ES2269365T3 - Baliza de hibridacion y metodo de deteccion y discriminacion rapidas de secuencias. - Google Patents
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Abstract
Una baliza de hibridación que es un oligonucleótido donde (a) el oligonucleótido no posee estructura secundaria que surja de una región del oligonucleótido que se hibride con otra, (b) el oligonucleótido está formado por residuos nucleotídicos de los cuales uno está marcado con un indicador fluorescente en el que la baliza incluye un solo indicador sin un extintor asociado y el indicador se selecciona entre el grupo de 6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína y hexaclorofluoresceína, (c) el residuo nucleotídico marcado con indicador está posicionado internamente dentro de la secuencia oligonucleotídica, (d) el oligonucleótido es totalmente complementario a un alelo de ADN genómico humano que tiene un polimorfismo conocido en el sitio de unión del oligonucleótido, y (e) la sonda oligonucleotídica está modificada en su extremo 3'' como para prevenir la extensión de la cadena durante la amplificación por PCR.
Description
Baliza de hibridación y método de detección y
discriminación rápidas de secuencias.
Se ha descrito una multitud de técnicas para
detectar secuencias de ADN específicas y marcar polimorfismos de
nucleótidos simples conocidos. Varios de estos métodos de detección
utilizan la hibridación de sondas marcadas en forma fluorescente y
se basan en la transferencia de energía entre los restos dador y
aceptor. La presente invención abarca un nuevo y simple sistema de
detección con sondas de hibridación fluorescentes que no se basa en
la acción enzimática ni en la estructura secundaria de la sonda. La
interacción entre estas sondas de hibridación y sus secuencias diana
genera alteraciones significativas en la emisión de la
fluorescencia. Las variaciones en el potencial de hibridación
permiten la discriminación de dianas polimorfas por la cantidad de
emisión de fluorescencia y la temperatura de fusión de los dúplex
sonda/diana. Los Polimorfismos de un Solo Nucleótido (Single
Nucleotide Polymorphisms o SNP) son la forma más abundante de
variación de secuencia en el genoma humano y ocurren en promedio
cada mil nucleótidos. Un SNP es un sitio dentro de la secuencia de
ADN que varía por una única base (sustitución, inserción o deleción)
de persona a persona. Estos SNP pueden afectar las características
fenotípicas directamente, como determinadas enfermedades, y
comúnmente se emplean como marcadores genéticos para identificar
rasgos complejos, tales como la respuesta a medicación
(Farmacogenética). Los SNP son extremadamente útiles como marcadores
genéticos porque evolucionan lentamente y se marcan fácilmente a
través de una diversidad de métodos. Se están haciendo intentos a
gran escala para descubrir nuevos SNP, para uso en estudios de
asociación que pueden permitir la identificación de genes que
contribuyen a trastornos genéticos comunes. A su vez, se han
desarrollado muchas técnicas para estudiar de manera eficaz los SNP
conocidos con un resultado relativamente alto. Los métodos actuales
para genotipificación de SNP incluyen análisis por polimorfismo en
la longitud de los fragmentos de restricción (restriction fragment
length polymorphism o RFLP) de productos de reacción en cadena de la
polimerasa (usando electroforesis en gel para la detección de los
fragmentos de restricción), hibridación de oligonucleótidos
específicos de alelos (allele-specific
oligonucleotide o ASO), sistema de mutación refractaria por
amplificación (amplification refractory mutation system o ARMS),
ensayo de ligación de oligonucleótidos (oligonucleotide ligation
assay u OLA), análisis de polimorfismo de conformación monocatenaria
(single-strand conformation polymorphism o SSCP),
escisión química, análisis heterodúplex,
mini-secuenciación y una diversidad de sistemas
basados en sondas. Los ejemplos de tecnologías basadas en sondas
incluyen balizas moleculares, el ensayo de
5'-exonucleasa, sondas de hibridación y cebadores
Scorpion. Varios de estos sistemas de sondas se basan en la
transferencia de energía entre los restos donante (p. ej.,
fluoróforo) y aceptor (p. ej., extintor de fluorescencia). Las
sondas fluorescentes son típicamente oligonucleótidos monocatenarios
que exhiben cantidades inferiores de emisión de fluorescencia en
aislamiento que cuando se hibridan a secuencias diana. Las
estructuras de estas sondas implican gran especificidad, permitiendo
la identificación de dianas que difieren por tan solo un nucleótido
sencillo.
La energía absorbida por un fluoróforo puede
transferirse a un extintor de fluorescencia y liberarse como calor.
La extinción de la señal de fluorescencia puede producirse por
mecanismos de Transferencia de Energía por Resonancia en la
Fluorescencia (Fluorescence Resonance Energy Transfer o FRET) o
mecanismos distintos a la FRET. La extinción FRET requiere una
superposición espectral entre el donante y el aceptor, donde la
eficacia de la extinción se relaciona con la distancia entre los dos
restos. La extinción no FRET se produce a través de "contactos"
de corto intervalo entre el fluoróforo y el extintor, sin necesidad
de superposición espectral entre los restos.
El ensayo 5'-exonucleasa
(TaqMan™) usa extinción FRET para analizar el ADN diana amplificado
por la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR). Las sondas TaqMan
son oligonucleótidos que contienen restos fluoróforo y extintor
preferiblemente ubicados en los extremos 5' y 3'. Se emite muy poca
fluorescencia desde la sonda intacta debido una extinción
intramolecular eficaz. No obstante, durante la amplificación por
PCR, la sonda se hibrida específicamente a su secuencia diana y la
actividad de 5'- 3'-exonucleasa de la polimerasa
Taq escinde la sonda entre los restos fluoróforo y extintor.
La escisión enzimática de las sondas TaqMan™ separa espacialmente
los componentes fluoróforo y extintor, provocando incrementos
significativos en la emisión de fluorescencia correlacionada con la
amplificación diana. El cuidadoso diseño de las sondas TaqMan™
permite la discriminación de dianas polimorfas, donde únicamente las
sondas perfectamente emparejadas se degradan para generar
incrementos en la señal de fluorescencia. Dado que las sondas
TaqMan™ se digieren durante la amplificación por PCR en tiempo real,
las sondas no están disponibles para análisis de curvas de fusión
post-amplificación.
Las balizas moleculares son sondas de
oligonucleótidos monocatenarios que no son fluorescentes en
aislamiento, pero que se tornan fluorescentes tras la hibridación a
secuencias diana. Las balizas moleculares no hibridadas forman
estructuras de tipo tallo-lazo
(stem-loop), que poseen un fluoróforo
covalentemente unido a un extremo de la molécula y un extintor
unido al otro, de modo tal que la horquilla de la baliza coloca al
resto fluoróforo próximo al extintor. Cuando las balizas moleculares
se hibridan a secuencias diana, los restos fluoróforo y extintor se
separan espacialmente, de modo tal que el fluoróforo ya no se
extingue y fluoresce la baliza molecular. Las balizas moleculares se
pueden emplear en ensayos de punto final y "tiempo real" para
detección de secuencias y discriminación de SNP. La estructura
secundaria de la baliza molecular transmite gran especificidad a la
sonda de hibridación, permitiendo la identificación de dianas que
difieren en un único nucleótido. No obstante, la interacción
intramolecular de la sonda molecular produce una fuente potencial de
competición para hibridación de dianas intermoleculares y, dado que
la baliza molecular es una sonda interna, debe competir con la
cadena opuesta del amplicón para unirse a la secuencia diana. La
combinación de ambas formas de competición puede reducir la eficacia
de la hibridación de la baliza molecular en algunas moléculas
diana.
Las sondas de hibridación son oligonucleótidos
que están marcados solamente con un resto fluoróforo. Se requieren
dos de dichos oligonucleótidos para cada ensayo de sonda de
hibridación, uno marcado con un fluoróforo donante y el otro con un
fluoróforo aceptor. Comúnmente se emplea fluoresceína como el
donante y Cy5, LC-RED 640 y LC-RED
705 se utilizan comúnmente como aceptores. La excitación del
fluoróforo donante produce un espectro de emisión que se superpone
con el espectro de absorción del fluoróforo aceptor. Los pares de
sondas de hibridación están diseñados para reconocer secuencias de
nucleótidos adyacentes dentro de las moléculas diana. En
aislamiento, el oligonucleótido aceptor no se excita y no genera una
señal fluorescente. No obstante, durante la hibridación a las
secuencias diana de polinucleótidos, las sondas donante y aceptor se
aproximan, permitiendo la transferencia de energía por resonancia en
la fluorescencia del donante al aceptor. La señal fluorescente desde
el fluoróforo aceptor se emite únicamente cuando ambas sondas se
hibridan a la molécula diana. Cuando se incorpora a reacciones PCR,
la fluorescencia de la sonda aceptora se controla una vez por ciclo
de amplificación, para facilitar la medición en tiempo real de
acumulación de producto, donde la cantidad de fluorescencia emitida
por el aceptor es proporcional a la cantidad de diana sintetizada.
El cuidadoso diseño de las sondas y las condiciones de ensayo
permiten la discriminación de dianas muy relacionadas por PCR en
tiempo real. A su vez, se pueden emplear pares de sondas de
hibridación para discriminar alelos por análisis de picos de fusión
y determinación de Tm. Las muestras homocigóticas pueden
identificarse por la generación de picos específicos durante el
análisis de curvas de fusión de dos picos dentro de un solo
indicio.
Los ensayos de sondas de hibridación,
5'-exonucleasa y baliza molecular son sistemas
bimoleculares que tienen la sonda y las secuencias diana ubicadas en
cadenas de ADN separadas. Las sondas Scorpion funcionan a través de
eventos de unión unimolecular, donde la sonda y la secuencia diana
amplificada están ubicadas en la misma cadena del ADN. Los eventos
de unión unimolecular están cinéticamente favorecidos en comparación
con la hibridación bimolecular. Las sondas Scorpion comprenden un
cebador adjunto a una secuencia final de sonda, donde la secuencia
de la sonda está contenida dentro de una estructura secundaria de
tipo tallo-lazo similar a aquella de una baliza
molecular. En la forma no extendida, los cebadores Scorpion no son
fluorescentes debido a que los restos fluoróforo y extintor están
muy próximos uno del otro. Durante la PCR, el componente cebador del
Scorpion se extiende en su extremo 3', produciendo la secuencia
diana homóloga requerida para la hibridación de sondas. Cuando la
secuencia de la sonda Scorpion se hibrida a la diana amplificada,
los restos fluoróforo y extintor se separan espacialmente, generando
incrementos significativos en la señal fluorescente concurrente con
la amplificación de la diana. El cuidadoso diseño de las sondas y
las condiciones de ensayo permite la discriminación de dianas
polimorfas, donde únicamente las dianas perfectamente emparejadas
producen incrementos en la señal de fluorescencia durante el
análisis PCR en tiempo real.
Las sondas TaqMan, las balizas moleculares, las
sondas de hibridación y los cebadores Scorpion utilizan FRET para
detectar y discriminar secuencias de polinucleótidos. No obstante,
el sistema alternativo de sonda iluminada no requiere transferencia
FRET entre los restos donante y aceptor para detectar y discriminar
secuencias del ADN. Estas sondas iluminadas comprenden una secuencia
que reconoce el oligonucleótido y un solo grupo indicador de
fluorescencia, donde el indicador es típicamente un derivado del
tinte asimétrico de cianina naranja de tiazol. El componente de
tinte fluorescente de las sondas iluminadas está unido al extremo de
la molécula oligonucleotídica. Cuando son monocatenarias, las
sondas emiten cantidades significativamente inferiores de
fluorescencia que cuando se hibridan a secuencias de ácido nucleico
complementarias. Al medir la cantidad de emisión de fluorescencia,
se pueden emplear sondas iluminadas para detectar secuencias de
ácido nucleico y diferenciar entre dianas que difieren en una única
posición.
Se han descrito los ensayos homogéneos que
efectúan la amplificación de ADN y la detección/discriminación de
secuencias en un único tubo para balizas moleculares, sondas TaqMan
(ensayo de 5' exonucleasa), sondas FRET y cebadores Scorpion. Los
métodos homogéneos de análisis eliminan el requerimiento de análisis
posteriores (p. ej., purificación de producto PCR, digestión de
enzimas, análisis en gel, etc) para generar resultados y reducir el
potencial de contaminación cruzada entre las reacciones.
El documento WO 98/26093 (US Health; Hawkins,
Mary) describe sondas oligonucleotídicas que incorporan un análogo
de nucleótido fluorescente en la secuencia interna del
oligonucleótido, sin un extintor asociado. No obstante, una
característica esencial de las sondas descritas es que el nucleótido
fluorescente está ubicado en la sonda, de modo tal que cuando la
sonda se hibrida al ácido nucleico diana, el nucleótido fluorescente
está en un lazo que no participa en el par de base complementario
con un nucleótido del ácido nucleico diana (véase la reivindicación
1 y las fórmulas I-V de las páginas
16-18). Preferiblemente, el lazo es una inserción en
la sonda de ácido nucleico que de otro modo es complementaria al
ácido nucleico diana (página 4, líneas 2-5).
El documento EP 0 710 668 (Becton Dickinson Co.)
se refiere a la química para unir tintes de cianina, tales como
naranja de tiazol, a oligonucleótidos. En los ejemplos que se
presentan, el tinte se adhiere exclusivamente al residuo terminal 5'
del oligonucleótido (véanse página 3, líneas 23-25;
Ejemplo 1; página 5, línea 23). Se menciona en la página 3, líneas
25-26, que el tinte también se puede unir a un
oligonucleótido en el extremo 3' o internamente.
Murakami et al (Nucleic Acids Research,
vol. 19, no. 15, 4097-4102, 1991) describe un método
para la detección de secuencias de ácido nucleico que utiliza sondas
oligonucleotídicas marcadas con fluoresceína y que detecta cambios
en la anisotropía de la fluorescencia debido a la formación de
híbridos. En todas las sondas de este estudio, la marca se colocó
en un grupo fosfato puente al nucleótido 5' con el nucleótido
inmediato en dirección 3'.
Bernard et al (Analytical Biochemistry,
vol. 255, 101-107, 1988) y Nauck et al
(Clinical Chemistry, vol. 45, no. 8, 1141-1147,
1999) describen sondas de hibridación y transferencia de energía por
resonancia en la fluorescencia en donde se yuxtaponen dos
fluoróforos de modo tal que el fluoróforo donante es entonces capaz
de excitar un fluoróforo aceptor. Las sondas de hibridación se
describen a continuación.
En un aspecto, la invención provee una baliza de
hibridación (HyBeacon) que es un oligonucleótido en el que (a) el
oligonucleótido no tiene estructura secundaria que surja de una
región del oligonucleótido que se hibride con otra, (b) el
oligonucleótido está formado por residuos nucleotídicos de los
cuales uno está marcado con un indicador a base de fluoresceína en
donde la baliza incluye un único indicador sin un extintor asociado,
y el indicador se selecciona del grupo de 6-carboxi
fluoresceína, tetraclorofluoresceína y hexaclorolfluoresceína, (c)
el residuo nucleotídico marcado con indicador está situado
internamente dentro de la secuencia oligonucleotídica, (d) el
oligonucleótido es totalmente complementario a un alelo del ADN
genómico humano que tiene un polimorfismo conocido en el sitio de
unión del oligonucleótido, y (e) la sonda oligonucleotídica está
modificada en su extremo 3' como para prevenir la extensión de la
cadena durante la amplificación por PCR. Las balizas de hibridación
de la invención, que poseen un indicador a base de fluoresceína sin
un extintor asociado, se denominan HyBeacon F. En la descripción que
sigue, las propiedades de las HyBeacon F se describen en comparación
con las propiedades de las balizas de hibridación que poseen ambos
restos fluoróforo y extintor, denominadas HyBeacon
F-Q. Las HyBeacon F-Q no son parte
de la presente invención que se reivindica.
