JP2002535998A - メチル化核酸の検出における蛍光分子ビーコンの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１）メチル化ヌクレオチドを含む疑いのある核酸サンプルを、核酸ハイブリッド形成に適切な条件下で、オリゴヌクレオチド配列と接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチド配列が、（ｉ）発蛍光団部分により標識された第１のステムと、前記核酸サンプルの、メチル化されやすい少なくとも１つの領域に対して相補的なヌクレオチドの１つの領域を有するループ配列と、前記発蛍光団部分に対して空間的に近傍に位置する際に前記発蛍光団部分を消光することが可能である消光部分により標識された第２のステムとを含んで成ることと、（ｉｉ）前記第１のステムを形成する前記ヌクレオチドが、前記プローブが前記核酸サンプルから分離されると、前記第２のステムを形成する前記ヌクレオチドの空間的近傍内に入ることが可能であることとを特徴とするステップと、２）前記オリゴヌクレオチドプローブが、非メチル化ＤＮＡから分離されるが、メチル化ＤＮＡにハイブリッド形成されたままであるように前記ハイブリッド形成条件を変更するステップと、３）蛍光における変化を測定するステップとを含非メチル化核酸を検出するための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、メチル化核酸の存在を検出するための方法に関する。詳細には、本
発明は、患部組織内の核酸がメチル化される、癌などの患者内の疾病状態を診断
する方法に関する。

【０００２】背景技術 科学面 ＤＮＡ内のシトシン残基のメチル化は、現在のところ、正常の細胞発達を制御
するのに積極的な役割を果たすと考えられている。様々な研究により、メチル化
と転写の不活性化との間に密接な相関関係が存在することが示されている。脊椎
動物において、不活性化された遺伝子が、しばしば、ＤＮＡ配列内で、グアノシ
ン（Ｇ）残基が直後に後続する修飾シトシン残基５−メチルシトシン（ｍＣ）を
含むことを立証する大量の証拠が存在する。しかし、転写に積極的に関与するＤ
ＮＡの領域は、５’メチルシトシン残基を欠如する。

【０００３】 現在、哺乳動物内のＤＮＡメチル化機構における変化が、癌発生および癌進行
に重要な役割を果たすかもしれないことを示唆する大量の証拠が存在する。この
面で、限局的な高メチル化および一般的なゲノム脱メチル化が、多数の異なるタ
イプの新生物の特徴と認識されている。

【０００４】 局所的な高メチル化のための標的は、通常、遺伝子プロモーター領域内に位置
する非メチル化「ＣｐＧ島」である。この高メチル化は、ｐ１６，ｐ１５，ＶＨ
Ｌ，およびＥ−ｃａｄを含む、腫瘍抑制遺伝子の不活性化のためのコード領域の
突然変異に対する代替として用いられることが可能である転写抑制と相関する。
特に、いかにして、いくつかの特異な領域の一般的なゲノム低メチル化および高
メチル化が腫瘍発生の間に進展するかは、定義されることが始まったばかりであ
る。通常、非メチル化ＣｐＧ島は、直接に側方に位置する領域に影響する密なメ
チル化から保護されているように見える。新生物細胞において、この保護は、多
分、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性の増加および／または局所的保護機構
の中断に慢性的に曝露されることに起因して、喪失される。

【０００５】 ある特定の遺伝子の高メチル化も、細胞周期の制御に重要な役割を果たす。１
つのこのような遺伝子はＭｙｆ−３遺伝子である。Ｍｙｆ−３遺伝子は、通常、
非悪性組織内で高メチル化される。最近の研究は、Ｍｙｆ−３遺伝子が、多数の
タイプの癌組織内で急激に高メチル化されることを示した。従って、遺伝子の高
メチル化を検出する簡単な方法が、いくつかの癌腫の検出および診断に対して新
しいアプローチを提供することが可能であるに違いない。

【０００６】 ＤＮＡ内のメチル化領域の地図作成は、サザンブロッティング技術を基礎とし
、１つ以上のメチル化シトシン残基を含む配列を切断できるメチル化感受性制限
酵素が働かないことに基づく。この方法は、比較的低感度であり、大量の高分子
量ＤＮＡを必要とし、メチル化感受性制限酵素により認識された配列内で発見さ
れるシトシン残基に関する情報しか提供することができない。サザンブロッティ
ング法の１つのさらなる欠点は、方法全体で７〜１０日が必要されることにある
。

【０００７】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）も、メチル化ＤＮＡを検出するのに使用され
る。ＰＣＲ法において、メチル化感受性酵素が、メチル化ＤＮＡと非メチル化Ｄ
ＮＡとを区別するのに使用される。より詳細には、ＰＣＲプライマーは、ＤＮＡ
メチル化に対して感受性を有する制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む、ＤＮ
Ａの１つの領域にまたがるように設計されている。酵素認識配列が、メチル化さ
れない場合、ＤＮＡは加水分解され、ＰＣＲ標的ＤＮＡは破壊される。ＤＮＡが
メチル化されると、酵素は、標的を加水分解せず、ＤＮＡ鎖合成が達成される。
非メチル化ＤＮＡの制限は、完全でなければならない、何故ならば、任意の非切
断ＤＮＡは、ＰＣＲにより増幅されるからである。これは、メチル化に対する誤
った陽性の結果に導くことがある。１つのさらなる問題は、この方法は、複数の
ステップを含むことにある。

【０００８】 第３の方法は、すべての非メチル化シトシンをチミンに変換させるために、Ｄ
ＮＡの重亜硫酸塩処理とＰＣＲとを組合せる。メチル化シトシン残基は、重亜硫
酸塩により、チミンへの変換から保護される。変換シトシン残基または非変換シ
トシン残基に対して特異的なＰＣＲプライマーが、研究下、シトシン残基を含む
ＤＮＡ鎖合成を生成するのに使用される。通常、クローニングステップおよび配
列決定ステップは、いずれのシトシン残基がメチル化されるかを割当てることが
必要とされる。この方法は、技術的に困難であり、労力が大きく、増幅産物をク
ローニングすすることがなく、検出のためにメチル化されるべき対立遺伝子の約
１０％を必要とする。

