ES2235832T3

ES2235832T3 - Utilizacion de marcadores moleculares fluorescentes en la deteccion de acidos nucleicos metilados.

Info

Publication number: ES2235832T3
Application number: ES00904696T
Authority: ES
Inventors: Peter H. Kay
Original assignee: Epigenomics AG
Current assignee: Epigenomics AG
Priority date: 1999-02-01
Filing date: 2000-02-01
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2020-02-01
Also published as: JP2002535998A; AUPP844899A0; WO2000046398A1; ATE286144T1; EP1151138A1; DE60017089D1; DE60017089T2; US20030017465A1; CA2361654A1; EP1151138B1; US20050221329A1; EP1151138A4

Abstract

Un método para detectar ácidos nucleicos metilados que incluye: (i) la puesta en contacto de una muestra de ácido nucleico, que se sospeche que contiene nucleótidos metilados, con una secuencia de oligonucleótidos en condiciones favorables para la hibridación del ácido nucleico. Dicha secuencia de oligonucleótidos se caracteriza por lo siguiente: (a) incluye un primer vástago identificado con una porción de fluoróforo, una secuencia de bucle que contenga una región de nucleótidos complementaria, al menos, a una porción de la muestra del ácido nucleico, cuya porción es susceptible de metilación, y un segundo vástago identificado con una región de atenuación que sea capaz de extinguir la porción de fluoróforo cuando se encuentra en proximidad espacial a la misma; y (b) cuando la sonda se separa de la muestra de ácido nucleico, los nucleótidos que forman el primer vástago son capaces desplazarse en una proximidad espacial con los nucleótidos que forman el segundo vástago; (ii) la alteración delas condiciones de hibridación, de manera que la sonda de oligonucleótidos se separa del ADN no metilado pero mantiene las condiciones de hibridación del ADN metilado; y (iii) la medición del cambio de fluorescencia.

Description

Utilización de marcadores moleculares fluorescentes en la detección de ácidos nucleicos metilados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método para detectar la presencia de ácidos nucleicos metilados. Particularmente, se refiere a un método para diagnosticar patologías en un paciente, como el cáncer, donde los ácidos nucleicos de los tejidos afectados se convierten en metilados.

Antecedentes de la invención Científicos

Actualmente, se considera que la metilación de residuos de citosina en el ADN desempeña un papel muy activo en el control del desarrollo celular normal. Varios estudios han demostrado que existe una estrecha correlación entre la metilación y la inactivación transcripcional. Existen pruebas considerables para determinar que en los vertebrados, los genes inactivos contienen a menudo un residuo modificado de citosina 5-metilcitosina (mC) seguido inmediatamente de un residuo de guanosina (G) en la secuencia de ADN. Las regiones de ADN que están activamente implicadas en la transcripción, carecen, no obstante, de residuos de metilcitosina 5'.

Existen pruebas considerables que sugieren que las alteraciones en la maquinaria de metilación del ADN de los mamíferos, pueden desempeñar un papel importante en la oncogenia y en la progresión del tumor. En este sentido, la hipermetilación focal y la desmetilación genómica generalizada, son características reconocidas de diferentes tipos de neoplamas.

Normalmente, los objetivos de la hipermetilación regional son "islas CpG" no metiladas, situadas en las regiones promotoras de genes. Esta hipermetilación está correlacionada con la represión transcripcional que puede servir como alternativa para la codificación de las mutaciones de una región por inactivación de los genes supresores del tumor, incluyendo p16, p15, VHL, y E-cad. Particularmente, se está comenzando a definir la manera en que la hipometilación y la hipermetilación genómica general de algunas regiones específicas evolucionan durante la oncogenia. Normalmente, las islas CpG no metiladas se muestran protegidas de la metilación densa que afecta a las regiones circundantes inmediatas. En células neoplásticas se pierde esta protección, posiblemente debido a la exposición crónica a la actividad de la metiltransferasa aumentada en el ADN y/o a la interrupción de mecanismos de protección local.

La hipermetilación de algunos genes también puede desempeñar un papel importante en el control del ciclo celular. Uno de dichos genes es el gen Myf-3. Normalmente el gen Myf-3 es hipometilado normalmente en tejidos benignos. Estudios recientes han demostrado que el gen Myf-3 es hipometilado de manera drástica en muchos tipos de tejido canceroso. Por lo tanto, un método simple para detectar la hipermetilación de los genes debería proporcionar nuevos procedimientos para la detección y diagnosis de algunos tipos de cáncer.

La representación de las regiones metiladas en el ADN se ha basado principalmente en las técnicas de "Southern Blotting", basadas en la incapacidad de las encimas de restricción sensibles a la metilación de cortar secuencias que contengan uno o más residuos de citosina metilados. Este método es relativamente insensible, requiere grandes cantidades de ADN con alto peso molecular y sólo puede proporcionar información acerca de estos residuos de citosina encontrados en secuencias reconocidas por enzimas de restricción sensibles a la metilación. Una desventaja añadida a los métodos de Southern Blotting es que el procedimiento completo requiere entre 7 y 10 días.

También se ha utilizado la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar el ADN metilado. En los métodos PCR, se utilizan las enzimas sensibles a la metilación para distinguir entre ADN metilado y no metilado. Más concretamente, se diseñan cebadores para PCR para abarcar una región de ADN, que incluya una secuencia de reconocimiento de endonucleasa de restricción que sea sensible a la metilación de ADN. Si la secuencia de reconocimiento de enzima no es metilada, el ADN es hidrolizado y se destruye el ADN objetivo de la PCR. Si el ADN es metilado, la enzima no hidroliza el objetivo y se obtiene la síntesis de la cadena de ADN. La restricción de ADN no metilado debe ser completa, debido a que cualquier ADN no cortado se ampliará por la PCR. Esto puede conducir a un falso resultado positivo de metilación. Un problema añadido es que este método implica numerosas etapas.

