CN111534572A - 一种基于qcm的核酸序列检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于QCM的核酸序列检测方法，属于生物检测技术领域。本发明通过结合两种官能团‑N(CH3)3和‑COOH的有效利用，证实了原位结晶的石英晶体微天平检测技术具有高特异性。在晶片表面修饰有‑N(CH3)3末端官能团的自组装膜，可以对晶片进行钝化作用，可以有效抑制非特异性的结晶。tDNA通过与修饰有‑COOH末端官能团的pDNA杂交，可以有效地促进晶片表面碳酸钙晶体的原位生长，达到检测tDNA的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，更具体的说是涉及一种基于QCM的核酸序列检测方法。
背景技术
在临床诊断、基因分析以及医学鉴定等领域中，开发一种灵敏度高并且成本低的DNA检测技术具有非常重要的意义。很多基于光学、电化学和机械仪器类的DNA检测技术已经有了很大的发展。石英晶体微天平(QCM)是一种质量检测的传感器，已经被广泛的应用于法学鉴定、空气污染监测、生物分子的动力学监测以及溶解度的测定等众多领域。近来，越来越多的研究开始转向石英晶体微天平传感器用于DNA的检测。为了进一步扩大检测的灵敏度，研究者们已经做出了很大的努力，主要是通过质量扩增来提高灵敏度，例如，与纳米颗粒的结合、生物催化沉淀、酶催化扩增以及银还原等方法。然而，每一种方法都存在一定的缺陷，例如，耗时长、步骤复杂、成本高或者严重依赖酶活性等。
因此，提供一种简单、低成本以及无需生物标记的基于QCM的核酸序列检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基于QCM的核酸序列检测方法，操作简便，成本低且无需生物标记。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于QCM的核酸序列检测方法，具体步骤如下：
(1)晶片的清洗；
(2)晶片的修饰：
①将清洗干净的晶片平铺在小烧杯底部，然后将1μM的捕获DNA溶液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③称取HS-C11-NMe3Cl，溶解配置成10mM的溶液，加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，然后将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(3)晶片的进一步修饰：
①将吹干的晶片平铺在小烧杯底部，然后将配制好的所需浓度的靶标DNA加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③配制过量浓度探针DNA，并将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，然后将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(4)结晶：取出修饰好的晶片，安装在石英晶体微天平检测系统的开放式检测池中，打开QCM软件，预热至37℃，并开始测量；当共振频率在空气中稳定在±2Hz内时，在开放式检测池中加入500μl 6mM CaCl2溶液，当共振频率稳定在±2Hz内后，在反应空间内加入过量的碳酸铵固体粉末，用一个载体盛放置于氯化钙溶液附近，营造一种二氧化碳的氛围，为氯化钙的结晶提供反应物二氧化碳；通过石英晶体微天平传感器记录下具有不同修饰的石英晶体微天平晶片表面的结晶化过程中的信号响应，当信号达到稳定后，保存数据。
进一步，步骤(1)所述晶片的清洗步骤如下：将晶片在食人鱼洗液(H2SO4：H2O2＝3：1的体积比)中浸泡10分钟，然后按照H2O：H2O2：NH3·H2O＝5:1:1的体积比配制碱液，将配制好的碱液在电热套上加热煮沸，晶片置于煮沸的碱液中浸泡15分钟；浸泡过程中保持碱液一直处于沸腾状态。用超纯水冲洗并在超纯水中浸泡5分钟，再用无水乙醇冲洗并在无水乙醇中浸泡5分钟；用氮气吹干，将干燥好的晶片放在净化工作台中紫外线下照射20分钟，去除其表面的有机物。