【０００９】 ＤＮＡメチル化を検出する現在の方法は時間がかかり、高価であり、しばしば
、特異性を欠如する。本発明は、メチル化核酸の検出のための新しい改善された
方法を提供することにより、従来技術に関連するこれらおよび他の問題を軽減す
ることを追求する。

【００１０】 一般面 当業者は、本願明細書に記載の本発明が、特定的に説明されたもの意外の変形
および変更が可能であることを理解するであろう。本発明は、すべてのこのよう
な変形および変更を含むと理解されたい。本発明は、個別的または集団的に、本
願明細書において引用されたまたは示されたすべてのステップ、特徴、組成およ
び化合物も含み、ステップまたは特徴の任意の組合せ及びすべての組合せまたは
任意の２つ以上のものも含む。

【００１１】 本発明は、例示の目的のみに意図されている、本願明細書に記載の特定的な実
施例により、範囲を制限されない。機能的に等価の産物、組成および方法は、本
明細書に記載の本発明の範囲内に明瞭に入る。

【００１２】 この明細書において数字を付加されて引用された出版物の文献目録の詳細は、
説明の最後に一括して記載されている。特許および特許出願を含む記載のすべて
の参照文献は、引用することにより、本願明細書の一部を成すものとする。参照
文献のうちの任意のものが、従来技術を成すことは承認されない。

【００１３】 本明細書において、「に由来する」という用語は、１つの特定の対象物が、１
つの特定のソースから得られることが可能であるが、しかし、そのソースから必
ずしも直接的に得られるとはかぎらないことを意味する。

【００１４】 本願明細書および請求の範囲全体において、コンテクストが別記しないかぎり
、「を含んで成る（含む）」という語句は、記載の対象物および対象物の群を含
むことを意味するが、任意の他の対象物および対象物の群を除外することを意味
しない。

【００１５】発明の概要 本発明は、（１）メチル化ヌクレオチドを含む疑いのある核酸サンプルを、核
酸ハイブリッド形成に適切な条件下で、オリゴヌクレオチド配列と接触させるス
テップであって、前記オリゴヌクレオチド配列が、 （ｉ）発蛍光団部分により標識された第１のステムと、前記核酸サンプルのメ
チル化されやすい少なくとも１つの領域に対して相補的なヌクレオチドの１つの
領域を有するループ配列と、前記発蛍光団部分に対して空間的に近傍に位置する
際に前記発蛍光団部分を消光することが可能である消光部分により標識された第
２のステムとを含んで成ることと、 （ｉｉ）前記第１のステムを形成する前記ヌクレオチドが、前記プローブが前
記核酸サンプルから分離されると、前記第２のステムを形成する前記ヌクレオチ
ドの空間的近傍内に動き入ることが可能であることと を特徴とするステップと、 （２）前記オリゴヌクレオチドプローブが、非メチル化ＤＮＡから分離される
が、メチル化ＤＮＡにハイブリッド形成されたままであるように前記ハイブリッ
ド形成条件を変更するステップと、 （３）蛍光における変化を測定するステップと を含むチル化核酸を検出するための方法を提供する。

【００１６】 本発明は、メチル化核酸を検出するのに必要な他の試薬と一緒に、本発明で使
用されるのに適する、本願明細書に記載の標識プローブを含むキットにも関する
。例えば、キットは、増幅産物を検出するための１つ以上の分子ビーコンと一緒
に、ＰＣＲ反応のための酵素、プライマーおよび緩衝液を含むこともある。複数
のアッセイにおいて、本発明によるキットは、複数のプローブを含み、前記プロ
ーブのうちの少なくとも１つは、本発明での使用のために説明されたプローブで
ある。

【００１７】発明の詳細な説明 本発明では、メチル化された核酸配列を同定するための方法が提供される。注
目すべきことに、この技術は、メチル化が僅か１つのシトシン残基で発生する場
合において、メチル化核酸配列と非メチル化核酸配列とを検出し、両者を区別す
るのに充分に高感度であることが発見された。

【００１８】 このような技術は、オリゴヌクレオチドサンプル内のメチル化核酸配列の存在
を検出する手段として、広い用途を有することが可能である。核酸配列のメチル
化が、例えば、癌組織内で、そして、外来のＤＮＡが、特にウイルス感染により
宿主内に導入される場合に発生することが発見された。事実、ＤＮＡメチル化は
、特にウイルスを介して導入された外来のＤＮＡが、中和またはサイレンスされ
る方法のうちの１つの方法であると現在認識されている。（たとば癌腫内の）細
胞ＤＮＡまたは外来のＤＮＡのいずれがメチル化される場合でも、本発明は、メ
チル化ＤＮＡの存在を検出するのに使用されることが可能である。

【００１９】 ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現に影響するので、特定の疾病状態に関連する特
異的遺伝子を再活性化または抑圧する狙いの治療戦略は、ＤＮＡメチル化を測定
するための簡単な方法へのアクセスを必要とする確率が高いため、本発明は、こ
のような方法を提供する。加えて、遺伝子治療を促進する最も適切な方法を理解
する狙いの研究が、本願明細書に記載のものなどの、メチル化シトシン残基の検
出のための簡単な方法の可用性によっても前進されるであろう。

【００２０】 シトシンのメチル化は、遺伝子量の標準化においても重要な役割を果たす。例
えば、雌において、Ｘ染色体のうちの１つは、シトシンメチル化により、不活性
化された状態に維持されている。ＤＮＡメチル化は、親のインプリンティングに
関与する、主要な遺伝子サイレンシング機構のうちの１つである。例えばＨ１９
などの遺伝子の適切な発現を維持するために、母親または父親から受け継がれた
遺伝子のうちの１つが、ＤＮＡメチル化によりサイレンシングされる。ＤＮＡメ
チル化は、また、発生の間に多数の生物学的過程に重要な役割を果たす。例えば
、ＤＮＡ内のシトシン残基をメチル化する能力を実験的に低減させると、胎児が
死亡する。

