CN110849957B - 基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法 - Google Patents

基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110849957B
CN110849957B CN201911143163.4A CN201911143163A CN110849957B CN 110849957 B CN110849957 B CN 110849957B CN 201911143163 A CN201911143163 A CN 201911143163A CN 110849957 B CN110849957 B CN 110849957B
Authority
CN
China
Prior art keywords
laps
layer
escherichia coli
zno
7dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911143163.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110849957A (zh
Inventor
吴春生
田玉兰
朱平
陈雅婷
杜立萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xian Jiaotong University
Original Assignee
Xian Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xian Jiaotong University filed Critical Xian Jiaotong University
Priority to CN201911143163.4A priority Critical patent/CN110849957B/zh
Publication of CN110849957A publication Critical patent/CN110849957A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110849957B publication Critical patent/CN110849957B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/48—Systems using polarography, i.e. measuring changes in current under a slowly-varying voltage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明公开了基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法，该装置包括：拉第屏蔽箱、装载台、半导体激光器、LAPS传感器、恒压器、锁相放大器、采集卡、计算机。该方法首先进行细菌培养，大肠杆菌O157:H7 DNA的提取，LAPS传感器制作及ZnO纳米棒的修饰；LAPS传感器表面修饰探针链DNA，扫描I‑V曲线；通过遍历及最小二乘法拟合出检测O157:H7 DNA浓度的最佳标定曲线；通过分析待测样品溶液的I‑V曲线，电压偏移量V，带入标定曲线，计算出待测样品的浓度。本发明实现了O157:H7 DNA的无标签检测，具有时间短，成本低廉，操作方便，为O157:H7 DNA杂交提供三维位点，灵敏度高等优点。