Un tercer método combina la PCR con tratamiento de bisulfito del ADN para convertir todas las citosinas no metiladas en timinas. Los residuos de citosina metilados son protegidos de la conversión a timinas por medio del bisulfito. Los cebadores para PCR que son específicos para residuos de citosina convertidos o sin convertir, se utilizan para generar síntesis de la cadena de ADN, incluyendo los residuos de citosina en investigación. Normalmente, las etapas de clonación y secuenciación son necesarias para determinar qué residuos de citosina son metilados. Este método es técnicamente muy exigente, requiere un trabajo intenso, y sin los productos de ampliación de clonación, precisa que, aproximadamente un 10% de los alelos, sean metilados para la detección.

Los métodos actuales para detectar la metilación en el ADN requieren mucho tiempo, son caros y a menudo carecen de especificidad. La presente invención trata de mejorar éstos y otros problemas asociados a la técnica anterior proporcionando un método nuevo y mejorado para la detección de ácidos nucleicos metilados.

Generalidades

Los expertos en la materia comprobarán que la invención aquí descrita puede estar sujeta a variaciones y modificaciones, además de las específicamente descritas.

La presente invención no debe limitarse en su alcance a las realizaciones específicas descritas en el presente documento, que se proporcionan únicamente como ejemplo. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes, se sitúan dentro del ámbito de la invención descrita en el presente documento.

La información bibliográfica de las publicaciones a las que se hace referencia numéricamente en esta especificación se recoge al final de la descripción. No se considera que cualquiera de las referencias constituya una técnica anterior.

Como se ha utilizado en el presente documento, el término "derivado de" indica que un número entero específico puede obtenerse de una fuente particular, aunque no es necesario que se obtenga directamente de dicha fuente.

En esta especificación y en las reivindicaciones siguientes, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "incluir", o variaciones tales como "incluye" o "que incluye", implican la inclusión de un número entero indicado o grupo de enteros, pero no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método para detectar ácidos nucleicos metilados que incluye:

1) la puesta en contacto de una muestra de ácido nucleico, que se sospeche que contiene nucleótidos metilados, con una secuencia de oligonucleótidos en condiciones favorables para la hibridación del ácido nucleico. Dicha secuencia de oligonucleótidos se caracteriza por lo siguiente:

- \; (i): incluye un primer vástago identificado con una porción de fluoróforo, una secuencia de bucle que contiene una región de nucleótidos complementaria, al menos, de una porción de la muestra del ácido nucleico, cuya región es susceptible de metilación, y un segundo vástago identificado con una porción de extinción que es capaz de extinguir la porción de fluoróforo cuando se encuentra en proximidad espacial a la misma; y

- \; (ii): cuando la sonda se separa de la muestra de ácido nucleico, los nucleótidos que forman el primer vástago pueden desplazarse en una proximidad espacial con los nucleótidos que forman el segundo vástago;

2) la alteración de las condiciones de hibridación, de manera que la sonda de oligonucleótidos se separa del ADN no metilado pero mantiene las condiciones de hibridación del ADN metilado; y

3) la medición del cambio de fluorescencia.

Breve descripción de las figuras

En los planos:

La figura 1 muestra un perfil de desnaturalización de varias mezclas de reacción que contienen secuencias de ADN objetivo, metiladas y no metiladas. Como se muestra en la figura (\Diamondblack) representa el uso de la baliza molecular B frente a un exceso de Myf-3 objetivo no metilado, (\blacksquare) representa el uso de la baliza molecular B frente a un exceso de Myf-3 objetivo metilado, (\blacktriangle) representa la baliza molecular A frente a un exceso de Myf-3 objetivo no metilado, (X) representa el uso de la baliza molecular A frente a un exceso de Myf-3 objetivo metilado, (*) representa el uso de una cantidad igual de objetivo frente al Myf-3 no metilado, y (\bullet) representa la baliza molecular A frente a una cantidad igual de Myf-3 objetivo metilado.

La figura 2 muestra el perfil de desnaturalización de la baliza molecular A con ninguno, 1, 2, 3, 4 y 5 oligonucleótidos metilados 5. Como se muestra en la figura (\blacksquare) representa el uso de la baliza molecular A frente al objetivo Myf-3 preferente sin citosinas metiladas, (\Diamondblack) representa el uso de la baliza molecular A frente al objetivo Myf-3 preferente con una 5-metilcitosina, (\blacktriangle) representa el uso de la baliza molecular A frente al objetivo Myf-3 preferente con dos 5-metilcitosinas, (\bullet) representa el uso de la baliza molecular A frente al objetivo Myf-3 preferente con tres citosinas metiladas, (X) representa el uso de la baliza molecular A frente al objetivo Myf-3 preferente con cuatro citosinas metiladas, y (O) representa el uso de la baliza molecular A frente al objetivo Myf-3 preferente con cinco citosinas metiladas.

Descripción detallada de la invención

Según la presente invención, se proporciona un método para identificar secuencias de ácidos nucleicos que han sido metilados. Es de destacar, que esta tecnología ha resultado ser lo suficientemente sensible como para detectar y/o diferenciar entre secuencias de ácidos nucleicos metilados y no metilados en las que metilación se ha producido con un solo residuo de citosina.

Dicha tecnología puede tener una amplia gama de aplicaciones como medio para detectar la presencia de secuencias de ácido nucleico metiladas en una muestra de oligonucleótidos. Se ha descubierto que la metilación de secuencias de ácido nucleico se produce, por ejemplo, en tejidos cancerígenos y cuando se introduce ADN ajeno en un huésped, especialmente por medio de una infección vírica. De hecho, actualmente, es sabido que la metilación de ADN es uno de los métodos en los que el ADN ajeno introducido, especialmente por medio de un virus, es neutralizado o amortiguado. Cuando el ADN celular (por ejemplo en el cáncer) o ajeno es metilado, puede utilizarse la presente invención para detectar la presencia de ADN metilado.

