３５５−１３７９参照）。水晶振動子法を用いる場合も、表面に核酸を固定化した粒子を併用することで、より高感度にハイブリダイゼーションの有無を検出することができる。
【００３０】
表面に核酸を固定化した粒子は、例えば、表面に核酸を固定化した金属粒子であることができ、好ましくは金粒子であることができる。表面に核酸を固定化した金粒子は、それ自体は知られている。但し、ハイブリダイゼーションの増感剤として、表面に核酸を固定化した金粒子を利用することは知られていない。表面に核酸を固定化した金粒子は、固定化すべき核酸の末端に、例えば、チオール基を導入し、この末端チオール化核酸と金粒子とを接触させることで、合成（固定化）することができる。この場合、ＤＮＡ鎖は、硫黄原子を介して金粒子表面に固定化される。核酸への末端チオール基の導入や金粒子への固定化の方法は、前記基板の調製方法で説明した方法と同様である。
【００３１】
金粒子の平均粒子径は、ターゲットＤＮＡの種類等を考慮して適宜決定できるが、検出精度、検出感度という観点からは、例えば、５〜５０ｎｍの範囲であることが好ましく、１０〜３０ｎｍの範囲であることがより好ましい。金粒子の平均粒子径が粒径５ｎｍ未満では検出感度が低下する傾向があり、粒径５０ｎｍを超えると検出精度が低下する傾向があるためである。
【００３２】
さらに、金粒子の表面に固定化された核酸は、一本鎖のＤＮＡであるか、または、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって二重鎖部分側が金粒子の表面に固定化されているＤＮＡ鎖であることもできる。二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって二重鎖部分側が金粒子の表面に固定化されているＤＮＡ鎖、及びその金粒子の表面への固定化は、基板の代わりに金粒子を用いる以外、前記基板の調製方法で説明した方法と同様にして行うことができる。
【００３３】
二重鎖部分の塩基数は１０〜８０の範囲であり、前記一重鎖部分の塩基数は２０〜９０の範囲であることができる。
さらに、前記金粒子は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前記金粒子の表面にさらに固定化されているものである事もできる。このような金粒子は、基板の代わりに金粒子を用いる以外、前記基板の調製方法で説明した方法と同様にして行うことができる。
この場合、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖と二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定化数の割合は、９９：１〜１：９９の範囲であることができる。
【００３４】
本発明の相補性試験方法では、塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出することもできる。即ち、本発明の相補性試験方法では、完全相補的なターゲットＤＮＡは、ハイブリダイゼーションをするが、一塩基ミスマッチを含むターゲットＤＮＡは、ハイブリダイゼーションをせず、その結果、一塩基ミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出することもできる。
【００３５】
本発明の相補性試験方法では、ＤＮＡ鎖を固定化した表面へのターゲットＤＮＡの接触を、２価金属イオンの存在下で行うことがハイブリダイゼーション後の二重鎖部分の安定性という観点から好ましい。２価金属イオンとしては、例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、コバルトイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、カドミウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン等を挙げることができる。これら２価金属イオンの濃度は、例えば、１〜１０００ｍＭの範囲とすることが適当である。
【００３６】
尚、本発明では基板にＤＮＡ鎖を固定する態様について説明した。しかし、例えば、基板に固定化される核酸は、一部または全部がＲＮＡであってもよい。
また、二重鎖部のみからなる鎖のいずれかの一本鎖がＲＮＡであってもよい。
【００３７】
【実施例】
以下本発明を実施例によりさらに説明する。
参考例１
チオール化したＤＮＡオリゴマー（二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖（５０マーと２０マーとの２本鎖ＤＮＡ（１））及び二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖（２０マーと２０マーとの２本鎖ＤＮＡ（２）））を調製し、基板に固定化し、さらにハイブリダイゼーションに使用した。
【００３８】
［チオール化したＤＮＡオリゴマーの合成］
５’末端チオール化したＨＳ−５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡ−３’（２０ｍｅｒＳＨ）（配列番号１）を公知のＣ６合成方法を用いて合成した。（例えば、化学と生物実験ライン２２、丹羽峰雄著、”ＤＮＡの化学合成”３８〜４３頁、廣川書店参照）
【００３９】
［チオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマーの金表面への固定化］
上記で合成した５’末端チオール化したＨＳ−５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡ−３’（２０ｍｅｒＳＨ）と５’−ＴｇｇＡｇＡＡＣＴｇＡＴＣｇＡＣＡＣＡｇＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡｇＣＡＴｇＣＴＡＡＴｇＣＡＴｇＣＡＴ−３’（５０ｍｅｒ）（配列番号２）を緩衝溶液中で９５℃まで過熱し、徐々に冷却することによって、一部が二重らせん化した５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１）を形成させ、プローブＤＮＡとした。