Description

基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA 的装置及方法
技术领域
本发明涉及大肠杆菌O157:H7 DNA的检测领域，具体涉及基于LAPS 和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法。
背景技术
细菌脱氧核糖核酸(DNA)的检测在生物医学、食品工业和环境控制等领域具有广泛的技术意义，大肠杆菌O157:H7是最危险的食源性致病菌之一，存在于各种食物和水中，可引起出血性结肠炎，并导致血性腹泻等多种症状。DNA生物传感器发展的前沿目前是基于PCR扩增技术和标记法；PCR方法是通过酶促合反应来扩增DNA片段或序列，放大微量DNA耗时久。标记法是通常采用荧光对探针或目标DNA分子进行标记，DNA制作成本高，检测过程复杂。因此，开发一种无标签和经济有效的检测细菌DNA的新方法是非常必要的。目前检测DNA非标记法一般是利用芯片修饰互补链直接捕获目标DNA分子，简单快速，但扁平的结构可能对DNA杂交产生一定影响。因此，在生物医学、食品工业和环境控制等领域迫切需要开发一种高性能的无标签检测大肠杆菌O157:H7的新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法，以克服现有技术存在的缺陷，本发明实现了大肠杆菌O157:H7DNA的无标签检测，具有时间短，成本低廉，操作方便，为O157:H7 DNA杂交提供三维位点，灵敏度高等优点。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置，包括法拉第屏蔽箱、装载台、半导体激光器、LAPS传感器、恒压器、锁相放大器、采集卡和计算机；其中，装载台置于法拉第屏蔽箱内，半导体激光器安装在装载台下方，LAPS传感器安装在装载台上，恒压器和锁相放大器设置在法拉第屏蔽箱中，且恒压器和锁相放大器与LAPS传感器上的电极连接，锁相放大器和采集卡连接，采集卡安装在计算机上，用于对LAPS 传感器光电流进行采集，所述计算机安装在法拉第屏蔽箱外侧。
进一步地，所述LAPS传感器包括合金板，合金板的中部位置上依次设置有大小相同的Si层、SiO2层及Al层，Al层中部位置上依次设置有大小相同的ZnO NRAs层和探针ssDNA层，且Si层、SiO2层、Al层、ZnO NRAs 层和探针ssDNA层均设置在LAPS检测腔中。
进一步地，Al层的外沿设置有参考电极和对电极，合金板的外沿设置有工作电极，且工作电极位于LAPS检测腔外侧，工作电极、参考电极和对电极与恒压器相连，锁相放大器与工作电极相连。
基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的方法，包括以下步骤：
步骤1：大肠杆菌O157:H7 DNA的制备：以大肠杆菌O157:H7 eaeA基因为材料，采用不对称聚合酶链反应的方法制备目标DNA；
步骤2：LAPS传感器制作及ZnO纳米棒的修饰；
步骤3：在LAPS传感器表面修饰探针链DNA，扫描LAPS光电流-电压曲线，记为I-V曲线，通过遍历及最小二乘法拟合出检测O157:H7 DNA浓度的最佳标定曲线；
步骤4：通过分析待测样品溶液的I-V曲线，得到电压偏移量V，带入最佳标定曲线中，计算出待测样品的浓度。
进一步地，步骤1具体包括：
步骤1.1：将大肠杆菌O157:H7在37℃的营养肉汤中培养12小时，放入 100℃水浴15分钟；
步骤1.2：利用细菌DNA试剂盒提取步骤1.1得到的大肠杆菌O157:H7 的基因组DNA；
步骤1.3：以提取的基因组DNA为模板利用PCR将反向引物浓度设置为正向引物浓度的50倍，大肠杆菌O157:H7 eaeA基因特异的正向和反向引物为5'-GGCGG ATAAG ACTTCGGCTA-3'和5'-CGTTT TGGCA CTATT TGCCC-3'，，采用Bio-Rad热循环仪进行不对称PCR反应，预孵育5分钟，然后进行40个循环，其中95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，最后延伸10秒，产物为大肠杆菌O157:H7 eaeA基因的短DNA片段，包含能够与探针ssDNA互补的碱基序列。
进一步地，步骤2具体包括：
步骤2.1：将厚度为400um的P型硅片作为基底，所述P型硅片电导率为1-10Ωcm，采用热氧化法在P型硅片表面制备厚度为30nm的SiO2层，在 SiO2层上修饰一层中间窗口图案厚度为300nm的Al层；
步骤2.2：采用水热法在Al层表面修饰一层ZnO NRAs，形成ZnO NRAs 层；
步骤2.3：将探针ssDNA分子经硅烷化过程共价固定于ZnO NRAs层上，形成探针ssDNA层，整体作为LAPS芯片；
步骤2.4：将LAPS芯片放入检测腔内，LAPS传感器制备完成。