Dado que la metilación del ADN influye en la expresión genética, es muy probable que las estrategias terapéuticas encaminadas a reactivar o suprimir los genes específicos asociados con patologías particulares, requieran utilizar un método simple para medir la metilación de ADN. La presente invención proporciona tal método. Además, los estudios encaminados a conocer los medios más apropiados para promover la terapia genética también pueden verse impulsados por la disponibilidad de un método simple para la detección de residuos de citosina metilada, tal como aquí se describe.

La metilación de citosina también desempeña un papel importante en la normalización de la dosificación genética. Por ejemplo, en las hembras, uno de los cromosomas X se mantiene en una forma inactiva por la metilación de citosina. La metilación del ADN es uno de los mayores mecanismos amortiguadores del gen implicado en la huella parental. Para mantener la expresión apropiada de genes como por ejemplo H19, uno de los genes paternos o maternos heredados se amortigua por medio de la metilación de ADN. La metilación de ADN también desempeña un papel vital en muchos procesos biológicos durante el desarrollo. Por ejemplo, la reducción experimental en la capacidad para metilar residuos de citosina dentro del ADN tiene como consecuencia la muerte embrionaria.

Así, la presente invención proporciona un método para detectar ácidos nucleicos metilados que incluye las siguientes etapas:

- \; (i): incluye un primer vástago identificado con una porción de fluoróforo, una secuencia de bucle que contenga una región de nucleótidos complementaria, al menos, de una región de la muestra del ácido nucleico, cuya región es susceptible de metilación, y un segundo vástago identificado con una porción de atenuación que es capaz de extinguir la porción de fluoróforo cuando se encuentra en proximidad espacial a la misma; y

- \; (ii): cuando la sonda se separa de la muestra de ácido nucleico, los nucleótidos que forman el primer vástago son capaces de desplazarse en una proximidad espacial con los nucleótidos que forman el segundo vástago;

3) la medición del cambio de fluorescencia.

Preferentemente, cuando las secuencias de oligonucleótidos identificadas se separan de la muestra de ácido nucleico objetivo, el primer y segundo vástago hibridan conjuntamente causando la extinción de la región de fluoróforo.

Cuando la secuencia de bucle en la sonda enlaza con una secuencia complementaria en un gen objetivo, la sonda entra en una "conformación abierta" y se puede detectar la fluorescencia del fluoróforo donante. Cuando la sonda se encuentra en una conformación cerrada (horquilla), la fluorescencia del fluoróforo donante se extingue.

Es conveniente que la secuencia de bucle sea complementaria a una porción de la secuencia del ácido nucleico que está sometida a la metilación cuando una célula se transforma de un estado normal a un estado cancerígeno. Además, la secuencia de bucle se selecciona preferiblemente de tal modo que sea capaz de hibridar específicamente con la secuencia objetivo. Sin embargo, no es posible formar estructuras internas que favorezcan el mantenimiento de la sonda en una "configuración cerrada" (por ejemplo cuando los dos vástagos hibridan conjuntamente). En un diseño particularmente preferente de sonda, ésta se diseña para hibridar una región en una secuencia de ácido nucleico que tiene una proporción alta de oligonucleótidos GC que pueden ser metilados.

En una realización preferente, la presente invención puede ser utilizada para detectar la presencia de células cancerígenas en una muestra de tejido. La metilación de varios genes ha estado implicada en el comienzo o desarrollo de estados cancerígenos en varias células. Uno de esos genes que es sabido que sufre tal transformación es el gen Myf-3. Existen otros genes que pueden contener regiones de ADN que normalmente no son metiladas pero que pueden llegar a ser hipermetiladas en células neoplásticas, como por ejemplo, los genes PAX, y los genes de la calcitonina de glutación-S-transferasa-\pi(pi).

Recientemente, los residuos específicos de citosina con una región particular de glutación-S-transferasa (pi) han demostrado ser exclusivamente metilados en tejido prostático maligno (1). La identificación de los residuos de citosina dentro de glutación-S-transferasa (pi) que son anormalmente metilados en los tejidos prostáticos cancerígenos, proporciona un nuevo método para el diagnóstico de tejido prostático maligno.

A medida que el gen es metilado, se produce un aumento progresivo en la temperatura de fusión del gen y su complemento. La presente invención aprovecha esta característica para distinguir los ácidos nucleicos metilados y los no metilados.

Cuando una secuencia de oligonucleótidos identificada, como la aquí descrita, se encuentra con una secuencia de ADN objetivo complementaria, sería conveniente formar un híbrido con la secuencia que sea más fuerte y más estable que el híbrido formado por secuencias del vástago. Cuando esto sucede, la secuencia de oligonucleótidos identificada, se somete a un cambio espontáneo de forma que tiene como resultado que las secuencias del vástago se separen, provocando que la secuencia de oligonucleótidos identificada adopte una "conformación abierta", en la que la puede detectarse la fluorescencia debido a que el fluoróforo ya no se encuentra próximo al extintor. Según la presente invención, la secuencia de oligonucleótidos identificada no hibridada no podría tener fluorescencia.

La detección de metilación según la invención se consigue alterando las condiciones de hibridación durante la reacción de hibridación para facilitar la disociación de la secuencia de oligonucleótidos identificada de una muestra de oligonucleótidos. Se logra preferiblemente aumentando la temperatura de la reacción de hibridación. A medida que aumenta la temperatura, se alcanza una temperatura en la que la secuencia de oligonucleótidos identificada desaparece de una secuencia no metilada objetivo, pero permanece ligada al ADN metilado.