La sonda de hibridación de la invención es un
oligonucleótido monocatenario lineal que prácticamente no posee
estructura secundaria. La estructura secundaria surge cuando una
región de un oligonucleótido se hibrida con otra, p. ej., formando
un lazo (como con las balizas molecular convencionales) que reduce
la eficacia del oligonucleótido que se está hibridando con su diana
complementaria. En las HyBeacon de la presente invención,
prácticamente no hay tendencia a que una región del oligonucleótido
se hibride con otra.
La longitud de la HyBeacon es tal que es
adecuada para hibridarse con una diana polinucleotídica
complementaria para proporcionar un híbrido estable cuya temperatura
de fusión depende de la secuencia exacta de la diana. Los
oligonucleótidos que contienen menos de 15 residuos nucleotídicos en
determinados casos no forman híbridos lo suficientemente estables,
particularmente si las dos secuencias hibridantes no son
precisamente complementarias. Los oligonucleótidos con más de
aproximadamente 30 residuos nucleotídicos en determinados casos
forman híbridos cuya temperatura de fusión es relativamente
insensible a la posible presencia de un emparejamiento incorrecto de
un solo nucleótido. Los residuos nucleotídicos usualmente derivan de
los nucleósidos naturales A, C, G y T. No obstante, se pueden usar
análogos de nucleótidos en uno o más sitios de la baliza de
hibridación, como análogos de nucleótidos modificados, p. ej., en la
porción de base y/o la porción de azúcar y/o el enlace trifosfato.
Las modificaciones de base, tales como propinil dU (análogo de dT) y
2-amino dA (análogo de dA), en general alteran las
propiedades de hibridación y pueden hacer atractivo el uso de
oligonucleótidos que tengan menos de 15 o más de 30 residuos
nucleotídicos. Alternativamente, se pueden emplear los
oligonucleótidos compuestos por o que comprenden ácido nucleico
peptídico (PNA), ácido nucleico bloqueado (LNA), ARN de
2'-O-metilo, ADN de fosforamidato,
ADN de fosforotioato, ADN de metilfosfonato, ADN de fosfotriéster o
análogos de base de ADN para formar interacciones más estables con
las secuencias diana.
Se ha demostrado que ambas HyBeacon F y
F-Q emiten cantidades significativamente mayores de
fluorescencia cuando se hibridan a secuencias de ácido nucleico
complementarias cuando están en conformación monocatenaria. Un
hallazgo inesperado fue que las HyBeacon F emiten significativamente
más señal fluorescente en el estado bicatenario que en el estado
monocatenario a pesar de la ausencia de un componente extintor.
Éste es un hallazgo importante ya que permite
diseñar ensayos de sondas que no requieren sondas aceptoras
asociadas o transferencia de energía entre las sondas tal como se
requiere con las sondas de hibridación conocidas. Para los fines de
la presente memoria, dichos ensayos se denominan "ensayos de una
sola sonda".
Los sistemas fluoróforo-extintor
se describen en la bibliografía y no se describirán en más detalles
en la presente memoria. La preparación de oligonucleótidos que
contienen residuos nucleotídicos marcados con fluoróforo y residuos
nucleotídicos marcados con extintor también se describe en la
bibliografía.
La relación de señal es la relación de la
intensidad de señal de un híbrido bicatenario que comprende una
baliza de hibridación a la intensidad de señal de la sonda
monocatenaria y es preferiblemente lo más grande posible, p. ej., 3
ó más. Esta relación de señal depende de múltiples factores. Para
las HyBeacon F-Q, el índice de transferencia de
energía desde una molécula donante excitada (fluoróforo) a una
molécula aceptora cercana (extintor) depende no solamente de la
distancia entre los dos restos, sino también en su disposición
angular relativa. Las HyBeacon con restos fluoróforo y extintor
separados por tan solo 1 ó 3 residuos nucleotídicos poseen
relaciones de señal de fluorescencia que son significativa y
útilmente mayores que 1. Las HyBeacon que poseen más de 3
nucleótidos que separan el fluoróforo y el extintor exhiben
relaciones de señal mayores. Para las HyBeacon F-Q,
los componentes fluoróforo y extintor están preferiblemente ubicados
de modo tal que 5 o más residuos nucleotídicos separan los dos
restos. Las moléculas donante y aceptora separadas por menos de 5
nucleótidos pueden entrar en "contacto", permitiendo posibles
interacciones no FRET.
Se ha demostrado que las HyBeacon F exhiben
relaciones de señal comparables a las HyBeacon F-Q
que poseen más de 5 nucleótidos que separan los componentes donante
y aceptor. Las relaciones de señal en las HyBeacon F son
significativa y útilmente mayores que 1 a pesar de la ausencia de
restos extintores. La ausencia de moléculas aceptoras causa que las
HyBeacon F no estén influenciadas por la disposición angular, de
modo que la distancia relativa entre las moléculas fluoróforo y
extintor no puede determinar la cantidad de señal fluorescente
emitida en los estados bicatenario y monocatenario. Se cree que los
restos fluoróforo emiten significativamente más señal fluorescente
cuando se hibridan sondas HyBeacon a las moléculas diana que cuando
las sondas están en la forma monocatenaria, posiblemente debido a
alguna forma de interacción con el ADN bicatenario.
En una baliza de hibridación de acuerdo con la
invención, el oligonucleótido tiene una secuencia totalmente
complementaria a un alelo de una diana polinucleotídica conocida que
tiene un polimorfismo conocido, p. ej., una mutación puntual o una
inserción o deleción de una sola base (SNP). En las HyBeacon
F-Q, este SNP de la diana es por lo general
complementario a un residuo nucleotídico del intermedio de la baliza
de hibridación entre el residuo nucleotídico marcado con fluoróforo
y el residuo nucleotídico marcado con extintor. Para las HyBeacon F,
el sitio de polimorfismo está preferiblemente, aunque no
esencialmente, ubicado centralmente dentro de la sonda
oligonucleotídica.
Alternativamente, la baliza de hibridación puede
ser complementaria a una diana polinucleotídica no polimorfa
conocida y se puede usar simplemente para detectar esa diana.
Además, las balizas de hibridación se pueden utilizar para estudiar
dianas potencialmente polimorfas con polimorfismos desconocidos y no
caracterizados. Se contempla la posibilidad de mapear la posición
y/o naturaleza de polimorfismos desconocidos por hibridación de
balizas diferencial y diferencias en la Tm de los picos de
fusión.
El residuo nucleotídico marcado con fluoróforo
está posicionado internamente dentro de la secuencia
oligonucleotídica, en vez del extremo 5' o el extremo 3'. Cuando la
baliza de hibridación se hibrida con una diana polinucleotídica,
todas estas características contribuyen a la formación de un híbrido
estable con una temperatura de fusión óptima y una diferencia
sustancial en las temperaturas de fusión entre las cadenas que están
perfectamente emparejadas y las cadenas que tienen posiciones
simples o múltiples de emparejamiento incorrecto (\DeltaTm).
Puede que sea conveniente proveer dos o más
balizas de hibridación, una totalmente complementaria a cada alelo
del SNP bajo investigación. Si cada baliza de hibridación porta un
fluoróforo diferente, puede ser conveniente mezclar las sondas en
disolución para análisis de dianas homocigóticas y heterocigóticas.
Del mismo modo, se puede usar una mezcla de sondas de hibridación
complementarias a los diversos alelos de los diferentes SNP en
disolución para análisis múltiplex, siempre que cada una esté
marcada con un fluoróforo espectralmente distinto.
Alternativamente, una baliza de hibridación de
la presente invención se puede proveer inmovilizada en o dentro de
un soporte Techniques y los enlazadores para inmovilizar
oligonucleótidos que usan soportes en formas que los dejan libres
para hibridarse con dianas complementarias en disolución se
describen en la bibliografía. También se incluye dentro del alcance
de la invención una gama de sondas oligonucleotídicas inmovilizadas
en ubicaciones espaciadas usando un soporte, donde las diferentes
sondas oligonucleotídicas son diferentes balizas de hibridación de
acuerdo con la presente invención. Asimismo, se pueden emplear las
sondas HyBeacon para analizar dianas de ADN inmovilizadas en o
dentro de un soporte, donde las distintas dianas se pueden ubicar en
ubicaciones espaciadas en formatos de tipo hilera.
En otro aspecto, la presente invención provee un
método para investigar una diana polinucleotídica, donde el método
comprende
(i) proveer una baliza de hibridación que es un
oligonucleótido donde (a) el oligonucleótido no tiene una estructura
secundaria que surge de una región del oligonucleótido que se
hibride con otra, (b) el oligonucleótido está formado por residuos
nucleotídicos de los cuales uno está marcado con un indicador a base
de fluoresceína en el que la baliza incluye un solo indicador sin un
extintor asociado, y el indicador se selecciona del grupo de
6-carboxi fluoresceína, tetraclorofluoresceína y
hexaclorofluoresceína, (c) el residuo nucleotídico marcado con
indicador está posicionado internamente dentro de la secuencia
oligonucleotídica, (d) el oligonucleótido es totalmente
complementario a la diana polinucleotídica, y (e) la sonda
oligonucleotídica está modificada en su extremo 3' como para
prevenir la extensión de la cadena durante la amplificación por PCR;
(ii) incubar la diana polinucleotídica con la baliza de hibridación
para formar un híbrido, exhibiendo la baliza de hibridación un
nivel superior de señal cuando está en la forma de híbrido que
cuando está en la forma monocatenaria; y (iii) observar el nivel de
señal de la baliza de hibridación a una temperatura predeterminada o
en un intervalo de temperaturas próximo a la temperatura de fusión
del híbrido.
La diana polinucleotídica puede ser ADN, ARN o
ADNc y se utiliza en forma monocatenaria, o se puede sondar un ADN
bicatenario para formar un tríplex. La diana polinucleotídica tiene
un polimorfismo conocido, preferiblemente un SNP. La diana se incuba
bajo condiciones de hibridación con una sonda oligonucleotídica, que
puede ser una baliza de hibridación tal como la descrita en la
presente memoria. Es necesario que el híbrido genere una señal de
fluorescencia más fuerte que la sonda oligonucleotídica
monocatenaria. La temperatura de fusión del híbrido dependerá, entre
otras cosas, de si la diana polinucleotídica y la sonda
oligonucleotídica son totalmente complementarias o de si hay un
emparejamiento incorrecto simple o incluso doble que surge en o
cerca de la ubicación del SNP. El método comprende observar el nivel
de señal de fluorescencia emitida por la sonda oligonucleotídica a
una temperatura predeterminada cercana a la temperatura de fusión
del híbrido, o en un intervalo de temperaturas. Se describen dos
alternativas, si bien otras son posibles:
a) La temperatura de una disolución que contiene
el híbrido se eleva lentamente, mientras se observa continuamente
una señal de fluorescencia, con el fin de construir un gráfico de
derivado negativo de intensidad de la señal de fluorescencia con
respecto a temperatura (-dF/dT) contra la temperatura. La
temperatura de fusión (Tm) del híbrido aparece como un pico y provee
información acerca de la secuencia de la diana polinucleotídica. Las
Tm generadas a través del análisis de fusión HyBeacon se pueden
utilizar para distinguir dianas polimorfas. El intervalo de
temperatura en general abarca la temperatura de fusión del
híbrido;
b) Se mantiene una disolución del híbrido a una
temperatura predeterminada y se observa el nivel de fluorescencia.
En general, la temperatura predeterminada se selecciona para ser un
intermedio entre la temperatura de fusión de un híbrido
perfectamente emparejado y la temperatura de fusión de un híbrido
con uno o dos errores de emparejamiento. El nivel de señal de
fluorescencia observada provee una indicación de si el híbrido se ha
fundido o no, y provee así información acerca de la secuencia de la
diana polinucleotídica. Las dianas polimorfas se pueden distinguir
en formatos de punto final y tiempo real o cinética.
Típicamente, la baliza de hibridación tiene una
secuencia complementaria, típicamente totalmente complementaria, a
un alelo del polinucleótido diana. El uso de balizas totalmente
complementarias permite la diferenciación entre la hibridación
emparejada e incorrectamente emparejada. Adecuadamente, una de dos o
más balizas de hibridación diferentes tiene una secuencia
complementaria, idealmente totalmente complementaria, a un alelo
diferente del polinucleótido diana.
Convenientemente, la diana polinucleotídica
puede ser un amplímero de PCR, formado usando cebadores adecuados
para amplificar una porción deseada de ADN genómico. Puede ser
conveniente llevar a cabo la amplificación e investigación de la
diana en un modo homogéneo, p. ej., en un solo recipiente de
reacción añadiendo la sonda oligonucleotídica antes, durante o
después del procedimiento del ciclo de amplificación. También puede
ser conveniente llevar a cabo la amplificación de la diana y la
investigación de la secuencia directamente de las muestras, como la
saliva, sin extracción previa del ADN, ARN o ADNc. La sonda
oligonucleotídica se modifica en su extremo 3' como para prevenir la
extensión de la cadena durante la amplificación por PCR.
Las temperaturas de fusión de las sondas de
hibridación se pueden utilizar para identificar polinucleótidos
diana polimorfos.
Las balizas de hibridación de la invención
también se pueden emplear para identificar ADN homocigótico y
heterocigótico usando una única sonda.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y
no tienen como fin limitarla en modo alguno.
Figura 1: Hibridación HyBeacon
diferencial. Ilustra la diferencia entre las interacciones
emparejadas, incorrectamente emparejadas e incorrectamente
emparejadas con doble error, donde las estrellas representan
polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Las interacciones de tipo
A implican una molécula HyBeacon diseñada para emparejarse
perfectamente a un tipo natural o un alelo de un SNP. Las
interacciones de tipo B implican una molécula HyBeacon diseñada para
emparejarse perfectamente a una diana mutante o al alelo alternativo
del SNP. Cuando se consideran dos SNP independientes, la baliza
hibridada a la molécula diana puede estar bien (i) perfectamente
emparejada, (ii) poseer emparejamiento incorrecto en una sola base o
(iii) poseer emparejamientos incorrectos en múltiples bases.
Figura 2: Discriminación del SNP usando la
cantidad de fluorescencia. La HyBeacon B9414 se hibridó a
oligonucleótidos perfectamente emparejados (i) y a oligonucleótidos
con emparejamiento incorrecto en una sola base (ii) y también se
estudió en ausencia de diana (iii). a) Perfiles de fusión derivados
de la HyBeacon B94141. A temperaturas inferiores a 42ºC y encima de
52ºC, la cantidad de fluorescencia emitida por la sonda hibridada a
dianas emparejadas e incorrectamente emparejadas es muy similar. No
obstante, entre estas temperaturas, la cantidad de fluorescencia
emitida por la sonda totalmente complementaria es significativamente
superior a la emisión de fluorescencia de la HyBeacon
incorrectamente emparejada. b) Las reacciones se desnaturalizaron y
se enfriaron rápidamente hasta 46ºC para adquisición de la
fluorescencia. Se observan agregación significativa con los
tratamientos y diferencias estadísticas entre los tratamientos, de
modo tal que la sonda hibridada a una diana emparejada emite una
fluorescencia significativamente mayor que la diana HyBeacon
hibridada a una diana incorrectamente emparejada, lo que a su vez
emite más fluorescencia que la baliza de hibridación en ausencia de
una diana. c) La HyBeacon en ausencia de diana no genera picos de
fusión. La B9414 produce curvas de fusión que poseen Tm de
aproximadamente 52ºC y 44ºC en presencia de dianas emparejadas e
incorrectamente emparejadas respectivamente, lo que permite una
discriminación confiable de los SNP.
Figura 3: Comparación de sondas HyBeacon F y
F-Q. Se hibridaron las balizas de hibridación
NAT2 F17834 (F-Q) y 0203002 (F) a un
oligonucleótido perfectamente emparejado. Las HyBeacon F y
F-Q poseen una secuencia nucleotídica idéntica y
generan picos de alta calidad con Tm de aproximadamente 60ºC en los
análisis de fusión. Debido a la falta de un resto extintor, las
HyBeacon F emiten mayores cantidades de fluorescencia de fondo en
comparación con las sondas F-Q.