【００２１】 このようにして、本発明は、１）メチル化ヌクレオチドを含む疑いのある核酸
サンプルを、核酸ハイブリッド形成に適切な条件下で、オリゴヌクレオチド配列
と接触させるステップであって、前記オリゴヌクレオチド配列が、 （ｉ）発蛍光団部分により標識された第１のステムと、前記核酸サンプルの、
メチル化されやすい少なくとも１つの領域に対して相補的なヌクレオチドの１つ
の領域を有するループ配列と、前記発蛍光団部分に対して空間的に近傍に位置す
る際に前記発蛍光団部分を消光することが可能である消光部分により標識された
第２のステムとを含んで成ることと、 （ｉｉ）前記第１のステムを形成する前記ヌクレオチドが、前記プローブが前
記核酸サンプルから分離されると、前記第２のステムを形成する前記ヌクレオチ
ドの空間的近傍内に動き入ることが可能であること とを特徴とするステップと、 ２）前記オリゴヌクレオチドプローブが、非メチル化ＤＮＡから分離されるが
、メチル化ＤＮＡにハイブリッド形成されたままであるように前記ハイブリッド
形成条件を変更するステップと、 ３）蛍光における変化を測定するステップと を含むメチル化核酸を検出するための方法を提供する。

【００２２】 好ましくは、標識オリゴヌクレオチド配列が、標的核酸サンプルから分離する
と、前記第１のステムおよび前記第２のステムは、ともにハイブリッド形成して
、前記発蛍光団部分の消光を惹起する。

【００２３】 プローブ内のループ配列が、標的遺伝子内の相補的配列に結合すると、プロー
ブは、「オープンコンホメーション（開いた高次構造）」内に入り、ドナー発蛍
光団の蛍光が検出可能である。プローブが、クローズコンホメーション（閉じた
高次構造）（ヘアピンコンホメーション）にあると、ドナー発蛍光団の蛍光は消
光される。

【００２４】 望ましくは、前記ループ配列が、細胞が正常状態から癌状態にトランスフォー
ムすると、メチル化を受ける核酸配列の部分に対して相補的である。さらに、好
ましくは、ループ配列は、ループ配列が、標的配列と特異的にハイブリッド形成
することが可能であるが、「閉じた立体配置」において（すなわち前記２つのス
テムがともにハイブリッド形成する場合に）プローブの維持を促す内部構造を形
成することが不可能であるように選択される。１つの特に好ましいプローブ設計
において、プローブは、メチル化される潜在的可能性を有するＣＧオリゴヌクレ
オチドの比が高い核酸配列内の領域にハイブリッド形成するように設計されてい
る。

【００２５】 １つの好ましい実施例において、本発明は、組織サンプル内の癌細胞の存在を
検出するのに使用されることも可能である。様々な遺伝子のメチル化が、様々な
細胞内の癌状態の開始または進展に関与するとされた。このようなトランスフォ
ームを受けることが知られているこのような遺伝子の一つは、Ｍｙｆ−３遺伝子
である。通常はメチル化されていないが、新生物細胞内で高メチル化される他の
遺伝子は、例えば、ＰＡＸ遺伝子、カルシトニンおよびグルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼＩＩ（ｐｉ）遺伝子を含む。

【００２６】 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｐｉ）の１つの特定の領域内の特異
的シトシン残基が、悪性前立腺組織内のみでメチル化されることが示された（１
）。前立腺癌組織内で異常にメチル化されている、グルタチオン−Ｓ−トランス
フェラーゼ（ｐｉ）内のシトシン残基の同定は、前立腺組織の悪性の診断のため
の新規の方法を提供する。

【００２７】 遺伝子がメチル化されるにつれ、遺伝子とその相補物の融解温度における漸進
的増加が発生する。本発明は、非メチル化核酸とメチル化核酸とを区別するため
に、この特徴を利用する。

【００２８】 本願明細書に記載のように、標識オリゴヌクレオチド配列が、標的相補性ＤＮ
Ａ配列に遭遇すると、標識オリゴヌクレオチド配列は、望ましくは、標的相補性
ＤＮＡ配列と共働して、ステム配列により形成されるハイブリッドに比してより
強くより安定的であるハイブリッドを形成しなければならない。これが発生する
と、標識オリゴヌクレオチド配列は、自然にコンホメーションの変化を受け、こ
の変化により、ステム配列は、互いから遠ざかって動き、これにより、標識オリ
ゴヌクレオチド配列は、「オープンコンホメーション」内に入り、これにより、
蛍光が検出されることが可能となる、何故ならば発蛍光団は、もはや、消光物の
密な近傍内に位置しないからである。本発明では、ハイブリッド形成されていな
い標識オリゴヌクレオチド配列は、蛍光することが不可能でなければならない。

【００２９】 本発明によるメチル化の検出は、標識オリゴヌクレオチド配列がオリゴヌクレ
オチドサンプルから分離することを促進するために、ハイブリッド形成反応の間
に、ハイブリッド形成条件を変更することにより、達成される。好ましくは、ハ
イブリッド形成反応の温度を上昇させることにより、達成される。温度が上昇す
ると、標識オリゴヌクレオチド配列が、非メチル化標的配列から融解して分離す
るが、メチル化ＤＮＡには結合されたままである温度に到達する。

【００３０】 標識オリゴヌクレオチド配列が標的から分離すると、標識オリゴヌクレオチド
配列は、コンホメーションの自由を獲得し、これにより、標識オリゴヌクレオチ
ド配列は、閉コンホメーション状態を形成することが可能となり、これにより、
蛍光が低減される。詳細には、標識オリゴヌクレオチド配列の構造における変化
により、発蛍光団と消光物とは、空間的近傍内に動かされ、これにより、蛍光が
消光される。ハイブリッド形成反応の温度が増加する過程で、反応における蛍光
の変化を測定することにより、プローブが、その相補性配列から融解して分離す
る時点を検出することが可能である。メチル化ＤＮＡは、より高い温度で分離す
るので、非メチル化ＤＮＡからメチル化ＤＮＡを区別することが可能となる。

【００３１】 標識オリゴヌクレオチド配列の融解温度は、ループ配列およびステム配列の長
さおよびＧ−Ｃ含量と、標識オリゴヌクレオチド配列が溶解している溶液内の塩
の濃度とに依存する。