La disociación de una secuencia de oligonucleótidos identificada del objetivo proporciona la secuencia de oligonucleótidos identificada con libertad conformacional, que le permite formar un estado de conformación cerrado, que da como resultado una reducción de fluorescencia. Específicamente, una alteración en la estructura de la secuencia de oligonucleótidos identificada acerca el fluoróforo y el extintor a una proximidad espacial que extingue la fluorescencia. Midiendo un cambio de fluorescencia en la reacción conforme aumenta la temperatura de la hibridación, es posible detectar el momento en el que la sonda desaparece de su secuencia complementaria. Dado que el ADN metilado se separa a una temperatura más elevada, es posible distinguir el ADN metilado del no metilado.

La temperatura de fusión de la secuencia de oligonucleótidos identificada dependerá de la longitud y del contenido G-C de las secuencias de bucle y vástago y de la concentración de sales en la solución en la que se disuelva.

Cuando es conocida la temperatura de fusión de una secuencia particular de oligonucleótidos identificada, en el momento en que se templa un gen metilado y no metilado, las condiciones de hibridación pueden variar aumentando la temperatura de hibridación a la temperatura que causa la secuencia de bucle, para desaparecer de la secuencia de gen no metilado complementario y objetivo, pero no de la secuencia de gen metilado objetivo. Se deben tomar las medidas de la cantidad de fluorescencia en la mezcla de la reacción y se deben analizar los resultados. Dado que las secuencias del vástago se adaptan para unirse tras la separación de la secuencia de gen no metilado, se observará un descenso en la fluorescencia.

Cuando la temperatura de fusión de una secuencia de oligonucleótidos identificada ligada a una secuencia de ácido nucleico metilada y/o no metilada no es conocida, o existe cierta duda acerca de la temperatura de fusión, es preferible desarrollar diversas reacciones de control en paralelo con la muestra de ensayo. Las reacciones de control deberían contener, al menos, una secuencia de gen correspondiente que sea metilada o no metilada o, si se desea, ambas reacciones, metilada y no metilada, pueden realizarse como dos controles separados.

El término "baliza molecular", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula capaz de participar en una reacción específicamente de enlace y cuya actividad fluorescente cambia cuando la molécula participa en dicha reacción de enlace. La secuencia de oligonucleótidos identificada referida anteriormente es, para los fines de la presente invención, una baliza molecular.

Una secuencia de oligonucleótidos identificada es "hibridable" a una molécula de ácido nucleico, como el ADN, ADN genómico, o ARN, cuando una única forma de la secuencia puede templar la molécula del ácido nucleico bajo las condiciones apropiadas de temperatura y la fuerza iónica de la solución (ver Sambrook et al., 1989, (2)). Las condiciones de temperatura y la fuerza iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Un ejemplo de condiciones con severidad progresivamente mayor es el siguiente: 2 x SSC/0,1% SDS a temperatura ambiente aproximadamente (condiciones de hibridación); 0,2 x SSC/0,1% SDS a temperatura ambiente aproximadamente (condiciones de severidad bajas); 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42ºC aproximadamente (condiciones de severidad moderadas); y 0,1 x SSC a 68ºC aproximadamente (condiciones de severidad altas). La hibridación requiere que la sonda y la molécula de ácido nucleico contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la severidad de la hibridación, es posible que aparezca algún desajuste entre las bases. La severidad apropiada para ácidos nucleicos hibridados depende de variables bien conocidas por la técnica actual. Por ejemplo, la longitud, el grado de complementariedad, la composición de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, contenido de GC frente a AT), y el tipo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN frente ADN) de las regiones hibridadas de los ácidos nucleicos pueden considerarse al seleccionar las condiciones de hibridación. A mayor grado de complementariedad entre dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de T_{m} para híbridos de ácidos nucleicos que contengan dichas secuencias. La estabilidad relativa (correspondiente a un mayor T_{m}) de hibridaciones de ácido nucleico disminuye en el siguiente orden: ARN: ARN, ADN: ARN; ADN: ADN. Para híbridos superiores a 100 nucleótidos de longitud, se han derivado las ecuaciones para calcular T_{m} (ver Sambrook et al., 1989, supra, 9.50-9.51). Para la hibridación con ácidos nucleicos más cortos, la posición de desajuste se hace más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su particularidad (ver Sambrook et al., 1989, supra, 11.7-11.8). Preferentemente, la secuencia de bucle incluye al menos un número mínimo de nucleótidos para evitar enlace específico entre la sonda y su secuencia de ácido nucleico objetivo. Es conveniente que una longitud mínima de ácido nucleico hibridado sea, al menos, de aproximadamente 10 nucleótidos y, preferentemente, al menos, de aproximadamente 15 nucleótidos o, mejor aún, si la longitud es, al menos, de aproximadamente 20 nucleótidos. En una realización preferente de la invención, la secuencia de bucle es una estructura de 18 o 19 bases aproximadamente.

Mientras que la secuencia de bucle debería contener al menos, aproximadamente, 10 nucleótidos, la secuencia de vástago, puede incluir cualquier secuencia de ácido nucleico que asegure la hibridación entre los dos vástagos en un estado libre (por ejemplo sin enlace). En este aspecto, no es necesario que los vástagos sean de la misma longitud. Si los vástagos son de distinta longitud, deben ser capaces de aproximar el fluoróforo y el extintor a una proximidad espacial para extinguir la fluorescencia del fluoróforo cuando los dos vástagos hibridan entre sí. En una forma de la invención, las secuencias del vástago no hibridarán al gen objetivo de la sonda. y son lo suficientemente cortas para evitar el enlace no específico entre el vástago y cualquier otra secuencia de ácido nucleico en la mezcla de reacción. En otra forma de la invención, uno de los vástagos puede adaptarse para hibridar la secuencia del gen objetivo.

Las longitudes mínima y máxima de los vástagos deberían ser, preferentemente, de 4 y 8 nucleótidos respectivamente. Además, la secuencia del vástago puede contener uno o más residuos de citosina metilados que sean capaces de ayudar a las secuencias de vástago a hibridar cuando se aproximan espacialmente entre sí.

