JP2003528626A - ハイブリダイゼーション・ビーコン、並びに迅速に配列を検出および判別する方法 - Google Patents

ハイブリダイゼーション・ビーコン、並びに迅速に配列を検出および判別する方法

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Abstract

(57)【要約】 蛍光ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブを使用して、特定のDNA配列および単一ヌクレオチド多型（SNPs）を判別するための方法を開示する。オリゴヌクレオチドプローブは、レポーター分子でラベルされ、このラベルは好ましくは内部のヌクレオチド残基に付着される。オリゴヌクレオチドプローブの蛍光発光は、クエンチャー部分が存在しないにも関わらず、一本鎖および二本鎖状態の場合で有意に異なり、相補的DNA標的を正確に検出することができる。プローブ／標的二本鎖の融解温度により、わずか単一ヌクレオチド残基が異なる標的の判別が可能となり、その結果多型標的を、蛍光およびTmによって判別することができるであろう。本発明のハイブリダイゼーション・プローブは、単一の蛍光オリゴヌクレオチドを使用して、ホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルを正確に同定し、ハイブリダイゼーション・プローブによって唾液を直接調査することにより、35-40分以内の超迅速な遺伝子型解析を可能にする。標的の検出およびSNPの判別のアッセイは、均一、不均一、「リアルタイム」および固相フォーマットにおいて成し遂げられた。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【従来技術】
導入 特定のDNA配列を検出して、既知の単一ヌクレオチド多型をスコアするための
多くの技術が記載されている。これら検査法のいくつかでは、蛍光ラベルされた
プローブのハイブリダイゼーションを利用し、ドナー部分およびアクセプター部
分間のエネルギー移転に基づいている。本発明は、プローブの二次構造または酵
素作用に依存しない、新規かつ簡便な蛍光ハイブリダイゼーション・プローブ検
出系を包含する。これらハイブリダイゼーション・プローブとその標的配列間の
相互作用により、蛍光発光に有意な変化が生じる。ハイブリダイゼーション能が
変化することにより、蛍光発光量およびプローブ/標的二本鎖の融解温度によっ
て多型標的を判別することができる。単一ヌクレオチド多型（SNPs）は、ヒトゲ
ノムの配列の変異において最も多い形態であり、平均して千ヌクレオチドごとに
生じている。SNPは、ヒトからヒトで一塩基（置換、挿入または欠失）が変化す
るDNA配列内の部位である。これらSNPsは、一般に、特定疾患などの表現型形質
に直接影響を及ぼし、したがって薬剤負荷に対する反応性（薬理遺伝学）などの
、複雑な形質を同定するための遺伝的マーカーとして使用することができる。SN
Psは、進化が遅く、かつ多くの方法によって容易にスコアされるため、遺伝子マ
ーカーとして極めて有用である。一般的な遺伝子疾患に寄与する遺伝子を同定で
きる可能性のある関連研究において使用するために、新規SNPsを発見するための
大規模な試みが進行中である。さらに、既知のSNPsを比較的高処理量で効率的に
スクリーニングするための多数の技術が開発されている。SNPの遺伝子型を決定
するための現在の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応産物の制限断片長多型性（RF
LP）解析（制限断片を検出するためにゲル電気泳動を使用する）、対立遺伝子特
異的オリゴヌクレオチド（ASO）のハイブリダイゼーション、増幅低抗性変異系
（ARMS）、オリゴヌクレオチド・ライゲーション・アッセイ（OLA）、一本鎖コ
ンホメーション多型（SSCP）解析、化学開裂、ヘテロ二重鎖解析、ミニ−シーケ
ンシング、および種々のプローブに基づいた系が含まれる。プローブに基づいた
技術例には、分子ビーコン、5'-エキソヌクレアーゼ・アッセイ、ハイブリダイ
ゼーション・プローブおよびスコーピオン・プライマーが含まれる。これらプロ
ーブ系のいくつかは、ドナー（たとえば蛍光団）部分とアクセプター（たとえば
クエンチャー）部分間のエネルギー移転に基づいている。蛍光プローブは、典型
的には一本鎖オリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは、標的配列
にハイブリダイズしたときよりも分離時の蛍光発光が、低い量を示す。これらの
プローブの構造は、高い特異性をもち、わずか単一ヌクレオチドだけが異なる標
的を同定することが可能となる。
【０００２】 蛍光団によって吸収されるエネルギーは、クエンチャーへ移転され、熱として
放出されるであろう。蛍光シグナルのクエンチングは、蛍光共鳴エネルギー移転
（FRET）または非FRET機構によって生じてもよい。FRETクエンチングでは、ドナ
ーとアクセプター間のスペクトルが重なることが必要であり、このクエンチング
の効率は、2つの部分間の距離に関連がある。非FRETクエンチングは、蛍光団と
クエンチャー間の短距離の「接触」により生じ、部分間でスペクトルが重なる必
要はない。
【０００３】 5'-エキソヌクレアーゼ（TaqManTM）アッセイでは、ポリメラーゼ連鎖反応（P
CR）で増幅された標的DNAを分析するために、FRETクエンチングを使用する。Taq
Manプローブは、蛍光団部分およびクエンチャー部分（好ましくは5'および3'末
端に位置する）を含むオリゴヌクレオチドである。効率的に分子内クエンチング
することにより、ほんのわずかの蛍光のみが、無処置プローブから発光される。
しかし、PCR増幅の間に、前記プローブはその標的配列に特異的にハイブリダイ
ズして、Taq ポリメラーゼの5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性によって蛍光団部分
とクエンチャー部分間でプローブが切断される。TaqManTMプローブが酵素切断さ
れることによって、蛍光団とクエンチャー成分が空間的に分離し、標的の増幅に
相関して蛍光発光の有意な増加を生じる。TaqManプローブを慎重にデザインする
ことによって、完全マッチのプローブのみが分解されて蛍光シグナルの増加を生
じ、多型標的の判別が可能となる。TaqManTMプローブは、リアルタイムPCR増幅
の間に消化されるため、増幅後融解曲線解析(post-amplification melting curv
e analysis)においてプローブを利用することはできない。
【０００４】 分子ビーコンは、分離時は非蛍光性であるが、標的配列にハイブリダイゼーシ
ョンすると蛍光性となる一本鎖オリゴヌクレオチドプローブである。ハイブリダ
イズしていない分子ビーコンは、ステム-ループ構造を形成し、前記ビーコンの
ヘアピンにより、前記蛍光団部分が前記クエンチャーのかなり近くに配置される
ように、該分子の一端に共有結合で結合された蛍光団と、もう一端に結合された
クエンチャーをもつ。分子ビーコンが標的配列にハイブリダイズすると、蛍光団
およびクエンチャー部分が空間的に分離され、その結果前記蛍光団はもはやクエ
ンチされず、分子ビーコンが蛍光を発光する。分子ビーコンは、配列の検出およ
びSNPの判別のために、終了点および「リアルタイム」アッセイにおいて使用し
もよい。分子ビーコンの二次構造は、ハイブリダイゼーション・プローブに対し
て高い特異性をもち、単一ヌクレオチドが異なる標的を同定することができる。
しかし、前記分子ビーコンの分子内相互作用は、分子間標的ハイブリダイゼーシ
ョンにおいて競合原因を生じる可能性を秘めており、かつ前記分子ビーコンは内
因性のプローブであるため、前記標的配列に結合するためのアンプリコン（単位
複製配列）の反対鎖と競合するに違いない。両競合形態が組合わさることにより
、いくつかの標的分子に対する分子ビーコンのハイブリダイゼーション効率は、
減少されるかもしれない。
【０００５】 ハイブリダイゼーション・プローブは、蛍光団成分で一箇所ラベルされたオリ
ゴヌクレオチドである。各ハイブリダイゼーション・プローブ・アッセイにおい
て、このようなオリゴヌクレオチドが二つ必要であり、一つはドナー蛍光団でラ
ベルされ、もう一つはアクセプター蛍光団でラベルされる。フルオレセインは、
通常ドナーとして使用され、通常Cy5、LC-RED 640およびLC-RED 705がアクセプ
ターとして使用される。ドナー蛍光団が励起されることにより、アクセプター蛍
光団の吸収スペクトルと重複する発光スペクトルを生じる。ハイブリダイゼーシ
ョン・プローブ対は、標的分子内で隣接したヌクレオチド配列を認識するように
デザインされる。前記アクセプター・オリゴヌクレオチドは、分離時には励起さ
れず、蛍光シグナルを発生しない。しかし、ポリヌクレオチド標的配列にハイブ
リダイゼーションしている間は、前記ドナーとアクセプター・プローブがかなり
近接し、前記ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移転が可能となる
。前記アクセプター蛍光団からの蛍光シグナルは、両プローブが標的分子にハイ
ブリダイズした場合にのみ生じる。PCR反応に組み込んだ場合、前記アクセプタ
ーによって発光される蛍光量は、合成される標的量に比例し、前記アクセプター
・プローブからの蛍光を増幅サイクル毎に一度モニターすると、蓄積産物のリア
ルタイム計測が容易になる。プローブおよびアッセイ条件を慎重にデザインする
ことにより、リアルタイムPCRによって密接に関連した標的を判別することが可
能になる。さらに、ハイブリダイゼーション・プローブ対は、融解ピーク解析お
よびTm測定によって対立遺伝子を判別するために使用することもできる。ホモ接
合性サンプルは、融解曲線解析の際に特定の融解ピークを生じることによって同
定され、ヘテロ接合性サンプルは、一回の融解トレースにおいて2つのピークが
存在することにより同定されるであろう。
【０００６】 5'-エキソヌクレアーゼ、分子ビーコンおよびハイブリダイゼーション・プロ
ーブ・アッセイは、別々のDNA鎖に位置するプローブおよび標的配列を有する二
分子の系である。スコーピオン・プローブは、単分子の結合イベントを介して作
動し、プローブおよび増幅された標的配列が、同じDNA鎖に位置する。単分子の
結合イベントは、動態学的に二分子ハイブリダイゼーションより好まれる。スコ
ーピオン・プローブには、プローブ末端配列が付着されたプライマーを含み、該
プローブ配列は、分子ビーコンのものと同様のステム-ループ二次構造内に含ま
れている。伸長されていない形態において、スコーピオン・プライマーは、蛍光
団とクエンチャー部分がかなり近接しているため、蛍光がない。PCRの際に、前
記スコーピオンのプライマー成分は、その3'が伸長され、プローブ・ハイブリダ
イゼーションに必要とされる相同的標的配列が産生される。前記スコーピオン・
プローブ配列が、増幅された標的にハイブリダイズすると、前記蛍光団およびク
エンチャー部分が空間的に分離されて、標的が増幅されると同時に蛍光シグナル
に有意な増加を生じる。プローブおよびアッセイ条件を慎重にデザインすること
により、リアルタイムPCR解析の際に完全マッチの標的のみが蛍光シグナルの増
加を生じ、多型標的を判別することができる。
【０００７】 TaqManプローブ、分子ビーコン、ハイブリダイゼーション・プローブおよびス
コーピオン・プライマーでは、ポリヌクレオチド配列を検出および判別するため
にFRETを利用する。しかし、他のライトアップ・プローブ系では、DNA配列を検
出および判別するために、ドナーとアクセプター部分間のFRET移転を必要としな
い。これらのライトアップ・プローブは、オリゴヌクレオチド認識配列および単
一の蛍光性レポーター基を含み、このようなレポーターは、典型的には不斉シア
ニン色素チアゾールオレンジの誘導体である。前記ライトアップ・プローブの蛍
光色素成分は、オリゴヌクレオチド分子の末端に付着される。一本鎖のときに、
相補的な核酸配列にハイブリダイズしたときよりも、プローブは有意に低い量の
蛍光を発光する。蛍光発光量を測定することにより、ライト−アップ・プローブ
を、核酸配列の検出および単一部位が異なった標的間の判別のために使用しても
よい。
【０００８】 単一チューブ内で標的DNAを増幅し、配列の検出/判別を行うアッセイである均
一(homogenous)アッセイが、分子ビーコン、TaqManプローブ（5'エキソヌクレア
ーゼアッセイ）、FRETプローブおよびスコーピオン・プライマーにおいて記載さ
れている。均一解析法により、結果を生じるための下流の解析（たとえば、PCR
産物の精製、酵素消化、ゲル解析その他）を行う必要がなくなり、反応間の相互
汚染の可能性が減少される。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明 一つの側面において、本発明は、ハイブリダイゼーション・ビーコン（HyBeac
on）であって、実質的に二次構造をもたず、かつヌクレオチド残基の一つがレポ
ーターでラベルされ、およびもう一つが任意にクエンチャーでラベルされており
、好ましくは前記レポーターでラベルされたヌクレオチド残基と前記クエンチャ
ーでラベルされたヌクレオチド残基間のヌクレオチド残基が1〜15の間であるヌ
クレオチド残基で形成されたオリゴヌクレオチドであるハイブリダイゼーション
・ビーコンを提供する。蛍光団部分とクエンチャー部分を両方もつハイブリダイ
ゼーション・ビーコンをF-Q HyBeaconと命名し、一方、蛍光団などのレポーター
成分をもつが、クエンチャー部分を欠いたプローブをF HyBeaconと命名する。
【００１０】 本発明のハイブリダイゼーション・ビーコンは、実質的に二次構造をもたない
直鎖状の一本鎖オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドの一領域が、も
う一方とハイブリダイズすると二次構造を生じ、たとえばループを形成して（従
来の分子ビーコンと同様に）、該オリゴヌクレオチドがその相補的標的とハイブ
リダイズする効率を減少させる。本発明のHyBeaconは、該オリゴヌクレオチドの
一領域がもう一方にハイブリダイズする傾向が、実質的に全く存在しない。
【００１１】 前記HyBeaconの長さは、相補的ポリヌクレオチド標的とハイブリダイズして、
その融解温度が標的の正確な配列に依存する安定なハイブリッドを提供するのに
適した長さである。15残基未満のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである
場合、特に前記ハイブリダイズする2つの配列が正確に相補的でない場合は、十
分に安定なハイブリッドを形成しない。約30ヌクレオチド残基より長いオリゴヌ
クレオチドである場合は、単一ヌクレオチドミスマッチが存在する可能性に対し