进一步地，步骤2.2具体包括：
步骤2.2.1：利用反应磁控喷射技术在Al层表面沉积一层ZnO膜，作为种子层；
步骤2.2.2：利用水热沉积法制作ZnO NRAs层：在密封烧杯中，在相同体积的0.02M的Zn(NO3)2和0.02M的六亚甲基四胺混合溶液中放入步骤 2.2.1得到的LAPS芯片，放置在95℃下2h，即生长出ZnO NRAs表面，然后用去离子水彻底冲洗，并用N2吹干，形成ZnO NRAs层。
进一步地，步骤2.3具体包括：
步骤2.3.1：O157:H7 DNA有特异性的单链DNA序列5'-AACGC CGATA CCATT ACTTATACCG CGACG-3'，对5'端进行氨基化；
步骤2.3.2：在沉积了ZnO NRAs的LAPS芯片表面滴加体积分数为0.1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，室温孵育1小时；
步骤2.3.3：冲洗干净，N2吹干，在120℃下加热2小时使芯片表面液体凝固；
步骤2.3.4：然后加入戊二醛，与芯片表面胺结合形成醛基；
步骤2.3.5：引入的醛基在室温条件下与探针ssDNA末端的胺类残基反应12小时，在芯片表面固定探针ssDNA；
步骤2.3.6：加入0.01g/ml的牛血清白蛋白，封闭其他非特异性结合位点；
步骤2.3.7：采用pH 7.5的PBS冲洗后4℃保存。
进一步地，步骤3具体包括：
步骤3.1：将测量溶液加入LAPS检测腔中，测量溶液为浓度10mM、pH7.5 的PBS，设置扫描电压扫描范围-1-0.8V，间隔10mV，记录LAPS传感器表面I-V曲线；
步骤3.2：将检测腔内测量液取出，加入大肠杆菌O157:H7目标DNA 溶液室温下孵育1小时，测量溶液用于清洗检测腔，去除未与探针表面DNA 杂交的DNA分子；
步骤3.3：重复步骤3.1；
步骤3.4：比较靶DNA结合前后LAPS表面的I-V曲线，计算LAPS I-V 曲线偏移量最大位置处的偏移电压量V；
步骤3.5：根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出偏移电压量V关于大肠杆菌O157:H7浓度以10为底的对数的标定曲线。
进一步地，步骤4具体为：待测样品溶液加入到LAPS检测腔中，重复步骤3.1-3.4，得到该待测样品的偏移电压量V，然后带入标定曲线，即计算出待测大肠杆菌O157:H7DNA的浓度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明利用LAPS传感测量系统来实现大肠杆菌O157:H7DNA的无标签检测，具有检测时间短，成本低廉，操作方便，灵敏度高等优势。LAPS传感系统是基于电化学的测量原理，利用光可寻址的特点实现对传感器表面电位的变化的测量，实现了无标签，操作简单，快速的大肠杆菌O157:H7DNA 的无标签检测。
本发明利用ZnO纳米棒阵列功能化的LAPS传感器实现了大肠杆菌 O157:H7DNA的无标签检测，灵敏度更高，检测下限更低，实现了高灵敏的无标签DNA检测。本发明较现有大肠杆菌O157:H7 DNA检测方法，ZnO纳米棒阵列为LAPS传感器结合DNA提供的更大的结合面积，提供了三维结合位点，相较于原芯片平面结构，响应信号更强，灵敏度更高，检测限更低，克服现有方法制作成本高，检测过程复杂耗时的缺点，根据以上优点，本发明的装置及方法可广泛用于生物医学、食品工业和环境控制等领域。
附图说明
图1是本发明LAPS测量装置的示意图装置整体结构图；
图2是本发明所使用的LAPS传感器结构图；
图3是本发明不同浓度的大肠杆菌O157:H7溶液的I-V曲线；
图4是本发明确定的检测大肠杆菌O157:H7的最佳标定曲线的结果图。
其中，1、法拉第屏蔽箱；2、装载台；3、半导体激光器；4、LAPS传感器；5、恒压器；6、锁相放大器；7、采集卡；8、计算机；9、LAPS检测腔；10、合金板；11、工作电极；12、参考电极；13、对电极；14、Si层； 15、SiO2层；16、Al层；17、ZnO NRAs层；18、探针ssDNA层。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的描述：
图1是本发明使用的测量装置。包括法拉第屏蔽箱1、装载台2、半导体激光器3、LAPS传感器4、恒压器5、锁相放大器6、采集卡7和计算机；其中，装载台2置于法拉第屏蔽箱1内，半导体激光器3安装在装载台2下方，LAPS传感器4安装在装载台2上，恒压器5和锁相放大器6和LAPS 传感器4上的电极连接，锁相放大器6和采集卡7连接，采集卡7安装在计算机8上用于对LAPS传感器4光电流进行采集。