Mg++ tiene una poderosa influencia estabilizadora en el híbrido del vástago. En una realización preferente de la invención, la reacción de hibridación se lleva a cabo en presencia de una concentración suficiente de iones Mg++, capaz de facilitar la formación híbrida del vástago. Es preferible que la mezcla de reacción contenga MgCl_{2} para aumentar la estabilidad del híbrido. Preferiblemente, la concentración de MgCl_{2} es de 5 mM a 10 mM.

Será preciso una mayor consideración de la longitud de la sonda en conjunto para crear una distancia mínima entre las porciones del fluoróforo y del extintor utilizados en la sonda en la conformación abierta para evitar la extinción del fluoróforo. Esta distancia óptima variará en función de las porciones específicas utilizadas, y puede ser fácilmente determinada por los expertos en la materia, utilizando las técnicas conocidas. Es conveniente que la secuencia de bucle doble al menos la longitud de las secuencias de vástago para asegurar que el cambio conformacional se produzca en la hibridación y para asegurar que el fluoróforo esté lo suficientemente alejado del extintor para restablecer la fluorescencia total. Preferiblemente, las porciones se separarán en una distancia de hasta 35 nucleótidos, y mejor de 10-25 nucleótidos y, todavía mejor, de 15-20 nucleótidos.

Para evitar resultados positivos falsos del método, es conveniente que la cantidad de sonda empleada en la reacción sea al menos igual o mayor que la cantidad relativa de secuencia de nucleótidos objetivo en la muestra. Se puede determinar la concentración de secuencia de nucleótidos objetivo en la muestra con cualquiera de los métodos conocidos por la técnica actual.

Las sondas de oligonucleótidos empleadas en la invención pueden sintetizarse en un número de procedimientos conocidos por la técnica actual (ver, por ejemplo, 3, 4). Las sondas de oligonucleótidos de la invención son convenientemente sintetizadas en un sintetizador automático de ADN, por ejemplo, un Applied Biosystems, Inc. Foster City, Calif.) modelo 392 o 394 Sintetizador ADN/ ARN, utilizando procedimientos químicos estándar, como el procedimiento de fosforamidita, que se cita por ejemplo en las siguientes referencias: Beaucage y lyer, (1992) Tetrahedron, 48:2223-2311; U.S. Pat. No. 4.725.677; U.S. Pat. Nos. 4.415.732; 4.458.066 y 4.973.679; y similares. También se pueden emplear otros procedimientos alternativos, por ejemplo los resultantes en grupos de producto principal no natural, como fosforotioato, fosforamida, y similares, siempre y cuando no se vea afectada de modo negativo la eficacia de la hibridación de los oligonucleótidos resultantes y/o la eficacia de fisura de la exonucleasa empleada.

El fluoróforo y el extintor se pueden añadir a la sonda por cualquier medio que permita la extinción del fluoróforo en una conformación cerrada y la iluminación del fluoróforo en una conformación abierta. Por ejemplo, las porciones se pueden añadir a la sonda por enlaces químicos, etc. Es preferible que el fluoróforo y/o la molécula del extintor estén unidos al nucleótido terminal 5' o 3' en la sonda. Los métodos para unir tales porciones a una sonda de nucleótidos son conocidos por los expertos en la materia.

Un fluoróforo es un compuesto químico que al exponerse a una longitud de onda de luz determinada, emite luz (es decir, fluorescencia) a una longitud de onda diferente Los fluoróforos y las moléculas del extintor participan en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).

En la FRET, la energía se transmite sin radioactividad sobre una distancia larga (1-10 nm) entre el fluoróforo y la molécula del extintor. El fluoróforo absorbe un fotón y transfiere esta energía de manera no radioactiva al extintor. Cuando el fluoróforo y el extintor están próximos y el espectro de emisión y de absorción se superponen, la energía del fluoróforo se transfiere al extintor sin la subsiguiente emisión de fluorescencia. Es preferible que la naturaleza del fluoróforo y del extintor sea tal que la energía recibida por el fluoróforo se transfiera al extintor y se disipe como calor, en vez de emitirse como luz. Como resultado de ello, el fluoróforo no puede fosforescer.

Las combinaciones de un fluoróforo y una molécula interactiva, como una porción de un extintor, se conocen como parejas "FRET". El primer requisito de la FRET es que el espectro de emisión del fluoróforo se superponga con el espectro de absorción de la molécula del extintor. La eficacia de la transmisión de energía disminuye proporcionalmente a la sexta potencia de la distancia entre el fluoróforo y las moléculas del extintor. Una de las prácticas habituales en la materia puede determinar fácilmente, utilizando las técnicas de espectrofotometría conocidas, que fluoróforos y qué extintores proporcionarán parejas FRET apropiadas. Las moléculas que habitualmente se utilizan en las parejas FRET incluyen la fluoresceína, 5-carboxifluoresceína (FAM), 2'7'-dimetoxi-4'5'dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), rodamina, 6'carboxirodamina (R6G), N, N, N', N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 4-(4'-dimetilaminofenilazo) ácido benzoico (DABCYL), y 5-(2'-aminoetil) aminonaftaleno-1-ácido sufónico EDANS). Preferiblemente FAM (que tiene una emisión máxima de 525 nm) se utiliza como fluoróforo para TAMRA, ROX, DABCYL y R6G (todos ellos tienen una excitación máxima de 514 nm) en una pareja FRET. De manera alternativa, el fluoróforo puede ser EDANS y el extintor DABCYL.