て、ハイブリッドの融解温度が比較的感受性が低いハイブリッドを形成する。ヌ
クレオシド残基は、通常天然に存在するA、C、GおよびTに由来する。しかし、前
記ハイブリダイゼーション・ビーコンの一以上の位置でヌクレオチド類似体を使
用してもよく、このようなヌクレオチド類似体は、たとえば塩基部分、および／
または糖部分、および／または三リン酸の結合に修飾がなされていてもよい。プ
ロピニルdU（dT-アナログ）および2-アミノdA（dA類似体）などの塩基修飾は、
一般にハイブリダイゼーション特性を変化させ、および15未満または30より多い
ヌクレオチド残基を有するオリゴヌクレオチドを使用することも魅力的であろう
。あるいは、ペプチド核酸（PNA）、ロック核酸（locked nucleic acid）（LNA
）、2'-O-メチルRNA、ホスホルアミダートDNA、ホスホロチオエートDNA、メチル
ホスホナートDNA、ホスホトリエステルDNAまたはDNA塩基類似体からなるか、ま
たはこれらを含むオリゴヌクレオチドを、より安定して標的配列と相互作用を形
成するために使用してもよい。
【００１２】 FおよびF-Q HyBeaconsは、相補的な核酸配列がハイブリダイズしたときに、一
本鎖のコンフォメーションのときよりも有意に多量の蛍光を発光した。F HyBeac
onsにはクエンチャー成分が存在しないにもかかわらず、一本鎖状態のときより
も二本鎖のときに有意に蛍光シグナルを発光したことは、予想外の所見であった
。
【００１３】 関連するアクセプター・プローブを、またはプローブ間のエネルギー移転を必
要とせず（既知のハイブリダイゼーション・プローブにおいて必要とされる）、
プローブ・アッセイをデザインできる点において、これは有利な所見である。本
明細書の目的として、このようなアッセイを「単一プローブ・アッセイ」と命名
する。
【００１４】 蛍光団−クエンチャー系は、文献に詳しく記載されており、本明細書でさらに
記載することはしない。蛍光団でラベルされたヌクレオチド残基、およびクエン
チャーでラベルされたヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドの調製も、文
献に詳しく記載されている。
【００１５】 前記シグナル比とは、ハイブリダイゼーション・ビーコンを含む二本鎖ハイブ
リッドのシグナル強度と、一本鎖プローブのシグナル強度の比であり、好ましく
は可能な限り大きく、たとえば3以上である。このシグナル比は、多数の因子に
依存する。F-Q HyBeaconにおいて、励起されたドナー分子（蛍光団）から近くの
アクセプター分子（クエンチャー）へのエネルギー移転の比は、前記二分子間の
距離だけでなく、それらの相対的な角配置にも依存する。わずか1または3ヌクレ
オチド残基によって分離された蛍光団およびクエンチャー部分を有するHyBeacon
sでは、有意にかつ有効に1より大きい蛍光シグナル比を有する。3ヌクレオチド
以上離れて蛍光団およびクエンチャーを有するHyBeaconsでは、より大きなシグ
ナル比を示す。F-Q HyBeaconにおいて、蛍光団およびクエンチャー成分は、二部
分が5ヌクレオチド残基以上離れるように位置することが好ましい。5ヌクレオチ
ド未満によって分離されたドナーおよびアクセプター分子では、「接触」を生じ
て、非FRET相互作用が可能になるかもしれない。
【００１６】 F HyBeaconは、5ヌクレオチドより離れたドナーおよびアクセプター成分を有
するF-Q HyBeaconsに匹敵するシグナル比を示すことが立証されている。F HyBea
conのシグナル比は、クエンチャー部分が存在しないにも関わらず有意かつ有効
に1よりも大きい。クエンチャー部分が存在しないことにより、F HyBeaconは角
配置の影響を受けず、その結果、蛍光団とクエンチャー分子間の相対距離では、
二本鎖および一本鎖状態において発光される蛍光シグナル量を決定できない。蛍
光団部分は、HyBeaconプローブが標的分子にハイブリダイズしたときに、該プロ
ーブが一本鎖形態のときよりも有意に強い蛍光シグナルを発光すると考えられて
いる。これは、おそらくいくつかが二重鎖DNAと相互作用した形態であるためで
ある。
【００１７】 一定の場合には、前記オリゴヌクレオチド内に一以上のレポーターを含むこと
が適切であろう。
【００１８】 本発明にしたがったハイブリダイゼーション・ビーコンにおいて、好ましくは
、前記オリゴヌクレオチドは、既知の多型を有する既知のポリヌクレオチド標的
の対立遺伝子の一つに完全に相補的な配列を有する。たとえば、点変異、または
一塩基挿入もしくは欠失（SNP）である。F-Q HyBeaconでは、前記標的における
このようなSNPは、たとえ本質的でないとしても、好ましくは蛍光団ラベルされ
たヌクレオチド残基とクエンチャーラベルされたヌクレオチド残基間のハイブリ
ダイゼーション・ビーコンの中間ヌクレオチド残基に相補的である。F HyBeacon
において、前記多型部位は、たとえ本質的でないとしても、好ましくは前記オリ
ゴヌクレオチドプローブ内の中心に位置している。
【００１９】 あるいは、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、既知の非多型ポリヌク
レオチド標的に相補的であってもよく、単にその標的を検出するために使用して
もよい。また、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、未知のおよび特徴づ
けられていない多型を有する潜在的な多型標的を研究するために使用してもよい
。ディファレンシャル・ビーコン・ハイブリダイゼーションおよび融解ピークTm
の相違によって、未知の多型の位置および／または特質をマップできる可能性が
考えられる。
【００２０】 前記蛍光団ラベルされたヌクレオチド残基および／またはクエンチャーラベル
されたヌクレオチド残基は、好ましくは、5’末端または3’末端よりもむしろオ
リゴヌクレオチド配列の内部に位置する。前記ハイブリダイゼーション・ビーコ
ンが、ポリヌクレオチド標的とハイブリダイズを生じると、これらの特徴のすべ
てが、最適な融解温度を有し、かつ完全マッチの鎖と単一または多数の部位にミ
スマッチを有する鎖の間の融解温度（ΔTm）に実質的な相違を有する安定なハイ
ブリッドの形成に寄与する。
【００２１】 二以上のハイブリダイゼーション・ビーコンであって、検査条件下においてSN
Pの各対立遺伝子に完全に相補的なものが提供されることによって便利になるで
あろう。それぞれのハイブリダイゼーション・ビーコンが異なった蛍光団を有す
る場合、ホモ接合性およびヘテロ接合性の標的を解析するための溶液にプローブ
を混合すれば便利になるであろう。同様の方法において、種々の対立遺伝子にお
けるいくつかの異なったSNPsに相補的なハイブリダイゼーション・ビーコンの混
合物を、多重解析のための溶液中で一緒に使用してもよい。ただし、それぞれが
、スペクトルの異なった蛍光団でラベルされている。
【００２２】 あるいは、本発明のハイブリダイゼーション・ビーコンは、支持体上または支
持体内に固定化されて提供されてもよい。溶液中で相補的な標的と自由にハイブ
リダイズするような形態で、支持体を使用してオリゴヌクレオチドを固定化する
ための技術およびリンカーが、文献に詳細に記載されている。また、支持体を使
用して、間隔を置いた位置に固定されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイで
あって、異なったオリゴヌクレオチドプローブが本発明による異なったハイブリ
ダイゼーション・ビーコンであるアレイが、本発明の範囲に含まれる。さらに、
HyBeaconプローブは、支持体上または内に固定されたDNA標的を解析するために
使用しもよく、このような解析では、異なった標的をアレイ型フォーマットで間
隔を空けた位置に置いてもよい。
【００２３】 もう一つの側面において、本発明は、既知のまたは疑わしい多型を任意に有す
るポリヌクレオチド標的を調査するための方法であって、該方法は、蛍光団ラベ
ルされたヌクレオチド残基および任意にクエンチャーラベルされたヌクレオチド
残基を含むオリゴヌクレオチドプローブを提供することを含む方法を提供する。
前記ポリヌクレオチド標的は、前記オリゴヌクレオチドプローブとインキュベー
トすることによってハイブリッドを形成し、前記オリゴヌクレオチドプローブは
、前記ハイブリッドが形成されたときに、一本鎖形態のときよりも蛍光レベルの
増加を示す。前記オリゴヌクレオチドプローブによって発光された蛍光レベルは
、所定の温度で観測されるか、または温度範囲以上でモニターされる。好ましく
は、前記オリゴヌクレオチドプローブは、本明細書において定義されたハイブリ
ダイゼーション・ビーコンである。本発明の好ましい態様において、前記方法は
、関連するクエンチャーを伴わず、かつアクセプター部分を保有するさらなるプ
ローブを伴わない、本発明にしたがったハイブリダイゼーション・ビーコンの単
一型を利用する。
【００２４】 前記ポリヌクレオチド標的は、DNA、RNAまたはcDNAであってもよく、一本鎖形
態で使用され、またはDNA二本鎖を三本鎖形成の調査のために使用してもよい。
前記ポリヌクレオチド標的は、既知の多型、好ましくはSNPｓを有する。前記標
的を、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーション条件下でインキュ
ベートする。このプローブは、本明細書において記載したハイブリダイゼーショ
ン・ビーコンであってもよい。前記ハイブリッドは、一本鎖オリゴヌクレオチド
プローブよりも強い蛍光シグナルを発生することが必要である。前記ハイブリッ
ドの融解温度は、数ある中で、ポリヌクレオチド標的とオリゴヌクレオチドプロ
ーブが完全に相補的であるかどうか、あるいは前記SNPの位置または近くで生じ
ている単一またはさらには二重のミスマッチが存在するかどうかに依存する。前
記方法は、前記オリゴヌクレオチドプローブによって発光される蛍光シグナルレ
ベルを、前記ハイブリッドの融解温度近くの所定の温度、または温度範囲以上で
観測することを含む。二つの選択肢を記載する。ただし、その他も可能である：
− a）前記ハイブリッドを含む溶液の温度をゆっくりと上昇し、一方、温度（-dF
/dT）対温度に関して蛍光シグナル強度のネガティブ誘導体のグラフを構築する
ために、連続して蛍光シグナルを観測する。前記ハイブリッドの融解温度は、ピ
ークとして現れ、前記ポリヌクレオチド標的配列についての情報を提供する。Hy
Beacon融解解析を介して生じたTmsを、多型標的を区別するために使用すること
もできる。選択される温度範囲は、一般に前記ハイブリッドの融解温度を包含す
る。
【００２５】 b）前記ハイブリッド溶液を所定の温度に保持して、蛍光レベルを観測した。
一般に、前記所定の温度は、完全マッチのハイブリッドの融解温度と、一または
二のミスマッチを有するハイブリッドの融解温度間の中間が選択される。観測さ
れた蛍光シグナルのレベルは、前記ハイブリッドが融解したかどうかの指標を提
供し、そしてポリヌクレオチド標的の配列についの情報を提供する。多型標的は
、終了点およびリアルタイム、または動態学的フォーマットで判別されてもよい
。
【００２６】 典型的には、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、前記標的ポリヌクレ
オチドの対立遺伝子の1つに相補的な配列、典型的には完全に相補的な配列を有
する。完全に相補的なビーコンを使用することにより、マッチしたハイブリダイ
ゼーションとミスマッチしたハイブリダイゼーション間の区別が可能になる。適
宜に、二以上の異なったハイブリダイゼーション・ビーコンは、標的ポリヌクレ
オチドの別々の対立遺伝子に相補的な配列、理想的には完全に相補的な配列を有
する。
【００２７】 都合の良いことに、前記ポリヌクレオチド標的は、適切なプライマーを使用し
てゲノムDNAの所望の部位を増幅することによって形成されたPCR アンプリマー
（amplimer）であってもよい。均一モードによって、たとえば増幅サイクル手順
の前、間、または後に、前記オリゴヌクレオチドプローブを単一の反応容器に添
加することによって増幅し、かつ標的調査を行うことによって簡便になるであろ
う。また、唾液などのサンプルから、DNA、RNAまたはcDNAを前もって抽出せずに
、直接標的の増幅および配列調査を行うことによって簡便になるであろう。好ま
しくは、前記オリゴヌクレオチドプローブは、PCR増幅の際に連鎖伸長を妨げる
ように、その3’末端が修飾される。
【００２８】 前記ハイブリダイゼーション・ビーコンの融解温度を、多型標的ポリヌクレオ
チドを同定するために使用してもよい。また、本発明のハイブリダイゼーション
・ビーコンは、単一のプローブを使用してホモ接合性およびヘテロ接合性DNAを
同定するために使用してもよい。
【００２９】 以下の実施例は、本発明を例示するものであり、いかなる方法においても限定
を意図するものではない。
【００３０】
【実施例】
材料および方法 （i）ハイブリダイゼーション・ビーコンのデザイン HyBeaconプローブを、ヒトN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）遺伝子（
表1参照）およびシトクロムP450をコードする（CYP）遺伝子（表2および3を参照
）内にある十個のSNPsに対してハイブリダイズするようにデザインした。プロー
ブは、多型ヌクレオチドがHyBeacon配列の中心近くに位置するようにデザインし
た。すべてのHyBeaconプローブは、約20ヌクレオチドの長さであり、内部のウラ
シル残基（DNA配列においてはチミンに置換する）に結合された蛍光団部分をも
つ。蛍光色素である6-カルボキシフルオレッセイン（FAM）、テトラクロロフル
オレッセイン（TET）およびヘキサクロロフルオレッセインを、新規ケミストリ
ー（novel chemistry）によってU残基に吸着し（Oswel DNA services, Southamp
ton, UKから入手可能）、六蛍光団結合ケミストリー（FAM propo dU、FAM propa
rgyl dU、dU C6 FAM、dU FAM、FAM cap prop dUおよびFMOC dU)を評価した。dU
C6 FAMおよびFMOC dU蛍光団が、わずかに優れたデータを生じることがわかり、
優先的に使用した。また、F-Q HyBeaconsでは、クエンチャー部分（メチルレッ
ド）を内部のU残基に配置し、そのHyBeaconsにおいて、蛍光団とクエンチャー分
子が1、3、5、6、7、8および9ヌクレオチド残基離れたHyBeaconsを試験した。蛍
光団とクエンチャー分子が側面に位置する多型ヌクレオチド、および側面に位置
しない多型ヌクレオチドをもつF-Q HyBeaconsを調査した。前記プローブをリア
ルタイムPCRアッセイに組み込んだときに、Taqを介したHyBeaconsからの伸長を