Figura 4: Análisis de fusión de polimorfismos
InDel. Se hibridó la sonda TB0993 NAT2 *4 a una serie de dianas
oligonucleotídicas para determinar si las balizas de hibridación
tienen el potencial de discriminar los polimorfismos de inserción y
deleción. Se compararon una diana emparejada (M), 3 oligonucleótidos
que contenían inserciones de nucleótidos simples
(1-3) y 3 oligonucleótidos que contenían deleciones
de nucleótidos simples (4-6). Se realizó el análisis
de fusión para cada dúplex HyBeacon/diana. En todos los casos, la
sonda emparejada generó curvas de fusión con Tm mayores que las
reacciones InDel incorrectamente emparejadas, de modo que los SNP
se pueden discriminar en base a la Tm del pico de fusión. a)
Oligonucleótidos de inserción. b) Oligonucleótidos de deleción. c)
Demuestra que los SNP también se pueden discriminar en base a la
cantidad de emisión de fluorescencia, donde la baliza emparejada
emite más fluorescencia que la hibridación a todos los
emparejamientos incorrectos InDel.
Figura 5: Discriminación de SNP en un formato
heterogéneo. Se emplearon las sondas HyBeacon F y
F-Q para discriminar dianas que contenían el
polimorfismo CYP2D6 *3, donde las dianas de ADN empleadas
fueron productos PCR de 119bp aislados. Las sondas F (2D63B) y
F-Q (2D63A) son secuencias nucleotídicas idénticas,
perfectamente emparejadas al alelo *1 del gen CYP2D6 y que
poseen un error de emparejamiento en una sola base cuando se
hibridan al alelo *3. a) La sonda F-Q 2D63A genera
picos de fusión con Tm de aproximadamente 65ºC y 56ºC cuando se
hibrida a dianas emparejadas e incorrectamente emparejadas
respectivamente. b) La HyBeacon F 2D63B produce picos de fusión con
Tm de aproximadamente 65ºC y 58ºC cuando se hibrida a las dianas PCR
*1 y *3 respectivamente.
Figura 6: Detección homogénea de secuencias
de ADN. Detección de la secuencia CYP2D6*1 en muestras de
ADN genómico (1) y saliva (2) usando la sonda HyBeacon 2D64C* para
controlar la acumulación en tiempo real de producto PCR. La cantidad
de fluorescencia emitida de las sondas HyBeacon se correlaciona con
la amplificación de secuencias diana específicas. Las reacciones de
control (3) que no contienen ADN molde o producto amplificado
tampoco exhiben niveles elevados de emisión de fluorescencia durante
la PCR.
Figura 7: Discriminación de SNP en un formato
homogéneo. Se empleó la sonda HyBeacon F 0203002, perfectamente
emparejada a la secuencia NAT2 *4, para discriminar los SNP
*4 y *5A en ensayos LightCycler homogéneos. a) Los SNP se
discriminaron de manera confiable a través de amplificación por PCR
en "tiempo real", donde únicamente las reacciones que contenían
el molde *4 emparejado produjeron incrementos significativos en la
emisión de fluorescencia. b) Los SNP también se discriminaron
post-amplificación, por análisis de fusión, donde
los alelos *4 emparejados generaron picos de fusión con Tm
significativamente mayores que las secuencias diana *5A
incorrectamente emparejadas. El análisis de punto final de los
productos amplificados permite la validación de los datos en
"tiempo real".
Figura 8: Discriminación en tiempo real del
polimorfismo CY2D6*4: Se empleó la HyBeacon 2D64C* para
detectar y discriminar los alelos *1 y *4 del gen CYP2D6. Las
secuencias polimorfas se amplificaron a partir de los plásmidos
pGEM-T que contenían el alelo *1 (1), y el alelo *4
(2). Se empleó una mezcla de los plásmidos *1 y *4 para simular ADN
heterocigótico (3). Se incluyeron también reacciones de control sin
molde (C) en el análisis. Únicamente aquellas reacciones que
contienen el alelo *1 (es decir, muestras 1 y 3) generan incrementos
en la emisión de fluorescencia durante la amplificación por PCR en
tiempo real. Las muestras homocigóticas *4 y los controles sin molde
no producen señales fluorescentes elevadas. Las muestras que son
heterocigóticas para los alelos *1 y *4 hacen que se generen
cantidades intermedias de fluorescencia durante la
amplificación.
Figura 9: Discriminación de alelos
CYP2D6 *1 y *4 por análisis de pico de fusión. Se
amplificaron dianas polimorfas de muestras de ADN genómico y los
picos de fusión aquí exhibidos derivaron del análisis
post-amplificación de las muestras 1 (*4
homocigóticas), 2 (*1 homocigótica) y 3 (ADN heterocigótico). La
HyBeacon 2D64C* es totalmente complementaria al alelo *1 del gen
CYP2D6 y genera picos de fusión únicos que poseen Tm de 49ºC
y 60ºC con muestras *4/*4 y *1/*1 homocigóticas respectivamente. Las
muestras heterocigóticas, que poseen ambos alelos *4 y *1, generan
indicios que poseen picos de fusión a 49ºC y 60ºC.
Figura 10: Identificación de heterocigocidad
que usa las HyBeacon F-Q. Se requirieron dos
HyBeacon F-Q, perfectamente emparejadas a ambos
alelos de un SNP para distinguir muestras homocigóticas (que
contenían únicamente un alelo de un polimorfismo) de muestras
heterocigóticas (que contenían ambos alelos). Las HyBeacon F17834 y
F17835 están perfectamente emparejadas a los alelos *4 y *5A del
gen NAT2 respectivamente. Las F17834 y F17835 poseen Tm
significativamente diferentes para distinguir las sondas marcadas
con FAM. a) La F17834 genera picos de fusión que poseen Tm de
aproximadamente 60ºC y 54ºC en presencia de alelos homocigóticos *4
y *5A respectivamente. b) La F17835 genera picos de fusión que
poseen Tm de aproximadamente 52ºC y 49ºC en presencia de alelos
homocigóticos *5A y *4 respectivamente. c) Las reacciones que
contienen HyBeacon F17834 o F17835 producen únicamente picos de
fusión emparejados en presencia de ADN heterocigótico. Las
reacciones que contienen ambas sondas producen indicios de fusión
que poseen Tm de aproximadamente 59ºC y 52ºC en presencia de una
mezcla de alelos *4 y *5A. La presencia de dos picos dentro de un
solo indicio de fusión permite la identificación de muestras
heterocigóticas.
Figura 11: Análisis de heterocigocidad que
usa HyBeacon F. La HyBeacon DdeFL1, que está perfectamente
emparejada a la secuencia polimorfa NAT2 *5C, se utilizó para
ensayar el potencial de las HyBeacon F para discriminar muestras
heterocigóticas. a) Las muestras homocigóticas analizadas con DdeFL1
generan indicios de fusión que poseen un solo pico. La sonda DdeFL1
se hibridó a dianas PCR homocigóticas *5C y *4, en ensayos
heterogéneos, generando curvas de fusión de 54ºC y 47ºC
respectivamente. b) Las reacciones que contienen HyBeacon DdeFL1 y
una mezcla de dianas emparejadas e incorrectamente emparejadas
generan curvas que poseen ambos picos de 54ºC y 47ºC en el mismo
indicio de fusión. La presencia de dos picos en un indicio de fusión
permite la identificación de muestras heterocigóticas.
Figura 12: Limitaciones del análisis
múltiplex HyBeacon. Para examinar el potencial del análisis
múltiplex
HyBeacon, la sonda HyBeacon 2D64B se incluyó en reacciones que contenían tanto moldes PCR específicos como no específicos. Los moldes PCR comprendían una mezcla de ADN específico (CYP2D6) y no específico (NAT2), de modo tal que la proporción de molde específico varió entre 100% y 5%. a) Las reacciones contenían cebadores CYP2D6 pero carecían de cebadores NAT2, de modo tal que se produjeron las únicas dianas específicas. Se observó una pequeña variación en el punto de cruce a medida que se reducía la concentración de la diana específica. No obstante, las eficacias de amplificación y detección fueron comparables entre las reacciones. b) Las reacciones contenían cebadores CYP2D6 y NAT2, de modo tal que se generaron dianas específicas y no específicas. Se observaron reducciones significativas en las eficacias de amplificación y detección a medida que se reducía la proporción de diana específica.
No obstante, los resultados sugieren que pueden ser posibles reacciones múltiplex que contengan hasta 4 ó 5 dianas.
HyBeacon, la sonda HyBeacon 2D64B se incluyó en reacciones que contenían tanto moldes PCR específicos como no específicos. Los moldes PCR comprendían una mezcla de ADN específico (CYP2D6) y no específico (NAT2), de modo tal que la proporción de molde específico varió entre 100% y 5%. a) Las reacciones contenían cebadores CYP2D6 pero carecían de cebadores NAT2, de modo tal que se produjeron las únicas dianas específicas. Se observó una pequeña variación en el punto de cruce a medida que se reducía la concentración de la diana específica. No obstante, las eficacias de amplificación y detección fueron comparables entre las reacciones. b) Las reacciones contenían cebadores CYP2D6 y NAT2, de modo tal que se generaron dianas específicas y no específicas. Se observaron reducciones significativas en las eficacias de amplificación y detección a medida que se reducía la proporción de diana específica.
No obstante, los resultados sugieren que pueden ser posibles reacciones múltiplex que contengan hasta 4 ó 5 dianas.
Figura 13: Análisis múltiplex HyBeacon.
a) Se amplificaron y detectaron simultáneamente dianas NAT2
*4 y CYP2D6 *1 en un único pocillo de una placa de
microvaloración que usa sondas marcadas con FAM (BamFL1) y HEX
(2D64E) respectivamente. Solamente las reacciones que contienen ADN
genómico y secuencias totalmente complementarias a las sondas
HyBeacon exhibieron niveles de emisión de fluorescencia en toda la
amplificación. Las reacciones con control negativo no generan
incrementos en la emisión de fluorescencia. b) Los picos de fusión
derivaron de sondas marcadas con FAM, HEX y TET usando el
instrumento ABI PRISM 7700 y un Excel macro. Los picos de fusión
aquí exhibidos derivaron de la hibridación de la sonda a
oligonucleótidos complementarios.
Figura 14: Efecto de la concentración de
MgCl_{2} en la Tm de la HyBeacon. La baliza de hibridación
F17834 se hibridó a un oligonucleótido totalmente complementario en
una serie de concentraciones de MgCl_{2}, variando de 0 mM a 50
mM. Se ha demostrado que la Tm de la baliza de hibridación aumenta a
medida que se eleva la concentración de MgCl_{2}. a) Ilustra las
curvas de fusión de la baliza de hibridación derivadas de reacciones
que contienen: MgCl_{2} 0 mM, 0,001 mM, 0,005 mM, 0,01 mM, 0,05
mM, 0,1 mM, 0,2 mM, 0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM, 0,6 mM, 0,7 mM, 0,8 mM,
0,9 mM, 1 mM, 1,5 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 7 mM, 10 mM y 50 mM
(de izquierda a derecha respectivamente). b) Demuestra la
correlación positiva que existe entre la concentración de MgCl_{2}
y la Tm de la HyBeacon. Cuando la Tm de la baliza de hibridación se
traza contra el log de la concentración de MgCl_{2}, se observa
una relación lineal dentro de un intervalo de concentración definido
(en este caso entre 0,1 mM y 10 mM). El análisis de regresión lineal
efectuado en este conjunto de datos generó un valor R^{2} de
99,4%.
Figura 15: Generación de un tampón PCR de
HyBeacon - Efecto de BSA. Exhibe los datos de PCR en tiempo real
y los resultados de la fusión post-amplificación
derivados de una serie de tampones PCR, usando NAT2 *5A
HyBeacon (NAT2*5) para supervisar la amplificación de la diana. Se
añadió una gama de concentraciones de BSA a un tampón PCR diseñado
para análisis HyBeacon: 1) 0 ng/\mul, 2) 1 ng/\mul, 3) 2,5
ng/\mul, 4) 5 ng/\mul, 5) 7,5 ng/\mul y 6) 10 ng/\mul.
También se analizó tampón PCR TaKaRa Z-Taq
(7) para comparación. Las concentraciones de BSA mayores que 2,5
ng/\mul mejoran la eficacia de la amplificación de la diana en los
análisis de tiempo real, de modo tal que la magnitud del incremento
de la fluorescencia es superior para el tampón TaKaRa en esta
instancia. La calidad de los picos de fusión derivados del análisis
HyBeacon es superior en concentraciones inferiores de BSA. Las
concentraciones mayores de BSA disminuyen la calidad de fusión
generando "salientes" en los picos y aumentando el ancho del
pico. La concentración óptima de BSA en análisis de amplificación en
tiempo real y post-amplificación parecer estar entre
2,5 ng/\mul y 5 ng/\mul.
Figura 16: Eficacia en la discriminación del
SNP y el tamaño del amplicón. Se ha demostrado que el tamaño y
la posición de los amplicones diana tienen efectos importantes en la
eficacia de los ensayos de SNP HyBeacon homogéneos y heterogéneos.
Se compararon dos conjuntos de cebadores, amplificando productos
NAT2 *4 (flanqueando el SNP *6) que difieren en tamaño por
22bp, en experimentos de análisis de curvas de fusión heterogéneos.
a) El producto NAT2 de 103bp, amplificado a partir de
cebadores TaqF y TaqR, no genera ningún pico de fusión en ensayos
heterogéneos que contienen HyBeacon F17836. b) No obstante, el
producto NAT2 *4 de 81bp, amplificado a partir de cebadores
TaqF2 y TaqR2, genera curvas de fusión emparejadas e incorrectamente
emparejadas con la sonda F17836. Se detectaron muestras de 103bp y
81bp en geles de agarosa, lo que confirma que la similitud de los
amplicones se debe a variaciones en la hibridación de la sonda y no
a diferencias en la eficacia de amplificación.
Figura 17: Discriminación del SNP usando
amplificación de diana asimétrica. Las eficacias de la detección
y discriminación de SNP de dianas mediadas por HyBeacon se
compararon en formatos de ensayo PCR simétricos y asimétricos. Ambos
tipos de amplificación por PCR únicamente generan incrementos en la
señal de fluorescencia en presencia de una diana emparejada. Se
compararon ocho HyBeacon; cuatro de ellas exhibieron eficacias
equivalentes entre los métodos de amplificación simétricos y
asimétricos (no se muestran datos). a) La sonda HyBeacon F17836 tuvo
una eficacia de detección significativamente reducida cuando se
empleó en ensayos asimétricos. b) Mientras que otras tres HyBeacon
exhibieron cantidades mayores de incremento en fluorescencia por
amplificación asimétrica en comparación con aquella generada por la
amplificación simétrica (como se demuestra con la sonda 2D64B).
Figura 18: Discriminación del SNP usando
balizas de hibridación y el instrumento DASH. La baliza de
hibridación F17832, que es totalmente complementaria al alelo
NAT2 *4 del polimorfismo *5A, se utilizó para discriminar las
dianas polimorfas *4 y *5A inmovilizadas en una fase sólida. La
baliza de hibridación es totalmente complementaria e incorrectamente
emparejada cuando se hibrida a las secuencias *4 y *5A
respectivamente. La hibridación emparejada e incorrectamente
emparejada genera curvas de fusión que poseen Tm de aproximadamente
66ºC y 60ºC respectivamente. Establecer zonas emparejadas e
incorrectamente emparejadas para la baliza de hibridación permite la
clasificación automática de muestras que usan el software DASH.