El método anterior tiene una aplicación general para detectar cualquier secuencia de ADN que sea metilada en tejido cancerígeno, e hipometilada en tejido no cancerígeno. En una realización de la invención, la secuencia de oligonucleótidos identificada es dirigida frente, al menos, una secuencia objetivo en el gen Myf-3. Las secuencias objetivo preferentes del gen Myf-3 son las siguientes:

100

En otra realización de la invención, la secuencia de oligonucleótidos identificada es dirigida frente, al menos, una secuencia objetivo en el gen glutación-S-transferasa (pi). Las secuencias objetivo preferentes del gen glutación-S-transferasa (pi) son las siguientes:

101

Las secuencias anteriores son objetivos particularmente preferentes para balizas moleculares por las siguientes razones:

i) contienen una alta densidad de dinucleótidos CG que pueden ser metilados;

ii) las secuencias que intervienen incluyen números suficientes de los nucleótidos A y T para que la baliza sea específica para Myf-3 o glutación-S-transferasa (pi).

iii) Las balizas designadas para hibridar con estas regiones, por lo general, no pueden formar ninguna estructura interna inapropiada que pueda favorecer el mantenimiento de la baliza en una configuración cerrada.

En una forma especialmente preferente de la invención, la temperatura de la reacción de hibridación se mantiene a 20ºC durante 20 minutos y es incrementada de 25ºC a 45ºC en aumentos de 2ºC, con 2 minutos de tiempo de estabilización. Cuando aumenta la temperatura de 50ºC a 90ºC con incrementos de 2ºC cada 5 minutos, se controla la fluorescencia de la mezcla de reacción. Aún mejor, la temperatura puede aumentar de 50ºC a 95ºC en incrementos de 2', manteniéndose cada temperatura durante 1 minuto.

Método preferente de realización la invención

Otras características de la presente invención se describirán con mayor detalle en los siguientes ejemplos. No obstante, debe entenderse que esta descripción detallada se incluye solamente a modo de ejemplo, y no debe entenderse de ninguna manera como una restricción de la amplia descripción proporcionada anteriormente. Particularmente, se entenderá que todas las gamas de temperatura y otras variables similares prescritas en los ejemplos, se exponen únicamente a modo de indicación, y que otros parámetros fuera de estos límites también pueden proporcionar resultados útiles.

Los métodos de biología molecular que no se describen de una manera explícita en los siguientes ejemplos, pueden encontrarse en las publicaciones y son bien conocidos por los expertos en la materia. Los textos generales que describen la biología molecular convencional, la microbiología, y las técnicas de recombinación del ADN dentro de las reglas del arte, incluyen, por ejemplo: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989); Glover ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volumen I y II, MRL Press, Ltd., Oxford, R.U. (1985); y Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K. Current protocols in molecular biology. Greene Publishing Associates/Wiley Intersciences, Nueva York.

Ejemplos Sondas

Se adquirieron dos balizas moleculares con secuencias de bucle complementarias a la región preferente del gen Myf-3 a la compañía de reactivos Midland Certified. La baliza molecular A contenía una secuencia de bucle complementaria larga de 18 nucleótidos y una secuencia de vástago de 6 nucleótidos (ver Tabla 1). Cinco de los 12 nucleótidos del vástago fueron también complementarios a la secuencia objetivo.

La baliza molecular B contenía los mismos 18 nucleótidos en una secuencia de bucle complementaria con una secuencia del vástago de 5 nucleótidos (ver Tabla 1). La secuencia de sonda es una base más larga en la baliza molecular A que en la B, y la base extra crea una pareja de base extra adyacente al vástago. Cuatro de los 10 nucleótidos del vástago fueron también complementarios a la secuencia objetivo.

ADN objetivo

Para investigar los perfiles de temperatura de ADN metilado y no metilado utilizando las balizas moleculares, se adquirieron a Bresatec oligonucleótidos de 32 bases que representaban la región preferente del gen Myf-3 y que eran complementarios a las balizas moleculares. Los oligonucleótidos contienen 7 zonas CG que incluyen residuos de citosina que pueden ser metilados. En el oligonucleótido 5M, las citosinas dentro de cada uno de los 7 dinucleótidos CG se reemplazaron por 5-metilcitosinas. El oligo No-5M permaneció no metilado. Todos los oligonucleótidos y las balizas moleculares adquiridas eran HPLC purificadas.

TABLA 1 Secuencias de oligonucleótidos

1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 C _{m}  = 5 citosinas metiladas\cr  5M = secuencia objetivo
Myf-3 preferente, 5M metilado, No-5M
no metilado (ver página 12, línea 8).\cr  Las secuencias de vástago
están
subrayadas\cr}

Perfiles de desnaturalización termal

Es sabido que las balizas moleculares linearizan e hibridan con ADN complementario a ciertas temperaturas, emitiendo fluorescencia como un indicador de la hibridación. Para determinar los efectos del cambio de temperatura sobre el nivel de fluorescencia, se llevaron a cabo perfiles de desnaturalización termal con diferentes oligonucleótidos y balizas moleculares. Se investigaron tres condiciones de temperatura diferentes y se escogió el mejor perfil de desnaturalización para un estudio adicional. Se controló la fluorescencia durante cada perfil utilizando un lector de fluorescencia con un control de temperatura programada (PE/ABI 7700 Applied Biosystems).

El primer perfil incluía aumentar la temperatura de 55ºC - 95ºC, en incrementos de 1º manteniéndose cada temperatura durante 1 minuto. En el segundo perfil, la temperatura se mantuvo a 20ºC durante 20 minutos y se aumentó de 25ºC a 45ºC en incrementos de 2º con un tiempo de estabilización de 2 minutos. Se controló la fluorescencia conforme la temperatura aumentaba de 50ºC a 90ºC en incrementos de 2º cada 5 minutos. En otro perfil se llevaron a cabo los mismos pasos y se detectó la fluorescencia a medida que la temperatura aumentaba en incrementos de 1º cada 5 minutos.

Se trazó la intensidad de fluorescencia de cada temperatura como función de la temperatura en una escala lineal de 0-100%. Los perfiles representativos se muestran en la Figura 1.