防ぐために、合成した大多数のHyBeaconsでは、3'リン酸またはオクタンジオー
ル成分をもつ。FおよびF-Q HyBeaconsは、NAT2およびCYP多型配列の対立遺伝子
の1つと完全にマッチするようにデザインされており、その結果SNPの他のバリア
ントでは、プローブ・ハイブリダイゼーションの際にミスマッチ部位が作製され
る。両方の対立遺伝子に完全に相補的なHyBeaconプローブを、両対立遺伝子それ
ぞれのSNPについて合成した。
【００３１】
【表１】 NAT2多型配列。アリールアミンN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）のヒ
ト遺伝子配列。単一ヌクレオチド多型（SNPs）を含む位置は、太字で示してある
。制限断片長多型は、481（*5A）、590（*6）、803（*5C）および857（*7A）に
存在する。
【００３２】 （ii）NAT2およびCYP2D6多型PCR産物の増幅 多型標的は、唾液（水で50％稀釈）、参照血液サンプル（Dundee大学）、ヒト
胎盤ゲノムＤＮＡ(Sigma-Aldrich)、増幅されたNAT2およびCYP産物を含むpGEM-T
プラスミド(Promega)から分離したゲノムDNAのいずれかから増幅した。多型部位
に関連して、大きさおよび位置が異なったNAT2並びにCYPアンプリコンを生じる
種々のプライマー対を評価した。たとえば、NAT2*5A、NAT2*5C、NAT2*6、NAT2*7
A、CYP2D6*3およびCYP2D6*4多型配列を増幅するために使用した最適なプライマ
ー対は、それぞれ195991/195993、DdeF2/DdeR、TaqF2/TaqR2、BamF2/BamR、2D63
F/2D63Rおよび2D64F2/2D64R2である（表4）。多型ヌクレオチドを含む約80-150B
pのDNA断片を増幅するために、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った
。標的の検出およびSNPの判定アッセイは、均一および不均一なフォーマットに
おいて行った。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
【００３５】
【表４】 （iii）SNPsの不均一融解解析 PCR量は、典型的には30μlであり、約200ngのDNAテンプレート、1×PCRバッフ
ァー（Pharmacia）、0.5μの各プライマー、1unitのTaqポリメラーゼ(Amersham
Pharmacia Biotech)および1mM dNTPs (Amersham Pharmacia Biotech)が含まれる
。変性反応工程（94℃、5分）の後、変性（94℃、30秒）、プライマーのアニー
リング（50℃、1分）および産物の伸長（72℃、1分）からなる40サイクルを使用
してPCR標的を増幅した。増幅後、PCR産物を0.1体積の3M酢酸ナトリウムおよび2
体積のエタノールで沈殿した。-20℃で10分間インキュベーションした後、13000
r.p.m.で30分間遠心して70％エタノールによる洗浄工程を二回おこない、ペレッ
トを1×ハイブリダイゼーションバッファー／プローブ混合物（50mM Tris pH7.4
、3mM MgCI2、適切なHyBeacon）に再懸濁した。この懸濁では、最初のPCR反応ご
とに、5μlのバッファー／プローブ混合物を添加した。F-Q HyBeaconsは、典型
的には500nM〜1μＭ間の濃度で使用し、F HyBeaconsは、100nM〜300nMの濃度の
間で使用した。5μlの反応量を、融解曲線解析プログラムを使用してLightCycle
rTM(Roche)によって解析した。ハイブリダイゼーション解析には、初期蛍光読み
とり（30℃において30秒）、ハイブリダイゼーション（94℃において1分間の後
、30℃において2分）、規準化（65℃において1秒、85℃において1秒、30℃にお
いて1秒）および融解解析（0.1℃／秒の移行速度で30℃〜95℃まで）を含む。規
準化に単一蛍光獲得を使用したことを除き、蛍光は連続してモニターした。融解
曲線は、LightCyclerソフトウェアを使用して、温度（ｙ軸に対する-dF/dt）対
温度（x軸）についてネガティブ誘導体蛍光をプロットすることによって構築し
た。
【００３６】 （iv）均一「リアルタイム」PCR増幅アッセイ PCR体積は20μlとし、これには2μlの50%唾液または約200ngのゲノムDNA、1xZ
-TaqTバッファー（TaKaRa）または1xHyBeacon PCRバッファー（10mmTris. Cl pH
8.8、25mm KCI、3.5mM MgCI2、5ng/pl BSA）、0.5μMプライマー、1unit Taq
ポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）、および1mmのdNTPsが含まれる。
増幅された標的の蓄積をモニターするために蛍光プローブを利用する「リアルタ
イム」PCRアッセイにおいても、適切なF-QおよびF HyBeaconsがそれぞれ500-100
0nMまたは100-300nM含まれる。多型標的配列は、LightCyclerTM（Roche）および
ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems）で増幅した。LightC
yclerキャピラリーで行った反応液を、95℃において1分間（ゲノム、およびプラ
スミドDNA）または5-10分間（唾液サンプル）インキュベーションすることによ
って変性させた後、変性（95℃において10秒）、プライマーのアニーリング（Fa
qにおいて10秒間）、および産物の伸長（72℃において10秒間）を含む40-50サイ
クルを使用して多型標的を増幅した。蛍光穫得は、各アニーリング工程の終わり
に行った。蛍光穫得温度（Faq）は、アンプリコンおよびHyBeacons間で変更し、
このFaqは、マッチおよびミスマッチプローブのTms（表5を参照）間のおよそ中
間である。たとえば、2D64C* HyBeaconアッセイでは、リアルタイム増幅によっ
てCYP2D6 *1および*4 SNPsを判別するために、57℃のFaqを使用する。増幅後、
反応液を変性（95℃において10秒）させて、冷却（35℃において2分間）した後
、蛍光を連続的に得て、融解解析（0.1℃／秒の移行速度で30℃〜95℃まで）を
行った。融解ピークは、LightCyclerソフトウェアを使用して、温度（ｙ軸に-dF
/dt）対温度（x軸）についてネガティブ誘導体蛍光をプロットすることによって
構築した。
【００３７】 (v)HyBeacon標的の非対称増幅 プローブ・ハイブリダイゼーションのための一本鎖DNA標的分子を作製するた
めに、非対称PCRを使用した。増幅は、LightCyclerキャピラリーで行った。HyBe
aconハイブリダイゼーションに必要な、相同DNA配列を含む一本鎖産物を増幅す
るために、アンチセンスプライマーを使用した。プローブ-結合部位を含まない
鎖を作製するために、センスプライマーを二本鎖DNAの初期増幅に含めた。アン
チセンスおよびセンスプライマーは、典型的には50：1の比で使用した。多型NAT
2およびCYP2D6標的を含むpGEM-Tプラスミドを、PCRテンプレートとして使用した
。PCR反応体積は、典型的には20μlであり、およそ200ngのプラスミドDNA、1xZ-
Taq PCRバッファー（TaKaRa）、0.5μMのアンチセンスプライマー、10nMのセン
スプライマー、1unit Taq ポリメラーゼ（Amersham Pharmacia Biotech）、1mM
dNTPs（Amersham Pharmacia Biotech）および適切なハイブリダイゼーション・
ビーコンが含まれている。均一増幅および融解ピークの解析は、上述の通りに行
った。
【００３８】 (vi)多型標的の固相解析 PCR増幅は、アンチセンスプライマーの5'末端がビオチン化されていることを
除いて、均一アッセイにおいて前述した通りに行った。増幅に続いて、10-15μl
のビオチン化されたPCR産物を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレ
ート（Hybaid）の個々のウェルに添加した。1x DASH buffer gold（Hybaid）を
各ウェルに添加して、最終体積を50μlとした。室温で1時間インキュベーション
した後、該溶液をそれぞれのウェルから除去した。50μlの0.1M NaOHをウェルに
添加して、二本鎖DNAを変性させた。5分間インキュベーションした後、ウェルを
50μlの0.1M NaOHで一回および1x DASH バッファーで二回洗浄して、ビオチン化
されていないDNA鎖を除去した。1x DASHバッファー中の過剰のHyBeacon（>1pM）
（2μlプローブ+48μlバッファー）を各ウェルに添加した。95℃において1分間
反応液を加熱して、次いで25℃まで概算速度0.08℃/秒で冷却することによって
、固定化された一本鎖DNAにプローブをハイブリダイズさせた。溶液およびハイ
ブリダイズしていないプローブをウェルから除去して、50μlのフレッシュ1xDAS
Hバッファーに置換した。ハイブリダイズしたプローブの融解解析は、DASH(Dyna
mic Allele Specific Hybridisation)装置(Hybaid)で、0.02-0.07℃/秒間の移行
速度を使用して行った。
【００３９】 (vii)多重HyBeacon標的検出 多数のプライマー対およびHyBeaconプローブを含む反応は、ABI PRISM（R）77
00Sequence Detectorを使用して行った。NAT2*4（*7A遺伝子座）、NAT2*4（*5C
遺伝子座）およびCYP2D6*1多型標的を増幅して、それぞれFAM、TETおよびHEXラ
ベルされたHyBeaconプローブを使用して検出した（表4）。変性反応工程（95℃
において5分）の後、変性（95℃において15秒）、プライマーアニーリング（50
℃において30秒）および産物の伸長（72℃において30秒）を含む40サイクルを使
用して、多型標的をゲノムDNAから増幅した。蛍光穫得は、それぞれの増幅工程
においてプライマーアニーリングの際に行った。
【００４０】 結果および考察 (i)多型標的配列 ヒトN-アセチルトランスフェラーゼ2（NAT2）遺伝子座は、多型であることが
示されている。NAT2遺伝子の欠失コピーでは、いくつかのアリールアミン薬剤お
よび毒物のアセチル化を遅くすることが知られている。疫学調査では、この緩徐
アセチル化表現型を、膀胱および結直腸癌に対するリスクと関連づけている。多
型NAT2遺伝子座の解析により、ヌクレオチド置換を含む多くの緩徐アレルが確認
されている（表1を参照）。これらの置換には、部位481（TからCに）、590（Gか
らAに）、803（AからGに）および857（GからAに）の点変異を含み、この変異が
、それぞれ*5A、*6、*5Cおよび*7Aの制限断片長多型性（RFLPs）を生み出す。こ
れら多型遺伝子座のそれぞれにおいて、*1はヒトゲノムにおいて最も頻繁に生じ
る対立遺伝子変異である。
【００４１】 CYP2D6、CYP2C9およびCYP2C19などのヒト遺伝子によってコードされるチトク
ロームP450酵素（デブリソキン4-ヒドロキシラーゼ）は、抗降下剤、抗不整脈剤
および血圧降下剤を含む30以上の一般的に処方される薬剤の代謝に応答性である
。コーカサス人のおよそ5-10%は、チトクロームP450酵素活性が欠損しているた
め、不十分な代謝表現型を示す。多くの対立遺伝子変異が、CYP2D6遺伝子座にお
いて同定されており、最も多くは、CYP2D6*3（別名CYP2D6A）およびCYP2D6*4（
別名CYP2D6B）単一ヌクレオチド多型である。*3および*4遺伝子型をもつ個体で
は、不十分な酵素活性表現型をもつことが示されている。
【００４２】 ハイブリダイゼーション・ビーコンが、特異的に増幅されたDNA配列を検出し
、および単一ヌクレオチド多型を含む標的を判別する可能性を試験するために、
NAT2およびCYPの多型を使用した。
【００４３】 (ii)オリゴヌクレオチド標的に対するディファレンシャル・プローブ・ハイブ
リダイゼーション HyBeaconプローブが標的配列にハイブリダイズする場合、その相互作用は、完
全にマッチまたはミスマッチのいずれでもよい。図1には、マッチ、ミスマッチ
、および二重ミスマッチの二本鎖間における相違を例示し、それぞれの相互作用
の型を分類している。HyBeaconプローブは、完全マッチおよびミスマッチのオリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズしており、LightCyclerで分析した。一本鎖お
よび二本鎖状態のHyBeaconから発光された蛍光量を比較した場合、プローブが標
的分子にハイブリダイズしたときに、溶液中でフリーなときよりも多くの蛍光量
が発光されることが観測された。一本鎖および二本鎖HyBeaconsプローブから生
じたこのような蛍光発光の相違は、統計学的に有意であり（p<0.01単一-因子ANO
VA）、標的DNAの存在を蛍光の定量により検出し得る方法が提供された（図2）。
【００４４】 温度およびプローブ・ハイブリダイゼーション状態の変化によって引き起こさ
れる蛍光発光の変化をモニターすることにより、HyBeacon/相同体対の融解ピー
クを作製することができる。オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたHyBeacon
プローブは、完全に相補的な標的分子にハイブリダイズしたプローブと比較して
、低いTmsの融解曲線を生じる。図2は、マッチおよびミスマッチのオリゴヌクレ
オチド標的に対するNAT2 *4 HyBeacon（*5A SNP）のディファレンシャル・ハイ
ブリダイゼーションを示す。ミスマッチ領域では、プローブTmが低下しており、
融解ピーク解析を介して多型標的を判別することができる。マッチ、単一ミスマ
ッチおよび複数ミスマッチの標的も、融解ピークTmによって確実に判別すること
ができるであろう。さらに、マッチおよびミスマッチのTms間の中間温度で蛍光
穫得を行うことよって、蛍光の定量に基づいて多型標的を判別することができる
ようになる。蛍光穫得温度では、マッチするHyBeaconがその標的にハイブリダイ
ズして、その標的から溶解して離れてしまったミスマッチのプローブよりも多く
の蛍光を発光する（図2）。
【００４５】 溶液中では、HyBeaconsは、少量のバックグラウンド蛍光のみを発光する。し
かし、標的配列に結合すると、ハイブリダイゼーションの直接の結果として、有
意により蛍光が発光される。わずか単一ヌクレオチドが異なった配列を、(i)ハ
イブリダイゼーション・ビーコン分子がその標的配列にハイブリダイズするとき
に生じる蛍光量および（ii）前記プローブ/標的二本鎖の融解温度（Tm）によっ