【００３２】 メチル化遺伝子および非メチル化遺伝子にアニールされている場合の、特定の
標識オリゴヌクレオチド配列の溶融温度は知られているので、ハイブリッド形成
条件は、ループ配列が、メチル化されていない相補的な標的遺伝子配列から融解
して分離するが、メチル化標的遺伝子配列からは融解分離しない温度まで、ハイ
ブリッド形成温度を上昇させることにより、変化させることが可能である。次い
で、反応混合物内の蛍光の量が測定され、結果が分析される。ステム配列は、非
メチル化遺伝子配列からの分離に後続して集まるため、蛍光の低下が、観察され
るに違いない。

【００３３】 メチル化核酸配列および／または非メチル化核酸配列に結合されている標識オ
リゴヌクレオチド配列の融解温度は、知られていない、または、溶融温度に関す
る不確定性が存在する場合、複数の異なる対照反応が、好ましくは、試験サンプ
ルと平行して行われる。対照反応は、非メチル化またはメチル化されている、少
なくとも１つの対応する遺伝子配列を含むことが必要であるであるか、または、
望まれる場合、非メチル化反応およびメチル化反応の双方が、２つの別個の対照
として、行われることも可能である。

【００３４】 本明細書において、「分子ビーコン」という用語は、特異的結合反応に参加す
ることが可能である分子であって、この分子の蛍光活性は、この分子がその結合
反応に参加すると、変化する分子を意味する。前述の標識オリゴヌクレオチド配
列は、本発明の目的のために、分子ビーコンである。

【００３５】 配列の一本鎖形が、温度および溶液イオン強度が適切な条件下で、核酸分子に
アニール化されることが可能である場合、標識オリゴヌクレオチド配列は、ｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの核酸分子に「ハイブリッド形成可能」
である（Sambrook et al., 1989, (2)参照）。温度およびイオン強度の条件は、
ハイブリッド形成の「ストリンジェンシー（厳密性）」を決定する。漸進的に高
くなるストリンジェントな条件の１つの例は、次のようである、すなわち、ほぼ
室温における２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（ハイブリッド形成条件）、ほぼ室
温における０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（低いストリンジェント条件）、
約４２゜Ｃにおける０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（中程度のストリンジェ
ント条件）、約６８゜Ｃにおける０．１×ＳＳＣ（高いストリンジェント条件）
。ハイブリッド形成は、プローブおよび核酸分子が、ハイブリッド形成のストリ
ンジェンシーに依存して、塩基と塩基との間のミスマッチが可能であるにもかか
わらず、相補的な配列を含むことを必要とする。核酸をハイブリッド形成するた
めの適切なストリンジェンシー（厳密性）は、当技術で知られている変数に依存
する。例えば、核酸のハイブリッド形成領域の長さ、相補性の程度、核酸配列組
成（例えばＧＣ対ＡＴ含量）、および核酸タイプ（例えばＲＮＡ対ＤＮＡ）が、
ハイブリッド形成条件を選択する際に考慮されることもある。２つの核酸配列の
間の相補性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのた
めのＴ_mの値も大きい。核酸ハイブリッド形成の（より高いＴ_mに対応する）相対
的安定性は、次の順序で低下する、すなわち、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ
、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００のヌクレオチドより長いハイブリッドにおいて、Ｔ_m
を計算するための式が、導出された（Sambrook et al., 1989,上記，9.50-9.51)
。より短い核酸でのハイブリッド形成において、ミスマッチの位置が、より重要
になり、オリゴヌクレオチドの長さが、その特異性を決定する（Sambrook et al
., 1989, 上記，11.7-11.8参照）。好ましくは、ループ配列は、プローブとその
標的核酸配列との間の非特異的結合を回避するために、ヌクレオチドの少なくと
も最小数を含む。望ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸のための最小長は、
少なくとも約１０のヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも約１５の
ヌクレオチドであり、最も好ましくは、長さは、少なくとも約２０のヌクレオチ
ドである。本発明の１つの非常に好ましい形態では、ループ配列は、約１８また
は１９の塩基の構造である。

【００３６】 ループ配列は、少なくとも約１０のヌクレオチドを含まなければならず、一方
、ステム配列は、自由な（すなわち非結合）状態における場合、２つのステムの
間のハイブリッド形成を保証する任意の核酸配列を含むことが可能である。この
面で、ステムは、等しい長さである必要はない。ステムが異なる長さを有する場
合、これらのステムは、これら２つのステムが互いにハイブリッド形成すると、
発蛍光団を消光するために、発蛍光団と消光物とを空間的近傍内に移動させるこ
とが可能であることが必要である。本発明の１つの形態では、ステム配列は、プ
ローブの標的遺伝子にハイブリッド形成せず、ステムと、反応混合物内の任意の
他の核酸配列との間の非特異的係合を回避するのに充分に短い長さを有する。本
発明の別の１つの形態では、ステムのうちの１つは、標的遺伝子配列にハイブリ
ッド形成することが可能である。

【００３７】 ステムの最小長および最大長は、好ましくは、それぞれ、約４または８のヌク
レオチドである。さらに、ステム配列は、ステム配列が互いに空間的近傍内に移
動されると、ステム配列がハイブリッド形成するのを支援することが可能である
１つ以上のメチル化シトシン残基を含むこともある。

【００３８】 Ｍｇ⁺⁺は、ステムハイブリッドに対して強力な安定化の影響を有する。本発明
の１つの特に好ましい実施例では、ハイブリッド形成反応は、ステムハイブリッ
ド形成を促進することが可能である、Ｍｇ⁺⁺の充分な濃度の存在下で実施される
。好ましくは、反応混合物は、ハイブリッドの安定性を向上させるために、Ｍｇ
Ｃｌ₂を含む。好ましくは、ＭｇＣｌ₂の濃度は、５ｍＭ〜１０ｍＭである。