Figura 19: Discriminación del SNP usando ADN
polimerasas que carecen de actividad de la
5'-3'-exonucleasa. Se
amplificaron los alelos NAT2 *4 y *5A con polimerasas de ADN
que poseen (Taq) y carecen de actividad de
5'-3' exonucleasa (Deep Vent y fragmento Stoffel),
para examinar si se requiere que la digestión de la sonda HyBeacon F
genere incrementos en la emisión de fluorescencia. Se utilizó la
HyBeacon F 0203002 para detectar la amplificación y discriminar los
SNP. a) Comparación de polimerasas Taq (1) y Deep Vent (2)
que amplifican la secuencia *4 totalmente complementaria. Ambas
polimerasas generan incrementos en "tiempo real" en la emisión
de fluorescencia con el molde emparejado mientras que las reacciones
que contienen molde *5A con emparejamiento incorrecto no producen
incrementos en la emisión de fluorescencia (3). b) Comparación de
polimerasas Taq (1) y fragmento Stoffel (2) que amplifican el
alelo *4 totalmente complementario. Ambas polimerasas generan
incrementos en "tiempo real" en la emisión de fluorescencia en
presencia de un molde *4 emparejado pero las reacciones que
contienen únicamente el alelo *5A con emparejamiento incorrecto no
producen incrementos en la emisión de fluorescencia (3).
Figura 20: PCR cuantitativa en "tiempo
real" que usa sonda HyBeacon. a) Se realizaron ensayos
homogéneos en "tiempo real" usando la HyBeacon 2D64B para
supervisar la amplificación de una secuencia CYP2D6. Se
analizó una gama de concentraciones de ADN conocidas: 1) 41,5 x
10^{9} attogramos por microlitro (ag/\mul), 2) 41,5 x 10^{8}
ag/\mul, 3) 41,5 x 10^{7} ag/\mul, 4) 41,5 x 10^{6}
ag/\mul, 5) 41,5 x 10^{5} ag/\mul, 6) 41,5 x 10^{4}
ag/\mul, 7) 41,5 x 10^{3} ag/\mul, 8) 41,5 x 10^{2}
ag/\mul y 9) 415 ag/\mul. Se midieron los puntos de cruce para
cada concentración de ADN. b) Las curvas estándar se construyeron
trazando la concentración logarítmica de ADN contra el punto de
cruce. Se utilizaron las curvas estándar para cuantificar las
concentraciones de ADN presentes en las muestras de reacción
"desconocidas".
Figura 21: Análisis homogéneo de saliva en
tiempo real. Se llevó a cabo la detección y discriminación de
dianas polimorfas NAT2 *4 y *5C por PCR en tiempo real y
metodologías de análisis de fusión. La HyBeacon DdeFL1, que es
totalmente complementaria al alelo *5C del gen NAT2, se
utilizó para genotipificar tres muestras de saliva (1, 2 y 5). Se
incluyó una reacción de control sin molde (C) en el análisis. a) Los
incrementos en la señal fluorescente únicamente se generan en
reacciones PCR homogéneas en presencia del alelo *5C. Por lo tanto,
las reacciones que no son homocigóticas ni heterocigóticas para el
alelo *5C (es decir, las muestras 1 y 5 respectivamente) generan
incrementos significativos en la señal fluorescente, mientras que
las reacciones homocigóticas para el alelo *4 (muestra 2) no
producen incrementos en la señal fluorescente. Las muestras
heterocigóticas, que poseen ambos alelos *5C y *4, producen
cantidades intermedias de fluorescencia que se han de generar
durante la amplificación. b) La sonda DdeFL1 genera picos de fusión
únicos, que poseen Tm de 47,6ºC y 54,1ºC, cuando se hibridan a ADN
*4 y *5C homocigótico respectivamente. Las muestras heterocigóticas
generan indicios que poseen picos de fusión de 47,6ºC y 54,1ºC,
mientras que las reacciones que carecen de ADN diana no generan
ninguno de los dos picos.
Figura 22: Análisis de picos de fusión con
HyBeacon de ADN amplificado de saliva. Se empleó la HyBeacon
DdeFL1*4, que es totalmente complementaria al alelo *4 del gen
NAT2, para genotipificar muestras de saliva con respecto al
polimorfismo *5C. a) La muestra de saliva 1 es homocigótica para el
alelo *5C ya que la hibridación HyBeacon produce un único pico de
fusión incorrectamente emparejado que posee una Tm de 42,6ºC. b) La
muestra de saliva 3 es heterocigótica para los alelos *5C y *4 ya
que se generan dos picos durante el análisis de fusión. c) La
muestra de saliva 2 es homocigótica para el alelo *4 ya que la
hibridación de la sonda produce un único pico de fusión emparejado
que posee una Tm de 52,6ºC.
Figura 23: Análisis de saliva RFLP. Se
efectuó el análisis de polimorfismo en la longitud de los fragmentos
de restricción para los productos PCR NAT2 *4 y *5C
amplificados a partir de muestras de saliva. La Banda M es una
escalera de 10bp (GIBCO BRL). La digestión de la enzima de
restricción permite que las muestras 1-3 sean
tipificadas como *5C/*5C, *4/*4 y *4/*5C respectivamente.
Las sondas HyBeacon fueron diseñadas para
hibridarse a diez SNP ubicados en el gen de
N-acetiltransferasa 2 (NAT2) humano (véase
tabla 1) y en los genes que codifican el citocromo P450 (CYP)
(véanse tablas 2 y 3). Las sondas han sido diseñadas de modo tal que
los nucleótidos polimorfos están ubicados hacia el centro de las
secuencias HyBeacon. Todas las sondas HyBeacon tienen
aproximadamente 20 nucleótidos de longitud y poseen restos
fluoróforos unidos a los residuos uracilo internos (que reemplazan a
la timina en las secuencias de ADN). Los tintes fluorescentes
6-carboxifluoresceína (FAM), tetraclorofluoresceína
(TET) y hexaclorofluoresceína se unieron a los residuos U mediante
químicas nuevas (comercializadas por Oswel DNA services,
Southampton, Reino Unido) y se evaluaron seis químicas de ligamiento
de fluoróforos (FAM propo dU, FAM propargyl dU, dU C6 FAM, dU FAM,
FAM cap prop dU y FMOC dU). Se descubrió que los fluoróforos dU C6
FAM y FMOC dU generan datos levemente superiores y se les dio
preferencia de uso. En las HyBeacon F-Q, los restos
extintores (Rojo metilo) también se ubicaron en residuos U internos,
donde se han ensayado las HyBeacon con 1, 3, 5, 6, 7, 8 y 9 residuos
nucleotídicos que separan las moléculas fluoróforo y extintor. Se
investigaron las HyBeacon F-Q que poseen moléculas
fluoróforo y extintor flanqueadoras y no flanqueadoras del
nucleótido polimorfo. La mayoría de las HyBeacon sintetizadas poseen
un fosfato 3' o componente octanodiol para prevenir la extensión
mediada por Taq de las HyBeacon cuando las sondas se
incorporan a ensayos PCR en tiempo real. Las HyBeacon F y
F-Q han sido diseñadas para emparejarse
perfectamente a un alelo de NAT2 y secuencias polimorfas
CYP, de modo tal que la otra variante de un SNP creara una
posición de emparejamiento incorrecto tras la hibridación de la
sonda. Las sondas HyBeacon, totalmente complementarias a ambos
alelos, se sintetizaron para cada SNP bialélico.
Secuencia polimorfa NAT2 (Secuencia ID No. 60).
Secuencia del gen humano para arilamina
N-acetil-traferasa 2 (NAT2). Las
posiciones que contienen polimorfismos de un solo nucleótido (SNP)
se muestran en letra negrita. Los polimorfismos de longitud de
fragmento de restricción existen en las posiciones 481 (*5A), 590
(*6), 803 (*5C) y 857 (*7A).
Se amplificaron dianas polimorfas de saliva
(diluida con agua al 50%), ADN genómico aislado de muestras de
sangre de referencia (Universidad de Dundee), ADN genómico de
placenta humana (Sigma-Aldrich) o plásmidos
pGEM-T (Promega) que contenían productos NAT2
y CYP amplificados. Se evaluaron diversos pares de cebadores,
generando amplicones NAT2 y CYP de diferentes tamaños
y posiciones relativas a los sitios polimorfos. Por ejemplo, los
pares de cebadores óptimos utilizados para amplificar las secuencias
polimorfas NAT2*5A, NAT2*5C, NAT2*6, NAT2*7A,
CYP2D6*3 y CYP2D6*4 fueron 195991/195993, DdeF2/DdeR,
TaqF2/TaqR2, BamF2/BamR, 2D63F/2D63R y 2D64F2/2D64R2 respectivamente
(tabla 4). Se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) estándar para amplificar fragmentos de ADN de aproximadamente
80-150bp que contenían los nucleótidos polimorfos.
Los ensayos de detección de dianas y discriminación de SNP se
llevaron a cabo en formatos heterogéneos y homogéneos.
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Los volúmenes de PCR fueron típicamente 30
\mul, que contenían aproximadamente 200 ng de molde de ADN, 1x
tampón PCR (Pharmacia), 0,5 \muM cada cebador, 1 unidad de
polimerasa Taq (Amersham Pharmacia Biotech) y dNTPs 1 mM
(Amersham Pharmacia Biotech). Siguiendo una etapa de reacción de
desnaturalización (94ºC, 5 min), las dianas de PCR se amplificaron
usando 40 ciclos que comprendían desnaturalización (94ºC, 30 s),
ablandamiento del cebador (50ºC, 1 min) y extensión de productos
(72ºC, 1 min). Después de la amplificación, los productos PCR se
precipitaron con 0,1 volúmenes de acetato sódico 3 M y 2 volúmenes
de etanol. Después de 10 minutos de incubación a -20ºC, 30 minutos a
centrifugación a 13.000 r.p.m. y dos etapas de lavado con etanol al
70%, se resuspendieron los sedimentos 1 X en una mezcla de tampón de
hibridación/sonda (Tris 50 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 3 mM, HyBeacon
apropiada), donde se añadieron 5 \mul de mezcla de tampón/sonda
por reacción PCR inicial. Las HyBeacon F-Q se
utilizaron típicamente a concentraciones entre 500
nM-1 \muM, mientras que las HyBeacon F se
utilizaron a concentraciones entre 100 nM y 300 nM. Los volúmenes de
reacción de 5 \mul se analizaron con LightCycler™ (Roche) usando
un programa de análisis de curvas de fusión. El análisis de
hibridación comprendió una lectura de fluorescencia inicial (30ºC
durante 30 s), hibridación (94ºC durante 1 min seguida de 30ºC
durante 2 min), normalización (65ºC durante 1 s, 85ºC durante 1 s,
30ºC 1 s) y análisis de fusión (30ºC a 95ºC, con un índice de
transición de 0,1ºC/s). A excepción de la normalización, que utilizó
adquisiciones de fluorescencia únicas, la fluorescencia se controló
continuamente. Las curvas de fusión se construyeron empleando el
software LightCycler, trazando el derivado negativo de fluorescencia
con respecto a temperatura (-dF/dT en el eje y) contra temperatura
(eje x).
Los volúmenes de PCR fueron 20 \mul, que
contenía 2 \mul de 50% saliva o aproximadamente 200 ng de ADN
genómico, 1x tampón Z-Taq™ (TaKaRa) o 1x
tampón PCR HyBeacon (Tris. Cl 10 mM, pH 8,8, KCl 25 mM, MgCl_{2}
3,5 mM, 5 ng/\mul BSA), cebadores 0,5 \muM, 1 unidad de
polimerasa Taq (Amersham Pharmacia Biotech) y dNTPs 1 mM. Los
ensayos PCR en "tiempo real", que utilizaron sondas
fluorescentes para controlar la acumulación de la diana amplificada,
también contenían 500-1000 nM o
100-300 nM adicionales de las HyBeacon
F-Q y F apropiadas respectivamente. Las secuencias
diana polimorfas se amplificaron con los instrumentos LightCycler™
(Roche) y el detector de secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied
Biosystems). Las reacciones, efectuadas en los capilares
LightCycler, se desnaturalizaron por incubación a 95ºC durante 1 min
(ADN genómico y plásmido) o 5-10 min (muestras de
saliva), antes de la amplificación de dianas polimorfas usando
40-50 ciclos, que comprendían desnaturalización
(95ºC, 0 s), ablandamiento de cebador (Faq 10 s) y extensión de
productos (72ºC, 10 s). La adquisición de fluorescencia se llevó a
cabo al final de cada etapa de ablandamiento del cebador. La
temperatura de adquisición de fluorescencia (Faq) varía entre los
amplicones y las HyBeacon, donde Faq se encuentra aproximadamente a
mitad de camino entre las Tm de sondas con emparejamiento y con
emparejamiento incorrecto (véase tabla 5). Por ejemplo, los ensayos
HyBeacon 2D64C* emplean una Faq de 57ºC para discriminar los SNP
CYP2D6 *1 y *4 por amplificación en tiempo real. Después de
la amplificación, las reacciones se desnaturalizaron (95ºC, 0 s) y
enfriaron (35ºC, 2 min) antes del análisis de fusión (35ºC a 95ºC,
con un índice de transición 0,1ºC/s), donde la fluorescencia se
adquirió continuamente. Los picos de fusión se construyeron
empleando el software LightCycler, trazando el derivado negativo de
fluorescencia con respecto a temperatura (-dF/dT en el eje y) contra
temperatura (eje x).
Se utilizó PCR asimétrica para generar moléculas
diana de ADN monocatenario para la hibridación de la sonda. Las
amplificaciones se llevaron a cabo en capilares LightCycler. Se
emplearon cebadores antisentido para amplificar el producto
monocatenario que contenía la secuencia de ADN homóloga requerida
para la hibridación HyBeacon. Se implicaron cebadores sentido en la
amplificación inicial de ADN bicatenario para generar la cadena que
no contenía el sitio de unión a la sonda. Se utilizaron típicamente
cebadores antisentido y sentido en una relación de 50:1. Se
utilizaron plásmidos pGEM-T que contenían dianas
NAT2 y CYP2D6 polimorfas como moldes de PCR. Los
volúmenes de reacción de PCR fueron típicamente 20 \mul, que
contenía aproximadamente 200 ng de ADN plásmido, 1x tampón PCR
Z-Taq™ (TaKaRa), 0,5 \muM cebador
antisentido, cebador sentido 10 nM, 1 unidad de polimerasa
Taq (Amersham Pharmacia Biotech), dNTPs 1 mM (Amersham
Pharmacia Biotech) y la baliza de hibridación apropiada. La
amplificación homogénea y el análisis de los picos de fusión se
realizaron tal como se describió previamente.
La amplificación por PCR se llevó a cabo tal
como se describió anteriormente para los ensayos heterogéneos, con
la excepción de que el cebador antisentido se biotiniló en el
extremo 5'. Tras la amplificación, se añadieron
10-15 \mul de producto PCR biotinilado a pocillos
individuales de placas de microvaloración recubiertas con
estreptavidina (Hybaid). Se añadió tampón Gold DASH 1x (Hybaid) a
cada pocillo para producir un volumen final de 50 \mul. Después de
1 hora de incubación a temperatura ambiente, la disolución se
eliminó de cada pocillo. Se añadieron 50 \mul de NaOH 0,1 M a los
pocillos para desnaturalizar el ADN bicatenario. Después de 5
minutos de incubación, los pocillos se lavaron una vez con 50 \mul
de NaOH 0,1 M y dos veces con 50 \mul de tampón 1x DASH para
eliminar la cadena de ADN no biotinilado. Se añadió un exceso de
HyBeacon (>1 \muM) en tampón DASH 1x (2 \mul sonda + 48
\mul tampón) a cada pocillo. Las sondas se hibridaron a ADN
monocatenario inmovilizado calentando las reacciones hasta 95ºC
durante 1 minuto, luego enfriando hasta 25ºC a un índice aproximado
de 0,08ºC/seg. La disolución y la sonda no hibridada se quitaron de
los pocillos y se reemplazaron con 50 \mul de tampón DASH nuevo
1x. El análisis de fusión de la sonda hibridada se llevó a cabo en
un instrumento DASH (Hibridación Específica de Alelos Dinámicos)
(Hybaid) usando índices de transición de temperatura entre
0,02-0,07ºC/seg.