て判別することができるであろう。
【００４６】 蛍光定量化および融解分析法を、F-QおよびF HyBeaconプローブで行うと、同
等な質の結果を生じた。図3は、オリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズしたF
およびF-Q NAT2*4 HyBeaconsに由来する融解曲線を例示する。F-Q HyBeaconsは
、蛍光団とクエンチャーの間隔および角配置効果（データは示さず）に対して若
干の依存性を有するかもしれない。しかし、F HyBeaconsでは、クエンチャー部
分が存在しないにもかかわらず、標的ハイブリダイゼーションに対して高いレベ
ルの蛍光発光を示す。FおよびF-Q HyBeaconプローブの蛍光団部分は、二本鎖の
状態のときに、一本鎖コンホメーションの場合よりも有意に蛍光を発光する（下
記参照）。
【００４７】 (iii)単一ヌクレオチド多型の多様性 HyBeaconプローブを使用して、NAT2およびCYP2D6対立遺伝子に存在する一塩基
置換多型が判別されることが示されている。ハイブリダイゼーション・ビーコン
分子が、挿入および欠失（InDel）多型を判別する能力を試験するために、一連
のオリゴヌクレオチド標的をTB0993 NAT2 *4プローブにハイブリダイズさせた。
多型の型および位置を変えて、3種の挿入および3種の欠失オリゴヌクレオチドを
解析した。それぞれのInDel標的は、完全マッチのオリゴヌクレオチドにハイブ
リダイズしたHyBeaconと比較して、かなりのTm低下を生じた（図4）。置換多型
と同様に、InDelsでも、HyBeacon/標的二本鎖のTms、並びにマッチとミスマッチ
プローブのTms間の温度で発光される蛍光量によって判別できるであろう。
【００４８】 (iv)PCR産物におけるSNPsの判別（不均一アッセイ） 別々のチューブで標的増幅およびSNP判別を行う不均一アッセイを、NAT2 *5A
、*5Cおよび*6多型について、並びにCYP2D6 *3および*4 SNPsについて行った。
融解ピーク解析を介して確実にSNP判別可能な好結果の不均一アッセイが、試験
した全ての多型において展開された。多型ヌクレオチドを含むPCR産物は、NAT2
およびCYP2D6テンプレートDNAから増幅した。アンプリコンの大きさは、80bp〜2
82bpの範囲の長さである。PCR産物を単離して、HyBeaconプローブを含むハイブ
リダイゼーションバッファーに再懸濁した。プローブをPCR標的にハイブリダイ
ズさせて、LightCyclerキャピラリーにおいて融解解析を行い、PCR標的の同一性
に依存したTmsの融解ピークを生じた。HyBeaconsは、マッチおよびミスマッチの
PCR標的を、プローブ/標的二本鎖の融解温度によって容易に判別する。F-Qおよ
びF HyBeacon変異型では、どちらも不均一SNP判別アッセイが適切に実行される
。
【００４９】 CYP2D6*3多型について行ったアッセイは、FおよびF-Q HyBeaconsが、不均一解
析においてどのくらいSNPを判別することができるかを示している。119bpのPCR
産物をCYP2D6*3多型DNAから増幅した。PCR産物を単離して、2D63A（F-Q）または
2D63B(F)HyBeaconプローブを含むハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁し
た。2D64 F HyBeaconは、クエンチャーを欠いていることにより大きな蛍光バッ
クグラウンドを生じるため、F-Qプローブより5倍低い濃度で使用した。図5は、H
yBeaconが*1および*3 CYP2D6対立遺伝子を含むPCR標的にハイブリダイゼーショ
ンすることによって誘導された融解曲線を示す。2D63Aおよび2D63Bプローブは、
同一のヌクレオチド配列を有し、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子に完全に相補的あ
り、したがって*3対立遺伝子にハイブリダイズするときは、単一塩基ミスマッチ
を含むことになる。2D63A F-Q HyBeaconは、*3および*1対立遺伝子の配列にそれ
ぞれハイブリダイズしたときに、約56℃および65℃のTmsを有する融解ピークを
生じた。2D63B F HyBeaconは、ミスマッチおよびマッチPCR産物にそれぞれハイ
ブリダイズしたときに、同様の約58℃および65℃のTmsを有する融解ピークを生
じた。HyBeaconが前記SNPの2種の対立遺伝子にハイブリダイゼーションすること
によって生じた融解温度は、非常によく再現することができ、統計学的にも有意
である（単一因子ANOVAがp<0.01）。したがって、CYP2D6 *1および*3遺伝子型（
それぞれ、正常および欠損型の酵素代謝表現型に関連する）は、不均一HyBeacon
アッセイで確実に判別される。
【００５０】 (v)核酸配列のリアルタイム検出 HyBeaconプローブから発光される蛍光量は、オリゴヌクレオチドが相補的な核
酸配列にハイブリダイズしたときに、一本鎖コンホメーションのときよりも有意
に大きい。したがって、PCR増幅の経過全体にわたって、特定のDNA標的の蓄積を
リアルタイムでモニターするのに、HyBeaconsが反応液に含まれていてもよい。
図6は、増幅の各サイクルにおいて産物の蓄積をモニターするために2D64C* HyBe
aconを使用した、ゲノムおよび唾液DNAに存在するCYP2D6*1配列の検出を示す。
【００５１】 (vi)SNPsの「リアルタイム」判別（均一アッセイ） HyBeaconプローブが多型標的配列にハイブリダイズするときに、相互作用は、
完全にマッチするか、またはミスマッチするかいずれであってもよい。ヌクレオ
チドがミスマッチする部位では、完全に相補的な配列と比較してハイブリダイゼ
ーションTmが低下するため、プローブ/標的二本鎖が不安定になる。ハイブリダ
イズしたHyBeaconから発光される蛍光量は、一本鎖プローブより有意に多いので
、ハイブリダイゼーションTmに基づいて多型標的配列を判別することができるだ
ろう。PCRにおけるアニーリング（および蛍光穫得）温度を最適化して、HyBeaco
nプローブに完全に相補的な標的配列のみが増幅時に蛍光シグナルを増加するよ
うな選択的ハイブリダイゼーションによって、密接に関連したDNA配列をリアル
タイム判別することもできるだろう。SNPsを含む多型配列を、リアルタイム増幅
の際に得られる蛍光データを使用して同定してもよい。たとえば、HyBeaconプロ
ーブが、変異を含むDNA配列に完全に相補的に設計されている場合、変異対立遺
伝子が存在する場合にのみ蛍光発光の増加が生じる。
【００５２】 HyBeaconプローブを、NAT2およびCYP多型配列を増幅するようにデザインした
ポリメラーゼ連鎖反応に組み込んだ。増幅の各サイクルのプライマーアニーリン
グ段階において、マッチおよびミスマッチHyBeaconのTmsの中間温度で単一蛍光
読み込みを獲得した。蛍光穫得温度において、前記HyBeaconは完全マッチの標的
にハイブリダイズすると予測されるが、ミスマッチ配列のハイブリダイズは予測
されない。ディファレンシャル・プローブ・ハイブリダイゼーションでは、蛍光
穫得温度において完全マッチのテンプレートを含む反応液は、増幅の際に蛍光を
増加する結果となるが、一方ミスマッチのテンプレートを含む反応液では、蛍光
の増加をもたらさない。NAT2*4および*5A多型を判別するために使用したF HyBea
con 0203002を用いた均一SNP解析を、ここに示す。前記HyBeaconは、NAT2の*4対
立遺伝子に完全にマッチし、*5A配列にハイブリダイズした場合は、単一塩基ミ
スマッチを有する。図7aは、SNPsの「リアルタイム」判別を示しており、*4対立
遺伝子を含む反応液のみが、PCRサイクル時の蛍光発光に有意な増加を生じる。
ミスマッチする*5A対立遺伝子のみを含む反応液では、増幅の際に蛍光発光の増
加を生じない。
【００５３】 図8は、多型CYP2D6 *1および*4配列の検出および判別を示すリアルタイムHyBe
acon解析のもう一つの例であり、テンプレート供与源としてプラスミドDNAを使
用する。また、ゲノムDNAおよび唾液サンプル中に存在する多型配列の判別は、
リアルタイムHyBeacon PCR解析によって行ってもよい。図8に示した2D64C* HyBe
aconは、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子と完全にマッチし、したがって蛍光発光が
リアルタイム増加することによって、*1配列の増幅が特異的に検出される。CYP2
D6*1配列のみを含む反応では、比較的多量の発光の増加を生じるが、*4対立遺伝
子のみを含むサンプルでは、有意な蛍光増加を示さない。*1および*4対立遺伝子
を含む反応では、中程度の蛍光発光量の増加を示す。CYP2D6*4対立遺伝子に完全
に相補的な2D64C HyBeaconを使用することにより、2D64C*の遺伝子型の決定結果
を確認することができる。リアルタイムPCRによってホモ接合性およびヘテロ接
合性DNAの正確な同定を確実にするためには、TaqManTMプローブ、分子的ビーコ
ン、ハイブリダイゼーション・プローブおよびスコーピオン・プライマーと同様
に、両対立遺伝子のSNPsに関してサンプルの遺伝子型を決定するために、2種のH
yBeaconプローブが必要とされる。
【００５４】 (vii)融解曲線解析によるSNPsの判別 また、多型DNA配列は、HyBeaconプローブを使用して融解解析およびTm測定を
行うことによって、「終了点」フォーマットで検出および判別してもよい。HyBe
acon/標的二本鎖のホモ接合性融解曲線解析では、増幅直後にLightCycler反応を
行ってもよい。融解曲線解析に由来する融解温度は、完全に相補的なHyBeacons
に由来するTmsではミスマッチするプローブが相互作用したものよりも有意に大
きく、標的DNA配列を同定することができる。0203002 HyBeacon並びに*4および*
5A多型標的について行った増幅後融解解析では、マッチおよびミスマッチ配列に
ついて、それぞれ約62℃および54℃のTmsを有する融解ピークが生じた（図7b）
。マッチおよびミスマッチ標的配列とハイブリダイゼーションすることによって
生じた融解ピークのTmsは、所与のSNPにおいて非常に再現性があり、かつSNPs間
で有意に異なっている。したがって、HyBeacon融解温度を解析することによって
、SNPsの確実な判別が達成される。増幅後融解解析により、「リアルタイム」蛍
光データを確認することができ、PCRにおける蛍光増加の有無が、それぞれマッ
チまたはミスマッチ標的の存在と実際に相関していることを確認できる。したが
って、増幅後融解によって、ミスマッチ標的が存在するために蛍光増加を生じな
い反応と、標的が存在しないか、またはPCRによる増幅が全くないために蛍光増
加を生じない反応間を判別することができる。F-QおよびF HyBeaconの変異型は
どちらも、適切に「リアルタイム」増幅アッセイがなされ、かつ均一アッセイに
おいて増幅後融解曲線を生じることが示されている。しかし、F HyBeaconsでは
、同一のDNA配列のF-Qプローブと比較して、概して優れた質の増幅後融解物を生
じることが見出されている。
【００５５】 F HyBeaconプローブにおいて、ホモ接合性サンプルでは、標的配列の同一性に
依存してマッチまたはミスマッチの単一の融解ピークを生じるが、一方ヘテロ接
合性のDNAでは、マッチおよびミスマッチのピークのどちらも持った融解トレー
スを生じる。図9は、ゲノムDNAサンプルから増幅した多型CYP2D6 *1および*4配
列の、融解ピーク解析による検出および判別を示す。2D64C* HyBeaconは、完全
に相補的な*1対立遺伝子を含むホモ接合性DNAにハイブリダイズするときに、約6
0℃のTmをもつ単一の融解ピークを生じる。ホモ接合性の*4サンプルにハイブリ
ダイゼーションするミスマッチプローブでは、約49℃のTmを有する単一の融解ピ
ークを生じる。*1および*4対立遺伝子をどちらも含むヘテロ接合性のサンプルは
、60℃および49℃の融解ピークをどちらも備えたトレースを生じる。
【００５６】 (viii)ホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルの同定 SNPsをスコアする技術により、サンプルが特定の対立遺伝子に対しホモ接合性
か、またはヘテロ接合性であるかを同定できることを考慮することが重要である
。F-Q HyBeaconsを利用するヘテロ接合性解析では、ヘテロ接合性サンプルを同
定するために、SNPの2つの対立遺伝子に完全にマッチする2種の異なったプロー
ブが必要なことが見出されている。F-Qプローブは、完全に相補的な標的および
ミスマッチ標的の混合液を含む反応において、マッチ融解ピークだけを典型的に
生じることが見出されたので、2種のHyBeaconsが必須であると考えられる。ミス
マッチ融解ピークは、ヘテロ接合性の反応においては観測されない。これは、完
全に相補的な標的に対する結合が、いずれも熱力学的に有利であるか、または融
解解析ではマッチした曲線を示すと同時に、ミスマッチのピークをマスキングし
ているかのいずれかによる。2種のHyBeaconsが、同時に励起され、かつ検出でき
る異なったスペクトルの蛍光団をもつ場合、F-Qプローブを使用して、均一ヘテ
ロ接合体判別アッセイを単一のチューブで行うことができるであろう。しかし、
現在、LightCyclerは、フルオレセインを励起できるだけである。したがって、
同じLightCyclerキャピラリーにおいて2種の異なったHyBeaconsを使用したディ
ファレンシャル・ビーコン・ハイブリダイゼーション解析を、有意に異なったTm
sをもつプローブを使用して行った。ホモ接合性およびヘテロ接合性のNAT2 *4お
よび*5Aサンプルを判別するために、異なった長さおよびTmの2種のF Q HyBeacon
プローブ（F17834およびF17835）を単離して、および併用して使用した（図10）
。F17834およびF17835プローブは、それぞれホモ接合性*4および*5A DNAにハイ
ブリダイズしたときに、約60℃および52℃のTmsをもつマッチ融解曲線を生じる
。*4および*5A配列（ヘテロ接合体）を含む混合DNAに対して、F17834およびF178
35 HyBeaconsを併用して使用したときに、約59℃および52℃のTmsをもつ2種の融
解ピークが、同じ融解トレース中に生じる。単一の融解トレースに2種のピーク
が存在することを、ヘテロ接合性の指標として使用することができる。
【００５７】 F HyBeacon技術の重要な特徴は、F-Qプローブおよび以前に報告した蛍光性プ
ローブとは異なり、単一のF HyBeacon蛍光プローブを使用してホモ接合性および