本发明将硫醇化的捕获DNA(cDNA)修饰在石英晶体微天平晶片表面，然后用硫醇化的-N(CH3)3(即-NMe3)作为碳酸钙结晶的阻断剂。在靶标DNA(tDNA)的存在下，标记有-COOH官能团的探针DNA(pDNA)可以与tDNA杂交，并提供碳酸钙结晶的结合位点。在结晶过程中，将氯化钙溶液加到石英晶体微天平晶片表面，-COOH就可以实现对Ca2+的捕获。最后碳酸铵粉末释放的二氧化碳气体可以触发石英晶体微天平表面碳酸钙晶体的选择性生长。石英晶体微天平传感器可以实时监测整个过程，包括tDNA的捕获、pDNA的杂交以及晶体的原位生长。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于QCM的核酸序列检测方法，本发明通过结合两种官能团-N(CH3)3和-COOH的有效利用，证实了原位结晶的石英晶体微天平检测技术具有高特异性。在晶片表面修饰有-N(CH3)3末端官能团的自组装膜，可以对晶片进行钝化作用，可以有效抑制非特异性的结晶。tDNA通过与修饰有-COOH末端官能团的pDNA杂交，可以有效地促进晶片表面碳酸钙晶体的原位生长，达到检测tDNA的目的。石英晶体微天平晶片表面碳酸钙晶体的原位生长可以导致传感器共振频率的变化，频率的变化可以反映出靶标DNA的浓度大小。
基于研究碳酸钙晶体的原位选择性生长，一种新型的石英晶体微天平信号放大平台得以构建。该技术可以用于检测DNA序列。在该工作中，石英晶体微天平信号响应与DNA浓度对数在10aM到1nM(R2＝0.997)的浓度范围内呈现了良好的线性关系，其检测的灵敏度为2aM。由此可见，该平台的建立为DNA的检测提供了一个简单灵敏的检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明只修饰-N(CH3)3的晶片和同时修饰了-N(CH3)3和cDNA的晶片QCM的结晶响应信号；
图2附图为本发明原位结晶的放大效应；
图3附图为本发明不同浓度tDNA原位选择性结晶后，石英晶体微天平的信号变化情况；
图4附图为本发明石英晶体微天平频率变化相对于不同DNA浓度对数的线性工作曲线；
图5附图为本发明不同浓度tDNA原位选择性结晶后晶片表面结晶情况扫描电镜图片；
其中，1-10浓度依次为blank,10aM,100aM,1fM,10fM,100fM,1pM,10pM,100pM,1nM；
图6附图为本发明基于原位结晶的石英晶体微天平传感器的选择性实验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
HS-C11-NMe3Cl购于Prochimia。用于石英晶体微天平检测的晶片购自BiolinScientific。CaCl2，(NH4)2CO3和tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride(TCEP)购自阿拉丁试剂公司，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)购自Sangon Biotech Co.,Ltd.(上海中国)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)购自铁塔试剂公司，氯化钠(NaCl)购自国药集团化学试剂有限公司，这些试剂均为分析纯。
杂交缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，1M NaCl，pH＝7.4)，清洗缓冲液(5mM Tris，10mM NaCl，pH＝7.4)，固定缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，1MNaCl，1mM TCEP，pH＝7.4)，所有缓冲液均用0.1M HCl或0.1M NaOH调节pH值。
过氧化氢(H2O2)，浓硫酸(H2SO4)，氨水(NH3·H2O)，无水乙醇(C2H5OH)等使用的其他化学试剂都为分析纯，没有特殊说明，实验过程中所用水为超纯水。
Q-Sense E1石英晶体微天平(Biolin Scientific)；
Hitachi 3400扫面电子显微镜成像仪(日本Hitachi公司)；
电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司)，可精确到0.0001g；
电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，可精确到0.00001g；
pHS-3D型酸度计(上海雷磁仪器厂)；
16R型离心机(珠海黑马医学仪器有限公司)；
DHT型磁力搅拌控温电热套(山东鄄城华鲁电热仪器有限公司)；
气浴恒温振荡器(金坛市精达仪器制造厂)；
净化工作台(苏州博莱尔净化设备有限公司)。
实施例1一种基于QCM的核酸序列检测方法
(1)晶片的清洗：将晶片(石英晶体微天平传感器晶片为瑞典Biolin scientific公司生产的，其直径为14mm，基本频率为5MHz)在食人鱼洗液(H2SO4：H2O2＝3：1的体积比)中浸泡10分钟，然后按照H2O：H2O2：NH3·H2O＝5:1:1的体积比配制碱液，将配制好的碱液在电热套上加热煮沸，晶片置于煮沸的碱液中浸泡15分钟；浸泡过程中保持碱液一直处于沸腾状态。用超纯水冲洗并在超纯水中浸泡5分钟，再用无水乙醇冲洗并在无水乙醇中浸泡5分钟；用氮气吹干，将干燥好的晶片放在净化工作台中紫外线下照射20分钟，去除其表面的有机物；