Se llevaron cabo reacciones que contenían
múltiples pares de cebadores y sondas HyBeacon usando el detector de
secuencias ABI PRISM® 7700. Las dianas polimorfas NAT2*4 (*7A
locus), NAT2*4 (*5C locus) y CYP2D6*1 se amplificaron
y detectaron usando sondas HyBeacon marcadas con FAM, TET y HEX
respectivamente (tabla 4). Después de la etapa de reacción de
desnaturalización (95ºC, 5 min), se amplificaron dianas polimorfas
de ADN genómico, usando 40 ciclos, que comprendían desnaturalización
(95ºC, 15 s), ablandamiento del cebador (50ºC, 30 s) y extensión de
productos (72ºC, 30 s). La adquisición de fluorescencia se llevó a
cabo durante cada etapa de ablandamiento del cebador de
amplificación.
Se ha demostrado que el locus
N-acetiltransferasa 2 (NAT2) humano es
polimorfo. Se sabe que las copias defectuosas del gen NAT2
producen la acetilación lenta de diversos fármacos y toxicante de
arilamina. Los estudios epidemiológicos han asociado este fenotipo
de acetilación lenta con un riesgo de cáncer de vejiga y
colorrectal. El análisis de los locus NAT2 polimorfos
identificó una serie de alelos lentos, que contenía sustituciones de
nucleótidos (véase Tabla 1). Estas sustituciones incluyen mutaciones
puntuales en las posiciones 481 (C a T), 590 (G a A), 803 (A a G) y
857 (G a A), que producen los polimorfismos de longitud de
fragmentos de restricción *5A, *6, *5C y *7A (RFLP) respectivamente.
En cada uno de estos locus polimorfos, *1 es la variante alélica
que ocurre más frecuentemente en genomas humanos.
La enzima del Citocromo P450 (debrisoquina
4-hidroxilasa), codificada por genes tales como
CYP2D6, CYP2C9 y CYP2C19 en seres humanos, es
responsable del metabolismo de más de 30 fármacos comúnmente
recetados, incluyendo agentes antidepresivos, antiarrítmicos y
antihipertensivos. Aproximadamente 5-10% de los
caucásicos exhiben un fenotipo de metabolismo deficiente debido a la
actividad deficiente de la enzima del citocromo P450. Se han
identificado muchas variantes alélicas en el locus del gen
CYP2D6, siendo las más comunes los polimorfismos de un solo
nucleótido CYP2D6*3 (también conocido como CYP2D6A) y
*4 (también conocido como CYP2D6B). Se ha demostrado que las
personas que poseen los genotipos *3 y *4 poseen fenotipos de
actividad enzimática deficiente.
Se han empleado los polimorfismos NAT2 y
CYP para ensayar el potencial de las balizas de hibridación
de detectar secuencias de ADN específicamente amplificadas y de
discriminar dianas que contienen polimorfismos de un solo
nucleótido.
Cuando se hibrida una sonda HyBeacon a una
secuencia diana, la interacción puede ser bien perfectamente
emparejada o incorrectamente emparejada. La Figura 1 ilustra las
diferencias entre dúplex emparejados, emparejados con error y
emparejados con doble error, clasificando cada tipo de interacción.
Las sondas HyBeacon se hibridaron a oligonucleótidos perfectamente
emparejados e incorrectamente emparejados y se analizaron en un
LightCycler. Cuando se compararon las cantidades de fluorescencia
emitida desde las HyBeacon en los estados monocatenario y
bicatenario, se observó que se emitía significativamente más
fluorescencia cuando las sondas se hibridaban a moléculas diana que
cuando estaban libres en disolución. Estas diferencias en la emisión
de fluorescencia, generadas por sondas HyBeacon monocatenarias y
bicatenarias, fueron estadísticamente significativas (p<0,01 en
ANOVA de un solo factor) y proporcionaron un método mediante el cual
se podría detectar la presencia de ADN diana por cuantificación de
fluorescencia (figura 2).
El control de los cambios en la emisión de
fluorescencia por alteraciones de la temperatura y el estado de
hibridación de la sonda permite la generación de picos de fusión con
HyBeacon/pares homólogos. Las sondas HyBeacon hibridadas a
oligonucleótidos incorrectamente emparejados producen curvas de
fusión con Tm reducidas en comparación con sondas hibridadas a
moléculas diana totalmente complementarias. La Figura 2 demuestra la
hibridación diferencial de una HyBeacon NAT2 *4 (en el SNP
*5A) a dianas oligonucleotídicas emparejadas e incorrectamente
emparejadas. Las regiones de emparejamiento incorrecto reducen la Tm
de la sonda y permiten la discriminación de dianas polimorfas a
través del análisis de los picos de fusión. Las dianas emparejadas,
emparejadas incorrectamente con un solo error y emparejadas
incorrectamente con múltiples errores pueden discriminarse
confiablemente por la Tm de los picos de fusión. A su vez, la
adquisición de fluorescencia efectuada a mitad de la temperatura
entre Tm emparejadas e incorrectamente emparejadas permite la
discriminación de dianas polimorfas en base a la cuantificación de
la fluorescencia. En la temperatura de adquisición de fluorescencia,
la HyBeacon emparejad se hibrida a su diana y emite más
fluorescencia que una sonda incorrectamente emparejada que se ha
fundido de su diana (figura 2).
En disolución, las HyBeacon únicamente emiten
pequeñas cantidades de fluorescencia de fondo. No obstante, tras
unirse a secuencias diana, se emite una cantidad significativamente
mayor de fluorescencia como resultado directo de la hibridación. Se
ha demostrado que las secuencias que difieren por tan solo un
nucleótido pueden distinguirse por (i) la cantidad de fluorescencia
producida cuando la molécula baliza de hibridación se hibrida a su
secuencia diana y (ii) la temperatura de fusión (Tm) del dúplex
sonda/diana.
Los métodos de cuantificación de la
fluorescencia y análisis de fusión se llevaron a cabo con sondas
HyBeacon F-Q y F, generando resultados de calidad
comparable. La Figura 3 ilustra curvas de fusión derivadas de
HyBeacon F y F-Q NAT2 *4 hibridadas a dianas
oligonucleotídicas. Las HyBeacon F-Q pueden depender
en algún punto del espaciado del fluoróforo y el extintor y de los
efectos de la disposición angular (no se muestran datos). No
obstante, las HyBeacon F exhiben niveles elevados de emisión de
fluorescencia tras la hibridación de la diana a pesar de la ausencia
de un resto extintor. Los restos fluoróforos en las sondas HyBeacon
F y F-Q emiten significativamente más fluorescencia
cuando están en el estado bicatenario que cuando están en
conformación unicatenaria (véase a continuación).
Se ha demostrado la discriminación de los
polimorfismos de sustitución de una sola base presente en los alelos
NAT2 y CYP2D6 usando las sondas HyBeacon. Se hibridó
una serie de dianas oligonucleotídicas a la sonda TB0993 NAT2
*4 para ensayar la capacidad de las moléculas baliza de hibridación
para discriminar polimorfismos de inserción y deleción (InDel). Se
analizaron oligonucleótidos de tres inserciones y tres deleciones,
variando en el tipo y la posición del polimorfismo. Cada diana InDel
generó una Tm significativamente reducida comparada con la HyBeacon
hibridada a un oligonucleótido perfectamente emparejado (figura 4).
De manera similar a los polimorfismos de sustitución, las InDel
también se pueden distinguir por las Tm de los dúplex HyBeacon/diana
y por la cantidad de fluorescencia emitida a una temperatura entre
las Tm de la sonda emparejada e incorrectamente emparejada.
Se realizaron ensayos heterogéneos que efectúan
amplificación de la diana y discriminación del SNP en tubos
separados, con los polimorfismos NAT2 *5A, *5C y *6 y con los
SNP CYP2D6 *3 y *4. Se han desarrollado ensayos heterogéneos
exitosos, que permiten una discriminación confiable del SNP a través
del análisis de los picos de fusión, para todos los polimorfismos
ensayados. Los productos PCR que contenían nucleótidos polimorfos se
amplificaron a partir del ADN de molde NAT2 y CYP2D6.
Los tamaños del amplicón variaban entre 80bp y 282bp de longitud.
Los productos PCR se aislaron y resuspendieron en tampón de
hibridación que contenía la sonda HyBeacon. Las sondas se hibridaron
a dianas PCR y los análisis de fusión se realizaron en capilares
LightCycler, generando picos de fusión con Tm dependientes de la
identidad de la diana de PCR. Las HyBeacon discriminan fácilmente
dianas de PCR emparejadas e incorrectamente emparejadas mediante la
temperatura de fusión de los dúplex sonda/diana. Las variantes de
las HyBeacon F-Q y F HyBeacon se desempeñan bien en
los ensayos de discriminación de SNP.
Los ensayos realizados con el polimorfismo
CYP2D6* 3 demuestran cómo las HyBeacon F y
F-Q permiten la discriminación del SNP en análisis
heterogéneos (figura 5). Se amplificó un producto PCR de 119bp a
partir de ADN polimorfo CYP2D6* 3. Los productos PCR se
aislaron y resuspendieron en tampón de hibridación que contenía bien
las sondas HyBeacon 2D63A (F-Q) o 2D63B (F). La
HyBeacon 2D64 F se utilizó en una concentración 5 veces menor que la
sonda F-Q debido a el fondo de fluorescencia más
grande causado por la falta de extintor. La Figura 5 muestra curvas
de fusión derivadas de la hibridación con HyBeacon a dianas PCR que
contienen los alelos *1 y *3 CYP2D6. Las sondas 2D63A y 2D63B
poseen secuencias nucleotídicas idénticas, que son totalmente
complementarias al alelo *1 del gen CYP2D6 y, en
consecuencia, contienen un emparejamiento incorrecto de una sola
base cuando se hibridan al alelo *3. La HyBeacon 2D63A
F-Q generó picos de fusión con Tm de aproximadamente
56ºC y 65ºC cuando se hibridó a las secuencias alélicas *3 y *1
respectivamente. La HyBeacon 2D63B F generó picos de fusión con Tm
similares de aproximadamente 58ºC y 65ºC cuando se hibridó a
productos PCR emparejados e incorrectamente emparejados. Las
temperaturas de fusión, generadas por la hibridación HyBeacon a los
dos alelos del SNP, son altamente reproducibles y estadísticamente
significativas (p<0,01 en ANOVA de un solo factor). Por lo tanto,
los genotipos de CYP2D6* 1 y *3, correlacionados a fenotipos
del metabolismo de enzimas normales y deficientes respectivamente,
se discriminan confiablemente en ensayos heterogéneos HyBeacon.
La cantidad de fluorescencia emitida de las
sondas HyBeacon es significativamente superior cuando los
oligonucleótidos se hibridan a secuencias de ácido nucleico
complementarias que cuando están en conformación unicatenaria. Por
lo tanto, las HyBeacon pueden incluirse en reacciones para controlar
la acumulación en tiempo real de dianas de ADN específicas en todo
el curso de la amplificación por PCR. La Figura 6 demuestra la
detección de la secuencia CYP2D6*1 presente en ADN genómico y
saliva, usando la HyBeacon 2D64C* para controlar la acumulación de
producto con cada ciclo de amplificación.
Cuando las sondas HyBeacon se hibridan a una
secuencia diana polimorfa, las interacciones pueden estar
perfectamente emparejadas o incorrectamente emparejadas. Las
posiciones del emparejamiento incorrecto de los nucleótidos
desestabiliza los dúplex sonda/diana de modo que la Tm de la
hibridación se reduce en comparación con las secuencias totalmente
complementarias. Ya que la cantidad de fluorescencia emitida de la
HyBeacon hibridada es significativamente mayor que la de la sonda
unicatenaria, la secuencia diana polimorfa puede discriminarse en
base a la Tm de hibridación. La temperatura de ablandamiento (y
adquisición de fluorescencia) de la PCR se puede optimizar para
lograr discriminación en tiempo real de secuencias de ADN
íntimamente relacionadas, por hibridación selectiva de la sonda, de
modo tal que únicamente las secuencias diana totalmente
complementarias a las sondas HyBeacon instiguen un aumento en las
señales fluorescentes durante la amplificación. Las secuencias
polimorfas que contienen los SNP se pueden identificar usando los
datos de fluorescencia derivados durante la amplificación en tiempo
real. Por ejemplo, si una sonda HyBeacon está diseñada para ser
totalmente complementaria a una secuencia de ADN que contiene una
mutación, los incrementos en la emisión de fluorescencia solamente
se generan en presencia del alelo mutante.
Las sondas HyBeacon se incorporaron a las
reacciones en cadena de la polimerasa diseñadas para amplificar las
secuencias polimorfas NAT2 y CYP. En cada ciclo de
amplificación, las lecturas de fluorescencia únicas se adquirieron
en la etapa de ablandamiento del cebador, a una temperatura
intermedia entre las Tm de la HyBeacon emparejada e incorrectamente
emparejada. A la temperatura de adquisición de la fluorescencia, se
espera que la HyBeacon se hibride a una diana perfectamente
emparejada pero no se espera que se hibride a una secuencia
incorrectamente emparejada. La hibridación de la sonda diferencial,
a la temperatura de adquisición de la fluorescencia, causa
reacciones que contienen molde perfectamente emparejado para
producir incrementos de fluorescencia durante la amplificación,
mientras que las reacciones que contienen molde incorrectamente
emparejado no producen incrementos en fluorescencia. Se demuestra
aquí el análisis homogéneo de SNP usando HyBeacon F 0203002, que se
empleó para discriminar los polimorfismos NAT2 *4 y *5A. La
HyBeacon está perfectamente emparejada al alelo *4 de NAT2 y
tiene un emparejamiento incorrecto en una sola base cuando se
hibrida a la secuencia *5A. La Figura 7a demuestra discriminación
en "tiempo real" de los SNP, donde únicamente las reacciones
que contienen el alelo *4 generan incrementos significativos en la
emisión de fluorescencia durante el ciclo PCR. Las reacciones que
contienen únicamente alelos *5A incorrectamente emparejados no
producen incrementos en la emisión de fluorescencia durante la
amplificación.
La Figura 8 es otro ejemplo del análisis
HyBeacon en tiempo real que demuestra la detección y discriminación
de secuencias polimorfas CYP2D6 *1 y *4, usando ADN de
plásmidos como la fuente del molde. La discriminación de secuencias
polimorfas presentes en el ADN genómico y en muestras de saliva
también se puede lograr por análisis PCR HyBeacon en tiempo real. La
HyBeacon 2D64C*, presentada en la figura 8, está perfectamente
emparejada al alelo *1 del gen CYP2D6 y, como tal, detecta
específicamente la amplificación de la secuencia *1 a través de
incrementos en tiempo real de la emisión de fluorescencia. Las
reacciones que contienen únicamente las secuencias CYP2D6* 1
generan incrementos de emisión relativamente grandes mientras que
las muestras que contienen únicamente los alelos *4 no demuestran
incrementos en fluorescencia significativos. Las reacciones que
contienen tanto los alelos *1 como *4 exhiben incrementos
intermedios en la cantidad de emisión de fluorescencia. El uso de la
HyBeacon 2D64C, que es totalmente complementaria al alelo
CYP2D6 *4, permite la confirmación de los resultados de la
genotipificación de 2D64C* (datos no publicados). Como con las
sondas TaqMan™, las balizas moleculares, las sondas de hibridación y
los cebadores Scorpion, se requieren dos sondas HyBeacon para
muestras de genotipos, con respecto a los SNP bialélicos, por PCR en
tiempo real para asegurar una identificación exacta de ADN
homocigótico y heterocigótico.