【００３９】 プローブ全体としての長さのに関する１つのさらなる考慮は、オープンコンホ
メーションにある場合、発蛍光団の消光を回避するために、発蛍光団と、プロー
ブ内で使用される消光部分との間の最小距離を形成する必要性に関する。この最
適距離は、使用される特異的部分と共に変化し、当技術で知られている技術を使
用して、当業者により容易に決定されることが可能である。望ましくは、ループ
配列は、コンホメーション変化がハイブリッド形成の結果として発生するのを保
証し、発蛍光団が完全な蛍光を回復させるために、そして、消光物から十分に遠
くに位置するのを保証するために、ステム配列の長さの少なくとも２倍を有する
。好ましくは、前記部分は、３５までのヌクレオチドの距離だけ分離され、より
好ましくは、１０〜２５のヌクレオチドの距離だけ分離され、さらにより好まし
くは１５〜２０の距離だけ分離されている。

【００４０】 本方法において疑陽性を回避するために、反応で使用されるプローブの量は、
望ましくは、サンプル内の標的ヌクレオチド配列の相対量に少なくとも等しいか
より大きい。サンプル内の標的ヌクレオチド配列の濃度を決定することは、当技
術で知られている任意の方法により達成される。

【００４１】 本発明で使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、当技術で知られている複
数のアプローチにより、合成されることが可能である（例えば３、４参照）。本
発明のオリゴヌクレオチドプローブは、好適には、例えばBeaucage and Iyer, (
1992) Tetrahedron, 48:2223-2311; U.S. Pat. No. 4,980,460; U.S. Pat. No.
4,725,677; U.S. Pat. Nos. 4,415,732; 4,458,066および4,973,679などに開示
されているホスホロアミジト化学などの標準の化学を使用して、例えばApplied
Biosystems, Inc. Foster City, Calif, model 392または394 DNA/RNA Synthesi
zerなどの自動化ＤＮＡ合成装置で合成される。例えば、ホスホロチオエート、
ホスホロアミデートなどの非天然バックボーン基を生成する代替的化学も、結果
として得られるオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成効率および／または使用
されるエキソヌクレアーゼの切断効率が、悪い影響を受けないとの前提条件で、
採用されることが可能である。

【００４２】 発蛍光団および消光物は、クローズコンホメーションにおいて発蛍光団の消光
を可能にし、オープンコンホメーションにおいて発蛍光団の発光を可能にする任
意の手段により、プローブに付着されることが可能である。例えば、前記部分は
、化学的リンカーなどにより、プローブに付着されることも可能である。好まし
くは、発蛍光団および／または消光物分子は、プローブ内の５’または３’末端
に付着される。ヌクレオチドプローブにこのような部分を付着させるための方法
は、当業者に知られている。

【００４３】 発蛍光団は、光の特定の波長への曝露により励起されると、異なる波長におい
て光を放射する（すなわち蛍光する）化合物である。発蛍光団および消光物分子
は、蛍光共鳴エネルギー転移（fluorescence resonance energy transfer; ＦＲ
ＥＴ）に参加する。

【００４４】 ＦＲＥＴにおいて、エネルギーは、長距離（１〜１０ｎｍ）にわたり、発蛍光
団と消光物分子と間で非放射的に受渡される。発蛍光団は、光子を吸収し、この
エネルギーを非放射的に消光物に転移させる。発蛍光団および消光物が、密に近
傍内に位置し、放射および吸収スペクトルが重なると、発蛍光団のエネルギーは
、消光物に転移されるが、これに後続する蛍光の放射は発生しない。好ましくは
、発蛍光団−消光物対の性質は、発蛍光団により受取られたエネルギーが、消光
物に転移されて、熱として消散するものであって、光として放射されるものでは
ない。その結果、発蛍光団は、蛍光することが可能でない。

【００４５】 発蛍光団と、消光部分としての相互作用分子との組合せは、「ＦＲＥＴ」対と
して知られている。ＦＲＥＴの主要な必要条件は、発蛍光団の放射スペクトルが
、消光分子の吸収スペクトルと重なることにある。エネルギー転移の効率は、発
蛍光団と消光物分子との間の距離の６乗に比例して減少する。当業者は、当技術
で知られている分光光度法技術を使用して、いずれの発蛍光団およびいずれの消
光物が、適切なＦＲＥＴ対を形成するかを容易に決定することが可能である。Ｆ
ＲＥＴ対内で普通使用される分子は、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレ
セイン（ＦＡＭ）、２’７’−ジメトキシ−４’５’ジクロロ−６−カルボキシ
フルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、６’カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）
、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ
）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、４−（４’−ジメチルアミノ
フェニラゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、および５−（２’−アミノエチル）ア
ミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）を含む。好ましくは、（５２５
ｎｍの放射最大値を有する）ＦＡＭが、ＦＲＥＴ対内でＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、Ｄ
ＡＢＣＹＬおよびＲ６Ｇ（これらはすべて、５１４ｎｍの励起最大値を有する）
のための発蛍光団として使用される。代替的に、発蛍光団は、ＥＤＡＮＳであり
、消光物は、ＤＡＢＣＹＬであることもある。

【００４６】 前述の方法は、非癌組織内では低メチル化されるが、癌組織内ではメチル化さ
れる任意のＤＮＡ配列を検出する一般的用途を有する。本発明の１つの実施例に
おいて、標識オリゴヌクレオチド配列は、Ｍｙｆ−３遺伝子内の少なくとも１つ
の標的配列に対して向けられる。Ｍｙｆ−３遺伝子の好ましい標的配列は、次の
通りである。

【００４７】

【化３】

【００４８】 本発明の別の１つの実施例では、標識オリゴヌクレオチド配列は、グルタチオ
ン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｐｉ）遺伝子内の少なくとも１つの標的配列に対
して向けられる。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ｐｉ）遺伝子の好ま
しい標的配列は、次の通りである。

【００４９】

【化４】

【００５０】 前述の配列は、次の理由に起因して、分子ビーコンのための特に好ましい標的
である。 ｉ）前述の配列は、メチル化される潜在的可能性を有するＣＧジヌクレオチド
を高濃度で含む。 ｉｉ）介在配列は、ビーコンを、Ｍｙｆ−３またはグルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼ（ｐｉ）に特異的にするために、充分な数のヌクレオチドＡおよび
Ｔを含む。 ｉｉｉ）これらの領域とハイブリッド形成するビーコンは、大部分、クローズ
コンホメーションにおいてビーコンの維持を促すであろう任意の不適切な内部構
造を形成することが不可能である。