ヘテロ接合性サンプルを確実に同定し得ることである。TaqManTMプローブなどの
蛍光プローブ、分子ビーコンおよびスコーピオン・プライマーでは、リアルタイ
ムPCR方法によって両対立遺伝子配列を確実に検出および判別するために、典型
的には2種のプローブを必要とする。さらに、ハイブリダイゼーション・プロー
ブでは、融解曲線解析によってホモ接合性およびヘテロ接合性のDNAを同定する
ために、一対の蛍光性オリゴヌクレオチドを必要とする。HyBeaconプローブによ
り、Tm測定および生じた融解ピークの数による融解曲線解析を介して確実にホモ
接合性およびヘテロ接合性のサンプルを判別することができる。図9および図11
は、融解ピーク解析によるホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルの同定を示す
。ここでホモ接合性サンプルは特定のTmsによって同定され、ヘテロ接合体は単
一融解トレースに2種のピークが存在することによって同定される。図11には、
ホモ接合性およびヘテロ接合性のDNA標的にハイブリダイズしたNAT2 *5C F HyBe
acon（DdeFL1）に由来する融解曲線を例示する。均一および不均一アッセイにお
いて、DdeFL1は、ホモ接合性のマッチ（*5C）およびミスマッチ（*4）標的に対
して、それぞれ約54℃および47℃のTmsを有する単一の融解ピークを生じる。*4
および*5C対立遺伝子に対してヘテロ接合性のサンプルでは、単一の融解トレー
スにおいて、マッチおよびミスマッチするピークの両方を生じることが見出され
た。したがって、HyBeacon融解トレースに2種のピークが存在することにより、
ヘテロ接合性のサンプルを確実に同定することができる。
【００５８】 HyBeaconプローブを使用してヘテロ接合性DNAを検出する能力は、ΔTm（完全
に相補的なものと、ミスマッチのハイブリダイゼーションのTm間の差異）の大き
さに依存する。表5は、NAT2およびCYP多型性遺伝子にハイブリダイゼーションさ
せた際の、HyBeaconプローブによって示されるTmおよびΔTm値を例示する。融解
ピーク解析によってホモ接合性およびヘテロ接合性サンプルを確実に同定するこ
とができるプローブを、本明細書において調査した9つのSNPsのそれぞれについ
て開発した。融解曲線解析によってヘテロ接合性DNAの存在を確実に検出するた
めには、約5.2℃を上回るΔTm値が必要であることが明らかである。ハイブリダ
イゼーションのΔTmは、プローブの長さ、ヌクレオチド・ミスマッチの位置およ
びミスマッチの同一性に依存する。HyBeaconオリゴヌクレオチドの長さは、ハイ
ブリダイゼーションの特異性を保証するのに十分足りるべきであるが、過剰とな
ってミスマッチに非感受性とならないようにすべきである。中心部位のミスマッ
チは、オリゴヌクレオチド末端に位置するミスマッチよりも、Tmに対して大きな
影響を有するので、HyBeaconsは、多型ヌクレオチドがプローブの中心近くに位
置するように設計されるべきである。すべてのヌクレオチド・ミスマッチは、ハ
イブリダイゼーションTmを不安定化する傾向を示すが、不安定化の程度は、ミス
マッチ相互作用の型に依存する。Gを含む相互作用（すなわちG/T、G/AおよびG/G
）は、室温において最も安定しており、Cを含むミスマッチ（すなわち、C/T、C/
AおよびC/C）は、最も安定していない。したがって、ΔTmに対するミスマッチの
及ぼす影響を最大にするために、Gを含むミスマッチを避けて、Cを含むミスマッ
チで行われる。
【００５９】 表5 NAT2およびCYP配列に対するHyBeaconのハイブリダイゼーションに由来するTm
およびΔTm。多型部位において生じるマッチおよびミスマッチヌクレオチドの相
互作用を含む。Tm値は、実験的変動を説明するために数回の独立した解析から得
られたものであり、平均および標準誤差値が含まれる。イタリックの値は、オリ
ゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションに由来したものである。ヘテロ
接合性DNAを同定する能力は、ΔTmに依存し、単一の融解トレースにマッチおよ
びミスマッチ融解ピークの両方が存在することによって同定される。
【００６０】
【表５】 （ix）SNPsの多重解析 HyBeaconプローブを使用した多重解析の可能性を、特異的および非特異的PCR
標的の混合液を使用して検討した。HyBeaconsは、PCRを通して増幅された特異的
DNA標的にハイブリダイズして、蛍光発光の増加を生じる。HyBeacon蛍光発光の
増加は、プローブの標的配列を欠いた非特異的DNA標的では生じない。2D64B HyB
eaconプローブが特異的標的の増幅を検出する機能を試験するために、種々の比
率の特異的および非特異的PCRテンプレート（非特異的DNAにおける特異的配列が
100、80、60、40、20、10および5%）を、均一アッセイにおいて分析した。特異
的標的のみを増幅した反応、すなわち非特異的増幅がない反応では、すべての開
始濃度の特異的標的が、蛍光発光を同等に増加して容易に検出された（図12a）
。しかし、特異的および非特異的標的が共に同じ反応において増幅されたときは
、特異的PCRテンプレートの比率が減少するにつれて（図12b）、プローブが特異
的増幅を検出する機能が低下した。本実験に由来する結果は、最高で4つまたは5
つの異なった標的を含むHyBeacon多重アッセイが可能であろうことを示唆する。
しかし、シグナル蛍光団を増加し、かつより高い感度の検出機器を使用すること
によって、5つ以上の標的に多重解析を拡大することができるであろう。
【００６１】 HyBeaconプローブの機能は、今までに、FAM、HEXおよびTET蛍光色素を使用し
て示されており、ハイブリダイズしたプローブはそれぞれ、一本鎖のHyBeacons
よりも有意に多量の蛍光を発光する。これらのスペクトルが異なったHyBeacons
により、リアルタイムPCRおよび融解ピーク解析を使用して多数の多型配列を同
時に増幅、検出および判別することもできる。図13aは、単一のABI PRISM 7700
マイクロタイタ-プレートにおいて、FAMおよびHEXラベルされたHyBeaconプロー
ブをそれぞれ使用した、NAT2*4およびCYP2D6*1対立遺伝子の同時増幅、および特
異的検出を示している。また、多型配列の同一性を、FAM、HEXおよびTETプロー
ブを使用して、融解温度測定によって決定してもよい。ABI PRISM 7700から得ら
れた融解物曲線データを融解ピークに転換するために、Excelマクロを作製した
。図13bには、FAM、HEXおよびTET色素でそれぞれラベルされた2D64C*、2D64Eお
よびDdeFL1*4Tプローブから得られたピークを示す。融解ピークは、相補的なオ
リゴヌクレオチドおよびPCR増幅された標的に対するHyBeaconのハイブリダイゼ
ーションから得られた。
【００６２】 (x)HyBeaconアッセイの最適化 標的検出およびSNP判別の効率を強力に改善するために、種々のHyBeaconアッ
セイにおけるパラメータを修飾してもよい。アッセイ最適化のために分析した反
応条件の例をここに示す： a)バッファー最適化：下記の少量バッファーの最適化は、1.25mM Tris.Cl pH8
. 0、250nM MgCl2、25nM DTTにおける不均一融解解析実験により行った。このハ
イブリダイゼーション・バッファーは、現在までに合成された大多数のHyBeacon
sにおいて、高品質の融解曲線を生じることが示された。しかし、F17836プロー
ブでは、オリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズした場合でも、このバッファ
ー中で融解曲線を生じなかった。その後、HyBeacon融解温度対MgCl2濃度の研究
を行った。上記バッファー中では、F17836に対する融解ピークが得られないが、
50mM Tris、3mM MgCl2中では、非常に良質の融解曲線が得られることが示された
。さらに、MgCl2濃度と融解ピークTmの間に、非常に強い相関があることが示さ
れた。この関係をF17831、TB0993、F17834、F17835およびB9414 HyBeaconsにつ
いて研究し、0.1mm〜10mmの濃度間で行った回帰分析にでは、それぞれ、98.9%,
97.9%, 99.4%, 99.3%および98.8%のR2値を生じた（図14を参照）。MgCl2濃度を
変更することにより、HyBeaconsのTmを10℃以上変化することができる。バッフ
ァー組成に基づいて特定のHyBeacon Tmsを選択し、ディファレンシャル・ビーコ
ン・ハイブリダイゼーション・アッセイをデザインすることができるであろう。
【００６３】 均一増幅アッセイで試験した市販のPCRバッファーの中で、TaKaRaのバッファ
ーが優れていることが見出された。Pharmacia, Taq Gold、並びにTaKaRa PCR bu
ffers、並びに対応するTaq、Taq Gold、Z-Taqポリメラーゼについて、HyBeacon
アッセイにおけるその効率を比較した。Taq Goldバッファーおよびポリメラーゼ
で行ったアッセイでは、まったく機能せず、したがってリアルタイム増幅曲線ま
たは融解ピークを生じなかった。PharmaciaおよびTaKaRaのバッファーはどちら
も、TaqおよびZ-Taqポリメラーゼによって増幅曲線および融解ピークを生じる。
しかし、さらなるMgCl2がPharmaciaのバッファーに含まれているときでさえも、
TaKaRaのバッファーが典型的に優れた結果を生じる。PharmaciaのPCRバッファー
を使用して、一連のMgCl2濃度における増幅および検出の効率を分析すると、最
適の濃度は、3.0〜3.5mMの間であることが見出された。TaKaRaのバッファーは、
3.0mMのMgCl2を含むことが知られているが、他の成分は知られていない。
【００６４】 StratageneのOptiprimeキットを使用して、HyBeacon PCRアッセイの最適化に
必要とされる成分および条件の指標を得た。Optiprimeキットは、種々のpH（8.3
、8.8および9.2）の12種の個別のバッファーから成り、種々の濃度のMgCl2（1.5
mMおよび3.5mM）およびKCl（25mMおよび75mM）を含む。標的を増幅および検出す
る効率は、pHによって顕著な影響は受けないが、MgCl2およびKCl濃度によってか
なりの影響を受けた（それぞれ（1×バッファー中に）3.5mMおよび25mMが最適で
あった）。Optiprimeキットから得られた情報を使用して、10×HyBeacon PCRバ
ッファー（100mM Tris.HCl pH8.8、250mM KCl、35mM MgCl2）を作製した。この
バッファーは、HyBeaconアッセイにおいて比較的十分に機能して、増幅後解析に
おいて高品質な融解ピークを生じることが見出された。しかし、リアルタイム解
析によって生じる蛍光増加の大きさは、TaKaRaのPCRバッファーで行った解析と
比較して減少していた。したがって、リアルタイム標的検出効率を改善するため
に、一連のPCR補助剤をHyBeacon PCRバッファーに添加した。HyBeacon PCRバッ
ファーにおいて検討した推定のPCRエンハンサーのうち、BSAのみがリアルタイム
増幅の効率に顕著な陽性の影響を有することが見出された。0μg/μl〜1μg/μl
の間で、BSAのワーキング濃度を研究した。BSAの濃度を0μg/μl〜100ng/μlに
増加すると、リアルタイム標的検出の効率を亢進した。しかし、BSA濃度を増加
した結果、増幅後融解ピークの質が低下していた。したがって、リアルタイム増
幅の亢進するが、融解ピークの質を低下させない最適なBSA濃度を捜した。この
最適なワーキング濃度は、2.5ng/μl〜5ng/μlの間であることが見出され（図15
を参照）、したがって50ng/μlのBSAを10×HyBeacon PCRバッファーに含ませた
。このバッファーは、TaKaRaPCRバッファーに匹敵する効率を有する機能を示し
た。
【００６５】 b）アンプリコンの選択：2種のプローブF18140およびF18141を除いては、試験
したHyBeaconsのすべてが、オリゴヌクレオチド相同体に対して非常に高い質の
融解曲線を生じる。しかし、これらプローブのすべてが、大きなPCR標的に対し
て高い質の融解物を生じるというわけではない。多型部位に関連するアンプリコ
ンの大きさおよびプライマーの位置を変化することにより、より効率的なプロー
ブ・ハイブリダイゼーションおよび優れた融解曲線の生成が可能となる。22bpだ
け異なた2種のアンプリコンを使用すると、NAT2*6プローブのうちの1つにおいて
、「リアルタイム」増幅検出および融解ピーク判別の効率に有意な差異が観察さ
れた（図16）。
【００６６】 c)プローブ融解温度：ハイブリダイゼーション・ビーコンのTmは、増幅後融解
曲線の質に影響を及ぼすかもしれない。合成および試験がなされた初期HyBeacon
sの多くでは、約60-65℃においてバックグラウンド蛍光効果を生じることが見出
された。約58℃より高いマッチTmsをもつ多数のHyBeaconsでは、このバックグラ
ウンド蛍光によって、それらマッチの融解ピークが不明瞭になったが、より低い
Tmsを有するミスマッチのピークでは、融解トレースにおいて明瞭に認識される
ことが見出された。58℃未満のマッチTmsをもつプローブでは、増幅後融解解析
実験が、もっと能率的に行われるであろう。CYP2D6 *3および*4多型のために、F
-QおよびF HyBeaconプローブをデザインした。オリジナルのCYP2D6 F HyBeacons
は、F-Qプローブに勝る多くの利点を備えており、高品質なリアルタイムPCR増幅
データを生じて、*3および*4 SNPsを確実に判別することが可能となった。しか
し、これらF HyBeaconプローブ（2D63Bおよび2D64B）では、バックグラウンド蛍
光の影響と有意に重なってしまうため、高品質の融解ピークを生じなかった。し
たがって、これらの高いTmのプローブでは、SNPs並びにホモ接合性およびヘテロ
接合性のサンプルを融解解析よって同定することはできなかった。Tmsが有意に
低下するように、*3および*4 HyBeaconsを、それぞれ2（2D63C）および3（2D64C
）ヌクレオチド短くして再びデザインした。これらのTmを低下したプローブでは
、どちらも高品質なリアルタイム増幅曲線および増幅後融解ピークを生じ、極め
て信頼性のあるSNP判別およびヘテロ接合体解析が可能となる。2D63Bおよび2D64
Bプローブとは対照的に、2D63Cおよび2D64Cでは、増幅後解析の際にマッチおよ
びミスマッチ融解ピークを生じ、バックグラウンド蛍光の影響とほとんど重なり
を示さない。
【００６７】 d)HyBeacon濃度：アッセイに含まれるHyBeaconの量は、シグナル：バックグラ