Las secuencias de ADN polimorfo también se
pueden detectar y discriminar en un formato de "punto final"
que utiliza sondas HyBeacon a través del análisis de curvas de
fusión y la determinación de Tm. El análisis de curvas de fusión
homogéneo de dúplex HyBeacon/diana se puede realizar en reacciones
LightCycler inmediatamente después de la amplificación. Las
temperaturas de fusión derivadas del análisis de curvas de fusión
permite la identificación de secuencias de ADN diana, donde las Tm
derivadas de HyBeacon totalmente complementarias son
significativamente superiores a las interacciones de sondas
incorrectamente emparejadas. El análisis de fusión realizado
post-amplificación con la HyBeacon 0203002 y las
dianas polimorfas *4 y *5A generó picos de fusión que poseen Tm de
aproximadamente 62ºC y 54ºC con secuencias emparejadas e
incorrectamente emparejadas respectivamente (figura 7b). Las Tm de
los picos de fusión, producidas por la hibridación con secuencias
diana emparejadas e incorrectamente emparejadas, son altamente
reproducibles para un determinado SNP y significativamente
diferentes entre los SNP. Por lo tanto, la discriminación confiable
de SNP se logra mediante el análisis de temperaturas de fusión
HyBeacon. El análisis de fusión post-amplificación
permite la validación de datos de fluorescencia en "tiempo
real", confirmando que la presencia o ausencia de incrementos de
fluorescencia en la PCR se correlacionan realmente con la presencia
de dianas emparejadas o incorrectamente emparejadas respectivamente.
Por lo tanto, las fusiones post-amplificación
permiten la diferenciación entre reacciones que no producen
incrementos en fluorescencia debido a la presencia de una diana
incorrectamente emparejada y aquellas reacciones que no generan
incrementos debido a la ausencia total de una diana o una falla de
la amplificación por PCR. Se ha demostrado que ambas variantes
HyBeacon F-Q y F se desempeñan bien en ensayos de
amplificación en "tiempo real" y generan curvas de fusión
post-amplificación en ensayos homogéneos. No
obstante, se ha descubierto que las HyBeacon F típicamente producen
fusiones post-amplificación de calidad superior
comparadas con las sondas F-Q de secuencias de ADN
idénticas.
Con las sondas HyBeacon F, las muestras
homocigóticas generan picos de fusión únicos, emparejados o
incorrectamente emparejados dependiendo de la identidad de la
secuencia diana, mientras que el ADN heterocigótico produce indicios
de fusión que poseen ambos picos emparejados e incorrectamente
emparejados. La figura 9 demuestra la detección y discriminación de
secuencias CYP2D6 *1 y *4 polimorfas, amplificadas a partir
de muestras de ADN genómico, por análisis de picos de fusión. La
HyBeacon 2D64C* genera un solo pico de fusión que posee una Tm de
aproximadamente 60ºC cuando se hibrida a ADN homocigótico que
contiene los alelos *1 totalmente complementarios. La hibridación de
sonda incorrectamente emparejada a muestras *4 homocigóticas produce
un solo pico de fusión con una Tm de aproximadamente 49ºC. Las
muestras heterocigóticas, que contienen ambos alelos *1 y *4,
generan indicios que poseen tanto picos de fusión de 60ºC como de
49ºC.
Se considera importante que una tecnología para
marcar los SNP sea capaz de identificar si una muestra es
homocigótica o heterocigótica para un alelo en particular. Se ha
descubierto que el análisis de heterocigotos que utiliza HyBeacon
requiere dos sondas distintas, perfectamente emparejadas a los dos
alelos de un SNP, para la identificación de muestras
heterocigóticas. Se cree que se necesitan dos HyBeacon, ya que se ha
hallado que las sondas F-Q típicamente generan
únicamente picos de fusión emparejados en reacciones que contienen
una mezcla de dianas totalmente complementarias e incorrectamente
emparejadas. Los picos de fusión incorrectamente emparejados no se
observan en reacciones heterocigóticas, donde cualquier unión a una
diana totalmente complementaria está bien favorecida en forma
termodinámica o el análisis de fusión revela la curva emparejada
mientras que enmascara el pico incorrectamente emparejado. Si las
dos HyBeacon poseyeran fluoróforos espectralmente distintos que
pudiesen excitarse y detectarse simultáneamente, se podrían efectuar
ensayos de discriminación de heterocigotos homogéneos usando sondas
F-Q en un solo tubo. No obstante, actualmente el
LightCycler puede únicamente excitar fluoresceína. Por lo tanto, se
realizó el análisis de hibridación con baliza diferencial que usa
diferentes HyBeacon en el mismo capilar LightCycler, usando sondas
que poseen Tm significativamente diferentes. Se emplearon dos
sondas HyBeacon F-Q, F17834 y F17835, de diferente
longitud y Tm en aislamiento y en combinación para discriminar
muestras NAT2 *4 y *5A homocigóticas y heterocigóticas
(figura 10). Las sondas F17834 y F17835 generan curvas de fusión
emparejadas que poseen Tm de aproximadamente 60ºC y 52ºC cuando se
hibridan a ADN *4 y *5A homocigóticos respectivamente. Cuando las
HyBeacon F17834 y F17835 se utilizan en combinación con un ADN
mixto, que contiene las secuencias *4 y *5A (heterocigoto), se
generan dos picos de fusión que poseen Tm de aproximadamente 59ºC y
52ºC en el mismo indicio de fusión. La presencia de dos picos dentro
de un solo indicio de fusión se puede emplear como un indicador de
heterocigosidad.
Una característica importante de la tecnología
HyBeacon F es que, a diferencia de las sondas F-Q y
las sondas fluorescentes previamente descritas, las muestras
homocigóticas y heterocigóticas se pueden identificar de modo
confiable usando una sola HyBeacon F. Las sondas fluorescentes,
tales como las sondas TaqMan™, las balizas moleculares y los
cebadores Scorpion, típicamente requieren dos sondas para detectar y
discriminar confiablemente secuencias bialélicas por métodos PCR en
tiempo real. Además, las sondas de hibridación requieren un par de
oligonucleótidos fluorescentes para identificar ADN homocigótico y
heterocigótico por análisis de curvas de fusión. Las sondas HyBeacon
pueden distinguir en forma confiable muestras homocigóticas y
heterocigóticas a través del análisis de curvas de fusión por
determinación de Tm y por la cantidad de picos de fusión generados.
Las Figuras 9 y 11 demuestran la identificación de muestras
homocigóticas y heterocigóticas por análisis de picos de fusión,
donde las muestras homocigóticas se identifican por Tm específicas y
las heterocigóticas por la presencia de dos picos con un único
indicio de fusión. La Figura 11 ilustra las curvas de fusión
derivadas de una HyBeacon F NAT2 *5C (DdeFL1) hibridada a
dianas de ADN homocigótico y heterocigótico. En ensayos homogéneos y
heterogéneos, DdeFL1 genera picos de fusión únicos con Tm de
aproximadamente 54ºC y 47ºC con dianas homocigóticas emparejadas
(*5C) e incorrectamente emparejadas (*4) respectivamente. Se
descubrió que las muestras heterocigóticas para los alelos *4 y *5C
generan tanto los picos emparejados como los incorrectamente
emparejados dentro de un solo indicio de fusión. Por consiguiente,
la presencia de dos picos dentro de un indicio de fusión HyBeacon
permite la identificación confiable de muestras heterocigóticas.
La capacidad de detectar ADN heterocigótico
usando sondas HyBeacon depende de la magnitud de la ATm (la
diferencia en Tm entre la hibridación totalmente complementaria y la
incorrectamente emparejada). La Tabla 5 ilustra los valores Tm y
\DeltaTm exhibidos por las sondas HyBeacon durante la hibridación
a genes polimorfos NAT2 y CYP. Se ha desarrollado una
sonda que permite la identificación confiable de muestras
homocigóticas y heterocigóticas por análisis de picos de fusión para
cada uno de los nueve SNP aquí investigados. Es evidente que se
requieren valores \DeltaTm que excedan aproximadamente 5,2ºC para
detectar de manera confiable la presencia de ADN heterocigótico
mediante el análisis de curvas de fusión. El \DeltaTm de la
hibridación depende de la longitud de la sonda, la posición del
emparejamiento incorrecto del nucleótido y la identidad del
emparejamiento incorrecto. La longitud de los oligonucleótidos
HyBeacon deberá ser suficiente para asegurar la especificidad de la
hibridación, pero no deberá ser excesiva como para causar la
insensibilidad del emparejamiento incorrecto. Las HyBeacon deberán
diseñarse de modo tal que los nucleótidos polimorfos estén ubicados
hacia el centro de las sondas, ya que los emparejamientos
incorrectos en las posiciones centrales tienen mayores efectos sobre
la Tm que los emparejamientos incorrectos ubicados en los extremos
de los oligonucleótidos. Todos los emparejamientos incorrectos de
nucleótidos exhiben efectos desestabilizadores sobre la Tm de la
hibridación, pero la magnitud de la desestabilización depende del
tipo de interacción del emparejamiento incorrecto. Las interacciones
incorrectamente emparejadas que implican G (es decir, G/T, G/A y
G/G) son las más estables a temperatura ambiente y los
emparejamientos incorrectos que contienen C (es decir, C/T, C/A y
C/C) son las menos estables. Por lo tanto, para maximizar el efecto
del emparejamiento incorrecto sobre el \DeltaTm, se evitan los
emparejamientos incorrectos que implican G y se buscan los
emparejamientos incorrectos que contienen C.
Se ha examinado el potencial de los análisis
múltiplex que utilizan sondas HyBeacon, utilizando mezclas de dianas
de PCR específicas y no específicas. Las HyBeacon se hibridan a
dianas de ADN específicas amplificadas por PCR, lo que produce
incrementos en la emisión de fluorescencia. Los incrementos en la
emisión de fluorescencia de las HyBeacon no ocurren con dianas de
ADN no específicas que carecen de la secuencia diana de la sonda. Se
analizaron diferentes proporciones de moldes PCR específicos y no
específicos (100, 80, 60, 40, 20, 10 y 5% secuencia específica en
ADN no específico) en ensayos homogéneos para probar la capacidad de
la sonda HyBeacon 2D64B para detectar la amplificación de la diana
específica. En reacciones que amplifican únicamente la diana
específica, es decir sin amplificación no específica, todas las
concentraciones de partida de la diana específica se detectaron
fácilmente, con incrementos equivalentes en la emisión de
fluorescencia (figura 12a). No obstante, cuando se amplificaron
ambas dianas específica y no específica en la misma reacción, la
capacidad de la sonda para detectar la amplificación específica
disminuyó a medida que se redujo la proporción de molde PCR
específico (figura 12b). Los resultados derivados de este
experimento sugieren que pueden ser posibles los ensayos múltiplex
HyBeacon que contienen hasta cuatro o cinco dianas distintas. No
obstante, el uso de fluoróforos de señal incrementados e
instrumentos de detección de mayor sensibilidad pueden permitir que
los análisis múltiplex se extiendan a más de cinco dianas.
Se ha demostrado la funcionalidad de las sondas
HyBeacon hasta la fecha usando tintes fluorescentes FAM, HEX y TET,
donde cada sonda hibridada emite cantidades significativamente
mayores de fluorescencia que las HyBeacon monocatenarias. Las
secuencias polimorfas múltiples se pueden amplificar, detectar y
discriminar simultáneamente con estas HyBeacon espectralmente
diferentes, usando PCR en tiempo real y análisis de picos de fusión.
La Fig. 13a demuestra la amplificación y detección específica
simultánea de alelos NAT2*4 y CYP2D6*1, en un único
pocillo de una placa de microvaloración ABI PRISM 7700, usando
sondas HyBeacon marcadas con FAM y HEX, respectivamente. La
identidad de las secuencias polimorfas también se puede determinar
usando sondas FAM, HEX y TET por determinación de la temperatura de
fusión. Se creó un macro Excel para convertir los datos de la curva
de fusión obtenida de la ABI PRISM 7700 a los picos de fusión. La
Fig. 13b muestra los picos obtenidos de las sondas 2D64C*, 2D64E y
DdeFL1*4T marcadas con tintes FAM, HEX y TET respectivamente. Los
picos de fusión se han obtenido de la hibridación HyBeacon a
oligonucleótidos complementarios y dianas amplificadas por PCR.
Se pueden modificar diversos parámetros en los
ensayos HyBeacon para mejorar potencialmente la eficacia de la
detección de la diana y la discriminación del SNP. Los ejemplos de
condiciones de reacción que se han analizado para la optimización
del ensayo se presentan aquí:
a) Optimización del tampón: Siguiendo una
pequeña cantidad de optimización de tampón, se realizaron los
experimentos de análisis de fusión heterogéneos en Tris.Cl 1,25 mM,
pH 8,0, MgCl_{2} 250 nM, DTT 25 nM. Se demostró que este tampón
de hibridación genera curvas de fusión de alta calidad con la
mayoría de las HyBeacon sintetizadas hasta la fecha. No obstante,
la sonda F17836 no generó curvas de fusión en este tampón, incluso
cuando se hibridaron dianas oligonucleotídicas. Posteriormente, se
realizó un estudio de concentración de MgCl_{2} versus
temperatura de fusión de HyBeacon. Se demostró que si bien no se
obtuvieron picos de fusión con F17836 en el tampón anterior, se
obtuvieron curvas de fusión de muy buena calidad en Tris 50 mM,
MgCl_{2} 3 mM. Asimismo, se demostró que existe una correlación
muy fuerte entre la concentración de MgCl_{2} y la Tm del pico de
fusión. Esta relación se estudió para las HyBeacon F17831, TB0993,
F17834, F17835 y B9414, donde se generaron valores R^{2} de 98,9%,
97,9%, 99,4%, 99,3% y 98,8% respectivamente en análisis de regresión
entre concentraciones 0,1 mM y 10 mM (véase figura 14). Se puede
lograr más de un desplazamiento de 10ºC en la Tm de la HyBeacon
alterando la concentración de MgCl_{2}. Puede ser posible diseñar
ensayos de hibridación con balizas diferenciales donde las Tm de
HyBeacon específicas se seleccionan sobre la base de composición
tampón.
Entre los tampones PCR existentes en el mercado
ensayados en los ensayos de amplificación homogéneos, se halló que
el tampón TaKaRa era superior. Los tampones PCR Pharmacia,
Taq Gold y TaKaRa y las correspondientes polimerasas Taq,
Taq Gold y Z-Taq se compararon por su eficacia
en los ensayos HyBeacon. Los ensayos realizados con el tampón y la
polimerasa Taq Gold no funcionaron en absoluto, de modo tal
que no se generaron curvas de amplificación o picos de fusión en
tiempo real. Los tampones Pharmacia y TaKaRa generan ambos curvas de
amplificación y picos de fusión con polimerasas Taq y
Z-Taq. No obstante, el tampón TaKaRa típicamente
produce resultados superiores incluso cuando se incluye MgCl_{2}
adicional en el tampón Pharmacia. Cuando se analizaron las eficacias
de amplificación y detección usando el tampón PCR Pharmacia en una
serie de concentraciones de MgCl_{2}, la concentración óptima
estuvo entre 3,0 mM y 3,5 mM. Se sabe que el tampón TaKaRa contiene
MgCl_{2} 3,0 mM, pero se desconocen los otros constituyentes.