【００５１】 本発明の１つの特に好ましい形態では、ハイブリッド形成反応の温度は、２０
分にわたり２０℃に維持され、２分間の安定化時間で２°の増分で２５℃から４
５℃に増加される。温度が、２℃毎５分の増分で、５０℃から９０℃に増加され
際、反応混合物の蛍光が監視される。より好ましくは、温度は、各温度が１分に
わたり保持される条件で、２’の増分で５０℃から９５℃に増加することを可能
にされる。

【００５２】 本発明は、アッセイのための他の試薬と一緒に、本発明による標識プローブを
含む試薬キットも含む。例えば、キットは、増幅産物を検出するための分子ビー
コンと一緒に、ＰＣＲ反応のための酵素、プライマーおよび緩衝液を含むことも
ある。複合アッセイにおいて、本発明によるキットは、複数のプローブを含み、
それらのうちの少なくとも１つは、本発明によるプローブである。

【００５３】発明を実施するための最良の方法 本発明のさらなる特徴は、次の例においてより詳細に説明される。しかし、こ
の詳細な説明は、本発明を例示する目的のみのために含まれると理解されるべき
であり、前述の概略的な説明に対するいかなる制限としても理解してはならない
。特に、例において定められたすべての温度領域および他のこのような変数は、
例示的のみに与えられ、これらの限界を越えるパラメーターも、有用な結果を提
供することもあると理解されたい。

【００５４】 次の例において、明示的に説明されない分子生物学的方法は、文献で報告され
、当業者に知られている。当技術内で、分子生物学、微生物学、および組換えＤ
ＮＡ技術を説明する一般的テキストは、例えば、Sambrook et al., Molecular C
loning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover ed., DNA Cloning;
A Practical Approach, Volumes I and II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1
985);およびAusubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman,
J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Current protocols in molecular biology,
Greene Publishing Associates/Wily Intersciences, New York.

【００５５】例 プローブ Ｍｙｆ−３の好ましい領域に相補的なループ配列を有する２つの分子ビーコン
が、Midland Certifled試薬会社から購入された。分子ビーコンＡは、１８のヌ
クレオチドの長さの相補的ループ配列と、６のヌクレオチドのステム配列とを含
んでいた（表１参照）。１２のステムヌクレオチドのうちの５つは、標的配列に
対しても相補的であった。

【００５６】 分子ビーコンＢは、５つのヌクレオチドのステム配列を有する、１８のヌクレ
オチドの相補的ループ配列を含んでいた（表１参照）。プローブ配列は、Ｂ内で
に比して、分子ビーコンＡ内で１つの塩基だけより長く、余分の塩基は、ステム
に隣接する余分の塩基対を形成する。１０のステムヌクレオチドのうちの４つは
、標的配列に対しても相補的であった。

【００５７】標的ＤＮＡ 分子ビーコンを使用して、メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡの温度プロ
フィールを調査するために、Ｍｙｆ−３遺伝子の好ましい領域を表し、分子ビー
コンに対して相補的な３２の塩基のオリゴヌクレオチドが、Bresatecから購入さ
れた。オリゴヌクレオチドは、メチル化が可能なシトシン残基を含む７ＣＧ部位
を含む。５Ｍオリゴヌクレオチドにおいて、７ＣＧジヌクレオチドの各ジヌクレ
オチド内のシトシンが、５−メチル化シトシンにより置換された。非５Ｍオリゴ
は、メチル化されないままであった。購入されたすべてのオリゴヌクレオチドお
よび分子ビーコンは、ＨＰＬＣ精製された。

【００５８】

【表１】

【００５９】熱的変性プロフィール 分子ビーコンは、ハイブリッド形成の指標として蛍光を放出するある特定の温
度で、相補性ＤＮＡと線形化およびハイブリッド形成することが知られている。
蛍光のレベルに対する、温度変化の作用を決定するために、熱的変性プロフィー
ルが、異なるオリゴヌクレオチドおよび分子ビーコンにより実施された。３つの
異なる温度条件が調査され、最良の変性プロフィールが、さらなる研究のために
選択された。蛍光が、プログラムによる温度制御を有する蛍光読取り機を使用す
ることにより、各プロフィールの間、監視された(PE/ABl 7700 Applied Biosyst
ems)。

【００６０】 第１のプロフィールは、１°のステップで、５５℃から９５℃に温度を上昇さ
せることを含み、各温度は、１分にわたり保持された。第１のプロフィールにお
いて、温度は、２０分にわたり２０℃に維持され、２分間の安定化時間で２°の
増分で、２５℃から４５℃に上昇された。蛍光が、温度が、２°増分毎５分間で
、５０℃から９０℃に上昇された際、監視された。

【００６１】 各温度における蛍光強度は、０〜１００％の直線状に温度の関数として、プロ
ットされた。

【００６２】反応混合物 融解曲線実験実験が、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ Ｋ
Ｃｌおよび５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む反応混合物に、適切な濃度のオリゴヌクレ
オチドを添加することにより行われた。反応混合物は、２重蒸留水により５０μ
ｌの最終容積にされた。ビーコンが、温度プロフィールの前のいかなる分子ビー
コン−標的相互作用も最小化するために、最後の時点で反応混合物に添加された
。

【００６３】ハイブリッド形成条件 ハイブリッド形成効率と、ハイブリッド形成に必要なオリゴヌクレオチドの最
小量とを決定するために、オリゴヌクレオチドが、等量、制限量および過剰量で
、反応混合物に添加された（すなわち、それぞれ、等量は３μＭ、制限量は２μ
Ｍ、過剰量は６μＭ、１２μＭ）。

【００６４】塩濃度の決定 Ｍｇ⁺⁺などの二価陽イオンが、等量、制限量および過剰量のメチル化オリゴヌ
クレオチド、（５Ｍ）および非メチル化オリゴヌクレオチド、（非５Ｍ）（それ
ぞれ３μＭ、１．４μＭおよび６μＭ）を含む反応混合物に、３μＭの最終濃度
に添加された。反応混合物は、次いで、温度プロフィールにかけられた。２０分
にわたり２０℃、２°増分毎２分間で２５℃〜３５℃、及び２°増分毎５分間で
５０℃〜９０℃、この場合、蛍光が監視された。