(2)晶片的修饰：
①将清洗干净的晶片平铺在小烧杯底部，然后将1μM的cDNA溶液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③称取HS-C11-NMe3Cl，溶解配置成10mM的溶液，加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，然后将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(3)晶片的进一步修饰：
①将吹干的晶片平铺在小烧杯底部，然后将配制好的所需浓度的tDNA加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③配制过量浓度pDNA，并将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，然后将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(4)结晶：取出修饰好的晶片，安装在石英晶体微天平检测系统的开放式检测池中，打开QCM软件，预热至37℃，并开始测量；当共振频率在空气中稳定在±2Hz内时，在开放式检测池中加入500μl 6mM CaCl2溶液，当共振频率稳定在±2Hz内后，在反应空间内加入过量的碳酸铵固体粉末，用一个载体盛放置于氯化钙溶液附近，营造一种二氧化碳的氛围，为氯化钙的结晶提供反应物二氧化碳；通过石英晶体微天平传感器记录下具有不同修饰的石英晶体微天平晶片表面的结晶化过程中的信号响应，当信号达到稳定后，保存数据。
所用核苷酸购自Sangon Biotech Co.,Ltd.(上海中国)，具体序列如下：
cDNA的核酸序列为：5’-TGG AAA ATC TCT AGC AGT CGT-3’；SEQ ID NO.1；其3’端修饰SH-；
tDNA的核酸序列为：5’-ACT GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CTA AAA GGG TCTGAG GGA-3’；SEQ ID NO.2；
pDNA的核酸序列为：5’-ATG TCC CTC AGA CCC TTT-3’；SEQ ID NO.3；其5’端修饰COOH-；
Two-base mismatch DNA的核酸序列为：5’-ACT GCT ACA GAT TTT CCA CAC TGACTA AAA GCG TCT GAG GGA-3’；SEQ ID NO.4；
One-base mismatch DNA的核酸序列为：5’-ACT GTT ACA GAT TTT CCA CAC TGACTA AAA GGG TCT GTG GGA-3’；SEQ ID NO.5。
在只修饰-N(CH3)3的晶片以及同时修饰了-N(CH3)3和cDNA的晶片进行结晶试验。通过石英晶体微天平传感器实时监测表面结晶化过程，信号响应结果如图1所示。
与只修饰-N(CH3)3的晶片表面结晶情况做对比，同时修饰-N(CH3)3和cDNA的晶片，石英晶体微天平的响应信号基本相同，是可以忽略的；表明DNA的存在并不会影响-N(CH3)3抑制结晶的能力；即使有核酸存在，修饰的-N(CH3)3依然能够完全抑制结晶的形成，同时也保证了-COOH官能团可以诱导特异性结晶。
实施例2信号放大能力的验证
tDNA的捕获，pDNA的杂交以及碳酸钙晶体的原位生长都可以被石英晶体微天平传感器实时监测，整个过程的频率变化如图2所示。从内插图中可以看出，由于DNA的质量非常小，当cDNA浓度为1nM时也没有明显的频率变化，pDNA杂交以后同样没有明显的频率变化。但是当加入碳酸铵时，结晶化过程开始发生，这时可以观察到非常明显的频率变化。频率变化超过10000Hz，是直接检测DNA时信号变化的大约1000倍。该明显的频率变化表明结晶化是放大石英晶体微天平信号的一个很好的方法。
实施例3石英晶体微天平原位选择性结晶方法检测DNA
原位选择性结晶石英晶体微天平响应体系是将一系列不同浓度的tDNA实时检测记录，结果如图3所示。结果发现，tDNA浓度越高频率变化就越大，每个浓度的实验重复三遍，石英晶体微天平信号响应相对于DNA浓度对数之间的线性工作曲线如图4所示。该线性回归满足方程y＝-21044.13-117073㏒c，其相关系数R2为0.997，其中y是表面结晶化过程中石英晶体微天平传感器的频率变化，c是DNA的浓度。DNA检测浓度的线性范围很广，从10aM到1nM，其最低检测限为2aM。广的线性范围在实际应用中是十分重要的。
图5的扫描电子显微镜图片展示了不同浓度tDNA引起的晶片表面结晶的情况。通过图片可以清楚地发现，晶片表面结晶的量随着tDNA浓度的增加而增加。该结果也验证了上面频率线性校准的正确性，其结果与扫描电镜图片展示的结果一致。
实施例4特异性实验
本发明通过1个碱基错配和2个碱基错配的DNA序列来验证石英晶体微天平传感器检测方法的序列选择性。结果如图6所示，在浓度分别为10-15M和10-9M时，完全配对的靶标DNA产生的频率变化远远大于错配DNA引起的频率变化，错配DNA序列的信号响应基本可以忽略。该结果表明，基于石英晶体微天平的原位选择性结晶方法能够区分完全配对的tDNA和错配DNA，并且具有很高的选择性。该方法可以用于分析单链DNA的多种形态。该方法之所以有高选择性的特点，除了DNA链之间的特定杂交的原因外，还由于结合了-COOH和-N(CH3)3对结晶的调控能力。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 临沂大学
<120> 一种基于QCM的核酸序列检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tggaaaatct ctagcagtcg t 21
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
actgctagag attttccaca ctgactaaaa gggtctgagg ga 42
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atgtccctca gacccttt 18
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
actgctacag attttccaca ctgactaaaa gcgtctgagg ga 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
actgttacag attttccaca ctgactaaaa gggtctgtgg ga 42
Claims (2)
1.一种基于QCM的核酸序列检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)晶片的清洗；
(2)晶片的修饰：
①将清洗干净的晶片平铺在小烧杯底部，然后将1μM的捕获DNA溶液加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③称取HS-C11-NMe3Cl，溶解配置成10mM的溶液，加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应12h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，然后将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(3)晶片的进一步修饰：
①将吹干的晶片平铺在小烧杯底部，然后将靶标DNA加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
②反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质并平铺在小烧杯底部；
③配制过量浓度探针DNA，并将其加入小烧杯中，在气浴恒温振荡器中保持37℃反应1h；
④反应结束后，将晶片取出，冲洗掉晶片上未反应的物质，然后将晶片在氮气氛围中吹干备用；
(4)结晶：取出修饰好的晶片，安装在石英晶体微天平检测系统的开放式检测池中，打开QCM软件，预热至37℃，并开始测量；当共振频率在空气中稳定在±2Hz内时，在开放式检测池中加入500μl6mM CaCl2溶液，当共振频率稳定在±2Hz内后，在反应空间内加入过量的碳酸铵固体粉末；通过石英晶体微天平传感器记录下具有不同修饰的石英晶体微天平晶片表面的结晶化过程中的信号响应，当信号达到稳定后，保存数据。
2.根据权利要求1所述的一种基于QCM的核酸序列检测方法，其特征在于，步骤(1)所述晶片的清洗步骤如下：将晶片在食人鱼洗液中浸泡10分钟，然后按照H2O：H2O2：NH3·H2O＝5:1:1的体积比配制碱液，将配制好的碱液在电热套上加热煮沸，晶片置于煮沸的碱液中浸泡15分钟；用超纯水冲洗并在超纯水中浸泡5分钟，再用无水乙醇冲洗并在无水乙醇中浸泡5分钟；用氮气吹干，将干燥好的晶片放在净化工作台中紫外线下照射20分钟。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2019
- 2019-07-26 CN CN201910683979.XA patent/CN111534572A/zh active Pending
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