Se empleó el kit Optiprime de Stratagene para
obtener una indicación de qué componentes y condiciones se requieren
para la optimización de los ensayos PCR de HyBeacon. El kit
Optiprime consiste en 12 tampones individuales de distintos pH (8,3,
8,8 y 9,2), que contienen diferentes concentraciones de MgCl_{2}
(1,5 mM y 3,5 mM) y KCl (25 mM y 75 mM). La eficacia de la
amplificación y detección de la diana no estuvo notablemente
afectada por el pH, pero estuvo significativamente afectada por la
concentración de MgCl_{2} y KCl, donde 3,5 mM y 25 mM fueron
óptimas respectivamente (en tampón 1x). Usando la información
obtenida del estuche Optiprime, se construyó un tampón PCR HyBeacon
10x (Tris.HCl 100 mM, pH 8,8, KCl 250 mM, MgCl_{2} 35 mM). Se
halló que este tampón funciona relativamente bien en ensayos
HyBeacon, generando picos de fusión de alta calidad en el análisis
post-amplificación. No obstante, se redujo la
magnitud de los incrementos en fluorescencia que resulta del
análisis en tiempo real, en comparación con los análisis realizados
para el tampón PCR TaKaRa. Por lo tanto, se añadieron una serie de
auxiliares de PCR al tampón PCR HyBeacon en un intento por mejorar
la eficacia de la detección de la diana en tiempo real. De los
mejoradores putativos de PCR que se examinaron en el tampón PCR
HyBeacon, se halló que únicamente BSA tenía un profundo efecto
positivo sobre la eficacia de la amplificación en tiempo real. Las
concentraciones de trabajo de BSA se estudiaron entre 0
\mug/\mul y 1 \mug/\mul. El aumento de la concentración de
BSA de 0 \mug/\mul a 100 ng/\mul aumenta significativamente
la eficacia de la detección de la diana en tiempo real. No obstante,
como consecuencia del incremento en las concentraciones de BSA, se
redujo la calidad de los picos de fusión
post-amplificación. Por consiguiente, se buscó una
concentración de BSA óptima que permitiera una mayor amplificación
en tiempo real pero que no disminuyera significativamente la calidad
del pico de fusión. Se descubrió que esta concentración de trabajo
óptima estaba entre 2,5 ng/\mul y 5 ng/\mul (véase figura 15) y,
por lo tanto, se incluyeron 50 ng/\mul de BSA en el tampón PCR
HyBeacon 10x. Se ha demostrado que este tampón funciona con una
eficacia comparable a la del tampón PCR TaKaRa.
b) Elección del amplicón: Con la
excepción de dos sondas F18140 y F18141, todas las HyBeacon
ensayadas generan curvas de fusión de muy alta calidad con homólogos
de oligonucleótidos. No obstante, no todas estas sondas producen
fusiones de alta calidad con dianas PCR grandes. Las alteraciones en
el tamaño del amplicón y la posición del cebador relativas al sitio
polimorfo permiten una hibridación de la sonda más eficiente y la
generación de curvas de fusión superiores. Se han observado
variaciones significativas en la eficacia de la detección de la
amplificación en "tiempo real" y discriminación de los picos de
fusión para una de las sondas NAT2 *6 cuando se usan dos
amplicones que difieren por solamente 22bp (figura 16).
c) Temperatura de fusión de la sonda: La
Tm de una baliza de hibridación puede afectar la calidad de las
curvas de fusión post-amplificación. Se descubrió
que muchas de las primeras HyBeacon que se sintetizaron y ensayaron
producen un efecto de fluorescencia de fondo a aproximadamente
60-65ºC. Se halló que numerosas HyBeacon que tienen
Tm emparejadas superiores a aproximadamente 58ºC tienen su pico de
fusión emparejado obscurecido por este efecto de fluorescencia de
fondo, mientras que los picos incorrectamente emparejados con Tm
inferiores fueron claramente visibles en el indicio de fusión. Las
sondas que poseen Tm emparejadas de menos de 58ºC pueden
desempeñarse más eficientemente en los experimentos de los análisis
de fusión post-amplificación. Las sondas HyBeacon
F-Q y F fueron diseñadas para los polimorfismos
CYP2D6 *3 y *4. Las HyBeacon F CYP2D6 originales poseían una
serie de ventajas en comparación con las sondas F-Q
y generaron datos de amplificación por PCR en tiempo real de alta
calidad que permitieron la discriminación confiable de los SNP *3 y
*4. Sin embargo, estas sondas HyBeacon F (2D63B y 2D64B) no
generaron picos de fusión de alta calidad debido a una
superposición significativa con un efecto de fluorescencia de fondo.
Por lo tanto, los SNP y las muestras homocigóticas y heterocigóticas
podrían ser identificadas por un análisis de fusión con estas sondas
de alta Tm. Las HyBeacon *3 y *4 fueron rediseñadas para ser 2
(2D63C) y 3 (2D64C) nucleótidos más cortas respectivamente, de modo
tal que las Tm se redujeran significativamente. Ambas sondas de Tm
reducida generan curvas de amplificación y picos
post-amplificación en tiempo real de alta calidad,
permitiendo la discriminación de SNP y el análisis de heterocigotos
extremadamente confiables. En contraste con las sondas 2D63B y
2D64B, las 2D63C y 2D64C generan ambas picos de fusión emparejados e
incorrectamente emparejados durante el análisis
post-amplificación, exhibiendo poca o ninguna
superposición con el efecto de fluorescencia de fondo.
d) Concentración de HyBeacon: Se ha
descubierto que la cantidad de HyBeacon incluida en el ensayo afecta
la calidad de los resultados generados, a través de variaciones en
las relaciones de señal: fluorescencia de fondo. Si se incluye un
exceso de sonda en un ensayo, la fluorescencia de fondo enmascara
las alteraciones mediadas por la hibridación en la fluorescencia. Se
han observado curvas de fusión de calidad superior en muchos casos
cuando se usan concentraciones reducidas de HyBeacon. La
concentración óptima de sonda HyBeacon F, que permite la generación
de datos de amplificación en tiempo real y picos de fusión
post-amplificación de alta calidad, está típicamente
entre 100 y 300 nM. Las concentraciones reducidas de HyBeacon
parecen eliminar el efecto de fluorescencia de fondo anteriormente
descrito.
e) PCR asimétrica: Todos los ensayos de
HyBeacon descritos en la presente memoria han empleado protocolos de
PCR simétrica para amplificar dianas de ADN bicatenario. Las sondas
que se hibridan a los ADN bicatenarios deben competir con la cadena
de la diana homóloga, de modo que esta unión competitiva puede
reducir la eficacia de la hibridación de la HyBeacon. La PCR
asimétrica es una técnica que se emplea para generar productos PCR
monocatenarios. Las HyBeacon se pueden hibridar a dianas
unicatenarias con mayor eficacia que a moléculas bicatenarias debido
a la ausencia de la cadena de ADN competente. La PCR asimétrica se
aplicó a ocho ensayos de SNP HyBeacon, para examinar si la técnica
es superior a la amplificación simétrica. Cuatro de los ocho ensayos
HyBeacon tuvieron eficacias de detección equivalentes en
amplificaciones simétricas y asimétricas, con incrementos similares
en la emisión de fluorescencia. Un ensayo HyBeacon demostró una
menor eficacia en ensayos asimétricos en comparación con las
amplificaciones simétricas (figura 17a), mientras que otros tres
ensayos demostraron mayores incrementos en la emisión de la
fluorescencia con la amplificación asimétrica que con la PCR
simétrica (figura 17b). Además, muchos de estos ensayos HyBeacon
produjeron curvas de fusión post-amplificación
superiores con dianas amplificadas asimétricamente en comparación
con las reacciones simétricas (no se muestran datos). Por lo tanto,
en algunos casos puede ser beneficioso adoptar la amplificación de
la diana asimétrica para ensayos de discriminación de SNP con
sensibilidad potencialmente superior. No obstante, el mecanismo que
generan los ADN monocatenarios asimétricos es lineal en lugar de
logarítmico, por lo tanto, la detección de amplificación y la
discriminación de los SNP se logra en un número del ciclo
significativamente mayor (figura 17b) que en las amplificaciones
simétricas. Este incremento en el ciclo umbral podría extender la
duración del ensayo y podría afectar las reacciones que contienen
bajas concentraciones de ADN genómico.
Se amplificaron dianas polimorfas NAT2 *4
y *5A de ADN genómico, usando un cebador biotinilado de la misma
secuencia que 195993' ó 195991. Los productos PCR biotinilados se
inmovilizaron en placas de microvaloración recubiertas con
estreptavidina de 96 pocillos. Las dianas de ADN se desnaturalizaron
con NaOH y la cadena de PCR no biotinilada se eliminó, dejando una
diana de ADN monocatenario unida a la superficie del pocillo. Las
sondas HyBeacon, típicamente F17832 y 0203002, se hibridaron a las
dianas monocatenarias inmovilizadas. Después de la hibridación, el
exceso de sonda se eliminó y se realizó el análisis de fusión usando
un instrumento DASH (Hibridación Específica de Alelos Dinámicos -
Hybaid). Las curvas de fusión de HyBeacon se obtuvieron a partir de
dianas inmovilizadas emparejadas e incorrectamente emparejadas,
permitiendo una discriminación confiable de los SNP (figura 18). La
HyBeacon F17832 produjo curvas de fusión de mala calidad en los
ensayos heterogéneos con LightCycler. No obstante, se lograron
análisis de fusión y buena calidad y discriminación confiable del
SNP con esta sonda en el análisis con el instrumento para DASH
LightCycler y análisis de fusión DASH que utilizan dianas
bicatenarias y monocatenarias respectivamente. Se obtienen curvas de
fusión de calidad significativamente superior a partir de dianas
monocatenarias debido a la falta de homólogo de PCR que compite con
la HyBeacon para la hibridación diana. El uso exitoso de las
HyBeacon en ambos formatos homogéneos de fase sólida provee un
sistema versátil en el que se pueden llevar a cabo grandes
cantidades de ensayos, potencialmente en alguna forma de sistema de
matrices.
Para garantizar que los ensayos HyBeacon son
distintos del sistema TaqMan, se ensayaron dos ADN polimerasas, Deep
Vent (New England Biolabs) y fragmento Stoffel (Pharmacia), que
carecen de actvidad de
5'-3'-exonucleasa en ensayos de
amplificación en "tiempo real". La actividad de
5'-3'-exonucleasa es esencial en los
ensayos TaqMan, donde se requiere la polimerasa Taq para
digerir específicamente las sondas TaqMan entre los restos
fluoróforo y extintor, causando incrementos en la emisión de
fluorescencia en presencia de dianas perfectamente emparejadas. Se
emplearon las polimerasas Deep Vent y fragmento Stoffel en los
ensayos de amplificación homogéneos para ensayar la capacidad de una
sonda HyBeacon F NAT2 *4 para detectar la amplificación de la diana
en ausencia de actividad de
5'-3'-exonucleasa (figura 19). Las
reacciones que contenían ambos tipos de polimerasas exhibieron
incrementos en la emisión de fluorescencia con moldes emparejados en
todo el curso de la amplificación, mientras que las reacciones que
contenían molde incorrectamente emparejado no generaron incrementos
en la fluorescencia. La discriminación de SNP se puede lograr en
formatos de "tiempo real" y post-amplificación
con polimerasas Deep Vent y fragmento Stoffel. Por lo tanto, estos
resultados indican que el mecanismo mediante el cual las HyBeacon
detectan secuencias de ADN por PCR en tiempo real es distinto de
aquel del ensayo de
5'-3'-exonucleasa, basado en
incremento de emisión de fluorescencia causado directamente por la
hibridación de la sonda, en lugar de la separación enzimática de los
restos fluoróforo y extintor.
La capacidad de controlar el progreso en
"tiempo real" de la amplificación por PCR revoluciona por
completo los planteamientos mediante los cuales se puede efectuar la
cuantificación de ADN y ARN basada en PCR. En los experimentos de
PCR cuantitativos en "tiempo real", las reacciones se
caracterizan por el punto en el tiempo durante el ciclo en el que se
detecta por primera vez un producto PCR (C_{T}- ciclo umbral) en
lugar de la cantidad de producto PCR acumulada después de un número
fijo de ciclos. Cuanto más alto sea el número de copia de partida de
la diana de ácido nucleico, más rápido se observará un incremento en
la fluorescencia. El potencial de las sondas HyBeacon para
cuantificar ADN diana en amplificaciones en "tiempo real" se
examinó usando las HyBeacon F 2D64B, 2D64C* y DdeFL1. Los análisis
de PCR cuantitativos de HyBeacon se efectuaron con los instrumentos
LightCycler y ABI 7700. Se emplearon intervalos de estándares de ADN
(concentraciones conocidas de producto PCR o ADN genómico) como
moldes para amplificación por PCR homogénea. Se midió el ciclo
umbral para cada estándar de ADN y se trazaron las concentraciones
logarítmicas de ADN contra C_{T} para generar curvas estándar en
"línea recta". Los ciclos umbral obtenidos de las muestras que
contenían concentraciones "desconocidas" de ADN genómico se
trazaron en la curva estándar para calcular la concentración de ADN
presente en estas reacciones. Las curvas estándar derivadas de PCR
cuantitativas HyBeacon fueron de muy alta calidad con ambos
instrumentos LightCycler y ABI 7700, con coeficientes de correlación
entre 0,93 y 0,99 (figura 20). El cálculo de la concentración de ADN
a partir de estas curvas estándar fue moderadamente preciso para las
reacciones "desconocidas" que se ensayaron, donde las
concentraciones calculadas estuvieron en el orden correcto de
magnitud. Por ejemplo, 5,4 x 10^{4} ng/\mul, 700 ng/\mul y 90
ng/\mul de muestras "desconocidas" tuvieron concentraciones
de 6,9 x 10^{4} ng/\mul, 1406 ng/\mul y 115 ng/\mul
calculadas a partir de las curvas estándar del LightCycler
respectivamente. Mientras que 285 ng/\mul, 163 ng/\mul y 53
ng/\mul de muestras genómicas se calcularon en 256 ng/\mul, 137
ng/\mul y 44 ng/\mul con las curvas estándar derivadas del ABI
7700.
La obtención de un genotipo de la muestra de un
paciente, como sangre o hisopado oral, típicamente exige que el ADN
genómico se extraiga antes de la amplificación por PCR y el análisis
posterior. Los protocolos de extracción de ADN pueden demandar mucho
tiempo, ser trabajosos y costosos. Por lo tanto, para reducir la
duración y el costo de los análisis HyBeacon, se llevó a cabo la
amplificación por PCR directa de ADN de saliva, eliminando el
requisito de extracción de ADN genómico. Combinada con las
condiciones de ciclo térmico rápido del LightCycler, la
amplificación de la diana directa de saliva permite genotipificar
secuencias polimorfas en 35-40 minutos.
Se amplificaron secuencias polimorfas NAT2
*4 y *5C de 10 muestras de saliva y se analizaron con las
HyBeacon DdeFL1 y DdeFL1*4, que son totalmente complementarias a los
alelos *5C y *4 respectivamente. Las figuras 21 y 22 ilustran los
datos PCR y los picos de fusión en tiempo real derivados de la
hibridación de DdeFL1 y DdeFL1*4 a secuencias de ADN amplificadas de
los genotipos *5C/*5C (muestra 1), *4/*4 (muestra 2) y *4/*5C
(muestra 3). La Tabla 6 muestra temperaturas de fusión de HyBeacon
derivadas de la hibridación de DdeFL1 y DdeFL1*4 a secuencias
polimorfas NAT2. Los datos de PCR y Tm en tiempo real
permiten determinar el genotipo de un individuo, con respecto al
polimorfismo *5C. De las 10 muestras de saliva analizadas, 3 se
clasificaron como homocigóticas para el alelo *5C, 1 se caracterizó
como homocigótica para el alelo *4 y 6 fueron heterocigóticas. Estos
genotipos, en el locus del gen NAT2 *5C, se correlacionan con
fenotipos de acetilación lenta, rápida e intermedia respectivamente.
Para confirmar los genotipos y fenotipos obtenidos del análisis
HyBeacon de las muestras de saliva, se llevó a cabo el análisis RFLP
para las muestras de saliva 1-3 (figura 23). Un
producto PCR de 179bp amplificado de ADN *4/*4 contiene un solo
sitio de restricción Ddel que tras la digestión resulta en
fragmentos de 121bp y 58bp. El polimorfismo *5C genera un sitio de
restricción Ddel adicional, de modo tal que la digestión del
producto de 179bp amplificado de ADN *5C/*5C resulta en fragmentos
de 98bp, 58bp y 23bp. La digestión de producto amplificado de
muestras de saliva heterocigóticas resulta en fragmentos de 121 bp,
98bp, 58bp y 23bp. Las muestras de saliva 1-3 son
tipificadas como homocigótica *5C, homocigótica *4 y heterocigótica
respectivamente por ambas metodologías RFLP y HyBeacon. Por lo
tanto, los datos presentados aquí demuestran que la amplificación,
detección y discriminación confiables de secuencias polimorfas
pueden efectuarse sin la necesidad de purificación de ADN de alta
calidad.