【００６５】ハイブリッド形成プロフィールの決定 相補鎖Ａ及びＢを有する分子ビーコンのための変性プロフィールを構築するた
めに、温度が、２°増分で５０℃から９０℃に上昇されることを可能にされ、各
温度は、１分にわたり保持された。これにより、典型的なＳ状曲線が得られた。
温度が上昇されると、蛍光が、増加された。これは、ステムループ配列からラン
ダムコイル構造への分子ビーコンのコンホメーションの変化に起因する。

【００６６】 Tyagiら（５）によると、分子ビーコンは、室温で、それらの標的に自発的に
ハイブリッド形成する。従って、混合物は、分子ビーコンへの標的の効率的なハ
イブリッド形成を可能にするために、最初は、２０分にわたり２０℃でインキュ
ベートされる。蛍光は、約５０℃で最大値に到達する。

【００６７】 蛍光は、％蛍光が急速に減少するかまたは０％蛍光に到達するある特定の温度
に到達するまで、高いままであった。この温度は、プローブ−標的ハイブリッド
が融解する温度を表した。相補鎖Ａ及びＢを有する分子ビーコンにおいて、ハイ
ブリッド形成融解温度は、約７４℃〜７６℃であった。分子ビーコンＢのための
ハイブリッド形成融解温度は、約７４℃であった。前述の例において、％蛍光は
、ハイブリッド形成融解温度に到達した後、０％に到達した。他方、鎖Ａを有す
るビーコンＡの％蛍光は、約７６℃〜７８℃で低下したが、９０℃においてさえ
も、０％に到達しなかった。

【００６８】 前述の温度プロフィールにおいて、一貫的な温度プロフィールを測定すること
が可能であり、分子ビーコン−標的ハイブリッド形成のために充分な時間を可能
にした。

【００６９】ハイブリッド形成に必要なオリゴヌクレオチドの量 ハイブリッド形成に必要なオリゴヌクレオチドの最小量を決定するために、分
子ビーコンＡ及びＢが、等量、制限量及び過剰量のオリゴヌクレオチドを含む反
応混合物に添加された。いかなる明瞭なハイブリッド形成融解温度も、分子ビー
コンＢを有する１．５μＭオリゴヌクレオチドサンプルを除いて、制限量（１．
５μＭまたは０．８μＭ）オリゴヌクレオチドサンプル内で観察されなかった。
相補鎖Ａで約６６℃のハイブリッド形成溶融温度と、相補鎖Ｂで約７２℃の溶融
温度とが、観察された。

【００７０】 等量のオリゴヌクレオチドで到達された最大蛍光強度は、過剰量オリゴヌクレ
オチドでの反応混合物に比してより低かった。ハイブリッド形成温度は、過剰量
オリゴヌクレオチドサンプルにおいても上昇された。例えば、等量の鎖Ａを有す
る分子ビーコンは、６６℃のハイブリッド形成温度を有し、一方、過剰量鎖での
同一の反応混合物において、約７４℃の融解温度を有した。効率的な分子ビーコ
ン・標的ハイブリッド形成が発生するために、過剰量または少なくとも等量の標
的が必要であると、一般的に結論された。

【００７１】変性プロフィールに対する塩濃度の作用 鎖Ａ及びＢを有する分子ビーコンＢを有する異なる塩濃度の分析は、反応混合
物内のＭｇＣｌ₂の存在が、予測されたように、ハイブリッドの安定性を向上さ
せた。制限量オリゴヌクレオチド及び等量オリゴヌクレオチドの双方において、
蛍光のより高い強度が、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を有するサンプル内で検出された。
しかし、塩濃度が、５ｍＭから１０ｍＭに増加されると、蛍光強度の僅かな増加
しか、観察されなかった。

【００７２】メチル化検出 分子ビーコンＡ及びＢが、メチル化オリゴヌクレオチド５Ｍにハイブリッド形
成された場合に観察されたハイブリッド形成融解温度は、非メチル化オリゴヌク
レオチド非５Ｍにハイブリッド形成されたビーコンＡ及びＢの融解温度に比して
より高かった。

【００７３】 例えば、図１に示されているように、等量の５Ｍを有する分子ビーコンＡは、
約８０℃で融解し、一方、非メチル化非５Ｍは、約６９℃で融解した。過剰量の
５Ｍを有する分子ビーコンＡは、約７６℃のハイブリッド形成融解温度を有し、
一方、非５Ｍにおいて、約７１℃だった。分子ビーコンＢと過剰量の５Ｍにおい
て、ハイブリッド形成は、約６８℃で融解し始め、その際、蛍光強度は、より遅
い速度で低下した。過剰量の非５Ｍにおいて、融解温度は、約６４℃であった。

【００７４】メチル化シトシンの検出の感度 分子ビーコンは、ＣｐＧジヌクレオチド内の７つすべてのシトシン残基が、メ
チル化されている場合、好ましい標的ＤＮＡのメチル化を容易に検出することが
可能である（表１参照）。ハイブリッドの融解温度を変化させるために、メチル
化される必要があるシトシン残基の最小数を決定するために、可変の数のメチル
化シトシン残基を有する好ましいＭｙｆ−３標的が、試験系内でビーコンＡと反
応された。表２に示されているように、５つの異なる修飾された好ましいＭｙｆ
−３標的が、調査された。図２に示されているように、２つ以上のシトシン残基
を有する標的を有するビーコンＡハイブリッドは、１つのメチル化シトシン残基
を有するかまたはメチル化シトシン残基を有しない標的に比して、大幅により高
い融解温度で、分離する。

【００７５】メチル化オリゴヌクレオチド

【表２】

【００７６】 当業者に自明の変更及び変化は、本発明の範囲内に入るものとする。

【００７７】 参考文献 1. Millar et al, (1999) Oncogene, 18:1313-1324 2. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edit
ion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (
1989) 3. Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20:5205-5214 4. Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Research, 15:5319-5423 5. Tyagi et al., Nature 1996 14(3):303-308