Mezcla de reacción

Se realizaron experimentos de la curva de fusión añadiendo concentraciones apropiadas de oligonucleótidos a una mezcla de reacción que contenía 20 mM tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl y 5 mM MgCl_{2}. Las balizas moleculares se añadieron a una concentración final de 3 \muM. Las mezclas de reacción se realizaron hasta un volumen final de 50 \mul con agua doblemente destilada. La baliza se añadió a la mezcla de reacción en el último minuto, para minimizar cualquier interacción baliza molecular/objetivo anterior al control de temperatura.

Condiciones de hibridación

Para determinar la eficacia de la hibridación y la cantidad mínima de oligonucleótidos necesaria para la hibridación, los oligonucleótidos se añadieron por igual, en cantidades limitadas y en exceso a la mezcla de reacción (es decir, Igual: 3 \muM, Limitada: 2 \muM, En exceso: 6 \muM, 12 \muM respectivamente).

Determinación de los efectos de la concentración de sal

Es sabido que los cationes divalentes, como por ejemplo Mg++, tienen un gran poder estabilizador en los híbridos del vástago. Se investigaron los efectos de las diferentes concentraciones de sal en los perfiles de desnaturalización de la baliza molecular B con cadena A y B. Las mezclas de reacción con cantidades iguales, limitadas y en exceso de oligonucleótidos, se sometieron a concentraciones de MgCl_{2} de 10 mM, 5 mM y 0 mM.

Perfiles de desnaturalización termal con oligonucleótidos metilados

Las balizas moleculares A y B se añadieron en una concentración final de 3 \muM a las mezclas de reacción que contenían cantidades iguales, limitadas y en exceso de oligonucleótidos metilados, (5M) y oligonucleótidos no metilados, (no-5M) (3 \muM, 1.4 \muM y 6 \muM respectivamente). Las mezclas de reacción se sometieron entonces al perfil de temperatura: 20ºC durante 20 minutos, 25ºC-35ºC en incrementos de 2º cada 2 minutos, y 50ºC a 90ºC en incrementos de 2º cada 5 minutos cuando se controló la fluorescencia.

Determinación del perfil de hibridación

Para construir un perfil de desnaturalización de las balizas moleculares con una cadena complementaria A y B, se permitió que la temperatura aumentara de 50ºC a 95ºC en incrementos de 2º manteniéndose cada temperatura durante 1 minuto. Esto dio como resultado una curva sigmoide típica. Cuando se aumentó la temperatura, se incrementó la fluorescencia. Esto fue debido al cambio de forma de la baliza molecular de la estructura de bucle del vástago a una estructura espiral aleatoria.

Según Tyagi et al., (5) las balizas moleculares hibridan de forma espontánea a sus objetivos a temperatura ambiente. Por lo tanto, la mezcla se incubó inicialmente a 20ºC durante 20 minutos para permitir la hibridación efectiva del objetivo a la baliza molecular. La fluorescencia alcanza un máximo de aproximadamente 50ºC.

Permaneció alto hasta que se alcanzó una temperatura determinada, cuando el % de fluorescencia disminuyó rápidamente o alcanzó el 0% de fluorescencia. Esta temperatura representaba la temperatura a la cual se funde el híbrido. Para la baliza molecular B con cadena complementaria A y B, la temperatura de fusión de hibridación era, aproximadamente, 74ºC-76ºC. La temperatura de fusión de hibridación para la baliza molecular B era, aproximadamente, 74ºC. En las incidencias anteriores el % de fluorescencia alcanzó el 0% después de alcanzar la temperatura de fusión de hibridación. Por otro lado, el % de fluorescencia de la baliza A con la cadena A descendió a 76ºC-78ºC pero no alcanzó el 0%, ni siquiera a 90ºC.

Con el perfil de temperatura anteriormente mencionado fue posible medir perfiles de temperatura consecuentes, así como dejar el tiempo suficiente para la hibridación de la baliza molecular objetivo.

Cantidades de oligonucleótidos necesarios para la hibridación

Para determinar las cantidades mínimas de oligonucleótidos necesarios para la hibridación, se añadieron las balizas moleculares A y B a las mezclas de reacción que contenían cantidades iguales, limitadas y en exceso de oligonucleótidos. No se observó una temperatura de fusión de hibridación distinta en las muestras de oligonucleótidos limitadas
(1.5 \muM o 0.8 \muM) excepto la muestra de oligonucleótidos de 1.5 \muM con baliza molecular B. Se observó una temperatura de fusión de hibridación de 66ºC aproximadamente con la cadena complementaria A y de 72ºC aproximadamente con la cadena complementaria B.

La máxima intensidad de fluorescencia alcanzada con cantidades iguales de oligonucleótidos era inferior que las mezclas de reacción con exceso de oligonucleótidos. La temperatura de hibridación era también elevada en las muestras con exceso de oligonucleótidos. Por ejemplo, la baliza molecular con cantidades iguales de la cadena A tenía una temperatura de hibridación de 66ºC, mientras que para la misma mezcla de reacción, con cadena de exceso, tenía una temperatura de fusión aproximada de 74ºC. Se concluyó de manera general que para que produjera la hibridación efectiva de la baliza molecular objetivo, era necesario someter al objetivo al exceso, o al menos a cantidades
iguales.

Efectos de concentraciones de sal en los perfiles de desnaturalización

Los análisis de diferentes concentraciones de sal con la baliza molecular B con la cadena A y B indicaban que la presencia de MgCl_{2} en la mezcla de reacción aumenta la estabilidad de los híbridos según lo previsto. Tanto en las cantidades limitadas de oligonucleótidos, como en las iguales, se detectó una mayor intensidad de fluorescencia en las muestras con concentración de 5 mM MgCl_{2}. No obstante, cuando se aumentó la concentración de sal de 5 mM a 10 mM, sólo se observó un aumento marginal en la intensidad de la fluorescencia.

Detección de la metilación

La temperatura de fusión de hibridación observada cuando las balizas moleculares A y B fueron hibridadas para el oligonucleótido metilado 5M era superior a la temperatura de fusión de las balizas A y B hibridadas para el oligonucleótido no metilado, No-5M.