Se evaluó el potencial de detección de dianas de
ARN. Inicialmente, se diseñó una sonda HyBeacon para detectar un
producto de ARN con Amplificación Basada en la Secuencia del Ácido
Nucleico (Nucleic Acid Sequence Based Amplification o NASBA). Este
producto no se detectó mediante la generación de picos de fusión
HyBeacon en los análisis de curvas de fusión, posiblemente debido a
la degradación del producto de ARN. Por consiguiente, se
sintetizaron homólogos de oligonucleótidos que consistían en ADN o
ARN para analizar la hibridación de la sonda HyBeacon. Inicialmente,
los picos de fusión derivaron de la diana de ARN pero no del
oligonucleótido de ARN. No fue hasta que la concentración de la
diana de ARN se incrementó a 2 \muM que derivaron los picos de
fusión característicos de la hibridación de la sonda (no se muestran
datos). Se demostró que la temperatura de fusión de los dúplex
HyBeacon/ARN se reduce significativamente en comparación con la de
los dúplex HyBeacon/ADN, lo que sugiere que la hibridación a ARN es
considerablemente menos estable que la hibridación a ADN. En
consecuencia, a menos que se puedan generar altas concentraciones de
dianas de ADN durante los análisis, las sondas HyBeacon pueden no
ser capaces de detectarlas.
La hibridación de las sondas HyBeacon a
secuencias de ADN diana complementarias produce alteraciones
importantes en la cantidad de emisión de fluorescencia, a pesar de
la ausencia de restos extintores en la sonda. Se ha demostrado que
los residuos nucleotídicos, especialmente la guanina, efectúan la
emisión de fluorescencia a través de mecanismos de extinción
estáticos y dinámicos. Por lo tanto, la extinción de la
fluorescencia de HyBeacon podría potencialmente surgir del
componente oligonucleotídico de la sonda a través de eventos de
apilamiento de tinte-base y transferencia de
electrones. La hibridación de HyBeacon a secuencias diana puede
alterar la orientación del resto fluoróforo en relación con el
componente oligonucleotídico, lo que afecta la cantidad de
transferencia de electrones entre el tinte y la base.
Alternativamente, los cambios en el apilamiento de
base-tintura provenientes de la formación de dúplex,
p. ej., intercalación del fluoróforo en el apilamiento de base,
puede alterar la cantidad y extinción de la fluorescencia. Cuando
las sondas HyBeacon se hibridan a secuencias de ADN diana, un
desplazamiento de conformación puede aliviar una cantidad pequeña
pero detectable de la extinción de fluorescencia impuesta por el
oligonucleótido HyBeacon. La reducción de la extinción produce un
incremento en la cantidad de emisión de fluorescencia, permitiendo
la detección de secuencias y discriminación de alelos. Para
investigar el mecanismo molecular mediante el cual funcionan las
sondas HyBeacon, se pueden emplear técnicas espectroscópicas de
fluorescencia y u.v. a fin de analizar posibles alteraciones de
rendimiento cuántico, vida útil de la fluorescencia y longitud de
onda de emisión que ocurren entre los estados monocatenarios y
bicatenarios.
Se ha demostrado que las balizas de hibridación
(HyBeacon) detectan secuencias de ADN específicas a través de
incrementos en la emisión de fluorescencia que se generan como
consecuencia directa de la hibridación de la sonda a secuencias
diana complementarias. La cantidad de emisión de fluorescencia y la
Tm de los dúplex sonda/diana permiten la discriminación de los SNP
en secuencias PCR amplificadas y en oligonucleótidos. Los resultados
aquí descritos demuestran que los ensayos con HyBeacon permiten la
identificación de muestras homocigóticas y heterocigóticas usando
una sola sonda y que el uso de múltiples sondas HyBeacon en un
ensayo de un solo tubo/pocillo tiene el potencial de un análisis
múltiplex. Además, las HyBeacon han demostrado cuantificar dianas de
ADN en ensayo PCR en "tiempo real".
Las sondas HyBeacon son una alternativa a los
sistemas comerciales actualmente disponibles (balizas moleculares,
Scorpions, sondas FRET y sondas TaqMan™) para la detección de
secuencias, discriminación de SNP y cuantificación de ADN. Los
ensayos de detección que utilizan HyBeacon son atractivos debido a
su modo simple de acción, que carece de estructura secundaria y del
requerimiento de una enzima, y por su capacidad de identificar ADN
heterocigótico usando una única sonda.
Los ensayos moleculares de diagnóstico se pueden
efectuar por un método homogéneo HyBeacon (tal como se describió
anteriormente), donde la amplificación y detección de la diana se
realizan en un solo tubo. Alternativamente, el aislamiento robótico
de inmovilización de fase sólida o diana amplificada, con posterior
reemplazo de tampón y adición de HyBeacon, puede constituir un
sistema de detección de alto rendimiento. Los ensayos de hibridación
diferencial se podrían llevar a cabo en formatos de micromatrices o
macromatrices, donde algunas de las sondas o más preferiblemente las
dianas se inmovilizan antes del análisis de fusión HyBeacon.
Las sondas de la invención contienen un
fluoróforo basado en fluoresceína sin un extintor asociado (HyBeacon
F) y han sido evaluadas en comparación con sondas que contienen
restos fluoróforo y extintor (HyBeacon F-Q). Las
HyBeacon F-Q no son parte de la invención que se
reivindica en la presente. Se ha demostrado que ambos tipos de
sondas discriminan en forma confiable los SNP en formatos homogéneos
y heterogéneos. No obstante, las HyBeacon F tienen ventaja obvias
sobre el diseño F-Q:
\bullet Actualmente, los restos fluoróforo y
extintor pueden únicamente posicionarse en residuos T. Por lo tanto,
las HyBeacon F son significativamente más directas para diseñar con
menos restricciones, de modo tal que no es necesario considerar el
número de residuos que separan los restos fluoróforo y extintor y
los posibles efectos de disposición angular.
\bullet Debido a la ausencia de un extintor,
las HyBeacon F son menos costosas para sintetizar y los ensayos
requieren aproximadamente cinco veces menos sonda por reacción
(menos de 200 nM) en comparación con las sondas
F-Q.
\bullet Se ha demostrado que las HyBeacon F
tienen el potencial de generar curvas de fusión
post-amplificación de calidad superior en ensayos
homogéneos en "tiempo real".
\bullet En contraste a las dos sondas
F-Q requeridas para el análisis de heterocigotos, se
ha demostrado que las HyBeacon F identifican las muestras
heterocigóticas usando una única sonda.
<110> LGC (Teddington) Limited
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Baliza y método de hibridación para
detección y discriminación rápida de secuencias
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
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<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatctggta ucuggaccaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgaatctggua tcuggaccaa
\hfill20
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<210> 3
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
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\hskip-.1em\dddseqskipgaatcuggta tcuggaccaa
\hfill20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
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<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
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<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
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\hskip-.1em\dddseqskipgaatcugcta ccuggaccaa
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<210> 6
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<212> ADN
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
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SONDA
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\hskip-.1em\dddseqskipgatttggtcc agguaccaga utc
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<220>
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<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
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<220>
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<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
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<210> 8
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
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\hskip-.1em\dddseqskipgatutggtcc agguaccaga ttc
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
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\hskip-.1em\dddseqskipgatutggtcc agguaccaga ttc
\hfill23
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<210> 10
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaggaatc uggtaccugg ace
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia ariticial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatcuggta ctuggaccaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcutgaaccuc gaacaattga ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN:SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgaaccuc gaacaautga ag
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttgaaccuc gaacaatuga ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcttcaattgu tcgaggutca ag
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<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcaautgt tcgaggutca ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcaautgt ttgaggutca ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagtgcuga gaaauatatt taag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatttggtcc agguaccaga utc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatutggtcc agguaccaga ttc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatcuggta ccuggaccaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaatcuggta ctuggaccaa
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaggucat cctgugctca g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggcgtccu gggggugg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaggaatc uggtacctgg ace
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagaggaatc uggtacttgg ace
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagtgcuga aaaatatatt taag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: 28
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagtgcuga gaaatatatt taag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagtgcuga aaaatatatt taag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcaautgt tcgaggttca ag
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctggtgaug gatcccttac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctggtgaug aatcccttac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaggucat cctgtgctc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaggucat cctgtgctca g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaggucat ccgtgctc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcgucctg ggggtg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggcgucct gggggtggg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcgtctug ggggtg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggcgucctg ggggtg
\hfill16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattgaggac cgugttcaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcattgaggac tgugttcaag
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggucaat gtatctctgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaaggucaag gtatctctgg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattattucc cgggaaccc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgattattucc caggaaccc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccuggatc cagggggtg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de combinación de
molécula ADN/ARN: SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
SONDA
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaccuggatt cagggggtg
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgctctctc ctgatttggt cc
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctctagaat taatttctgg g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctatagaaa attcaattat aaag
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgagattt ctccccaagg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctgccaaag aagaaacacc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtattcatag actcaaaatc ttc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagaggttg aagaagtgct g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaagggttta ttttgttcct tattc
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaccgtggc agccactctc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccagctggat gagctgctaa c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaagcggcg cccgcagg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
CEBADOR
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggacgggga aggcgacc
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 930
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SNP QUE CONTIENEN EL GEN HUMANO NAT
2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
Claims (23)
1. Una baliza de hibridación que es un
oligonucleótido donde (a) el oligonucleótido no posee estructura
secundaria que surja de una región del oligonucleótido que se
hibride con otra, (b) el oligonucleótido está formado por residuos
nucleotídicos de los cuales uno está marcado con un indicador
fluorescente en el que la baliza incluye un solo indicador sin un
extintor asociado y el indicador se selecciona entre el grupo de
6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína y
hexaclorofluoresceína, (c) el residuo nucleotídico marcado con
indicador está posicionado internamente dentro de la secuencia
oligonucleotídica, (d) el oligonucleótido es totalmente
complementario a un alelo de ADN genómico humano que tiene un
polimorfismo conocido en el sitio de unión del oligonucleótido, y
(e) la sonda oligonucleotídica está modificada en su extremo 3' como
para prevenir la extensión de la cadena durante la amplificación por
PCR.
2. La baliza de hibridación según la
reivindicación 1, en la que el polimorfismo es una mutación puntual
o una inserción o deleción de una sola base.
3. La baliza de hibridación según la
reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el polimorfismo
conocido es complementario a un residuo nucleotídico ubicado
centralmente dentro de la molécula baliza de hibridación.
4. La baliza de hibridación según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, que está inmovilizada en un
soporte.
5. Una gama de sondas oligonucleotídicas
inmovilizadas en ubicaciones espaciadas en o dentro de un soporte,
en las que diferentes sondas oligonucleotídicas son diferentes
balizas de hibridación según una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3.
6. El uso de una baliza de hibridación según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para detectar polimorfismos
en ADN humano.
7. Un método para elaborar una baliza de
hibridación que es un oligonucleótido, comprendiendo el método
(i) seleccionar una diana polinucleotídica;
(ii) designar un oligonucleótido totalmente
complementario a la diana polinucleotídica y donde (a) el
oligonucleótido no tiene estructura secundaria que surja de una
región del oligonucleótido que se hibride a otra, (b) el
oligonucleótido está formado por residuos nucleotídicos de los
cuales uno está marcado con un indicador fluorescente en el que la
baliza incluye un solo indicador sin un extintor asociado y el
indicador se selecciona del grupo de
6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína y
hexaclorofluoresceína, (c) el residuo nucleotídico marcado con
indicador está posicionado internamente dentro de la secuencia
oligonucleotídica, y (d) la sonda oligonucleotídica está modificada
en su extremo 3' como para prevenir la extensión de la cadena
durante la amplificación por PCR; y (iii) sintetizar dicha baliza de
hibridación.
8. Un método para investigar una diana
polinucleotídica, donde el método comprende
(i) proveer una baliza de hibridación que es un
oligonucleótido donde (a) el oligonucleótido no posee estructura
secundaria que surja de una región que se hibrida con otra, (b) el
oligonucleótido está formado por residuos nucleotídicos de los
cuales uno está marcado con un indicador fluorescente en el que la
baliza incluye un solo indicador sin un extintor asociado y el
indicador se selecciona del grupo de
6-carboxifluoresceína, tetraclorofluoresceína y
hexaclorofluoresceína, (c) el residuo nucleotídico marcado con
indicador está ubicado internamente dentro de la secuencia
oligonucleotídica, (d) el oligonucleótido es totalmente
complementario a la diana polinucleotídica, y (e) la sonda
oligonucleotídica está modificada en su extremo 3' como para
prevenir la extensión de la cadena durante la amplificación por
PCR;
(ii) incubar la diana polinucleotídica con la
baliza de hibridación exhibiendo un nivel superior de señal cuando
está en la forma de híbrido que cuando está la forma monocatenaria;
y
(iii) observar el nivel de señal de la baliza de
hibridación a una temperatura predeterminada, o en un intervalo de
temperaturas, cercano a la temperatura de fusión del híbrido.
9. Un método según la reivindicación 8, en el
que la diana polinucleotídica tiene un polimorfismo conocido o
sospechado.
10. El método según las reivindicaciones 8 ó 9,
en el que el método se utiliza para detectar, identificar o
cuantificar la presencia o cantidad de secuencia diana presente en
una muestra.
11. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en el que la baliza de hibridación tiene
una secuencia complementaria a un alelo del polinucleótido
diana.
12. El método según la reivindicación 11, en el
que se proveen dos o más balizas de hibridación diferentes,
teniendo, cada una, una secuencia complementaria a un alelo
diferente del polinucleótido diana.
13. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en el que la temperatura predeterminada, en
la cual se observa el nivel de señal de la baliza de hibridación, es
intermedio a las temperaturas de fusión de los híbridos formados con
los diferentes alelos de la diana polinucleotídica.
14. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, en el que el intervalo de temperaturas, en
el cual se observa el nivel de señal de la baliza de hibridación,
abarca la temperatura de fusión del híbrido.
15. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 12, y 14, en el que se realiza la observación
del índice de cambio del nivel de señal con el cambio de
temperatura.
16. El método según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 15, en el que la diana polinucleotídica es un
amplímero de PCR.
17. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 16, en el que la amplificación de la diana
polinucleotídica se realiza en presencia de la baliza de
hibridación.
18. El método según la reivindicación 17, en el
que la amplificación del polinucleótido se realiza por la Reacción
en Cadena de la Polimerasa (PCR), Reacción en Cadena de la Ligasa
(LCR), Amplificación por Desplazamiento de Cadena (Strand
Displacement Amplification o SDA), Amplificación Mediada por
Transcripción (Transcription Mediated Amplification o TMA),
Amplificación por Círculo Rodador (Rolling Circle Amplification o
RCA) o Amplificación Basada en la Secuencia del Ácido Nucleico
(Nucleic Acid Sequence Bases Amplification o NASBA).
19. El método según las reivindicaciones 17 ó
18, en el que la observación de la señal de la baliza de hibridación
se realiza durante la amplificación de la diana
polinucleotídica.
20. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 19, en el que las balizas de hibridación se
emplean para detectar y discriminar dianas amplificadas a partir de
muestras, tales como saliva, sin extracción previa de ADN.
21. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20, en el que la reacción PCR es una
amplificación asimétrica.
22. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 21, en el que la baliza de hibridación, la
secuencia diana o ambas están inmovilizadas en un soporte.
23. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 22, en el que el método se utiliza en la
diferenciación entre dianas polinucleotídicas homocigóticas y
heterocigóticas.
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