【図面の簡単な説明】

【図１】 メチル化標的ＤＮＡ配列および非メチル化標的ＤＮＡ配列を含む様々な反応混
合物の変性プロフィールを示す。図に示されているように、「黒いひし形」は、
標的非メチル化Ｍｙｆ−３の過剰に対する分子ビーコンＢの使用を示し、「黒い
四角」は、標的メチル化Ｍｙｆ−３の過剰に対する分子ビーコンＢの使用を示し
、「黒い三角」は、標的非メチル化Ｍｙｆ−３の過剰に対する分子ビーコンＡの
使用を示し、「×」は、標的メチル化Ｍｙｆ−３の過剰に対する分子ビーコンＡ
の使用を示し、「＊」は、非メチル化Ｍｙｆ−３に対する同量の標的の使用を示
し、「黒い丸」は、同量の標的メチル化Ｍｙｆ−３に対する分子ビーコンＡを示
す。

【図２】 ０、１、２、３、４または５つの５−メチル化オリゴヌクレオチドを有する分
子ビーコンＡの変性プロフィールを示す。図示のように、「黒い四角」は、メチ
ル化シトシン無しの好ましいＭｙｆ−３標的に対する分子ビーコンＡの使用を示
し、「黒いひし形」は、１つの５−メチル化シトシンを有する好ましいＭｙｆ−
３標的に対する分子ビーコンＡの使用を示し、「黒い三角」は、２つの５−メチ
ル化シトシンを有する好ましいＭｙｆ−３に対する分子ビーコンの使用を示し、
「黒い丸」は、３つのメチル化シトシンを有する好ましいＭｙｆ−３標的に対す
る分子ビーコンＡの使用を示し、「×」は、４つのメチル化シトシンを有する好
ましいＭｙｆ−３標的に対する分子ビーコンＡの使用を示し、「白い丸」は、５
つのメチル化シトシンを有する好ましいＭｙｆ−３標的に対する分子ビーコンＡ
の使用を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 メチル化核酸を検出するための方法であって、 （ｉ）メチル化ヌクレオチドを含む疑いのある核酸サンプルを、核酸ハイブリ
   ッド形成に適切な条件下で、オリゴヌクレオチド配列と接触させるステップであ
   って、前記オリゴヌクレオチド配列が、 （ａ）発蛍光団部分により標識された第１のステムと、前記核酸サンプルのメ
   チル化されやすい少なくとも１つの領域に対して相補的なヌクレオチドの領域を
   有するループ配列と、前記発蛍光団部分に対して空間的に近傍に位置する際に前
   記発蛍光団部分を消光することが可能である消光部分により標識された第２のス
   テムとを含んで成ることと、 （ｂ）前記第１のステムを形成する前記ヌクレオチドが、前記プローブが前記
   核酸サンプルから分離されると、前記第２のステムを形成する前記ヌクレオチド
   の空間的近傍内に入ることが可能であること とを特徴とするステップと、 （ｉｉ）前記オリゴヌクレオチドプローブが、非メチル化ＤＮＡから分離され
   るが、メチル化ＤＮＡにハイブリッド形成されたままであるように前記ハイブリ
   ッド形成条件を変更するステップと、 （ｉｉｉ）蛍光における変化を測定するステップと を含む方法。
2. 【請求項２】 標識オリゴヌクレオチド配列が、ステップ（ｉｉ）に従って
   標的核酸サンプルから分離すると、前記第１のステムおよび前記第２のステムは
   、ともにハイブリッド形成して、前記発蛍光団部分の消光を惹起することを特徴
   とする請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記ループ配列が、少なくとも約１０のヌクレオチドを含む
   請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記ループ配列が、少なくとも約３５までのヌクレオチドを
   含む、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記ループ配列が、少なくとも約２５のヌクレオチドを含む
   請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ループ配列が、少なくとも約１５〜２０のヌクレオチド
   を含む請求項１に記載の方法。
7. 【請求項７】 細胞が正常状態から癌状態にトランスフォームすると、前記
   ループ配列が、メチル化を受ける核酸配列の部分に対して相補的である請求項１
   に記載の方法。
8. 【請求項８】 細胞が正常状態から癌状態にトランスフォームすると、前記
   ループ配列が、メチル化を受けるＭｙｆ−３核酸配列の部分に対して相補的であ
   る請求項１に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記標識オリゴヌクレオチド配列が、 【化１】 から成る群から選択された配列のうちの少なくとも１つの配列に対して相補的で
   ある請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 細胞が正常状態から癌状態にトランスフォームすると、前
    記ループ配列が、メチル化を受けるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＩＩ
    （ｐｉ）核酸配列の部分に対して相補的である請求項１に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記標識オリゴヌクレオチド配列が、 【化２】 から成る群から選択された配列のうちの少なくとも１つの配列に対して相補的で
    ある請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 細胞が正常状態から癌状態にトランスフォームすると、前
    記ループ配列が、メチル化を受けるカルシトニン核酸配列の部分に対して相補的
    である請求項１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記方法が、前立腺癌組織内の、異常にメチル化された遺
    伝子配列を検出するために使用される請求項１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 前記ハイブリッド形成反応の間に変更される前記ハイブリ
    ッド形成条件が、ハイブリッド形成反応の温度である請求項１に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記ステム配列が、標的遺伝子にハイブリッド形成せず、
    前記ステムと、反応混合物内の他の核酸配列との間の非特異的結合を回避するの
    に充分に短い長さを有する請求項１に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記ステム配列が、少なくとも約４〜８のヌクレオチドの
    長さを有する請求項１に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記ステム配列のうちの少なくとも１つのステム配列内の
    少なくとも１つのシトシンが、メチル化シトシン残基を含む請求項１に記載の方
    法。
18. 【請求項１８】 請求項１に記載の方法で使用される場合、メチル化核酸配
    列と非メチル化核酸配列とを区別することが可能である、本願明細書に記載の標
    識オリゴヌクレオチド配列を含んで成るキット。
19. 【請求項１９】 本願明細書に記載のものと実質的に同一である請求項１に
    記載の方法。