ウンドの蛍光比を変化することによって、生じた結果の質に影響を及ぼすことが
見出されている。過剰なプローブがアッセイに含まれる場合、バックグラウンド
蛍光が、ハイブリダイゼーションを介した変化をマスキングする。多くの場合、
HyBeacon濃度を低くして使用したときに、優れた質の融解曲線が観察される。高
品質のリアルタイム増幅データおよび増幅後融解ピークの生成を可能にするF Hy
Beaconプローブの最適濃度は、典型的には100〜300nMの間である。HyBeacon濃度
を減少することによって、上記したバックグラウンド蛍光の影響が除去されるよ
うである。
【００６８】 e)非対称PCR：今まで記載したすべてのHyBeaconアッセイでは、対称的PCRプロ
トコールを使用して二本鎖DNA標的を増幅した。二本鎖DNAにハイブリダイズした
プローブは、標的の相同鎖と競合しなければならず、その結果この競合的結合が
、HyBeaconハイブリダイゼーションの効率を低下するであろう。非対称PCRは、
一本鎖のPCR産物を作製するために使用される技術である。一本鎖の標的では競
合するDNA鎖が共存しないので、HyBeaconsが二本鎖の分子よりも高い効率でハイ
ブリダイズするのであろう。非対称PCRが、対称的増幅よりも優れているかどう
かを検討するために、該技術を八つのHyBeacon SNPアッセイに適用した。八つの
HyBeaconのうち四つでは、対称および非対称増幅において蛍光発光が同様に増加
され、同等の検出効率をもっていた。一つのHyBeaconアッセイでは、対称増幅と
比較して非対称アッセイにおける効率の低下を示したが（図17a）、他の三つの
アッセイでは、非対称増幅において対称的PCRよりも蛍光発光の増加を示した（
図17b）。さらに、これらのHyBeaconアッセイの多くは、対称的反応と比較して
、非対称増幅された標的において優れた増幅後融解曲線を生じた（示されないデ
ータ）。したがって、いくつかの場合には、潜在的により高感受性のSNP判別ア
ッセイのために、非対称標的増幅を採用することが有益であろう。しかし、非対
称一本鎖DNAを生じる機構は、対数的ではなく直線的であり、したがって増幅の
検出およびSNPsの判別は、対称的増幅よりもかなり多いサイクル数で達成される
（図17b）。許容限界サイクルにおいてこのように増加することは、アッセイ持
続時間を延長するであろうし、かつ低濃度のゲノムDNAを含む反応に影響を及ぼ
すかもしれない。
【００６９】 (xi)固相におけるSNPsの判別 NAT2 *4および*5A多型標的を、195993'または195991と同じ配列のビオチン化
されたプライマーを使用して、ゲノムDNAから増幅した。ビオチン化されたPCR産
物を、96ウェルのストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに固定した
。DNA標的をNaOHで変性させて、ビオチン化されていないPCR鎖を除去し、ウェル
の表面に結合した一本鎖DNA標的を残した。HyBeaconプローブ（典型的にはF1783
2および0203002）を、固定化された一本鎖標的にハイブリダイズさせた。ハイブ
リダイゼーション後、過剰なプローブを除去して、DASH（Dynamic Allele Speci
fic Hybridisation-Hybaid）装置を使用して融解解析を行った。マッチおよびミ
スマッチの固定化された標的からHyBeacon融解曲線が得られ、SNPsを確実に判別
することができた（図18）。F17832 HyBeaconでは、不均一LightCyclerアッセイ
において不十分な質の融解曲線を生じた。しかし、DASH 装置でこのプローブを
用いることにより、良質な融解解析および確実なSNP判別が達成された。LightCy
clerおよびDASH融解解析には、それぞれ二本鎖および一本鎖の標的を利用する。
標的ハイブリダイゼーションに対してHyBeaconと競合するPCR相同体がないので
、一本鎖標的からかなり優れた質の融解曲線が得られる。均一および固相フォー
マットのどちらにおいても、HyBeaconsを適切に使用することにより、場合によ
るとアレイ系形態のいくつかにおいて、大量のアッセイを行うことができる多用
途な系が提供される。
【００７０】 (xii)Taqポリメラーゼの5-3'-エキソヌクレアーゼ活性 HyBeaconアッセイが、TaqMan systemと異なることを確認するために、5'-3'-
エキソヌクレアーゼ活性を欠いた二種のDNAポリメラーゼ、Deep Vent(New Engla
nd Biolabs)およびStoffel断片(Pharmacia)を、「リアルタイム」増幅アッセイ
において試験した。5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性は、TaqManアッセイに必須で
あり、このTaqポリメラーゼ活性は、蛍光団とクエンチャー部分間でTaqManプロ
ーブを特異的に消化するために必要とされ、完全にマッチする標的が存在する場
合に蛍光発光の増加を引き起こす。Deep VentおよびStoffel断片ポリメラーゼを
均一増幅アッセイにおいて使用して、NAT2 *4F HyBeaconプローブが、5'-3'-エ
キソヌクレアーゼ活性の非存在下において標的の増幅を検出する能力を試験した
（図19）。両タイプのポリメラーゼを含む反応では、増幅過程の全体にわたって
、マッチするテンプレートによる蛍光発光の増幅を示したが、ミスマッチするテ
ンプレートを含む反応では、蛍光の増加を生じなかった。Deep VentおよびStoff
el断片ポリメラーゼによって、「リアルタイム」および増幅後フォーマットにお
けるSNP判別がなされてもよい。したがって、これらの結果は、F HyBeaconsがリ
アルタイムPCRによってDNA配列を検出する機構が、5'-3'-エキソヌクレアーゼア
ッセイの機構と異なっており、蛍光団とクエンチャー部分が酵素的に分離される
ためではなく、むしろプローブ・ハイブリダイゼーションによって直接生じる蛍
光発光の増加に依存していることを示している。
【００７１】 (xiii)HyBeaconプローブを利用した定量的PCR PCR増幅の進行を「リアルタイム」でモニターする能力は、PCRに基づいてDNA
およびRNAの定量化を行うことができるアプローチに完全な革命を起こす。「リ
アルタイム」定量PCR実験では、一定数のサイクル後に蓄積されたPCR産物量より
も、むしろPCR産物の増幅が最初に検出されたときの（CT-閾値サイクル）サイク
リング時点によって反応が特徴づけられる。核酸標的の開始コピー数を多くする
ほど、蛍光の有意な増加が速やかに観察される。「リアルタイム」増幅における
HyBeaconプローブによる標的DNAの定量化の可能性を、2D64B、2D64C*およびDdeF
L1 F HyBeaconsを使用して検討した。定量的HyBeacon PCR解析は、LightCycler
およびABI 7700 instrumentで行った。均一PCR増幅におけるテンプレートとして
、DNA標準（PCR産物またはゲノムDNAの既知濃度）の範囲を使用した。各DNA標準
における閾値サイクルを測定して、ログDNA濃度をCTに対してプロットし、「直
線」標準曲線を作製した。「未知」の濃度のゲノムDNAを含むサンプルから得ら
れた閾値サイクルを、標準曲線にプロットして、これら反応液に存在するDNA濃
度を算出した。HyBeacon定量的PCRに由来する標準曲線は、LightCyclerおよびAB
I 7700 instrumentのどちらにおいても非常に高い質であり、0.93〜0.99の間の
相関係数をもっていた（図20）。試験した「未知」の反応液において、これらの
標準曲線から計算されたDNA濃度は、正しいオーダーの算出濃度であり、適度に
正確だった。たとえば、5.4×104ng/μl、700ng/μlおよび90ng/μlの「未知」
のサンプルでは、それぞれ6.9×104ng/μl、1406ng/μlおよび115ng/μlのLight
Cycler標準曲線から算出された濃度を有した。ところが、285ng/μl、163ng/μl
および53ng/μlのゲノムサンプルでは、ABI 7700に由来する標準曲線において、
256ng/μl、137ng/μlおよび44ng/μlであるとして算出された。
【００７２】 (xiv)従来のDNA抽出を伴わない標的配列の検出および判別 血液または頬スワブなどの患者サンプルから遺伝子型を得るためには、典型的
にはPCR増幅および下流解析の前にそのゲノムDNAを抽出することが必要である。
DNA抽出プロトコールは、時間がかかり、面倒で、かつ高価であろう。したがっ
て、HyBeacon解析における期間および費用を減らすために、唾液DNAから直接PCR
増幅を行い、ゲノムDNAを抽出する必要をなくした。LightCyclerによる迅速な温
熱サイクリング条件と合わせて、唾液から直接標的を増幅することにより、35-4
0分以内で多型配列の遺伝子型を決定することができる。
【００７３】 多型NAT2 *4および*5C配列を10の唾液サンプルから増幅して、*5Cおよび*4対
立遺伝子にそれぞれ完全に相補的なDdeFL1およびDdeFL1*4 HyBeaconsによって分
析した。図21および22は、リアルタイムPCRデータ、並びに*5C/*5C（サンプル1
）、*4/*4（サンプル2）および*4/*5C（サンプル3）遺伝子型から増幅されたDNA
配列とDdeFL1およびDdeFL1*4のハイブリダイゼーションに由来する融解ピークを
例示する。表6は、多型NAT2配列HyBeaconとDdeFL1およびDdeFL1*4のハイブリダ
イゼーションに由来する融解温度を示す。リアルタイムPCRおよびTmデータから
、*5C多型に関して個々の遺伝子型を決定することが可能となる。分析した10の
唾液サンプルのうち、3つが*5C対立遺伝子に対してホモ接合性であると分類され
、1つが*4対立遺伝子に対してホモ接合性であると特徴づけられ、および6つがヘ
テロ接合性であることが見出された。NAT2 *5C遺伝子座のこれらの遺伝子型は、
それぞれ緩徐、速い、および中間のアセチル化表現型と関連がある。唾液サンプ
ルをHyBeacon解析することによって得られた遺伝子型および表現型を確かめるた
めに、唾液サンプル1-3についてRFLP解析を行った（図23）。*4/*4 DNAから増幅
された179bp PCR産物は、単一のDdel制限部位を含み、その部位を消化すること
により、121bpおよび58bp断片が生じる。*5C多型は、さらなるDdel制限部位を生
じ、その結果、*5C/*5C DNAから増幅された179bp産物の消化により、98bp、58bp
および23bp断片が生じる。ヘテロ接合性の唾液サンプルから増幅された産物を消
化することにより、121bp、98bp、58bpおよび23bp断片を生じる。RFLPおよびHyB
eacon方法論のどちらによっても、唾液サンプル1-3は、それぞれホモ接合性*5C
、ホモ接合性*4およびヘテロ接合性であるとタイプされる。したがって、ここに
示されたデータは、高品質のDNA精製を必要とせず、多型配列の確実な増幅、検
出および判別を行ことができることを示している。
【００７４】 表6 Tm値は、増幅されたNAT2 *4および*5C配列の融解曲線解析に由来した。DdeFL1
およびDdeFL1*4 HyBeaconsは、*5Cおよび*4対立遺伝子にそれぞれ完全にマッチ
する。マッチおよびミスマッチの融解ピークの平均および標準誤差は、各唾液サ
ンプルにおいて、および全てのサンプルにおいてひとまとめにして詳述する。Np
は、所与の融解トレースにおいて特定のピークが存在しないことを示し、「−」
は、deFL1*4アッセイが特定の唾液サンプルにおいて行われなかったことを示す
。
【００７５】
【表６】 （xv）RNA配列の検出 RNA標的を検出する可能性を評価した。最初に、NASBA（核酸配列ベース増幅（
Nucleic Acid Sequence Based Amplification））RNA産物を検出するためのHyBe
aconプローブをデザインした。この産物は、融解曲線解析におけるHyBeacon融解
ピークの生成によって検出されなかった。これは、おそらくRNA産物が減少する
ためである。したがって、DNAまたはRNAからなるオリゴヌクレオチド相同体を合
成して、HyBeaconプローブのハイブリダイゼーションを分析した。最初に、融解
ピークはDNA標的から得られたが、RNAオリゴヌクレオチドからは得られなかった
。RNA標的濃度が2μMに増加されるまで、プローブ・ハイブリダイゼーションに
特徴的な融解ピークは得られなかった（データ示さず）。HyBeacon/RNA二本鎖の
融解温度は、HyBeacon/DNA二本鎖と比較して有意に低下していることが示され、
RNAに対するハイブリダイゼーションは、DNAに対するハイブリダイゼーションよ
り、かなり不安定であることが示唆される。したがって、解析の際に高濃度のRN
A標的を産生することができない限り、HyBeaconプローブは、確実にそれらを検
出することができないだろう。
【００７６】 (xvi)配列検出の機構 プローブ・クエンチャー部分が存在しないにも関わらず、相補的標的DNA配列
に対してHyBeaconプローブがハイブリダイゼーションすることによって、蛍光発
光量に有意な変化が生じる。ヌクレオチド残基（特にグアニン）は、静的および
動的なクエンチング機構を介して、蛍光発光に効果を及ぼすことが示されている
。したがって、HyBeacon蛍光のクエンチングは、塩基−色素のスタッキングおよ
び電子移転イベントを介して、プローブのオリゴヌクレオチド成分から生じる可
能性もある。標的配列に対するHyBeaconのハイブリダイゼーションは、オリゴヌ
クレオチド成分に関して蛍光団部分の指向を変え、色素と塩基間の電子移転量に
影響を及ぼしている可能性がある。あるいは、二本鎖形成によって生じる塩基−
色素のスタッキング、たとえば蛍光団の塩基スタック内へのインターカレーショ
ンによって蛍光クエンチング量を変化するのかもしれない。HyBeaconプローブが
標的DNA配列にハイブリダイズすると、HyBeaconオリゴヌクレオチドによって課
せられていた蛍光クエンチングは、コンホメーション変化によって少量ではある
が検出可能な量が軽減されるであろう。クエンチングが減少することにより、蛍
光発光量の増加を生じ、配列検出および対立遺伝子判別が可能となる。HyBeacon
が機能する機序を調査するために、蛍光およびu.v.分光技術を使用して、量子収
率、蛍光寿命および一本鎖と二体鎖状態間で生じる放射波長の変化の可能性を分
析してもよい。
【００７７】
【発明の効果】
結論 ハイブリダイゼーション・ビーコン（HyBeacons）は、相補的標的配列とプロ
ーブがハイブリダイゼーションする直接的結果として生じる蛍光発光の増加を介