参见图2，LAPS传感器4包括合金板10，合金板10的中部位置上依次设置有大小相同的Si层14、SiO2层15及Al层16，Al层16中部位置上依次设置有大小相同的ZnO NRAs层17和探针ssDNA层18，且Si层14、SiO2层15、Al层16、ZnO NRAs层17和探针ssDNA层18均设置在LAPS检测腔9中；Al层16的外沿设置有参考电极12和对电极13，合金板10的外沿设置有工作电极11，且工作电极11位于LAPS检测腔9外侧，工作电极11、参考电极12、对电极13与恒压器5相连，锁相放大器6与工作电极11相连。
一种基于LAPS和ZnO纳米棒阵列的无标签检测大肠杆菌O157:H7 DNA的方法，包括以下步骤：
(1)大肠杆菌O157:H7 DNA的制备：以大肠杆菌O157:H7 eaeA基因为材料，采用不对称聚合酶链反应(PCR)的方法制备目标DNA。
(1.1)大肠杆菌O157:H7在37℃的营养肉汤中培养12小时，放入100℃水浴15分钟
(1.2)利用细菌DNA试剂盒提取大肠杆菌O157:H7基因组DNA。
(1.3)以提取的基因为模板利用PCR，大肠杆菌O157:H7 eaeA基因特异的正向和反向引物为5'-GGCGG ATAAG ACTTC GGCTA-3'和5'-CGTTT TGGCA CTATT TGCCC-3'，将反向引物浓度设置为正向引物浓度的50倍，采用Bio-Rad热循环仪进行不对称PCR反应，预孵育5分钟，然后进行40 个循环，其中95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，最后延伸 10秒，产物为大肠杆菌O157:H7 eaeA基因的短DNA片段(151个碱基)，包含可以与探针ssDNA互补的碱基序列。
(2)功能化LAPS传感器的制作
(2.1)厚度为400um的P型硅片(1-10Ωcm)作为基底,采用热氧化法在硅片表面制备了30nm的SiO2层。为了欧姆接触和光照射，在SiO2层上修饰一层中间窗口图案的300nm的Al层。
(2.2)采用水热法在LAPS芯片表面修饰一层ZnO NRAs。
(2.2.1)利用反应磁控喷射技术在LAPS芯片表面沉积了一层薄薄的 ZnO膜，作为种子层。
(2.2.2)利用水热沉积法制作ZnO NRAs层：在密封烧杯中，等体积等浓度的0.02M的Zn(NO3)2和六亚甲基四胺混合溶液中放入(2.2.1)中LAPS 芯片。放置在95℃下2h，即生长出ZnO NRAs表面，然后用去离子水彻底冲洗LAPS芯片，用N2吹干备用。(2.3)探针ssDNA分子经硅烷化过程共价固定于LAPS表面。
(2.3.1)O157:H7 DNA有特异性的单链DNA序列5'-AACGC CGATA CCATT ACTTATACCG CGACG-3'，5'端进行氨基化。
(2.3.2)在沉积了ZnO NRAs的LAPS芯片表面滴加0.1％(v/v)3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的甲苯溶液，室温孵育1小时。
(2.3.3)冲洗干净，N2吹干，在120℃下加热2小时使芯片表面液体凝固，在芯片表面固定探针ssDNA。
(2.3.4)加入戊二醛，与芯片表面胺结合形成醛基。
(2.3.5)引入的醛基在室温条件下与探针ssDNA末端的胺类残基反应 12小时。
(2.3.6)加入0.01g/ml的牛血清白蛋白(BSA)，封闭其他非特异性结合位点。
(2.3.7)PBS(pH 7.5)冲洗，4℃保存，以备后续实验。
(2.4)将LAPS芯片放入检测腔内，LAPS传感器制备完成。
(3)通过记录LAPS传感器表面加入大肠杆菌O157:H7目标DNA溶液前后的光电流-电压曲线(I-V曲线)的变化来检测目标DNA浓度。
(3.1)将测量溶液(10mM PBS,pH 7.5)加入检测腔中，设置扫描电压扫描范围-1-0.8V，间隔10mV，记录LAPS表面I-V曲线。
(3.2)将检测腔内测量液取出，加入大肠杆菌O157:H7目标DNA溶液室温下孵育1小时。测量溶液用于清洗检测腔，去除未与探针表面ssDNA杂交的DNA分子。
(3.3)重复步骤(3.1)。
(3.4)比较靶DNA结合前后LAPS表面的I-V曲线，计算LAPS I-V曲线偏移量最大位置处的偏移电压量V。
(3.4)根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出偏移电压量V关于大肠杆菌O157:H7浓度以10为底的对数的标定曲线；
(4)检测未知浓度的样品溶液大肠杆菌O157:H7浓度：将步骤1得到的待测样品溶液加入到LAPS检测腔中，重复步骤3.1-3.4，得到在该待测样品的偏移电压量V，带入步骤标准曲线计算出待测大肠杆菌O157:H7的浓度。
图4为本发明方法的标定结果，从图中可以看出，本发明方法的标定曲线公式为V＝21.3lg[C]－28.9，V偏移电压值，C为大肠杆菌O157:H7浓度。实验结果证明本发明方法能够准确检测大肠杆菌O157:H7DNA的浓度。