同様の手順により、 ５’−ＴＡＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴ−３’（２０ｍｅｒ）（配列番号３）と２０ｍｅｒＳＨの複合体２０ｍｅｒＣ／２０ｍｅｒＳＨ（２）を形成させ、混合希釈化合物として用いた。
上記５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１）及び２０ｍｅｒＣ／２０ｍｅｒＳＨ複合体（２）（比率＝１００：０）を用い、以下の条件でチオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマーの金基板表面への固定化を行った。
バッファーの種類：ＭｇＣｌ２（Ｈ２Ｏ）６を２０ｍＭの濃度に調整し、この溶液を１２０℃で２０分間滅菌した後、溶媒として使用した。
チオール化した二重鎖ＤＮＡオリゴマー濃度：１．３ＯＤ（約３．０マイクロモル）。
温度：２０℃
後処理： 溶媒でリンスして過剰のＤＮＡを洗い流した。
【００４０】
［核酸を固定化した金粒子の調製］
核酸を固定化した金粒子の調製は、図２に示すスキームに従って行った。
ＨＡｕＣｌ４（Ｈ２Ｏ）４ １００ｍｇ（２．５ｘ１０−４ ｍｏｌ）をクエン酸三ナトリウム２００ｍｇ （６．８ｘ１０−４ ｍｏｌ）の存在下で１０分間環流して、表面にクエン酸を有する金粒子（平均粒子径２０ｎｍ）を得た。次いで、この金粒子と末端チオー化した核酸とを混合し、室温で１５時間攪拌して、核酸を固定化した金粒子を得た。
金粒子に固定化したＤＮＡの塩基配列は以下の通りである。
２０ｍｅｒＳＨ：
５’−ＡＴｇＣＡＴｇＣＡＴＴＡｇＣＡＴｇＣＴＡ−３’（配列番号１）
５’末端チオール化
５０ｍｅｒＴ：
５’− ＣＴｇＴｇＴＣｇＡＴＣＡｇＴＴＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡｇＣＡＴｇＣＴＡＡＴｇＣＡＴｇＣＡＴ−３’（配列番号４）
【００４１】
［ハイブリダイゼーション実験］
上記で得られた二重鎖ＤＮＡオリゴマーを固定化した基板にターゲットＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。金粒子を用いたハイブリダイゼーションの概念図を図３に示す。
ターゲットＤＮＡとして、以下に示す５０ｍｅｒＰＭ及び５０ｍｅｒＭＭを用いた。５０ｍｅｒＰＭは、５’側の２０塩基が完全相補鎖であり、プローブ ＤＮＡ のプローブ部位へ相補的に相互作用が期待される。それに対して、５０ｍｅｒＭＭは、１塩基ミスマッチ鎖（５’側の２０塩基）であり、コントロールＤＮＡとして用いた。また、５０ｍｅｒＰＭ及び５０ｍｅｒＰＭともに、３’側の２０塩基は、前記５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１）の５０ｍｅｒの５’側の２０塩基と完全相補鎖である。
【００４２】
ターゲットＤＮＡの塩基配列
５０ｍｅｒＰＭ（完全相補鎖）
５’−ＴＣＣＡｇＡＴｇＡＡＣｇｇＴＣＴｇｇＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇｇＡｇＡＡＣＴｇＡＴＣｇＡＣＡＣＡｇ−３’（配列番号５）
５０ｍｅｒＭＭ（１塩基ミスマッチ鎖）
５’−ＴＣＣＡｇＡＴＡＡＡＣｇｇＴＣＴｇｇＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴｇｇＡｇＡＡＣＴｇＡＴＣｇＡＣＡＣＡｇ−３’（配列番号６）
【００４３】
ハイブリダイゼーション及び表面プラズモンの測定条件は以下の通りである。
溶媒：６．７×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）緩衝溶液（１ＭＮａＣｌ含有）（図４）
０．６７×ＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ−Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ）緩衝溶液（０．１ＭＮａＣｌ含有）（図５）
ＤＮＡ濃度：５．０マイクロモル
金粒子濃度：６．０ナノモル
測定温度：２０℃
【００４４】
［ＤＮＡ単分子膜の評価の具体的方法］
ターゲットＤＮＡ、金粒子及び基板に固定化したプローブＤＮＡとの相互作用（ハイブリダイゼーション）は表面プラズモン共鳴によりその場観察を行なった。
【００４５】
［ハイブリダイゼーションの確認］
上記複合体を金基板表面に固定化した基板を用い、上記金粒子の共存下で、この基板にターゲットＤＮＡとして上記５０ｍｅｒＰＭをハイブリダイズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観察した。結果を図４に示す。対照として、上記金粒子の共存させない場合についても同様にハイブリダイズさせ、表面プラズモン共鳴によりその場観察した。結果を図４に示す。
５’側の２０塩基が完全相補鎖であり、３’側の２０塩基は、前記５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１）の５０ｍｅｒの５’側の２０塩基と完全相補鎖である５０ｍｅｒＰＭがターゲットＤＮＡであり、かつ上記金粒子の共存する場合、ハイブリダイゼーションが検出された。
【００４６】
また、５０ｍｅｒＰＭに代えて、 ５’側の２０塩基に１塩基ミスマッチを有する５０ｍｅｒＭＭをターゲットＤＮＡとして用い、かつ上記金粒子の共存下でハイブリダイゼーションを行った。結果を図５に示す。
図５に示すように、５’側の２０塩基が完全相補鎖である５０ｍｅｒＰＭを用いた場合は、ハイブリダイゼーションが検出されたが、５’側の２０塩基に１塩基ミスマッチを有する５０ｍｅｒＭＭを用いた場合は、上記金粒子の共存下でも、ハイブリダイゼーションは検出されなかった。この結果から、本発明の方法によれば、一塩基ミスマッチを識別できることが分かる。尚、図５の実験においてはミスマッチ検出を容易にするために、ＮａＣｌ濃度を図４の場合の１／１０に変更した。
【００４７】
【発明の効果】
本発明によれば、ターゲット核酸を予め蛍光プローブ等で修飾することなく、単に、増感剤となる粒子を共存させるだけで、簡便にハイブリダイゼーションを検出できる。さらに、本発明の方法は、より高感度であり、より微量のターゲット核酸であっても、プローブ核酸とのハイブリダイゼーションの検出が容易にできる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例における、チオール化したＤＮＡオリゴマー（二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖（５０ｍｅｒ／２０ｍｅｒＳＨ 複合体（１））及び二重鎖部分のみからなるＤＮＡ鎖（２０ｍｅｒＣ／２０ｍｅｒＳＨ複合体（２））の調製、基板への固定化、及びハイブリダイゼーションのスキームを示す。
【図２】核酸を固定化した金粒子の調製方法のスキームを示す。
【図３】金粒子を用いたハイブリダイゼーションの概念図を示す。
【図４】基板にターゲットＤＮＡ５０ｍｅｒＰＭを金粒子の共存下または非共存下でハイブリダイズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観察した結果。
【図５】金粒子の共存下、基板にターゲットＤＮＡ５０ｍｅｒＰＭまたは５０ｍｅｒＭＭをハイブリダイズさせた状況を表面プラズモン共鳴によりその場観察した結果。
Claims (16)
- 基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置いて、基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸との相補性を試験する方法であって、
表面に核酸を固定化した粒子（但し、表面に固定化された核酸は、前記ターゲット核酸の一部の配列と相補的な配列を有する）の共存下で、前記基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とをハイブリダイゼーション可能な状態に置くか、または前記ハイブリダイゼーション可能な状態に置いた後の前記基板表面を前記粒子に暴露することを特徴とする方法。 - 基板に固定化された核酸がＤＮＡである請求項１に記載の方法。
- 前記ＤＮＡは、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であり、かつ前記二重鎖部分側が前記基板表面に固定化されている請求項２に記載の方法。
- 基板に固定化された核酸の基板表面から遠い側の配列の少なくとも一部は、ターゲット核酸の一方の端部付近の核酸配列と相補的な配列を有する請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
- 粒子の表面に固定化された核酸は、一本鎖のＤＮＡであるか、または、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって前記二重鎖部分側が粒子の表面に固定化されているＤＮＡ鎖である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記粒子が、金粒子であり、金粒子の平均粒子径が５〜５０ｎｍの範囲である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記基板表面に固定化された核酸とターゲット核酸とのハイブリダイゼーションの有無を表面プラズモン共鳴法または水晶振動子法により検出する請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 塩基のミスマッチを含むターゲットＤＮＡを検出するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 核酸を固定化した基板表面へのターゲットＤＮＡの吸着、一価または二価の金属イオンの存在下で行う請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- ２価金属イオンがマグネシウムイオンまたはナトリウムイオンである請求項９に記載の方法。
- 表面にＤＮＡ鎖を固定化した金粒子であって、前記ＤＮＡ鎖は、二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖であって前記二重鎖部分側が金粒子の表面に固定化されている、金粒子。
- 金粒子の平均粒子径が５〜５０ｎｍの範囲である請求項１１に記載の金粒子。
- 前記二重鎖部分の塩基数は１０〜８０の範囲であり、前記一重鎖部分の塩基数は２０〜９０の範囲である請求項１１または１２に記載の金粒子。
- 前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖に加えて、二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖が前記金粒子の表面にさらに固定化されている請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の金粒子。
- 前記二重鎖部分及び一重鎖部分を有するＤＮＡ鎖と前記二重鎖部分のみを有するＤＮＡ鎖との固定化数の割合は、９９：１〜１：９９の範囲である請求項１４に記載の金粒子。
- 前記金粒子表面に前記ＤＮＡ鎖が硫黄原子を介して固定化されている請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の金粒子。
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| KR101293666B1 (ko) | 2011-03-07 | 2013-08-13 | 고려대학교 산학협력단 | 단백질 나노입자를 이용한 3차원 나노구조체 |
| JPWO2013191197A1 (ja) * | 2012-06-20 | 2016-05-26 | 東レ株式会社 | 核酸の検出方法および核酸検出キット |
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- 2003-05-07 JP JP2003128818A patent/JP2004329096A/ja active Pending
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