して、特定のDNA配列を検出することが示された。蛍光放射の量およびプローブ/
標的二本鎖のTmにより、オリゴヌクレオチドおよび増幅PCR配列のSNPsの判別が
可能となる。ここで報告した結果は、HyBeaconアッセイにより、単一のプローブ
を使用してホモ接合性およびヘテロ接合性のサンプルを同定することができるこ
と、並びに単一チューブ/ウェル・アッセイにおける多数のHyBeaconプローブの
使用により、多重解析の可能性を有することを示す。さらに、HyBeaconsにより
、「リアルタイム」PCRアッセイにおいてDNA標的が定量化されることが示された
。
【００７８】 HyBeaconプローブは、配列検出、SNP判別およびDNA定量化のための現在利用で
きる市販の系（分子ビーコン、Scorpions、FRETプローブおよびTaqManプローブ
）に代わるものである。HyBeaconsを使用した検出アッセイは、それらが単純な
作用機序であって二次構造を欠き、かつ酵素の必要性を欠くこと、並びに単一プ
ローブを使用してヘテロ接合性DNAを同定するというその能力のために、魅力的
である。
【００７９】 標的の増幅および検出を単一のチューブで行う、均一HyBeacon法（上記の通り
の）によって、分子診断アッセイを行ってもよい。あるいは、増幅された標的の
ロボット単離、またはロボット固相固定により、バッファーの置換およびHyBeac
on添加に続いて、ハイスループットな検出系を形成することもできる。ディファ
レンシャル・ハイブリダイゼーション・アッセイは、マイクロアレーまたはマク
ロアレーフォーマットで行うこともでき、このフォーマットでは、プローブまた
はより好ましくは標的のいずれかを、HyBeacon融解解析前に固定させる。
【００８０】 HyBeaconプローブの2種の変異型を評価した。プローブには、内部ヌクレオチ
ド残基に蛍光団およびクエンチャー部分の両方が連結されたもの（F-Q HyBeacon
）を含んでもよく、または蛍光団成分のみ（F HyBeacon）を含んでもよい。変異
型はどちらも、均一および不均一フォーマットにおいて確実にSNPsを判別するこ
とが示されている。しかし、F HyBeaconsは、F-Qデザインに勝る明らかな効果を
有する： ・現在、蛍光団およびクエンチャー部分は、T残基のみに配置され得る。した
がって、蛍光団とクエンチャー部分を分離する残基数および角素因の効果の可能
性を考慮する必要がないため、F HyBeaconsは、かなり簡単に束縛が少なくデザ
インされる。
【００８１】 ・クエンチャーが存在しないため、F HyBeaconsは、合成が高価ではなく、ア
ッセイには、F-Qと比較して反応あたり約5分の一のプローブ（200nM未満）が必
要なだけである。
【００８２】 ・F HyBeaconsは、「リアルタイム」均一アッセイにおいて、優れた質の増幅
後融解曲線を生じる可能性を有することが示されている。
【００８３】 ・ヘテロ接合体解析において2種のF-Qプローブが必要なこととは対照的に、F
HyBeaconsでは、単一のプローブを使用してヘテロ接合性サンプルが同定される
ことが示された。
【００８４】 本発明は、先に記載された態様に限定されず、本発明の精神から逸脱すること
なく、構成および詳細が変更されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 種々のHyBeaconのハイブリダイゼーション。マッチ、ミスマッチ、二重ミスマ
ッチ間における相互作用の差異を図示する。図中、星は単一のヌクレオチド多型
（SNPs）を示す。タイプAの相互作用は、野生型標的またはSNPの一対立遺伝子と
完全にマッチするようにデザインされたHyBeacon分子を含む。タイプBの相互作
用は、変異型標的またはSNPのもう一つの対立遺伝子と完全にマッチするように
デザインされたHyBeacon分子を含む。二つの独立したSNPsを考慮した場合、標的
分子にハイブリダイズするビーコンは、（i）完全マッチ、（ii）一塩基ミスマ
ッチをもつ、または（iii）多塩基ミスマッチをもつのいずれかであろう。
【図２】 蛍光量を使用したSNPの判別。B9414HyBeaconは、完全マッチ（i）および一塩
基ミスマッチ（ii）にハイブリダイズし、標的が存在しない場合の実験（iii）
も行った。a）融解プロフィールは、B94141HyBeaconに由来する。42℃以下およ
び52℃以上の温度では、マッチおよびミスマッチ標的にハイブリダイズしたプロ
ーブによって発光される蛍光量が非常に小さい。しかし、これらの温度間では、
完全に相補的なプローブによって発光される蛍光量は、ミスマッチHyBeaconの蛍
光発光よりも有意に増加する。b)蛍光穫得のために、反応液を変性して46℃まで
急冷した。処理範囲内では有意なクラスター形成、および処理間では統計学的な
相違が観測され、その結果マッチ標的にハイブリダイズしたプローブは、ミスマ
ッチ標的にハイブリダイズしたHyBeaconよりも有意に多くの蛍光を発光し、標的
が存在しない場合のハイブリダイゼーション・ビーコンよりも多くの蛍光を発光
する。c）HyBeaconは、標的の非存在下において融解ピークを生じない。B9414は
、マッチまたはミスマッチ標的の存在下において、それぞれ約52℃および44℃の
Tmsを有する融解曲線を生じ、確実なSNPsの判別が可能となる。
【図３】 FおよびF-Q HyBeaconプローブの比較。NAT2ハイブリダイゼーション・ビーコ
ンF17834（F-Q）および0203002(F)は、完全マッチのオリゴヌクレオチドにハイ
ブリダイズした。FおよびF-Q HyBeaconsは、同一のヌクレオチド配列を有し、か
つ融解解析において約60℃のTmsの高品質なピークを生じる。F HyBeaconsは、ク
エンチャー部分が欠失しているため、F-Qプローブと比較してより大量のバック
グラウンド蛍光を発する。
【図４】 InDel多型の融解解析。ハイブリダイゼーション・ビーコンが、挿入および欠
失多型を判別する能力を有するかどうかを決定するために、TB0993 NAT2 *4プロ
ーブを一連のオリゴヌクレオチド標的にハイブリダイズさせた。マッチ標的（M
）、単一ヌクレオチドの挿入を含む3種のオリゴヌクレオチド（1-3）、および単
一ヌクレオチドの欠失を含む3種のオリゴヌクレオチド（4-6）を比較した。それ
ぞれのHyBeacon/標的二本鎖において融解解析を行った。すべての場合において
、マッチプローブは、ミスマッチInDelの反応より高いTmsおよび融解曲線を生じ
、その結果融解ピークTmに基づいて、SNPsが判別されるであろう。a)挿入オリゴ
ヌクレオチド。b)欠失オリゴヌクレオチド。c)マッチするビーコンでは、全ての
InDelミスマッチに対するハイブリダイゼーションよりも多くの蛍光を発光し、S
NPsを蛍光発光量に基づいて判別してもよいことを示す。
【図５】 不均一フォーマットにおけるSNPsの判別。CYP2D6 *3多型を含む標的を判別す
るために、FおよびF-Q HyBeaconプローブを使用し、そのうち、使用したDNA標的
は、単離された119bpのPCR産物であった。F（2D63B）およびF-Q（2D63A）プロー
ブは、同一のヌクレオチド配列であり、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子に完全にマ
ッチし、および*3アレルにハイブリダイズしたときは、一塩基ミスマッチをもつ
。a)2D63A F-Qプローブは、マッチおよびミスマッチ標的にそれぞれハイブリダ
イズしたときに、およそ65℃および56℃のTmsの融解ピークを生じる。b)2D63B F
HyBeaconは、*1および*3 PCR標的にそれぞれハイブリダイズしたときに、およ
そ65℃および58℃のTms有する溶解ピークを生じる。
【図６】 DNA配列の均一検出。PCR産物の蓄積をリアルタイムでモニターするために、2D
64C* HyBeaconプローブを使用してゲノムDNA(1)および唾液(2)サンプルにおける
CYP2D6*1配列の検出する。HyBeaconプローブから発光される蛍光量は、特異的標
的配列の増幅と相関している。テンプレートDNAまたは増幅産物を含まないコン
トロール反応（3）では、PCRの間に蛍光発光レベルの上昇を示さない。
【図７】 均一フォーマットにおけるSNPsの判別。NAT2 *4配列に完全マッチのF HyBeaco
nプローブ0203002を、*4および*5A SNPsを識別するために均一LightCyclerアッ
セイにおいて使用した。a)SNPsは、リアルタイムPCRによって確実に識別され、
マッチの*4テンプレートを含む反応のみが、蛍光発光に有意な増加を生じた。b)
SNPsは、増幅後融解解析によっても識別された。この解析では、マッチの*4アレ
ルでは、ミスマッチの5A標的配列よりも有意に高いTmsの融解ピークを生じた。
増幅された産物の終了点分析によって、リアルタイムデータの確証が可能となる
。
【図８】 CY2D6*4多型のリアルタイム判別：CYP2D6遺伝子の*1および*4対立遺伝子を検
出および識別するために、2D64C* HyBeaconを使用した。多型配列は、*1対立遺
伝子(1)および*4対立遺伝子(2)を含むpGEM-Tプラスミドから増幅した。ヘテロ接
合性DNA(3)をシミュレーションするために、*1および*4プラスミドの混合液を使
用した。また、テンプレートコントロール反応(C)は、解析に含まなかった。*1
対立遺伝子を含むこれらの反応（すなわちサンプル1および3）のみが、リアルタ
イムPCR増幅の間に蛍光発光の増加を生じる。ホモ接合性*4サンプルおよびテン
プレート・コントロール以外では、蛍光シグナルの上昇を生じない。*1および*4
対立遺伝子に対するヘテロ接合性サンプルでは、増幅の間に発生すべき蛍光の中
間量を生じさせる。
【図９】 融解ピーク解析によるCYP2D6 *1および*4対立遺伝子の判別。多型標的は、ゲ
ノムDNAサンプルから増幅され、かつここで示した融解ピークは、サンプル1（ホ
モ接合*4）、2（ホモ接合*1）、および3（ヘテロ接合性のDNA）の増幅後解析に
由来した。2D64C* HyBeaconは、CYP2D6遺伝子の*1対立遺伝子に完全に相補的で
あり、ホモ接合性*4/*4および*1/*1サンプルに対しそれぞれ49℃および60℃のTm
sをもつ単一の融解ピークを生じる。*4および*1対立遺伝子をもつヘテロ接合性
サンプルでは、49℃および60℃融解ピークをもつトレースを生じる。
【図１０】 F-Q HyBeaconsを使用したヘテロ接合性の同定。ホモ接合サンプル（多型の一
方の対立遺伝子のみを含む）をヘテロ接合性のサンプル（両方の対立遺伝子を含
む）と区別するためには、SNPの両方の対立遺伝子に完全マッチの2種のF-QHyBea
consを必要とした。F17834およびF17835 HyBeaconsは、それぞれNAT2遺伝子の*4
および*5A対立遺伝子に完全にマッチする。F17834およびF17835は、有意に異な
ったTmsを有し、2種のFAMラベルされたプローブは区別される。a)F17834では、
ホモ接合性の*4および*5A対立遺伝子が存在する場合に、それぞれ約60℃および5
4℃のTmsをもつ融解ピークを生じる。b)F17835では、ホモ接合性の*5Aおよび*4
対立遺伝子が存在する場合に、それぞれ約52℃および49℃のTmsをもつ融解ピー
クを生じる。c)F17834またはF17835 HyBeaconsを含む反応では、ヘテロ接合性の
DNAが存在する場合に、マッチする融解ピークのみを生じる。両プローブを含む
反応では、*4および*5A対立遺伝子混合物が存在する場合に、約59℃および52℃
のTmsをもつ融解トレースを生じる。単一の融解トレースに2つのピークが存在す
ることにより、ヘテロ接合性のサンプルを同定することができる。
【図１１】 F HyBeaconを使用したヘテロ接合性の解析。F HyBeaconsがヘテロ接合性サン
プルを判別する能力を試験するために、HyBeacon DdeFL1（これはNAT2 *5C多型
配列に完全マッチ）を使用した。a)ホモ接合サンプルをDdeFL1で分析すると、単
一のピークをもつ融解トレースを生じる。DdeFL1プローブは、不均一アッセイに
おいてホモ接合性の*5Cおよび*4 PCR標的にハイブリダイズして、それぞれ54℃
および47℃の融解曲線を生じた。b)DdeFL1 HyBeaconとマッチおよびミスマッチ
標的の混合液を含む反応では、同様の融解トレースにおいて54℃および47℃のピ
ークをもつ曲線を生じた。融解トレースに2種のピークが存在することにより、
ヘテロ接合性サンプルを同定することができる。
【図１２】 HyBeacon多重解析の限界。HyBeacon多重解析における能力を検討するために、
2D64B HyBeaconプローブを、特異的および非特異的PCRテンプレートを含む反応
に含めた。PCRテンプレートは、特異的テンプレートの比率が100%〜5%の間で変
化するような、特異的（CYP2D6）および非特異的（NAT2）DNAの混合液からなる
。a)特異的標的だけが生じるように、反応にはCYP2D6プライマーを含むが、NAT2
プライマーを欠いた。横断点において特異的標的の濃度が減少するという、小さ
な変化が観測された。しかし、反応間で増幅および検出の効率を比較可能であっ
た。b)特異的および非特異的標的が生じるように、反応には、CYP2D6およびNAT2
プライマーを含ませた。増幅および検出の効率の有意な減少は、特異的標的の比
率の減少として観測された。しかし、この結果は、最高で4または5個の標的を含
む多重反応が可能であろうことを示唆する。
【図１３】 多重HyBeacon解析。a)NAT2*4およびCYP2D6 *1標的は、それぞれFAM（BamFL1）
およびHEX（2D64E）ラベルされたプローブを使用して、単一のマイクロタイター
プレートにおいて同時に増幅および検出した。ゲノムDNAおよび完全にHyBeacon
プローブに相補的な配列を含む反応のみが、増幅によって蛍光発光レベルの上昇
を示した。ネガティブコントロール反応では、蛍光発光の増加を生じなかった。
b)融解物ピークは、ABI PRISM 7700 instrumentおよびExcel macroを使用したFA
M、HEXおよびTETラベルされたプローブに由来する。ここで示した融解ピークは
、相補的なオリゴヌクレオチドへのプローブ・ハイブリダイゼーションに由来し
た。
【図１４】 HyBeacon Tmに対するMgCI2濃度の効果。一連のMgCI2濃度において0mM〜50mMま
で変化させて、ハイブリダイゼーション・ビーコンF17834を完全に相補的なオリ
ゴヌクレオチドにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション・ビーコンの
Tmは、MgCl2濃度の上昇につれて増加を示した。a)以下のものを含む反応に由来
するハイブリダイゼーション・ビーコン融解曲線を例示する：0mM、0.001mM、0.