Por ejemplo, como se muestra en la Figura 1, la baliza molecular A con cantidad igual de 5M se fusionó a, aproximadamente, 80ºC, mientras que la No-5M no metilada, se fusionó a, aproximadamente, 69ºC. La baliza molecular A con cantidades en exceso de 5M, tenía una temperatura de fusión de hibridación de 76ºC aproximadamente, mientras que la No-5M tenía 71ºC aproximadamente. Con la baliza molecular B y cantidades en exceso de 5M, la hibridación comenzó a fundir a 68ºC aproximadamente mientras la intensidad fluorescente disminuía a menor velocidad. Con cantidades en exceso de No-5-M, la temperatura de fusión era de 64ºC aproximadamente.

Sensibilidad de la detección de citosinas metiladas

El método de la baliza molecular puede detectar fácilmente la metilación del ADN preferente objetivo cuando la totalidad de los 7 residuos de citosinas dentro de los dinucleótidos CpG son metilados (ver Tabla 1). Para determinar el número mínimo de residuos de citosina que necesitan ser metilados para alterar la temperatura de fusión de los híbridos, se sometieron a reacción los objetivos preferentes Myf-3 con números variables de residuos de citosina metilados con la baliza A en el sistema de ensayo. Según se muestra en la Tabla 2, se examinaron cinco objetivos diferentes modificados y preferentes. Las modificaciones variaban de disponer de uno a cinco residuos de citosinas metiladas. Como se muestra en la Figura 2, los híbridos de la baliza A con objetivos que tienen 2 o más residuos de citosina se separan a una temperatura de fusión significativamente más alta comparada con los objetivos que tienen uno o ningún residuo de citosina metilado.

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(Secuencias pasan a página siguiente)

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Oligonucleótidos metilados

2

: M = residuos de citosina metilados.

: NB. Perfiles de reacción mostrados en la Fig. 2.

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Referencias

1.- Millar et al, (1999) Oncogene, 18:1313-1324.

2.- Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

3.- Ozaki et al. (1992) Nucleic Acids Research, 20:5205-5214.

4.- Agrawal et al. (1990) Nucleic Acids Reasearch, 15:5319-5423.

5.- Tyagi et al., Nature 1996 14(3):303-308.

Claims

1. Un método para detectar ácidos nucleicos metilados que incluye:

(i) la puesta en contacto de una muestra de ácido nucleico, que se sospeche que contiene nucleótidos metilados, con una secuencia de oligonucleótidos en condiciones favorables para la hibridación del ácido nucleico. Dicha secuencia de oligonucleótidos se caracteriza por lo siguiente:

(a): incluye un primer vástago identificado con una porción de fluoróforo, una secuencia de bucle que contenga una región de nucleótidos complementaria, al menos, a una porción de la muestra del ácido nucleico, cuya porción es susceptible de metilación, y un segundo vástago identificado con una región de atenuación que sea capaz de extinguir la porción de fluoróforo cuando se encuentra en proximidad espacial a la misma; y

(b): cuando la sonda se separa de la muestra de ácido nucleico, los nucleótidos que forman el primer vástago son capaces desplazarse en una proximidad espacial con los nucleótidos que forman el segundo vástago;

(ii) la alteración de las condiciones de hibridación, de manera que la sonda de oligonucleótidos se separa del ADN no metilado pero mantiene las condiciones de hibridación del ADN metilado; y

(iii) la medición del cambio de fluorescencia.

2. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el que las secuencias de oligonucleótidos identificadas se separan de la muestra de ácido nucleico objetivo de acuerdo con la etapa (ii) y el primer y segundo vástago hibridan conjuntamente causando la extinción de la porción de fluoróforo.

3. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la secuencia de bucle contiene, al menos, unos 10 nucleótidos.

4. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la secuencia de bucle contiene hasta 35 nucleótidos.

5. Un método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la secuencia de bucle contiene entre 10 y 25 nucleótidos.

6. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la secuencia de bucle contiene, al menos, entre 15 o 20 nucleótidos.

7. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la secuencia de bucle es complementaria a una porción de la secuencia de ácido nucleico que se somete a la metilación cuando una célula se transforma de un estado normal, a un estado cancerígeno.

8. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la secuencia de bucle es complementaria a una porción de una secuencia de ácido nucleico Myf-3 que se somete a la metilación cuando una célula se transforma de un estado normal, a un estado cancerígeno.

9. Un método de conformidad con la reivindicación 8, en el que la secuencia de oligonucleótidos identificada es complementaria a, al menos, una de las secuencias seleccionadas del grupo que incluye:

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3

10. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la secuencia de bucle es complementaria a una porción de una secuencia de ácido nucleico glutación-S-transferasa-\pi (pi) que se somete a la metilación cuando una célula se transforma de un estado normal, a un estado cancerígeno.

11. Un método de conformidad con la reivindicación 10 en el que la secuencia de oligonucleótidos identificada es complementaria a, al menos, una de las secuencias seleccionadas del grupo que incluye:

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6

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12. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la secuencia de bucle es complementaria a una porción de una secuencia de ácido nucleico de calcitonina que se somete a la metilación cuando una célula se transforma de un estado normal, a un estado cancerígeno.

13. Un método de conformidad con la reivindicación 1, en el que el método se utiliza para detectar secuencias de genes anormalmente metilados en tejidos prostáticos cancerígenos.

14. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la condición de hibridación, que se altera durante la reacción de hibridación, es la temperatura de la reacción de hibridación.

15. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las secuencias del vástago no hibridan al gen objetivo y son de una longitud lo suficientemente corta para evitar el enlace no específico entre el vástago y cualquier otra secuencia de ácido nucleico en la mezcla de reacción.

16. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las secuencias del vástago tienen entre 4 y 8 nucleótidos de longitud.

17. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos una citosina en, al menos, una de las secuencias del vástago es un residuo de citosina metilada.