Claims (6)

1.基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置，其特征在于，包括法拉第屏蔽箱(1)、装载台(2)、半导体激光器(3)、LAPS传感器(4)、恒压器(5)、锁相放大器(6)、采集卡(7)和计算机(8)；其中，装载台(2)置于法拉第屏蔽箱(1)内，半导体激光器(3)安装在装载台(2)下方，LAPS传感器(4)安装在装载台(2)上，恒压器(5)和锁相放大器(6)设置在法拉第屏蔽箱(1)中，且恒压器(5)和锁相放大器(6)与LAPS传感器(4)上的电极连接，锁相放大器(6)和采集卡(7)连接，采集卡(7)安装在计算机(8)上，用于对LAPS传感器(4)光电流进行采集，所述计算机(8)安装在法拉第屏蔽箱(1)外侧；
所述LAPS传感器(4)包括合金板(10)，合金板(10)的中部位置上依次设置有大小相同的Si层(14)、SiO2层(15)及Al层(16)，Al层(16)设置有中间窗口，且Al层(16)中部位置上依次设置有大小相同的ZnO NRAs层(17)和探针ssDNA层(18)，且Si层(14)、SiO2层(15)、Al层(16)、ZnO NRAs层(17)和探针ssDNA层(18)均设置在LAPS检测腔(9)中；
Al层(16)的外沿设置有参考电极(12)和对电极(13)，合金板(10)的外沿设置有工作电极(11)，且工作电极(11)位于LAPS检测腔(9)外侧，工作电极(11)、参考电极(12)和对电极(13)与恒压器(5)相连，锁相放大器(6)与工作电极(11)相连。
2.基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：大肠杆菌O157:H7 DNA的制备：以大肠杆菌O157:H7 eaeA基因为材料，采用不对称聚合酶链反应的方法制备目标DNA；
具体包括：
步骤1.1：将大肠杆菌O157:H7在37℃的营养肉汤中培养12小时，放入100℃水浴15分钟；
步骤1.2：利用细菌DNA试剂盒提取步骤1.1得到的大肠杆菌O157:H7的基因组DNA；
步骤1.3：以提取的基因组DNA为模板利用PCR将反向引物浓度设置为正向引物浓度的50倍，大肠杆菌O157:H7 eaeA基因特异的正向和反向引物为5'-GGCGG ATAAG ACTTCGGCTA-3'和5'-CGTTT TGGCA CTATT TGCCC-3'，采用Bio-Rad热循环仪进行不对称PCR反应，预孵育5分钟，然后进行40个循环，其中95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，最后延伸10秒，产物为大肠杆菌O157:H7 eaeA基因的短DNA片段，包含能够与探针ssDNA互补的碱基序列；
步骤2：LAPS传感器制作及ZnO纳米棒的修饰；
具体为：
步骤2.1：将厚度为400um的P型硅片作为基底，所述P型硅片电导率为1-10Ωcm，采用热氧化法在P型硅片表面制备厚度为30nm的SiO2层，在SiO2层上修饰一层中间窗口图案厚度为300nm的Al层；
步骤2.2：采用水热法在Al层的中部位置修饰一层ZnO NRAs，形成ZnO NRAs层；
步骤2.3：将探针ssDNA分子经硅烷化过程共价固定于ZnO NRAs层上，形成探针ssDNA层，整体作为LAPS芯片；
步骤2.4：将LAPS芯片放入检测腔内，LAPS传感器制备完成；
步骤3：在LAPS传感器表面修饰探针链DNA，扫描LAPS光电流-电压曲线，记为I-V曲线，通过遍历及最小二乘法拟合出检测O157:H7 DNA浓度的最佳标定曲线；
步骤4：通过分析待测样品溶液的I-V曲线，得到电压偏移量V，带入最佳标定曲线中，计算出待测样品的浓度。
3.根据权利要求2所述的基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的方法，其特征在于，步骤2.2具体包括：
步骤2.2.1：利用反应磁控喷射技术在Al层表面沉积一层ZnO膜，作为种子层；
步骤2.2.2：利用水热沉积法制作ZnO NRAs层：在密封烧杯中，在相同体积的0.02M的Zn(NO3)2和0.02M的六亚甲基四胺混合溶液中放入步骤2.2.1得到的LAPS芯片，放置在95℃下2h，即生长出ZnO NRAs表面，然后用去离子水彻底冲洗，并用N2吹干，形成ZnO NRAs层。
4.根据权利要求2所述的基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的方法，其特征在于，步骤2.3具体包括：
步骤2.3.1：O157:H7 DNA有特异性的单链DNA序列5'-AACGC CGATA CCATT ACTTATACCG CGACG-3'，对5'端进行氨基化；
步骤2.3.2：在沉积了ZnO NRAs的LAPS芯片表面滴加体积分数为0.1％的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液，室温孵育1小时；
步骤2.3.3：冲洗干净，N2吹干，在120℃下加热2小时使芯片表面液体凝固；
步骤2.3.4：然后加入戊二醛，与芯片表面胺结合形成醛基；
步骤2.3.5：引入的醛基在室温条件下与探针ssDNA末端的胺类残基反应12小时，在芯片表面固定探针ssDNA；
步骤2.3.6：加入0.01g/ml的牛血清白蛋白，封闭其他非特异性结合位点；
步骤2.3.7：采用pH 7.5的PBS冲洗后4℃保存。
5.根据权利要求2所述的基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的方法，其特征在于，步骤3具体包括：
步骤3.1：将测量溶液加入LAPS检测腔中，测量溶液为浓度10mM、pH7.5的PBS，设置扫描电压扫描范围-1-0.8V，间隔10mV，记录LAPS传感器表面I-V曲线；
步骤3.2：将检测腔内测量液取出，加入大肠杆菌O157:H7目标DNA溶液室温下孵育1小时，测量溶液用于清洗检测腔，去除未与探针表面DNA杂交的DNA分子；
步骤3.3：重复步骤3.1；
步骤3.4：比较靶DNA结合前后LAPS表面的I-V曲线，计算LAPS I-V曲线偏移量最大位置处的偏移电压量V；
步骤3.5：根据最小二乘法拟合曲线算法，拟合出偏移电压量V关于大肠杆菌O157:H7浓度以10为底的对数的标定曲线。
6.根据权利要求5所述的基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的方法，其特征在于，步骤4具体为：待测样品溶液加入到LAPS检测腔中，重复步骤3.1-3.4，得到该待测样品的偏移电压量V，然后带入标定曲线，即计算出待测大肠杆菌O157:H7DNA的浓度。
CN201911143163.4A 2019-11-20 2019-11-20 基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法 Active CN110849957B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911143163.4A CN110849957B (zh) 2019-11-20 2019-11-20 基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911143163.4A CN110849957B (zh) 2019-11-20 2019-11-20 基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110849957A CN110849957A (zh) 2020-02-28
CN110849957B true CN110849957B (zh) 2020-11-10