005mM、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、
0.8mM、0.9mM、1mM、1.5mm、2mm、3mm、4mm、5mm、7mm、10mmおよび50mmのMgCl2 （それぞれ左から右へ）。b)MgCI2濃度およびHyBeacon Tmの間に存在するポジテ
ィブな相関を示す。ハイブリダイゼーション・ビーコンのTmをMgCl2濃度の対数
に対してプロットしたときに、定義した濃度範囲において、比例関係が観測され
る（0.1mMと10mM間の場合）。このデータセットに対して行った線形回帰分析で
は、99.4％のR2値を生じた。
【図１５】 HyBeacon PCR bufferの作製-BSAの影響。標的増幅をモニターするためにNAT2
*5A HyBeacon（NAT2*5）を使用した一連のPCRバッファーに由来するリアルタイ
ムPCRデータおよび増幅後融解の結果を示す。以下のBSA濃度の範囲で、HyBeacon
解析のためにデザインしたPCRバッファーに添加した：1）Ong/μl、2）1ng/μl
、3）2.5ng/μl、4）5ng/μl、5）7.5ng/μlおよび6）10ng/μl。また、TaKaRa
Z-Taq PCRバッファー(7)を比較にして分析した。2.5ng/μlより高濃度のBSAによ
って、リアルタイム解析における標的の増幅および検出の効率が増強され、その
結果、この場合では蛍光増加の大きさがTaKaRa bufferより優れている。HyBeaco
n解析に由来する融解ピークの質は、低濃度のBSAよりも優れている。より高濃度
のBSAでは、ピークに「肩部」を生じて、ピーク幅を増加し、融解の質を減少さ
せる。リアルタイム解析および増幅後解析における最適なBSA濃度は、2.5ng/μl
〜5ng/μlの間のようである。
【図１６】 SNP判別の効率およびアンプリコン大きさ。標的アンプリコンの大きさおよび
位置は、均一および不均一HyBeaconSNPアッセイの効率に対し有意な影響を及ぼ
すことが示されている。大きさが22bp異なるNAT2 *4産物（*6 SNPの側面に位置
する）を増幅する2種のプライマーセットを、不均一融解曲線解析実験において
比較した。a)TaqFおよびTaqRプライマーから増幅された103bpのNAT2産物は、F17
836 HyBeaconを含む不均一アッセイにおいて融解ピークを生じない。b)しかし、
TaqF2およびTaqR2プライマーから増幅された81bpのNAT2 *4産物では、F17836プ
ローブにマッチおよびミスマッチの融解曲線を生じる。103bpおよび81bpサンプ
ルがどちらもアガロースゲルにおいて検出されたことから、アンプリコン間の相
違は、プローブ・ハイブリダイゼーションの差異によるためであり、増幅効率が
相違するためではないことが確認された。
【図１７】 非対称標的増幅を使用したSNP判別。HyBeaconを介した標的検出およびSNP判別
の効率を、対称および非対称PCRアッセイ・フォーマットにおいて比較した。 両タイプのPCR増幅では、マッチ標的の存在下においてのみ蛍光シグナルの増加
を生じる。8つのHyBeaconsを比較し;そのうちの4つは、対称および非対称増幅法
（示されないデータ）間で同等の効率を示した（データは示さず）。a)F17836 H
yBeaconプローブは、非対称アッセイにおいて使用したときに検出効率が有意に
減少した。b)一方、その他の三つのHyBeaconsでは、対称増幅（2D64Bプローブに
よって示したもの）と比較して、非対称増幅によってより大量の蛍光の増加を示
した。
【図１８】 ハイブリダイゼーション・ビーコンおよびDASH instrumentを使用したSNP判別
。NAT2 *4対立遺伝子の*5A多型に完全に相補的なハイブリダイゼーション・ビー
コンF17832を、固相に固定化された*4および*5A多型標的の判別に使用した。該
ハイブリダイゼーション・ビーコンは、*4および*5A配列にハイブリダイズした
ときに、それぞれ完全に相補的およびミスマッチである。マッチおよびミスマッ
チのハイブリダイゼーションは、それぞれ約66℃および60℃のTmsをもつ融解曲
線を生じる。ハイブリダイゼーション・ビーコンのマッチおよびミスマッチの領
域を確立することにより、DASHソフトウェアを使用してサンプルを自動分類する
ことが可能になる。
【図１９】 5'-3'-エキソヌクレアーゼ活性を欠いたDNAポリメラーゼを使用したSNP判別。
NAT2 *4および*5A対立遺伝子を、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性をもつ（Taq）、
および欠いている（Deep VentおよびStoffel fragment）DNAポリメラーゼで増幅
して、蛍光発光の増加を生じるためにF HyBeaconプローブの消化が必要とされる
かどうかを調査した。F HyBeacon 0203002を、増幅を検出してSNPsを識別するた
めに使用した。a)Taq(1)とDeep Vent(2)ポリメラーゼによる完全に相補的な*4配
列の増幅の比較。どちらのポリメラーゼも、マッチテンプレートの場合に「リア
ルタイム」に蛍光発光の増加を生じるが、一方ミスマッチ*5Aテンプレートを含
む反応では、蛍光発光の増加を生じない(3)。b)Taq(1)とStoffel fragment(2)ポ
リメラーゼによる完全に相補的な*4対立遺伝子増幅の比較。どちらのポリメラー
ゼも、マッチする*4テンプレートの存在下で「リアルタイム」に蛍光発光の増加
を生じるが、ミスマッチする*5A対立遺伝子を含む反応では蛍光発光の増加を生
じない(3)。
【図２０】 HyBeaconプローブを使用した「リアルタイム」定量的PCR。a)「リアルタイム
」均一アッセイを、CYP2D6配列の増幅をモニターするために2D64B HyBeaconを使
用して行った。既知のDNA濃度範囲：1)41.5×109 アトグラム／マイクロリット
ル（ag/μl）2）41.5×108ag/μl、3）41.5×107ag/μl、4）41.5×106ag/μl、
5）41.5×1085ag/μl、6）41.5×104ag/μl、7）41.5×103ag/μl、8）41.5×102 ag/μlおよび9）415ag/μlを分析した。各DNA濃度において横断点を測定した。
b)横断点に対して対数DNA濃度をプロットすることによって標準曲線を構築した
。「未知」の反応サンプルに存在するDNA濃度を定量するために標準曲線を使用
した。
【図２１】 均一リアルタイム唾液解析。NAT2 *4および*5C多型標的の検出並びに判別は、
リアルタイムPCRおよび融解解析方法によって行った。NAT2遺伝子の*5C対立遺伝
子に完全に相補的なDdeFL1 HyBeaconを、3つの唾液サンプル（1、2および5）の
遺伝子型決定に使用した。また、テンプレート・コントロール反応(C)は、本解
析には含まなかった。a)蛍光性シグナルの増加は、均一PCR反応において*5C対立
遺伝子が存在する場合にのみ生じる。したがって、*5C対立遺伝子に対してホモ
接合性およびヘテロ接合性である反応（すなわちそれぞれサンプル1および5）で
は、蛍光性シグナルの有意な増加を生じるが、一方、*4対立遺伝子に対してホモ
接合性の反応（サンプル2）では、蛍光性シグナルに増加を生じない。*5Cおよび
*4対立遺伝子をもつヘテロ接合性のサンプルでは、増幅の間に発光されるべき蛍
光の中間量が生じる。b)DdeFL1プローブでは、ホモ接合性*4および*5C DNAにそ
れぞれハイブリダイズしたときに、47.6℃および54.1℃のTmsをもつ単一の融解
ピークを生じる。ヘテロ接合性サンプルでは、どちらも47.6℃および54.1℃の融
解ピークをもつトレースを生じる一方、標的DNAを欠いた反応では、いずれのピ
ークも生じない。
【図２２】 増幅した唾液DNAのHyBeacon融解ピーク解析。NAT2遺伝子の*4対立遺伝子に完
全に相補的なDdeFL1*4 HyBeaconを、*5C多型に関する唾液サンプルの遺伝子型の
決定に使用した。a)HyBeaconのハイブリダイゼーションによって、42.6℃のTmを
もつ単一のミスマッチ融解ピークを生じるため、唾液サンプル1は、*5C対立遺伝
子に対してホモ接合性である。b)融解解析の際に2つのピークが生じるので、唾
液サンプル3は、*5Cおよび*4対立遺伝子に対してヘテロ接合性である。c)プロー
ブ・ハイブリダイゼーションによって、52.6℃のTmをもつ単一のマッチする融解
ピークが生じるので、唾液サンプル2は、*4対立遺伝子に対してホモ接合性であ
る。
【図２３】 RFLP唾液解析。制限断片長多型性解析を、唾液サンプルから増幅したNAT2 *4
および*5C PCR産物に対して行った。レーンMは、1Obpラダー（GIBCO BRL）であ
る。限定酵素消化により、サンプル1-3はそれぞれ*5C/*5C、*4/*4および*4/*5C
として分類することができる。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１４年８月１３日（２００２．８．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/58 Ｆ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マクドウェル、デビッド・ゴードン イギリス国、ティーダブリュ11・０エルワ イ、ミドルセックス、テディントン、クイ ーンズ・ロード（番地なし）、エルジーシ ー（テディントン）リミテッド内 (72)発明者 ブラウン、トム イギリス国、エスオー16・７ジェイディ ー、サザンプトン、チルワース、ヘザーラ ンド・ロード、ケッペルス（番地なし) Ｆターム(参考） 2G045 AA35 DA12 DA13 DA14 FB02 FB07 FB12 4B024 AA11 AA19 CA01 CA09 FA10 HA12 HA13 4B029 AA07 AA23 BB20 FA15 4B063 QA12 QQ03 QQ42 QR32 QR41 QR56 QR66 QR82 QS24 QS25 QS34 QS36 QS39 QX02 【要約の続き】 遂げられた。

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 実質的に二次構造をもたず、かつヌクレオチド残基の一つが
    レポーターでラベルされたヌクレオチド残基で形成されたオリゴヌクレオチドで
    あるハイブリダイゼーション・ビーコンであって、前記ビーコンは、クエンチャ
    ーが結合していない単一のレポーターを含むハイブリダイゼーション・ビーコン
    。
  2. 【請求項２】 請求項1に記載のハイブリダイゼーション・ビーコンであっ
    て、前記オリゴヌクレオチドは、任意に既知の多型／変異を有する既知の標的ポ
    リヌクレオチドの対立遺伝子の一つに相補的な配列を有するハイブリダイゼーシ
    ョン・ビーコン。
  3. 【請求項３】 請求項2に記載のハイブリダイゼーション・ビーコンであっ
    て、前記既知の多型は、点変異、または一塩基挿入もしくは欠失であるハイブリ
    ダイゼーション・ビーコン。
  4. 【請求項４】 請求項2または3に記載のハイブリダイゼーション・ビーコン
    であって、前記ポリヌクレオチド標的の既知の多型は、前記ハイブリダイゼーシ
    ョン・ビーコン分子の中心近くのヌクレオチド残基に相補的であるハイブリダイ
    ゼーション・ビーコン。
  5. 【請求項５】 請求項1〜4のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション
    ・ビーコンであって、前記レポーターラベルされたヌクレオチド残基は、前記オ
    リゴヌクレオチドの内部に位置するハイブリダイゼーション・ビーコン。
  6. 【請求項６】 請求項1〜5のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション
    ・ビーコンであって、前記レポーターは、蛍光団であるハイブリダイゼーション
    ・ビーコン。
  7. 【請求項７】 実質的に二次構造をもたず、かつヌクレオチド残基の一つが
    レポーターでラベルされ、およびもう一つがクエンチャーでラベルされ、前記レ
    ポーターラベルされたヌクレオチド残基と前記クエンチャーラベルされたヌクレ
    オチド残基間が、1〜15ヌクレオチド残基であるヌクレオチド残基で形成された
    オリゴヌクレオチドであるハイブリダイゼーション・ビーコン。
  8. 【請求項８】 支持体に固定化された、請求項1〜7のいずれか一項に記載の
    ハイブリダイゼーション・ビーコン。
  9. 【請求項９】 支持体上または支持体内に、間隔を置いた位置に固定化され
    たオリゴヌクレオチドプローブのアレイであって、異なったオリゴヌクレオチド
    プローブが、請求項1〜7のいずれか一項に記載の異なったハイブリダイゼーショ
    ン・ビーコンであるアレイ。
  10. 【請求項１０】 既知のまたは疑わしい多型を有するポリヌクレオチド標的
    を調査する方法であって、請求項1〜7のいずれか一項に記載のハイブリダイゼー
    ション・ビーコンを提供することと、前記標的ポリヌクレオチドを前記ハイブリ
    ダイゼーション・ビーコンとインキュベートして、ハイブリッドを形成すること
    と、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンは、前記ハイブリッドが形成された
    ときに、一本鎖形態のときよりも高レベルのシグナルを示すことと、並びに所定
    の温度において、もしくは温度範囲以上の前記ハイブリッドの融解温度近くで前
    記ハイブリダイゼーション・ビーコンのシグナルレベルを観測することとを含む
    方法。
  11. 【請求項１１】 請求項10に記載の方法であって、前記レポーターは、蛍光
    団であり、かつ前記シグナルレベルが観測されるシグナルは、蛍光である方法。
  12. 【請求項１２】 請求項10または11に記載の方法であって、前記方法は、サ
    ンプル中に存在する標的配列の存在または量を、検出、同定または定量化するた
    めに使用される方法。
  13. 【請求項１３】 請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法であって、前記
    ハイブリダイゼーション・ビーコンは、前記標的ポリヌクレオチドの一つの対立
    遺伝子に相補的な配列を有する方法。
  14. 【請求項１４】 請求項13に記載の方法であって、二以上の異なったハイブ
    リダイゼーション・ビーコンのそれぞれが、前記標的ポリヌクレオチドの異なっ
    た対立遺伝子に相補的な配列を有する方法。
  15. 【請求項１５】 請求項10〜14のいずれか一項に記載の方法であって、前記
    ハイブリダイゼーション・ビーコンのシグナルレベルを観測した前記所定の温度
    は、前記ポリヌクレオチド標的の前記異なった各対立遺伝子で形成された前記ハ
    イブリッドの融解温度の中間である方法。
  16. 【請求項１６】 請求項10〜14のいずれか一項に記載の方法であって、前記
    温度範囲は、前記ハイブリッドの融解温度を包含する方法。
  17. 【請求項１７】 請求項10〜14、および17のいずれか一項に記載の方法であ
    って、前記観測は、温度変化とシグナルレベルの変化の割合から成る方法。
  18. 【請求項１８】 請求項10〜17のいずれか一項に記載の方法であって、前記
    ポリヌクレオチド標的の増幅は、前記ハイブリダイゼーション・ビーコンの存在
    下で行われる方法。
  19. 【請求項１９】 請求項10〜18のいずれか一項に記載の方法であって、前記
    好ましいポリヌクレオチド標的は、PCRアンプリマーである方法。
  20. 【請求項２０】 請求項18または19に記載の方法であって、ポリヌクレオチ
    ドの増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、鎖置換
    増幅（SDA）、転写媒介増幅（TMA）、ローリングサークル増幅（RCA）または核
    酸配列塩基増幅（NASBA）によって行われる方法。
  21. 【請求項２１】 請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法であって、前記
    ハイブリダイゼーション・ビーコンの前記シグナルの観測は、前記ポリヌクレオ
    チドの増幅時になされる方法。
  22. 【請求項２２】 請求項10〜21のいずれか一項に記載の方法であって、ハイ
    ブリダイゼーション・ビーコンが、事前にDNA抽出をせずに、唾液などのサンプ
    ルから増幅された標的を検出および判別するために使用される方法。
  23. 【請求項２３】 請求項20〜22のいずれか一項に記載の方法であって、前記
    PCR反応は、非対称増幅である方法。
  24. 【請求項２４】 請求項10〜23のいずれか一項に記載の方法であって、前記
    ハイブリダイゼーション・ビーコン、前記標的配列または両方が、支持体に固定
    化されている方法。
  25. 【請求項２５】 ホモ接合性およびヘテロ接合性ポリヌクレオチド標的間を
    区別する際の、請求項1〜7のいずれか一項に記載のハイブリダイゼーション・ビ
    ーコンの使用。
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