Family

ID=69602806

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911143163.4A Active CN110849957B (zh) 2019-11-20 2019-11-20 基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110849957B (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI544617B (zh) * 2015-01-19 2016-08-01 長庚大學 光定址電位感測器

Also Published As

Publication number Publication date
CN110849957A (zh) 2020-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kavita DNA biosensors-a review
Izadi et al. Fabrication of an electrochemical DNA-based biosensor for Bacillus cereus detection in milk and infant formula
Rai et al. Electrochemical nanoporous alumina membrane-based label-free DNA biosensor for the detection of Legionella sp
Escamilla-Gómez et al. Gold screen-printed-based impedimetric immunobiosensors for direct and sensitive Escherichia coli quantisation
WO2016062101A1 (zh) 检测ndm-1的修饰电极及其制备方法和应用
Zhuang et al. Sensitive electrochemical monitoring of nucleic acids coupling DNA nanostructures with hybridization chain reaction
CN103175873B (zh) 基于目标dna重复序列自身增强放大信号的dna电化学传感器
JPH10509025A (ja) 固体表面に吸着された核酸の電気的に発生した化学ルミネッセンス性検出のためのバイオセンサーおよび方法
CN104502437B (zh) 一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对核酸的检测
Siddiquee et al. Electrochemical DNA biosensor for the detection of specific gene related to Trichoderma harzianum species
Wen et al. Electrochemical detection of PCR amplicons of Escherichia coli genome based on DNA nanostructural probes and polyHRP enzyme
CN109596685B (zh) 一种检测atp的电化学传感器及其制备方法
CN112730547A (zh) 一种用于检测nsclc循环肿瘤基因的电化学生物传感器的制备方法及应用
Siddiquee et al. DNA hybridization based on Trichoderma harzianum gene probe immobilization on self-assembled monolayers on a modified gold electrode
Soni et al. Label-free impedimetric detection of Listeria monocytogenes based on poly-5-carboxy indole modified ssDNA probe
EP2477031A2 (en) Method for detecting and quantifying a target substance using a biochip
CN109856211B (zh) 一种同时检测Exo I和TdT的电化学生物传感器的制备方法及其应用
Xu et al. Microfabricated disposable DNA sensors based on enzymatic amplification electrochemical detection
Ghindilis et al. Sensor Array: Impedimetric Label‐Free Sensing of DNA Hybridization in Real Time for Rapid, PCR‐Based Detection of Microorganisms
Shams et al. Application of biosensors in food quality control
CN110849957B (zh) 基于LAPS和ZnO纳米棒阵列无标签检测大肠杆菌O157:H7DNA的装置及方法
CN110849958B (zh) 一种利用ZnO纳米棒提升光寻址电位传感器检测DNA性能的装置及方法
CN106468682A (zh) 一种纳米探针诱导酶聚合放大电化学核酸适体传感器检测癌胚抗原的方法
CN106645344B (zh) 一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇电化学传感器的制备方法及其应用
Peng et al. Fabrication of an electrochemical sensor for Helicobacter pylori in excrement based on a gold electrode

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant