ES2972231T3 - Procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar la eficacia de la amplificación - Google Patents
Procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar la eficacia de la amplificación Download PDFInfo
- Publication number
- ES2972231T3 ES2972231T3 ES21205358T ES21205358T ES2972231T3 ES 2972231 T3 ES2972231 T3 ES 2972231T3 ES 21205358 T ES21205358 T ES 21205358T ES 21205358 T ES21205358 T ES 21205358T ES 2972231 T3 ES2972231 T3 ES 2972231T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- primer
- ubp
- nucleotide
- primers
- nucleic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 252
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 252
- 239000000539 dimer Substances 0.000 title claims abstract description 233
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 106
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 96
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 204
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 179
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 179
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 119
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 416
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 415
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 40
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 33
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 30
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 23
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 claims description 23
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims description 20
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 claims description 20
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 20
- LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound [O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LOJNBPNACKZWAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 5-nitro-1h-indole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 OZFPSOBLQZPIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 13
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- NEJMFSBXFBFELK-UHFFFAOYSA-N 4-nitro-1h-benzimidazole Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC2=C1N=CN2 NEJMFSBXFBFELK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 8
- NZJKEQFPRPAEPO-UHFFFAOYSA-N 1h-benzimidazol-4-amine Chemical compound NC1=CC=CC2=C1N=CN2 NZJKEQFPRPAEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 4
- -1 morpholinonebularin Chemical compound 0.000 claims description 4
- WETFHJRYOTYZFD-YIZRAAEISA-N (2r,3s,5s)-2-(hydroxymethyl)-5-(3-nitropyrrol-1-yl)oxolan-3-ol Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1N1C=C([N+]([O-])=O)C=C1 WETFHJRYOTYZFD-YIZRAAEISA-N 0.000 claims description 3
- FRYOZNAQLGCIKS-UHFFFAOYSA-N 4-(3-nitro-1h-pyrrol-2-yl)morpholine Chemical compound C1=CNC(N2CCOCC2)=C1[N+](=O)[O-] FRYOZNAQLGCIKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QTJTWXGFPBTKRR-UHFFFAOYSA-N 4-(4-nitro-1h-benzimidazol-2-yl)morpholine Chemical compound N=1C=2C([N+](=O)[O-])=CC=CC=2NC=1N1CCOCC1 QTJTWXGFPBTKRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- UTHBAKVGHIUWIP-UHFFFAOYSA-N 4-(5-nitro-1h-indol-2-yl)morpholine Chemical compound C=1C2=CC([N+](=O)[O-])=CC=C2NC=1N1CCOCC1 UTHBAKVGHIUWIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QFFLRMDXYQOYKO-KVQBGUIXSA-N 7-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-imidazo[4,5-d]triazin-4-one Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NN=NC(O)=C2N=C1 QFFLRMDXYQOYKO-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 3
- OXYNAKURPIFROL-PYUPQCDSSA-N 9-[(2s,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-2-morpholin-4-yloxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1)N1CCOCC1 OXYNAKURPIFROL-PYUPQCDSSA-N 0.000 claims description 3
- LTTZPKKPMZCXJD-UHFFFAOYSA-N aminophosphonic acid;3-nitro-1h-pyrrole Chemical compound NP(O)(O)=O.[O-][N+](=O)C=1C=CNC=1 LTTZPKKPMZCXJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JRTXBRPKDAKSSH-UHFFFAOYSA-N aminophosphonic acid;4-nitro-1h-benzimidazole Chemical compound NP(O)(O)=O.[O-][N+](=O)C1=CC=CC2=C1NC=N2 JRTXBRPKDAKSSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ATWWOPGVWCAISQ-UHFFFAOYSA-N aminophosphonic acid;5-nitro-1h-indole Chemical compound NP(O)(O)=O.[O-][N+](=O)C1=CC=C2NC=CC2=C1 ATWWOPGVWCAISQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- CKJJHVZEWIAJMK-MCDZGGTQSA-N aminophosphonic acid;9-[(2r,3r,4s,5r)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-3h-purin-6-one Chemical compound NP(O)(O)=O.O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 CKJJHVZEWIAJMK-MCDZGGTQSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 151
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 51
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 30
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 26
- 241000935255 Ureaplasma parvum Species 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 9
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 9
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 9
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000012340 reverse transcriptase PCR Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 description 3
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 3
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical class CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- 102100029684 Methylenetetrahydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2NC(=O)N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HCAJQHYUCKICQH-VPENINKCSA-N 0.000 description 1
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701832 Enterobacteria phage T3 Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101000587058 Homo sapiens Methylenetetrahydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000508310 Meiothermus chliarophilus Species 0.000 description 1
- 241000589496 Meiothermus ruber Species 0.000 description 1
- 241000508289 Meiothermus silvanus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010030837 Methylenetetrahydrofolate Reductase (NADPH2) Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093078 Pyrimidine dimer Proteins 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 1
- 241000206213 Thermosipho africanus Species 0.000 description 1
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 1
- 241000204664 Thermotoga neapolitana Species 0.000 description 1
- 241000015345 Thermus antranikianii Species 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000589498 Thermus filiformis Species 0.000 description 1
- 241000015334 Thermus igniterrae Species 0.000 description 1
- 241000557726 Thermus oshimai Species 0.000 description 1
- 241001522143 Thermus scotoductus Species 0.000 description 1
- 241000202921 Ureaplasma urealyticum Species 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 125000003192 dTMP group Chemical group 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001094 effect on targets Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6848—Nucleic acid amplification reactions characterised by the means for preventing contamination or increasing the specificity or sensitivity of an amplification reaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/117—Modifications characterised by incorporating modified base
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/101—Temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
- C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
- C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Microwave Amplifiers (AREA)
Abstract
La presente invención se refiere a un método para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con formación reducida de dímero de cebador en una reacción de amplificación múltiple. El método de la presente invención puede inhibir la formación de dímeros de cebadores y, por tanto, la generación de productos de amplificación no específicos de manera eficaz en una reacción de amplificación múltiple para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar la eficacia de la amplificación
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud reivindica prioridad a partir de la Solicitud de patente coreana Núm. 2016-0182955, presentada el 29 de diciembre de 2016, en la Oficina Coreana de la Propiedad Intelectual.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar la eficacia de la amplificación en reacciones de amplificación multiplex.
Antecedentes de la invención
La amplificación del ácido nucleico es un procedimiento fundamental para una amplia variedad de procedimientos en biología molecular, de tal manera que se han propuesto varios procedimientos de amplificación. Por ejemplo, Miller, H. I. et al. (documento WO 89/06700) desvela un procedimiento para amplificar ácidos nucleicos, que comprende la hibridación de una secuencia promotora/cebador a un ADN monocatenario ("ssDNA") diana, seguido de la transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Otros procedimientos conocidos de amplificación de ácidos nucleicos son los sistemas de amplificación basados en la transcripción (Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173(1989); y Gingeras TR. et al., documento WO 88/10315).
El procedimiento más predominante para la amplificación de ácidos nucleicos, conocido como reacción en cadena de la polimerasa (en adelante "PCR"), se basa en ciclos repetidos de desnaturalización del ADN de doble cadena, seguidos por el recocido del cebador de oligonucleótidos al molde de ADN y la extensión del cebador por una ADN polimerasa (Mullis et al. Patentes de los EE. UU. Núm. 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).
Las técnicas basadas en la PCR se han utilizado ampliamente no sólo para la amplificación de una secuencia de ADN diana, sino también para aplicaciones o procedimientos científicos en los campos de la investigación biológica y médica, como la PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR), la PCR de visualización diferencial (DD-PCR), la clonación de genes conocidos o desconocidos por PCR, la amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE), la PCR de cebado arbitrario (AP-PCR), la PCR multiplex, la tipificación de genomas SNP y el análisis genómico basado en la PCR (McPherson and Moller, (2000) PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, NY).
Dado que las técnicas basadas en la PCR implican la amplificación de la molécula de ácido nucleico diana, se requiere amplificar sólo la secuencia diana de forma precisa y eficiente. Para ello, es necesario seleccionar cebadores de secuencia y longitud adecuadas y realizar una reacción de amplificación ajustando adecuadamente el tipo y contenido de los componentes utilizados (porejemplo,ADN polimerasa, dNTPs, iones Mg y tampones) y la temperatura/tiempo de reacción. Sin embargo, en algunos casos, es difícil seleccionar las condiciones óptimas de reacción, y puede que no se consiga una eficacia de amplificación satisfactoria incluso en las condiciones de reacción seleccionadas. Se han desarrollado varios procedimientos para una amplificación más eficaz.
Mientras tanto, la reducción de la eficacia de amplificación puede ser causada por la formación de dímeros de cebadores. A este respecto, Lebedevet aldesvelan un procedimiento para mejorar la especificidad y la eficacia de la amplificación mediante el uso de un cebador en el que se introduce el grupo fosfotriester (PTE) 4-oxo-1-pentilo (OXP) en el enlace fosfodiéster terminal 3' o en el penúltimo enlace fosfodiéster del cebador, para evitar la hibridación inespecífica de los cebadores que se produce en condiciones de baja temperatura en una reacción inicial (Véase Lebedev et al., Nucleic Acids Res 2008; 36: e131).
Los cebadores tienen un efecto significativo en la especificidad y la eficacia de la reacción de amplificación, porque se hibridan específicamente con una molécula de ácido nucleico diana e inician su amplificación. En particular, la importancia de los cebadores se acentúa aún más en las reacciones de amplificación multiplex que utilizan cebadores múltiples.
Típicamente, se ha utilizado un procedimiento para alterar el sitio donde se hibrida el cebador o para ajustar la secuencia o la longitud del cebador para minimizar la formación de dímeros del cebador; sin embargo, tiene limitaciones al aplicarse al diseño de cebadores utilizados en reacciones de amplificación múltiple. Por lo tanto, sigue siendo necesario un procedimiento novedoso para inhibir eficazmente la formación de dímeros de cebadores, y dicho procedimiento mejoraría la eficacia de la amplificación de una manera más económica y conveniente, solo o en combinación con los procedimientos conocidos descritos anteriormente.
El documento WO2013/081755A1 desvela un procedimiento para reducir la formación de artefactos de amplificación en PCR multiplex, tal como cebadores-dímeros. El documento contempla el uso de pares de cebadores específicos de diana en la PCR multiplex, en la que un cebador específico de diana puede incluir una o más moléculas de ácido nucleico no nativas, como dímeros de timina, 8-oxo-2'-desoxiguanosina, inosina, desoxiuridina, bromodesoxiuridina o nucleótidos apurínicos.
A lo largo de la presente solicitud, se hace referencia a varias patentes y publicaciones y las citas se proporcionan entre paréntesis.
Sumario de la invención
Los presentes inventores se han esforzado por desarrollar un procedimiento capaz de reducir eficazmente la formación del dímero de cebador en una reacción de amplificación múltiple, particularmente para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana. Como resultado, los presentes inventores han encontrado que el uso de un cebador(es) que contiene(n) un nucleótido de base universal en una reacción de amplificación multiplex puede conducir a la formación inhibida de dímeros de cebadores, aumentando así la eficacia de la amplificación.
En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebadores.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación multiplex para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana.
Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar un kit para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con formación reducida de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación múltiple.
Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar el uso de un kit para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con formación reducida de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación múltiple.
Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar un medio de almacenamiento legible por ordenador que contenga instrucciones para configurar un procesador para diseñar pares de cebadores para su uso en un procedimiento para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con formación reducida de dímeros de cebadores.
Otros objetos y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue, tomada en conjunción con las reivindicaciones y dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra la estructura esquemática de un cebador de base universal (UBP) según la presente invención. El UBP comprende dos regiones libres de bases universales en ambos extremos y una región de base universal que comprende una región central.
La Fig. 2 muestra tres tipos de dímeros de cebador que pueden generarse inadvertidamente en una reacción de amplificación múltiple: dímero de cebador no extensible (fila superior); dímero de cebador extensible de una hebra (fila central); y dímero de cebador extensible de ambas hebras (fila inferior).
La Fig. 3 muestra las curvas de amplificación de los dímeros de cebadores, obtenidas utilizando los conjuntos de cebadores #1-3 (arriba a la izquierda) y #11-13 (arriba a la derecha) para formar dímeros de cebadores no extensibles, los conjuntos de cebadores #4-6 (centro a la izquierda) y #14-16 (centro a la derecha) para formar dímeros de cebadores extensibles de una hebra, y los conjuntos de cebadores #7-10 (abajo a la izquierda) y #17-20 (abajo a la derecha) para formar dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras, respectivamente.
La Fig. 4 muestra las curvas de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana (UP y NG), obtenidas utilizando el conjunto de cebadores de control UP y el conjunto de cebadores de control NG (1 ° fila); los conjuntos de cebadores #21-23 y #31-33 para formar dímeros de cebadores no extensibles (2° fila), los conjuntos de cebadores #24-26 y #34-36 para formar dímeros de cebadores extensibles de una sola hebra (3° fila), y los conjuntos de cebadores #27-30 y #37-40 para formar dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras (4° fila), respectivamente.
La Fig. 5A muestra las curvas de amplificación de los dímeros de cebadores, obtenidas utilizando un conjunto de cebadores #9 (1° fila, izquierda), un conjunto de cebadores #9A (1° fila, derecha), un conjunto de cebadores #9B (2° fila, izquierda) un conjunto de cebadores #9C (2° fila, derecha), un conjunto de cebadores #9D (3° fila, izquierda), un conjunto de cebadores #9E (3° fila, derecha), un conjunto de cebadores #9F (4° fila, izquierda) y un conjunto de cebadores #9G (4° fila, derecha), respectivamente.
La Fig. 5B muestra las curvas de amplificación de los dímeros de cebadores, obtenidas utilizando un conjunto de cebadores #19 (1 ° fila, izquierda), un conjunto de cebadores #19A (1 ° fila, derecha), un conjunto de cebadores #19B (2° fila, izquierda) un conjunto de cebadores #19C (2° fila, derecha), un conjunto de cebadores #19D (3° fila, izquierda), un conjunto de cebadores #19E (3° fila, derecha), un conjunto de cebadores #19F (4° fila, izquierda) y un conjunto de cebadores #19G (4° fila, derecha), respectivamente.
La Fig. 6A muestra las curvas de amplificación para una molécula de ácido nucleico diana, UP, obtenidas utilizando un conjunto de cebadores #29 (1‘ fila, izquierda), un conjunto de cebadores #29A (1‘ fila, derecha), un conjunto de cebadores #29B (2‘ fila, izquierda) un conjunto de cebadores #29C (2‘ fila, derecha), un conjunto de cebadores #29D (3‘ fila, izquierda), un conjunto de cebadores #29E (3‘ fila, derecha), un conjunto de cebadores #29F (4‘ fila, izquierda) y un conjunto de cebadores #29G (4‘ fila, derecha), respectivamente. Para comparar, se obtuvieron curvas de amplificación con los conjuntos de cebadores #29 y #29A-#29G sin un cebador para formar dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras (UP-C-3). En las figuras, los resultados de los conjuntos de cebadores #29 y #29A-#29G se representan con "-O-"; los resultados de los conjuntos de cebadores sin cebador para formar dímeros de cebadores (UP-C-3) se representan con "-X-".
La Fig. 6B muestra las curvas de amplificación para una molécula de ácido nucleico diana, NG, obtenidas utilizando un conjunto de cebadores #39 (1‘ fila, izquierda), un conjunto de cebadores #39A (1‘ fila, derecha), un conjunto de cebadores #39B (2‘ fila, izquierda) un conjunto de cebadores #39C (2‘ fila, derecha), un conjunto de cebadores #39D (3‘ fila, izquierda), un conjunto de cebadores #39E (3‘ fila, derecha), un conjunto de cebadores #39F (4‘ fila, izquierda) y un conjunto de cebadores #39G (4‘ fila, derecha), respectivamente. A modo de comparación, se obtuvieron curvas de amplificación con los conjuntos de cebadores #39 y #39A-#39G sin un cebador para formar dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras (NG-C-3). En las figuras, los resultados de los conjuntos de cebadores #39 y #39A-#39G se representan con "-O-"; los resultados de los conjuntos de cebadores sin cebador para formar dímeros de cebadores (NG-C-3) se representan con "-X-".
La Fig. 7 muestra las curvas de amplificación de los dímeros de cebadores, obtenidas utilizando una mezcla de cebadores convencional (-O-), una 1a mezcla UBP (-A-) y una 2a mezcla UBP (-□-).
La Fig. 8 muestra las curvas de amplificación para las moléculas de ácido nucleico diana, UU, MG, NG y CT, obtenidas utilizando una mezcla de cebadores convencional (columna izquierda), una 1a mezcla UBP (columna central) y una 2a mezcla UBP (columna derecha) en presencia de una molécula de ácido nucleico diana a concentraciones de 10 pg (-O-), 1 pg (-A-), 0,1 pg (-0-) y NTC (-X-).
Descripción detallada de la invención
La presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con formación reducida de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación multiplex, que comprende los pasos de:
(a) preparar al menos tres pares de cebadores, cada uno de los cuales comprendiendo un cebador directo y un cebador inverso; en el que cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente; en el que cualquiera o ambos de los cebadores en al menos un par de cebadores son cebadores de base universal (UBP); en el que el número de nucleótidos de base universal en el UBP es 1-2; en el que uno o dos de los nucleótidos de base universal están localizados en una región central que oscila del 3° nucleótido al el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está localizado en una región que oscila del 4° nucleótido en el extremo 5' del UBP hasta el 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP, de manera que una reacción de amplificación multiplex utilizando los al menos tres pares de cebadores genera productos de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebador en la que los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP; y en el que al menos uno de los UBP no comprende una base degenerada representada por el código degenerado IUB; y
(b) realizar una reacción de amplificación multiplex que comprenda al menos dos ciclos de recocido del cebador, extensión del cebador y desnaturalización utilizando los al menos tres pares de cebadores; en el que la reacción de amplificación multiplex genera productos de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebador.
Los inventores de la presente se han esforzado por desarrollar un procedimiento capaz de reducir eficazmente la formación del dímero de cebador en una reacción de amplificación múltiple, particularmente para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana. Como resultado, los presentes inventores han encontrado que el uso de un cebador(es) que contiene(n) un nucleótido de base universal en una reacción de amplificación multiplex puede conducir a la formación inhibida de dímeros de cebadores, aumentando así la eficacia de la amplificación.
En una reacción de amplificación de ácido nucleico convencional, pueden generarse inadvertidamente subproductos no específicos, como dímeros de cebadores, por hibridación entre cebadores. La presente invención se refiere a la inhibición de un dímero de cebador entre subproductos no específicos.
El término "dímero de cebador", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un híbrido formado por la inter hibridación de dos cebadores o por la intra-hibridación (auto-hibridación) de un solo cebador. En particular, el dímero de cebador incluye un híbrido que está formado por un par de cebadores que hibridan con moléculas de ácido nucleico diana iguales o diferentes. Además, el dímero de cebador, tal como se utiliza en el presente documento, incluye no sólo un híbrido de dos cebadoresper se,sino también un producto de extensión en el que una o ambas cadenas de cebadores que constituyen el híbrido se extienden.
Dependiendo de si cada hebra del dímero de cebador está extendida o no, los dímeros de cebador pueden dividirse en tres categorías: (i) dímero de cebador no extensible; (ii) dímero de cebador extensible de una hebra; y (iii) dímero de cebador extensible de ambas hebras (véase la Fig. 2).
El dímero de cebador no extensible, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a aquellos en los que ambas hebras de cebador, tras la hibridación, no son extendidas por una polimerasa de ácido nucleico (véase la fila superior de la Fig. 2). El dímero de cebador extensible de una hebra, tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a aquellos en los que una de las dos hebras de cebador tras la hibridación es extendida por una polimerasa de ácido nucleico (véase la fila central de la Fig. 2). Los dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras se refieren a aquellos en los que ambas hebras de cebadores, tras la hibridación, son extendidas por una polimerasa de ácido nucleico (véase la fila inferior de la Fig. 2).
De acuerdo con los experimentos, la formación del dímero de cebador no extensible o del dímero de cebador extensible de una hebra no tiene una influencia significativa en la amplificación de la molécula de ácido nucleico diana, mientras que la formación del dímero de cebador extensible de ambas hebras dificulta la hibridación de los cebadores con la molécula de ácido nucleico diana en una reacción de amplificación de ácido nucleico. Además, la amplificación del dímero de cebador extensible de ambas hebras puede hacer que se desperdicien enzimas, dNTPs, etc., en la reacción de amplificación del ácido nucleico diana y que aumenten los productos de amplificación no específicos que compiten con la molécula de ácido nucleico diana por unirse al cebador, lo que acaba deteriorando la eficacia de la reacción de amplificación del ácido nucleico normal.
En consecuencia, la presente invención se centra en la inhibición de la formación y amplificación no deseada de dímeros de cebador extensibles de ambas hebras para mejorar la eficacia de amplificación de la diana.
Las etapas del procedimiento de la presente invención se describirán en detalle como sigue:
Paso (a): Preparación de al menos tres pares de cebadores
De acuerdo con la presente invención, primero se determinan al menos tres moléculas de ácido nucleico diana a amplificar.
Aunque el procedimiento de la presente es aplicable a varias reacciones de amplificación multiplex, las características y ventajas del procedimiento de la presente serán evidentes en una reacción de amplificación para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana.
El término "molécula de ácido nucleico diana", "molécula diana" o "ácido nucleico diana", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico que debe ser finalmente amplificada o detectada. Tal y como se utiliza en el presente documento, los términos "molécula de ácido nucleico diana" o "molécula de ácido nucleico" pueden utilizarse indistintamente con "secuencia de ácido nucleico diana" o "secuencia de ácido nucleico", respectivamente. La molécula de ácido nucleico diana comprende una molécula de una sola hebra así como de una doble hebra. La molécula de ácido nucleico diana comprende una secuencia de ácido nucleico recién producida en las reacciones, así como una secuencia inicialmente presente en una muestra.
La molécula de ácido nucleico diana puede incluir cualquier ADN (ADNg y ADNc), moléculas de ARN y sus híbridos (ácido nucleico quimera). La molécula puede estar en forma de doble cadena o de cadena simple. Cuando el ácido nucleico como material de partida es de doble cadena, se prefiere convertir las dos cadenas en una forma de cadena simple o parcialmente simple. Los procedimientos conocidos para separar las hebras incluyen, entre otros, el calentamiento, el álcali, la formamida, el tratamiento con urea y glicoxal, los procedimientos enzimáticos (por ejemplo, la acción de la helicasa) y las proteínas de unión. Por ejemplo, la separación de los filamentos puede lograrse mediante el calentamiento a una temperatura que oscila entre 80°C y 105°C. Los procedimientos generales para llevar a cabo este tratamiento se encuentran en Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001).
La secuencia de ácido nucleico diana incluye cualquier ácido nucleico procariota, eucariota (por ejemplo, protozoos y parásitos, hongos, levaduras, plantas superiores, animales inferiores y superiores, incluidos los mamíferos y los seres humanos), vírico (por ejemplo, virus del herpes, VIH, virus de la gripe, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis, virus de la polio, etc.) o viroide. La molécula de ácido nucleico también puede ser cualquier molécula de ácido nucleico que haya sido o pueda ser producida recombinantemente o sintetizada químicamente. Así, la secuencia de ácido nucleico puede encontrarse o no en la naturaleza.
La molécula de ácido nucleico diana no debe interpretarse como una limitación de la secuencia conocida en un momento dado o de la secuencia disponible a partir de un momento dado, sino que debe leerse para abarcar la secuencia que puede estar disponible o ser conocida ahora o en cualquier momento en el futuro. En otras palabras, la molécula de ácido nucleico diana puede ser conocida o no en el momento de practicar el presente procedimiento.
En caso de que se desconozca el ácido nucleico diana, su secuencia puede determinarse mediante uno de los procedimientos de secuenciación convencionales antes de realizar el presente procedimiento.
Cuando la molécula diana es una molécula de ácido nucleico diana, la muestra puede someterse a un procedimiento de extracción de ácido nucleico conocido en la técnica (véase Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press (2001)). El proceso de extracción de ácidos nucleicos puede variar en función del tipo de muestra. Además, cuando el ácido nucleico extraído es ARN, se puede realizar un procedimiento de transcripción inversa para sintetizar el ADNc (véase Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Press (2001)).
De acuerdo con una realización de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico diana comprende una variación de nucleótidos.
El término "variación de nucleótidos" utilizado en la presente memoria se refiere a cualquier sustitución, supresión o inserción de uno o varios nucleótidos en una secuencia de ADN en una ubicación particular entre segmentos de ADN contiguos que, por lo demás, son similares en cuanto a la secuencia. Estos segmentos contiguos de ADN incluyen un gen o cualquier otra porción de un cromosoma. Estas variaciones de nucleótidos pueden ser variaciones alel mismoicas mutantes o polimórficas. Por ejemplo, la variación de nucleótidos detectada en la presente invención incluye el SNP (polimorfismo de un solo nucleótido), la mutación, la deleción, la inserción, la sustitución y la translocación. Las variaciones nucleotídicas ejemplificadas incluyen numerosas variaciones en el genoma humano (por ejemplo, variaciones en el gen MTHFR (metilentetrahidrofolato reductasa)), variaciones implicadas en la resistencia a los fármacos de los patógenos y variaciones causantes de la tumorigénesis. El término "variación de nucleótidos" utilizado en este documento incluye cualquier variación en una ubicación particular en una secuencia de ácido nucleico. En otras palabras, el término "variación de nucleótidos" incluye un tipo salvaje y su cualquier tipo mutante en una ubicación particular en una secuencia de ácido nucleico.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresión "determinar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana para ser amplificadas" se refiere a un procedimiento para determinar qué secuencia de ácido nucleico debe ser amplificada,es decir,seleccionar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana para ser amplificadas, entre un número de moléculas de ácido nucleico.
En una realización de la presente invención, la molécula de ácido nucleico diana a amplificar es al menos tres moléculas de ácido nucleico diana, al menos cuatro moléculas de ácido nucleico diana, al menos cinco moléculas de ácido nucleico diana, al menos seis moléculas de ácido nucleico diana, al menos siete moléculas de ácido nucleico diana, o al menos ocho moléculas de ácido nucleico diana. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico diana a amplificar puede ser 3-20, 3-18, 3-15, 3-12, 3-10, 3-8, 3-5, 4-20, 4-18, 4-15, 4-12, 4-10, 4-8, 4-5, 5-20, 5-18, 5-15, 5 12, 5-10 o 5-8 moléculas de ácido nucleico diana.
En una realización de la presente invención, se utilizan al menos tres pares de cebadores, al menos cuatro pares de cebadores, al menos cinco pares de cebadores, al menos seis pares de cebadores, al menos siete pares de cebadores o al menos ocho pares de cebadores para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana, al menos cuatro moléculas de ácido nucleico diana, al menos cinco moléculas de ácido nucleico diana, al menos seis moléculas de ácido nucleico diana, al menos siete moléculas de ácido nucleico diana o al menos ocho moléculas de ácido nucleico diana, respectivamente.
De acuerdo con una realización, el número de moléculas de ácido nucleico diana que se amplifican y detectan mediante el procedimiento de la presente es el mismo que el de los pares de cebadores utilizados en el procedimiento de la presente.
De acuerdo con la presente invención, se preparan al menos tres pares de cebadores para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana, donde cada par de cebadores comprende un cebador directo y un cebador inverso. Cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente.
De acuerdo con una realización de la presente invención, al menos tres pares de cebadores utilizados en la presente memoria son tres pares de cebadores, cuatro pares de cebadores, cinco pares de cebadores, o similares.
El término "cebador", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis cuando se coloca en condiciones en las que se induce la síntesis del producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico (molde),es decir,en presencia de nucleótidos y un agente para la polimerización, como la ADN polimerasa, y a una temperatura y pH adecuados. Preferiblemente, los cebadores son moléculas de desoxirribonucleótidos monocatenarios. Los cebadores utilizados en esta invención pueden estar compuestos por dNMP naturales (es decir, dAMP, dGM, dCMP y dTMP), nucleótidos modificados, o nucleótidos no naturales. Los cebadores también pueden incluir ribonucleótidos.
El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia del agente de polimerización. La longitud exacta de los cebadores dependerá de muchos factores, como la temperatura, la aplicación y la fuente del cebador. El término "recocido" o "cebado", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la aposición de un oligodesoxinucleótido o ácido nucleico a un ácido nucleico molde, por lo que la aposición permite a la polimerasa polimerizar nucleótidos en una molécula de ácido nucleico que es complementaria al ácido nucleico molde o a una parte del mismo.
El término "complementario" se utiliza en la presente memoria para significar que los cebadores o las sondas son suficientemente complementarios para hibridar selectivamente con una secuencia de ácido nucleico diana bajo las condiciones de recocido designadas o las condiciones estrictas, abarcando los términos "sustancialmente complementario" y "perfectamente complementario", preferentemente perfectamente complementario.
El término "hibridación" utilizado en la presente memoria se refiere a la formación de un ácido nucleico de doble cadena a partir de ácidos nucleicos complementarios de cadena simple. La hibridación puede producirse entre dos cadenas de ácido nucleico perfectamente emparejadas o sustancialmente emparejadas con algunos desajustes. La complementariedad para la hibridación puede depender de las condiciones de hibridación, especialmente de la temperatura.
No se pretende distinguir entre los términos "recocido" e "hibridación", y estos términos se utilizarán indistintamente.
Los términos "un par de cebadores", " par de cebadores", "un solo par de cebadores" y "un tipo de par de cebadores", tal y como se utilizan en la presente memoria, incluyen un par de cebadores directos e inversos. Un par de cebadores puede utilizarse en una reacción de amplificación para una molécula de ácido nucleico diana.
Además, una pluralidad de pares de cebadores como se menciona en la presente memoria, por ejemplo, (al menos) dos pares de cebadores, (al menos) tres pares de cebadores, (al menos) cuatro pares de cebadores,etc.,significa que el número de pares de cebadores es plural y los pares de cebadores son diferentes entre sí. Por lo tanto, los términos "al menos tres pares de cebadores", tal y como se utilizan en la presente memoria, significan que el número de pares de cebadores es al menos tres y que los pares de cebadores son diferentes entre sí.
La expresión "los pares de cebadores son diferentes entre sí" puede abarcar el significado de: (i) los pares de cebadores son sustancialmente diferentes entre sí, o (ii) los pares de cebadores son completamente diferentes entre sí.
La expresión "los pares de cebadores son sustancialmente diferentes entre sí" significa que un cebador directo de un par de cebadores es diferente de un cebador directo del otro par de cebadores, o que un cebador inverso de un par de cebadores es diferente de un cebador inverso del otro par de cebadores.
La expresión "los pares de cebadores son completamente diferentes entre sí" significa que un cebador directo de un par de cebadores es diferente de un cebador directo del otro par de cebadores y un cebador inverso de un par de cebadores es diferente de un cebador inverso del otro par de cebadores.
El procedimiento de la presente invención generalmente utiliza al menos tres pares de cebadores que son completamente diferentes entre sí, pero no excluye el uso de al menos tres pares de cebadores que sean sustancialmente diferentes entre sí.
De acuerdo con una realización, los pares de cebadores de la presente invención son completamente diferentes entre sí.
Dos pares de cebadores diferentes pueden expresarse como "dos pares de cebadores"; tres pares de cebadores diferentes como "tres pares de cebadores".
Además, la expresión "los cebadores son diferentes entre sí" significa que los cebadores son diferentes en longitud, o que los cebadores no están representados por una secuencia o una secuencia que contiene 5 o menos bases degeneradas en la misma.
Por ejemplo, cuando los cebadores se diseñan para incluir bases degeneradas en sitios específicos con el fin de amplificar ácidos nucleicos que tienen algunas variaciones en una región conservada, los cebadores se consideran los mismos cebadores, es decir, un solo cebador, porque tienen la misma longitud de secuencias y están representados por una secuencia que contiene 5 o menos bases degeneradas. Según una realización de la presente invención, el término "uno o varios cebadores" es uno que tiene una longitud específica y está representado por una secuencia o representado por una secuencia que incluye cinco o menos, particularmente cuatro o menos, más particularmente tres o menos bases degeneradas.
En la presente memoria se utilizan los códigos degenerados IUB para las bases de nucleótidos. En este código, R significa cualquiera de las bases de purina A o G; Y significa cualquiera de las bases de pirimidina C o T; M significa cualquiera de las bases de amino A o C; K significa cualquiera de las bases de ceto G o T; S significa cualquiera de los socios de enlace de hidrógeno más fuertes C o G; W significa cualquiera de los socios de enlace de hidrógeno más débiles A o T; H significa cualquiera de A, T o C; B significa cualquiera de G, T o C; D significa cualquiera de G, A o T; V significa cualquiera de G, A o C y N significa cualquiera de A, C, G o T
En la presente invención, al menos tres pares de cebadores, cada par de cebadores que comprende un cebador directo y un cebador inverso, que se utilizan en una reacción de amplificación multiplex para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana, incluyen una pluralidad de cebadores. Por lo general, el número total de cebadores suele ser dos veces el número total de pares de cebadores. Sin embargo, en el caso de que haya uno o más cebadores idénticos entre los pares de cebadores, el número total de cebadores puede ser inferior a dos veces el número total de pares de cebadores.
De acuerdo con una realización de la presente invención, al menos tres pares de cebadores utilizados en la presente memoria comprenden 4, 5 o 6 cebadores.
De acuerdo con una realización de la presente invención, al menos cinco pares de cebadores utilizados en la presente memoria comprenden 6, 7, 8, 9 o 10 cebadores.
De acuerdo con una realización de la presente invención, al menos siete pares de cebadores utilizados en la presente memoria comprenden 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 cebadores.
Convencionalmente, una base universal como la desoxiinosina o la inosina ha sido ampliamente empleada como "base degenerada" debido a su capacidad de emparejarse indistintamente con cada una de las cuatro bases nucleotídicas estándar. En particular, los cebadores que contienen inosina compensan la alta tasa de degeneración de los codones diana y pueden reducir sustancialmente la degeneración general de los cebadores, así como el falso cebado y la amplificación de genes no diana (Kilpatrick, D. R. et. al., 1996. J. Clin. Microbiol. 34:2990-2996 Rossolini. G. M. y otros, 1994. Mol. Celular. Probes 8:91-98). Sin embargo, no se ha intentado inhibir la formación de dímeros en una reacción de amplificación multiplex mediante la incorporación de una(s) base(s) universal(es) como la inosina en la región central del cebador como en la presente invención.
El procedimiento de la presente invención utiliza cebadores que contienen nucleótidos de base universal para reducir la formación de dímeros de cebador, particularmente los dímeros de cebador extensible de ambas hebras y para mejorar la eficacia de amplificación de la diana. De acuerdo con la presente invención, la colocación de nucleótidos de base universal de forma elaborada en el cebador puede inhibir eficazmente la formación de dímeros de cebador, conservando al mismo tiempo las propiedades (por ejemplo, la unión específica a la secuencia complementaria y la elongación por la polimerasa) de un cebador convencional correspondiente (es decir, un cebador que comprende un nucleótido natural complementario a la diana en lugar del nucleótido de base universal).
El cebador preparado de acuerdo con la estrategia propuesta por la presente invención se denomina cebador de base universal (UBP). El término "cebador de base universal (UBP)", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a uno en el que al menos un nucleótido de un cebador contiene una base universal en lugar de una base natural (A, C, G o T (U)). En la presente invención, el UBP actúa como inhibidor de la formación de dímeros de cebadores. En particular, un cebador que incorpora desoxiinosina o inosina entre las bases universales se denomina cebador de inosina (IPm). Por el contrario, el término "cebador convencional", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un cebador de uso común que consiste en nucleótidos naturales solamente (A, C, G o T (U)). Los cebadores en la presente memoria utilizados pueden ser sintetizados en la propia empresa o por un tercero para sintetizar un cebador.
La incorporación de bases universales en un cebador de acuerdo con la presente invención contribuye a suprimir la formación de dímeros en el cebador y a aumentar la eficacia de amplificación en una reacción de amplificación multiplex para al menos tres pares de cebadores.
Para un procedimiento de amplificación de ácido nucleico, se pueden formar dímeros de cebadores por hibridación entre algunas secuencias de cebadores. Dado que la fuerza de unión entre una base universal y una base natural es relativamente menor que la que existe entre dos bases naturales complementarias, la incorporación de al menos un nucleótido de base universal en una posición adecuada, esdecir,la región del núcleo del cebador, reduciría la Tm del dímero de cebador e inhibiría la formación del dímero del mismo.
De acuerdo con la presente invención, el UBP tiene 1-3 nucleótidos de base universal. En una realización, el UBP tiene 1-2 nucleótidos de base universal.
El término "nucleótido de base universal" se refiere a un nucleótido que contiene una base universal en lugar de una base natural. El término puede utilizarse de forma intercambiable con "nucleótido universal", "nucleótido universal que contiene una base", "nucleótido universal que incorpora una base" y similares.
La incorporación de al menos cuatro nucleótidos universales en el UBP no es deseable porque puede reducir la eficacia de hibridación entre la diana y el cebador debido a la alta abundancia de nucleótidos de base universal. Por lo tanto, la incorporación de tres o menos, en particular dos o menos nucleótidos de base universal, es adecuada para mantener una hibridación estable entre la diana y el cebador.
De acuerdo con la presente invención, el UBP tiene de 1 a 3 nucleótidos de base universal; en la que uno o dos de los nucleótidos de base universal están situados en una región central que oscila del 3° nucleótido hasta el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP.
El término "región central", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere al rango de ubicación óptimo para colocar uno o dos nucleótidos de base universal en el UBP para lograr la inhibición de la formación de dímeros de cebadores, en particular la formación de dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras. Es decir, la región central se refiere a una región específica dentro del UBP en la que se ubican uno o dos nucleótidos de base universal para ejercer el máximo efecto.
Ambas hebras de cebador que constituyen el dímero de cebador, especialmente el dímero de cebador extensible de ambas hebras, se consumen durante la reacción de extensión y no pueden utilizarse para amplificar la molécula de ácido nucleico diana. Los presentes inventores han descubierto que la colocación de uno o más nucleótidos de base universal en la región central de una o ambas cadenas de cebadores puede minimizar la posibilidad de que la porción del extremo 3' participe en la formación de dímeros de cebadores extensibles de ambas cadenas.
De acuerdo con nuestros resultados experimentales, se encontró que la amplificación de la molécula de ácido nucleico diana se vio afectada en gran medida por la formación de dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras. Dado que los dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras se producen normalmente por hibridación entre las porciones del extremo 3' de dos hebras de cebadores, se reveló que la colocación de uno o dos nucleótidos de base universal en la porción del extremo 3' es preferible para inhibir dicha formación de dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras.
En la presente invención, se determinó la posición exacta de la región central en el UBP en términos de amplificación de la diana y de formación de dímeros de cebadores. Es decir, la posición exacta de la región central en el UBP se determinó identificando una región crítica para inhibir la formación del dímero de cebador sin afectar negativamente a la amplificación de la molécula de ácido nucleico diana.
De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, la región central en el UBP va desde el 3° nucleótido hasta el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP
En general, el primer nucleótido o el segundo nucleótido en el extremo 3' de un cebador tiene un efecto significativo en la extensión del cebador. Por ejemplo, cuando el primer nucleótido o el segundo nucleótido del extremo 3' del cebador no es complementario al nucleótido correspondiente de la molécula de ácido nucleico diana, el primer nucleótido o el segundo nucleótido del extremo 3' del cebador no se hibridaría con el nucleótido correspondiente de la molécula de ácido nucleico diana y el extremo 3' no se extendería, lo que a su vez puede reducir en gran medida la eficacia de amplificación de la diana. Del mismo modo, para el UBP de la presente invención, el posicionamiento de un nucleótido de base universal en la primera posición o en la segunda posición en el extremo 3' del UBP reduce la unión del primer nucleótido o del segundo nucleótido en el extremo 3' a un nucleótido correspondiente de la molécula de ácido nucleico diana, lo que conduce a la baja eficacia de amplificación de la diana. Por lo tanto, según una realización de la presente invención, en vista de la eficacia de la amplificación de la diana, la región central en la que se encuentra el nucleótido universal es desde el 3°ernucleótido hasta un nucleótido superior (por ejemplo, 4°, 5°, 6°, 7° nucleótido o más) en el extremo 3' del UBP
Por otro lado, el efecto de los dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras en la amplificación de la diana depende del número de nucleótidos complementarios (superpuestos) dentro del dímero de cebador. Nuestros resultados experimentales revelan que el dímero de cebador que contiene cuatro nucleótidos complementarios (el dímero de cebador con cuatro nucleótidos superpuestos) no afecta significativamente a la amplificación de la diana; mientras que el dímero de cebador que contiene cinco nucleótidos complementarios (el dímero de cebador con cinco nucleótidos superpuestos) puede afectar a la amplificación de la diana dependiendo del tipo de diana; el dímero de cebador que contiene seis nucleótidos complementarios (el dímero de cebador con seis nucleótidos superpuestos) tiene un efecto significativo en la amplificación de la diana. Así, para inhibir la formación de dímeros de cebadores que tengan seis nucleótidos complementarios en su interior, un tipo de dímero que afecta en gran medida a la amplificación de la diana, el nucleótido de base universal puede situarse en el 6° nucleótido o en uno inferior.
De acuerdo con la presente invención, el posicionamiento del nucleótido de base universal en el primer nucleótido o en el segundo nucleótido en el extremo 3' del UBP no es deseable porque disminuye la eficacia de amplificación de la diana. Por otra parte, el posicionamiento del nucleótido de base universal en el tercer nucleótido puede inhibir la formación de dímeros de cebadores con tres o más nucleótidos complementarios en el extremo 3' de cada cadena de cebadores; el posicionamiento del nucleótido de base universal en el cuarto nucleótido puede inhibir la formación de cuatro o más nucleótidos complementarios en el extremo 3' de cada cadena de cebadores; el posicionamiento del nucleótido de base universal en el quinto nucleótido puede inhibir la formación de dímeros de cebadores con cinco o más nucleótidos complementarios en el extremo 3' de cada cadena de cebadores; y el posicionamiento del nucleótido de base universal en el sexto nucleótido puede inhibir la formación de dímeros de cebadores con seis o más nucleótidos complementarios en el extremo 3' de cada cadena de cebadores, mejorando así la eficacia de amplificación de la diana.
De acuerdo con una realización, el procedimiento de la presente puede evitar la hibridación de dos hebras de cebadores, y por tanto la formación de dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras.
Como se ha descrito anteriormente, cabe señalar que la formación de los dímeros de cebadores con cuatro o menos nucleótidos complementarios en ellos no afecta significativamente a la eficacia de amplificación de la diana. Por ejemplo, la colocación del nucleótido de base universal en el3 nucleótido del extremo 3' del UBP no inhibe la formación del dímero de cebador que contiene dos nucleótidos complementarios en el extremo 3' de cada cadena del cebador, pero la formación del dímero de cebador no afecta a la eficacia de amplificación de la diana. En cambio, el UBP que tiene un nucleótido de base universal colocado como se ha indicado anteriormente puede inhibir la formación de un dímero de cebador que tenga tres o más nucleótidos complementarios en el mismo, de modo que es adecuada para lograr el objeto de la presente invención.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la región central va desde el 3° nucleótido al 6° nucleótido, desde el 3° nucleótido al 5° nucleótido, desde el 3° nucleótido al 4° nucleótido del 4° nucleótido al 6° nucleótido, del 4° nucleótido al 5° nucleótido, o del 5° nucleótido al 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, particularmente del 3° nucleótido al 5° nucleótido en el extremo 3' del UBP.
Con respecto a la definición de la región central y la posición del nucleótido de base universal, el primer nucleótido en el extremo 3' de un cebador se refiere al nucleótido en el extremo 3' -terminal,es decir,el último nucleótido 3' (nucleótido 3'-terminal). Secuencialmente, el segundo nucleótido en el extremo 3' del UBP se refiere al nucleótido en la segunda posición desde la última,es decir,el penúltimo nucleótido 3'; el tercer nucleótido en el extremo 3' del UBP se refiere al nucleótido en la tercera posición desde la última, es decir, el 3' antepenúltimo nucleótido; el cuarto nucleótido en el extremo 3' del UBP se refiere al nucleótido en la cuarta posición desde el último,es decir,el 3' preantepenúltimo nucleótido; el quinto nucleótido en el extremo 3' del UBP se refiere al nucleótido en la quinta posición desde el último, y similares. La descripción de la posición se aplica igualmente al extremo 5'del cebador.
En un ejemplo, suponiendo un cebador que tiene la siguiente secuencia: 5'-AGNNNNNNNNNNNCT-3' (SEQ ID NO: 61; A: adenina, G: guanina, N: cualquier nucleótido, C: citosina; T: timina), "A" corresponde al primer nucleótido en el extremo 5'del cebador, "G" al segundo nucleótido en el extremo 5'del cebador, "C" al segundo nucleótido en el extremo 3' del cebador y "T" al primer nucleótido en el extremo 3' del cebador.
En otro ejemplo, suponiendo un cebador que tiene la siguiente secuencia: 5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGAA-3' (SEQ ID NÚM.: 62; A: adenina, G: guanina), la región central que va del 3° nucleótido al 6° nucleótido en el extremo 3' es "GGGGG".
De acuerdo con la presente invención, los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP Esto significa que los nucleótidos de base universal en el UBP no son inmediatamente adyacentes entre sí.
De acuerdo con la presente invención, uno o dos nucleótidos de base universal pueden ubicarse en la región del núcleo.
De acuerdo con la presente invención, la expresión "los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP" puede usarse indistintamente con la expresión "los nucleótidos de base universal están posicionados aparte unos de otros en el UBP". La expresión "los nucleótidos de base universal están colocados aparte uno del otro en el UBP", tal como se utiliza en la presente memoria, significa que hay otro(s) nucleótido(s) entre los dos nucleótidos de base universal. Por ejemplo, "los nucleótidos de la base universal están situados a dos nucleótidos de distancia entre sí" significa que hay otros dos nucleótidos entre los dos nucleótidos de la base universal.
En una realización de la presente invención, los nucleótidos de base universal están posicionados al menos a 1,2, 3, 5, 8, 10, 12, 15 y 20 nucleótidos de distancia entre sí en el UBP
En una realización de la presente invención, los nucleótidos de la base universal están posicionados a una distancia de 1-10 nucleótidos entre sí en el UBP, por ejemplo a 1-8 nucleótidos, 1-6 nucleótidos, 1-4 nucleótidos, 2-10 nucleótidos, 2-8 nucleótidos, 2-6 nucleótidos, 2-4 nucleótidos, 3-10 nucleótidos, 3-8 nucleótidos, 3-6 nucleótidos, o 3 4 nucleótidos entre sí en el UBP
De acuerdo con la presente invención, otros nucleótidos de base universal, excepto los nucleótidos de base universal situados en la región del núcleo, si están presentes, están situados en una región que oscila del 4° nucleótido en el extremo 5'del UBP hasta el 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP
Teniendo en cuenta que la delimitación de la región del núcleo puede variar, el resto (otro(s) nucleótidos de base universal) puede estar situado en una región excepto la región del núcleo, tres nucleótidos consecutivos en el extremo 5'del UBP, y dos nucleótidos consecutivos en el extremo 3' del UBP En otras palabras, el resto se encuentra en una región que va desde el 4° nucleótido del extremo 5' del UBP hasta un nucleótido inmediatamente adyacente (un nucleótido próximo) al último nucleótido 5' de la región central.
La posición de los nucleótidos de base universal restantes que no están ubicados en la región del núcleo se determina como sigue:
(i) la localización del (de los) nucleótido(s) de base universal en la primera posición de nucleótido o en la segunda posición de nucleótido en el extremo 3' del UBP dificulta significativamente la amplificación de la diana; y
(ii) la localización del nucleótido o nucleótidos de base universal en la posición del primer nucleótido (nucleótido 5' último), en la posición del segundo nucleótido (nucleótido 5' penúltimo) o en la posición del tercer nucleótido (nucleótido 5' antepenúltimo) en el extremo 5' del UBP no es suficiente para mejorar la amplificación de la diana, porque el dímero de cebador formado por la hibridación en la posición anterior no afecta en gran medida a la amplificación de la diana debido a una extensión corta.
En conjunto, el resto se localiza en una región excepto la región del núcleo, tres nucleótidos consecutivos en el extremo 5'del UBP, y dos nucleótidos consecutivos en el extremo 3' del UBP.
De acuerdo con la presente invención, cuando uno o dos de los nucleótidos de base universal están localizados en una región central que oscila del 3° nucleótido hasta el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está localizado en una región que oscila del 4° nucleótido en el extremo 5' del UBP hasta el 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP
De acuerdo con una realización, cuando uno o dos de los nucleótidos de la base universal están localizados en una región central que oscila del 3° nucleótido hasta el 5° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está localizado en una región que oscila del 4° nucleótido en el extremo 5' del UBP hasta el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP
Dependiendo del número de bases universales en el UBP, la posición de uno a tres de los nucleótidos de base universal en el UBP puede describirse como sigue:
(i) Cuando el UBP tiene un nucleótido de base universal:
El nucleótido de base universal se encuentra en una región central.
(ii) Cuando el UBP tiene dos nucleótidos de base universal:
En una realización, dos nucleótidos de base universal se encuentran en una región central.
En una realización alternativa, un nucleótido de base universal está localizado en una región del núcleo, y el otro está localizado en una región excepto la región del núcleo, tres nucleótidos consecutivos en el extremo 5'del UBP, y dos nucleótidos consecutivos en el extremo 3' del UBP En el caso de que la región central vaya desde el 3° nucleótido hasta el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, el resto se encuentra en una región que va desde el 4° nucleótido en el extremo 5'del UBP hasta el 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP En el caso de que la región del núcleo vaya desde el 3° nucleótido hasta el 5° nucleótido en el extremo 3' del UBP, el resto se encuentra en una región que va desde el 4° nucleótido en el extremo 5'del UBP hasta el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP
(ii) Cuando la UBP tiene tres nucleótidos de base universal:
En una realización, un nucleótido de base universal se localiza en una región del núcleo, y dos nucleótidos de base universal se localizan en una región excepto la región del núcleo, tres nucleótidos consecutivos en el extremo 5'del UBP, y dos nucleótidos consecutivos en el extremo 3' del UBP
En una realización alternativa, dos nucleótidos de base universal se localizan en una región del núcleo, y un nucleótido de base universal se localiza en una región excepto la región del núcleo, tres nucleótidos consecutivos en el extremo 5' del UBP, y dos nucleótidos consecutivos en el extremo 3' del UBP
Las realizaciones en las que el UBP tiene dos o tres nucleótidos de base universal se explican con más detalle, como sigue:
(i) Cuando el UBP tiene dos nucleótidos de base universal:
En una realización, dos nucleótidos de base universal se encuentran en la región del núcleo.
En otra realización, un nucleótido de base universal está localizado en la región del núcleo del UBP, y el otro está localizado dentro de 5, 10 o más nucleótidos en la dirección 5' desde el último nucleótido 5' de la región del núcleo del UBP Por ejemplo, cuando la región central va desde el 3° nucleótido hasta el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, la otra está situada desde el 11° nucleótido hasta el 7° nucleótido, desde el 12° nucleótido hasta el 7° nucleótido, desde el 13° nucleótido hasta el 7° nucleótido, desde el 14° nucleótido hasta el 7° nucleótido, desde el 15° nucleótido hasta el 7° nucleótido, o desde el 16° nucleótido hasta el 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP En este caso, la posibilidad de que la porción 3' del UBP hibride con otro cebador puede reducirse aún más.
De acuerdo con una realización alternativa, un nucleótido de base universal está situado en la región del núcleo del UBP, y el otro está situado en la porción 5' o en la porción 3' del UBP, donde la porción 5' y la porción 3' pueden determinarse por bisección de la longitud de los nucleótidos del UBP En este caso, la posibilidad de que otro cebador hibride con la UBP puede reducirse aún más.
En cuanto a la limitación de la ubicación del nucleótido base universal, una realización de la presente invención utiliza la bisección de toda la longitud del nucleótido del UBP. Cuando la longitud total del UBP es un número par, el UBP es bisecada uniformemente, mientras que cuando la longitud total del UBP es un número impar, el UBP no es bisecada uniformemente. En el caso de que el UBP no esté bisecada uniformemente, se puede emplear la adición o la supresión de un nucleótido. En otras palabras, el UBP se puede bisecar con precisión eliminando cualquier nucleótido en el extremo 5' o añadiendo cualquier nucleótido imaginario al extremo 5'. La adición o supresión de cualquier nucleótido tiene como diana únicamente la bisección exacta del UBP, por lo que no se interpreta que el nucleótido de base universal esté situado en el nucleótido añadido o suprimido. Alternativamente, el UBP puede bisecarse eliminando cualquier nucleótido en el extremo 3' o añadiendo cualquier nucleótido imaginario al extremo 3'. (ii) Cuando el UBP tiene tres nucleótidos de base universal: Según una realización, un nucleótido de base universal está situado en la región del núcleo, y dos nucleótidos universales están situados a 5, 10 o más nucleótidos en la dirección 5' desde el último nucleótido 5' de la región del núcleo del UBP. Por ejemplo, cuando la región central va del 11° nucleótido al 7° nucleótido, del 12° nucleótido al 7° nucleótido, del 13° nucleótido al 7° nucleótido, del 14° nucleótido al 7° nucleótido, del 15° nucleótido al 7° nucleótido, o del 16° nucleótido al 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP.
De acuerdo con una realización alternativa, un nucleótido de base universal se localiza en la región del núcleo del UBP, otro se localiza dentro de 5, 10 o más nucleótidos en la dirección 5' desde el último nucleótido 5' de la región del núcleo del UBP, y el otro se localiza en la porción 5' del UBP, donde la porción 5' y la porción 3' pueden determinarse por bisección de la longitud de los nucleótidos del UBP con o sin adición o supresión de un nucleótido.
De acuerdo con otra realización, un nucleótido de base universal está situado en la región del núcleo del UBP, otro está situado en la porción 5', en la porción media o en la porción 3' del UBP, donde las tres porciones se determinan por trisección de la longitud de los nucleótidos del UBP con o sin adición o supresión de uno o dos nucleótidos, y el otro está situado en la misma o diferente porción que el otro nucleótido. Por ejemplo, un nucleótido de base universal está situado en la región central del UBP, otro está situado en la porción 5' del UBP y el otro está situado en la porción media del UBP.
La posición de la base universal descrita anteriormente pretende ser ilustrativa, y un experto en la materia puede considerar otras posiciones del nucleótido de base universal.
La colocación de los nucleótidos de base universal como se ha indicado anteriormente permite que una reacción de amplificación multiplex utilizando los al menos tres pares de cebadores genere productos de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebadores.
En particular, la disposición de la base universal en la porción 5' del UBP, como se ha descrito anteriormente, puede inhibir la formación del dímero de cebador extensible de una hebra, y en consecuencia, evitar el consumo de componentes de la reacción de PCR, como la polimerasa y los dNTP
De acuerdo con la presente invención, al menos uno de los UBP no comprende una base degenerada. De acuerdo con una realización, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 o 12 de los UBP utilizados en la reacción de amplificación multiplex no incluyen una base degenerada. Según una realización de la presente invención, al menos el 50%, el 60% o el 70% de los UBP utilizados en la reacción de amplificación multiplex no comprenden una base degenerada. Según una realización de la presente invención, cuando el UBP tiene una base degenerada, el número de bases degeneradas no excede de uno. Según otra realización, todos los UBP no comprenden una base degenerada. La incorporación de los nucleótidos de base universal en un cebador puede reducir la necesidad de utilizar bases degeneradas.
De acuerdo con una realización de la presente invención, tanto el cebador directo como el cebador inverso del par de cebadores al menos uno, del par de cebadores al menos dos, del par de cebadores al menos tres, del par de cebadores al menos cuatro o del par de cebadores al menos cinco son UBP
De acuerdo con una realización de la presente invención, uno o ambos cebadores directos e inversos de cada par de cebadores son UBP
De acuerdo con una realización de la invención, al menos el 50%, el 60%, el 70%, el 80% o el 90% del número total de cebadores utilizados son UBP
De acuerdo con una realización de la presente invención, los cebadores son todos cebadores de base universal.
De acuerdo con una realización de la presente invención, al menos tres pares de cebadores utilizados en la presente realización comprenden al menos dos UBP Específicamente, al menos tres pares de cebadores utilizados en la presente realización comprenden al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 UBP
De acuerdo con una realización de la presente invención, al menos cuatro pares de cebadores utilizados en la presente realización comprenden al menos 3 UBP Específicamente, al menos cuatro pares de cebadores utilizados en la presente realización comprenden al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 UBP
De acuerdo con una realización de la presente invención, al menos cinco pares de cebadores utilizados en la presente realización comprenden al menos 3 UBP Específicamente, al menos cinco pares de cebadores utilizados en la presente realización comprenden al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos 10 UBP
De acuerdo con una realización de la presente invención, al menos siete pares de cebadores utilizados en la presente realización comprenden al menos 4 UBP Específicamente, al menos siete pares de cebadores utilizados en la presente realización comprenden al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13 o al menos 14 UBP.
La longitud de los cebadores utilizados en la presente invención puede variar en función de varios factores, como la conveniencia y el coste de la síntesis de cebadores, y la precisión y sensibilidad de la reacción de amplificación. Por ejemplo, la longitud de los cebadores utilizados en la presente invención puede ser, sin limitación, de al menos 12 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos 18 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos, al menos 22 nucleótidos, al menos 24 nucleótidos, hasta 60 nucleótidos, 50 nucleótidos, hasta 40 nucleótidos, hasta 35 nucleótidos, hasta 30 nucleótidos o hasta 25 nucleótidos.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la longitud del cebador es de 12-60, 12-50, 12-40, 12-35, 12-30, 12-25, 15-60, 15-50, 15-40, 15-35, 15-30, 15 - 25, 20-60, 20-50, 20-40, 20-35, 20-30, 20-25, 22-60, 22-50, 22 40, 22-35, 22-30, 22-25, 24-60, 24-50, 24-40, 24-35, o 24-30 nucleótidos, específicamente 20-30 nucleótidos.
De acuerdo con la presente invención, la base universal se selecciona del grupo que consiste en deoxiinosina, inosina, 7-deaza-2'-deoxiinosina, 2-aza-2'-deoxiinosina, 2'-OMe inosina, 2'-F inosina, deoxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2'-OMe 3-nitropirrol, 2'-F 3-nitropirrol, 1-(2'-deoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol, deoxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2'-OMe 5-nitroindol, 2'-F 5-nitroindol, deoxi 4-nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, deoxi 4-aminobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, deoxi nebularina, 2'-F nebularina, 2'-F 4-nitrobenzimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobenzimidazol, PNA-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfolinoinosina, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2'-O-metoxietil inosina, 2'-O-metoxietil nebularina, 2'-O-metoxietil 5-nitroindol, 2'-O-metoxietil 4-nitrobenzimidazol, 2'-O-metoxietil 3-nitropirrol, y sus combinaciones. Más concretamente, la base universal es la desoxiinosina, la inosina o una combinación de las mismas.
Paso (b): Reacción de amplificación multiplex con al menos tres pares de cebadores
A continuación, se lleva a cabo una reacción de amplificación multiplex utilizando los al menos tres pares de cebadores de la etapa (a), comprendiendo la reacción al menos dos ciclos de recocido, extensión y desnaturalización de los cebadores.
En la etapa (b), la reacción de amplificación multiplex genera productos de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebadores.
La reacción de amplificación multiplex de la presente invención se realiza en un recipiente único cerrado.
La amplificación multiplex de moléculas de ácido nucleico diana puede realizarse mediante varios procedimientos de amplificación de ácido nucleico con cebadores conocidos en la técnica, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Patente de los EE. UU. Núm. 4.683.195 y 4.683.202; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990)), la amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) (Walker, et al. Nucleic Acids Res. 20(7):1691-6 (1992); Walker PCR Methods Appl 3(1):1-6 (1993)), la amplificación mediada por transcripción (Phyffer, et al., J. Clin. Microbiol. 34:834-841 (1996); Vuorinen, et al., J. Clin. Microbiol. 33:1856-1859 (1995)), la amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA) (Compton, Nature 350(6313):91-2 (1991)), la amplificación por círculo rodante (RCA) (Lisby, Mol. Biotechnol. 12(1):75-99 (1999) Hatch et al., Genet. Anal. 15(2):35-40 (1999)) y la replicasa Q-Beta (Lizardi et al., BiolTechnology 6:1197 (1988)).
La reacción de amplificación multiplex de la presente invención puede realizarse de acuerdo con un procedimiento de PCR en tiempo real (véanselas Patentes de los EE. UU. Núm. 5.210.015, 5.538.848 y 6.326.145). El término "amplificación multiplex” significa la amplificación simultánea de dianas de ADN multiplex en una sola mezcla de reacción de polimerasa.
Las moléculas de ácido nucleico diana para la amplificación multiplex pueden incluir cualquier ADN (ADNg y ADNc), moléculas de ARN y sus híbridos (ácido nucleico quimera). La secuencia puede estar en forma de doble cadena o de cadena simple. Cuando el ácido nucleico como material de partida es de doble cadena, se prefiere convertir las dos cadenas en una forma de cadena simple o parcialmente simple. Los procedimientos conocidos para separar las hebras incluyen, entre otros, el calentamiento, el álcali, la formamida, el tratamiento con urea y glicoxal, los procedimientos enzimáticos (por ejemplo, la acción de la helicasa) y las proteínas de unión. Por ejemplo, la separación de los filamentos puede lograrse mediante el calentamiento a una temperatura que oscila entre 80°C y 105°C. Los procedimientos generales para llevar a cabo este tratamiento se encuentran en Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y(2001).
Cuando se emplea un ARNm como material de partida, es necesario una etapa de transcripción inversa antes de realizar la etapa de recocido, cuyos detalles se encuentran en Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); y Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). Para la transcripción inversa, se puede utilizar un cebador oligonucleótido dT hibridable con el ARNm, un hexámero aleatorio o un oligonucleótido complementario a la molécula de ácido nucleico diana.
El cebador oligonucleótido dT está compuesto por dTMP, uno o más de los cuales pueden ser sustituidos por otros dNMPs siempre que el cebador dT pueda servir como cebador. La transcripción inversa puede realizarse con una transcriptasa inversa que tenga actividad RNasa H. Si se utiliza una enzima con actividad de Rnasa H, puede ser posible omitir una etapa de digestión de Rnasa H por separado eligiendo cuidadosamente las condiciones de reacción.
El cebador utilizado en la presente invención se hibrida o es recocido en un sitio de la plantilla para formar una estructura de doble cadena. Las condiciones adecuadas para la hibridación del ácido nucleico para formar dicha estructura de doble cadena se describen por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y(2001) y Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985).
En la etapa de amplificación de la presente invención se puede utilizar una variedad de ADN polimerasas, incluyendo, por ejemplo, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I deE. coli,una ADN polimerasa termoestable y la ADN polimerasa del bacteriófago T7. En particular, la polimerasa es una polimerasa de ADN termoestable que puede obtenerse de una variedad de especies bacterianas, incluyendoThermus aquaticus(Taq),Thermus thermophilus(Tth),Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17 Thermus thermophilus, Thermotoga marítima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilusyAquifex aeolieus.La mayoría de estas enzimas pueden aislarse de la propia bacteria o estar disponibles en el mercado. Además, la polimerasa utilizada en la presente invención puede obtenerse a partir de células que expresan altos niveles del gen de clonación que codifica la polimerasa.
Cuando se lleva a cabo la reacción de polimerización, los componentes necesarios para la reacción pueden proporcionarse en exceso en el recipiente de reacción. El exceso de los componentes necesarios para la reacción de amplificación significa una cantidad tal que la reacción de amplificación no está sustancialmente restringida a la concentración del componente. Los cofactores, como el Mg2+, y los dNTPs, como el dATP, el dCTP, el dGTP y el dTTP, deben suministrarse a la mezcla de reacción en una cantidad que permita alcanzar el grado de amplificación deseado.
Todas las enzimas utilizadas en la reacción de amplificación pueden ser activas en las mismas condiciones de reacción. De hecho, los tampones garantizan que todas las enzimas estén cerca de las condiciones óptimas de reacción. Por lo tanto, el proceso de amplificación multiplex de la presente invención puede llevarse a cabo en una sola reacción sin cambiar las condiciones, como la adición de reactivos.
En la presente invención, el recocido o la hibridación se lleva a cabo en condiciones estrictas que permitan la unión específica entre la secuencia de ácido nucleico diana y el cebador. Las condiciones estrictas de recocido dependen de la secuencia y varían en función de las variables ambientales.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el recocido de los cebadores en la reacción de amplificación multiplex en la etapa (b) se lleva a cabo a 50°C o más.
La reacción de amplificación en el procedimiento de la presente invención puede llevarse a cabo a una temperatura de recocido relativamente alta para evitar la formación de dímeros de cebadores, aunque una UBP contenga una base universal. En la reacción de amplificación multiplex del paso (b), el recocido de los cebadores se lleva a cabo a una temperatura de 50°C o superior, 52°C o superior, 55°C o superior, o 57°C o superior. Específicamente, en la reacción de amplificación multiplex del paso (b), el recocido del cebador se realiza a 85°C o menor, a 80°C o menor, 75°C o menor, 70°C o menor, 65°C o menor y 60°C o menor, por ejemplo, 50-85°C, 50-80°C, 50-75°C, 52-75°C, 55-75°C, 50-70°C, 52-70°C, 55-70°C, 50-60°C, 52-60°C, 55-60°C o 57-60°C.
Se lleva a cabo una reacción de amplificación multiplex para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana utilizando un cebador(es) de base universal en presencia de al menos tres sondas adicionales para detectar la presencia de cada molécula de ácido nucleico diana. Cada una de las al menos tres sondas adicionales tiene una secuencia de hibridación con la correspondiente molécula de ácido nucleico diana y está situada entre un cebador directo y un cebador inverso para amplificar la molécula de ácido nucleico diana. El uso de las sondas en la reacción de amplificación multiplex utilizando lo(s) UBP de la presente invención puede aumentar aún más la especificidad de detección de la molécula de ácido nucleico diana. La utilización de las sondas puede llevarse a cabo según diversos procedimientos conocidos en la técnica. Los ejemplos de estos procedimientos incluyen el procedimiento de la sonda TaqMan™ (Patente de los EE. UU. Núm. 5.210.015), el procedimiento de baliza molecular (Tyagi et al., Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), CPT (Duck P, et al. Biotécnicos, 9: 142-148(1990)), el procedimiento LNA (Patente de los EE.<u>U. Núm. 6.977.295), el procedimiento Plexor (Sherrill CB et al., Journal of the American Chemical Society, 126: 4550-4556 (2004)), Hybeacons™ (D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363 374 y Patente de los EE. UU. Núm. 7.348.141), sondas de doble etiquetado con auto-desconexión (Patente de los EE. UU. Núm. 5.876.930), sondas de hibridación (Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148), PTOCE (desdoblamiento y extensión de documento WO; documento WO 2012/096523), PCE-SH (desdoblamiento y extensión de documento PTO-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization; documento W<o>2013/115442), PCE-NH (desdoblamiento y extensión de documento PTO-Dependent Non-Hybridization; documento WO 2014/104818) y el procedimiento CER (documento WO 2011/037306).
De acuerdo con una realización de la presente invención, las al menos tres sondas no tienen un nucleótido de base universal.
De acuerdo con una realización de la presente invención, las sondas pueden o no contener una etiqueta. Según una realización de la presente invención, dependiendo de la presencia de moléculas de ácido nucleico diana, las sondas pueden mediar una reacción posterior (por ejemplo, el procedimiento PTOCE).
El procedimiento de la presente invención presenta una formación reducida de dímeros de cebadores en comparación con la reacción de amplificación que utiliza cebadores convencionales.
Específicamente, la formación reducida de los dímeros de cebadores puede evaluarse midiendo el cambio en las señales acompañado por la formación del dímero de cebador. Alternativamente, se puede utilizar un cambio en los valores Ct, un cambio en los RFU máximos o una relación de cambio de las señales para evaluar la formación reducida de los dímeros del cebador.
En una realización, la formación reducida de los dímeros de cebadores puede evaluarse comparando los valores de Ct entre una reacción que utiliza el UBP de la presente invención en ausencia de la molécula de ácido nucleico diana y una reacción que utiliza cebadores convencionales consistentes en nucleótidos naturales en ausencia de la molécula de ácido nucleico diana. Para dicha comparación, se puede utilizar un cebador convencional que contenga nucleótidos naturales complementarios a los nucleótidos de una molécula de ácido nucleico diana, en lugar de los nucleótidos de base universal.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor Ct obtenido de una reacción utilizando un par de cebadores que contienen el UBP en ausencia de una molécula de ácido nucleico dianafes decir, el valor Ct del dímero de cebador) se incrementa en 1 o más, en comparación con el que utiliza un par de cebadores compuesto por cebadores convencionales en ausencia de una molécula de ácido nucleico diana. El valor Ct obtenido a partir de una reacción utilizando un par de cebadores que contienen el UBP en ausencia de una molécula de ácido nucleico diana se incrementa en 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, por ejemplo, de 3 a 20, de 5 a 15, o de 8 a 12, en comparación con el que utiliza un par de cebadores formado por cebadores convencionales en ausencia de una molécula de ácido nucleico diana.
El término “valor Ct del dímero de cebador” significa el valor Ct calculado a partir de la curva de amplificación de los dímeros de cebadores, que se obtiene mediante una reacción de amplificación utilizando una mezcla de reacción de PCR en ausencia de cualquier plantilla. Así, el aumento del valor Ct del dímero de cebador indica que la formación del dímero de cebador está inhibida o reducida.
Los procedimientos para obtener los valores Ct son conocidos en la técnica (véase Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)).
Cuando la inhibición o la reducción de la formación del dímero de cebador es muy eficaz, el valor Ct en la curva de amplificación del dímero de cebador puede no obtenerse debido a la baja amplificación del dímero de cebador. En este caso, se considera que el valor Ct del dímero de cebador aumenta en 1 o más.
El procedimiento de la presente invención exhibe una mayor eficacia de amplificación de la diana en comparación con una reacción de amplificación de la diana utilizando un cebador convencional en lugar del UBP. El aumento de la eficacia de la amplificación de la diana puede evaluarse comparando las diferencias entre las señales obtenidas al amplificar una molécula de ácido nucleico diana utilizando un cebador que contiene nucleótidos naturales y las señales obtenidas al amplificar una molécula de ácido nucleico diana utilizando un cebador de base universal (por ejemplo, un cambio en los valores Ct, un cambio en las RFU máximas, una relación de cambio de las señales, etc.).
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término “eficacia de amplificación” incluye cualquier valor siempre que pueda indicar la eficacia de una reacción de amplificación.
La eficacia de la amplificación puede calcularse por cualquiera de los diversos procedimientos conocidos en la técnica.
En una realización, la eficacia de amplificación puede estimarse calculando la tasa de amplificación sobre la base de una pendiente de regresión lineal de una fila de dilución y calculando la eficacia de amplificación sobre la base de la siguiente ecuación (Higuchi et al., 1993; Rasmussen, 2001):
Ecuación 1
E<=>lCr1'<pendiente>
en la que E representa la eficacia de amplificación; la pendiente representa la pendiente de la curva estándar en la que los valores Ct se trazan contra el número de copias inicial de la diana.
En otra realización, la eficacia de amplificación puede ser estimada por cualquiera de los programas conocidos en la técnica. Por ejemplo, la eficacia de la amplificación puede ser calculada mediante LinRegPCR para el análisis de datos de RT-PCR cuantitativa (qPCR) (versión 2017.1).
Cuando se emplea LinRegPCR para obtener la eficacia de amplificación, los datos de PCR en brutofes decir, no corregidos por la línea base) se utilizan en el análisis. La corrección de la línea de base se lleva a cabo con una tendencia de base basada en una selección de ciclos tempranos. La eficacia de la PCR para cada muestra individual se deriva de la pendiente de la línea de regresión ajustada a un subconjunto de puntos de datos con corrección de base en la fase log-lineal utilizando LinRegPCR. El programa utiliza normalmente una ventana de linealidad individual, pero, en el caso de algunas muestras, se puede establecer el límite superior e inferior de la ventana de linealidad individual.
La eficacia de la reacción con el UBP obtenido por uno de los procedimientos anteriores puede compararse con la eficacia de la reacción con cebadores convencionales. La eficacia de la reacción utilizando UBP puede expresarse como una tasa de aumento en relación con la reacción utilizando cebadores convencionales. La tasa de aumento puede calcularse mediante la siguiente ecuación:
Ecuación 2
Aumento de tasa de eficacia (%) = [(eficacia para una reacción utilizando UBP/eficacia para una reacción utilizando cebadores convencionales)-1] * 100
De acuerdo con una realización de la presente invención, la amplificación de una molécula de ácido nucleico diana mediante el uso del UBP en una reacción de amplificación multiplexada exhibe un índice de aumento de la eficacia del 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300% o más, en comparación con los que utilizan cebadores que consisten en nucleótidos de origen natural.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la eficacia de amplificación de cada reacción se calcula mediante LinRegPCR, y la tasa de aumento de eficacia para la reacción que utiliza UBP se calcula en comparación con la reacción que utiliza los cebadores convencionales.
En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación multiplex para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana, que comprende las etapas de:
(a) determinar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana a ser amplificadas;
(b) determinar las secuencias de nucleótidos de al menos tres pares de cebadores, cada uno de los cuales comprende un cebador directo y un cebador inverso; en el que cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente;
(c) sustituir 1-3 nucleótidos en uno o ambos cebadores en al menos un par de cebadores entre los al menos tres pares de cebadores con nucleótidos de base universal para preparar nucleótidos de base permite la inhibición de la formación de dímeros de cebadores; en el que el UBP tiene 1 a 3 nucleótidos de base universal; en el que uno o dos de los nucleótidos de base universal están situados en una región central que va del 3° nucleótido al 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está situado en una región que va del 4° nucleótido en el extremo 5'del UBP al 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP; en el que los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP; y
(d) realizar una reacción de amplificación multiplex que comprenda al menos dos ciclos de recocido del cebador, extensión del cebador y desnaturalización utilizando los al menos tres pares de cebadores; en la que la reacción de amplificación multiplex genera productos de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebador.
En una realización de la presente invención, la región central va desde el 3° nucleótido hasta el 5° nucleótido en el extremo 3' del UBP
En una realización de la presente invención, ambos cebadores del al menos un par de cebadores son UBP.
En una realización de la presente invención, uno o ambos cebadores en cada par de cebadores son UBP.
De acuerdo con la presente invención, al menos el 50% del número total de cebadores utilizados son UBP.
De acuerdo con una realización de la presente invención, al menos uno de los UBP no comprende una base degenerada.
En una realización de la presente invención, se utilizan al menos cinco pares de cebadores para amplificar al menos cinco moléculas de ácido nucleico diana.
En una realización de la presente invención, el recocido del cebador en la reacción de amplificación multiplex se realiza a 50°C o más.
En una realización de la presente invención, el procedimiento exhibe una eficacia de amplificación de la diana de al menos un 3% mayor que la de utilizar cebador(es) que contengan nucleótidos naturales (A, C, G o T (U)) complementarios a la secuencia de ácido nucleico diana en lugar de los al menos un UBP
En una realización de la presente invención, el valor Ct obtenido a partir de una reacción utilizando un par de cebadores que contienen el UBP en ausencia de una molécula de ácido nucleico diana se incrementa en 1 o más, en comparación con el que utiliza un par de cebadores compuesto por cebadores convencionales en ausencia de una molécula de ácido nucleico diana.
En una realización de la presente invención, la reacción de amplificación multiplex se realiza en presencia de al menos tres sondas adicionales para detectar la presencia de las moléculas de ácido nucleico diana; en la que cada una de las al menos tres sondas comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con la molécula de ácido nucleico diana que se va a amplificar y está situada entre el cebador directo y el cebador inverso.
En una realización de la presente invención, las al menos tres sondas no tienen un nucleótido de base universal.
En una realización de la presente invención, el nucleótido de base universal se selecciona del grupo que consiste en deoxiinosina, inosina, 7-deaza-2'-deoxiinosina, 2-aza-2'-deoxiinosina, 2'-OMe inosina, 2'-F inosina, deoxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2'-OMe 3-nitropirrol, 2'-F 3-nitropirrol, 1-(2'-deoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol, deoxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2'-OMe 5-nitroindol, 2'-F 5-nitroindol, deoxi 4-nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, deoxi 4-aminobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, deoxi nebularina, 2'-F nebularina, 2'-F 4-nitrobenzimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobenzimidazol, PNA-3-hitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolinonebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2'-O-metoxietil inosina, 2'-O-metoxietil nebularina, 2'-O-metoxietil 5-nitroindol, 2'-O-metoxietil 4-nitrobenzimidazol, 2'-O-metoxietil 3-nitropirrol, y sus combinaciones.
En una realización de la presente invención, el nucleótido de base universal comprende desoxiinosina, inosina o una combinación de las mismas.
El segundo aspecto de la presente invención, "un procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación múltiple" es una aplicación del primer aspecto mencionado anteriormente. Por lo tanto, se omiten las descripciones comunes entre ellos para evitar una redundancia indebida que provoque la complejidad de la presente memoria.
En un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un kit para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con formación reducida de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación multiplex, que comprende:
(a) al menos tres pares de cebadores, cada uno de los cuales comprendiendo un cebador directo y un cebador inverso; en el que cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente; en el que cualquiera o ambos de los cebadores en al menos un par de cebadores son cebadores de base universal (UBP); en el que el número de nucleótidos de base universal en el UBP es 1-2; en el que uno o dos de los nucleótidos de base universal están localizados en una región central que oscila del 3° nucleótido al el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está localizado en una región que oscila del 4° nucleótido en el extremo 5' del UBP hasta el 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP, de manera que una reacción de amplificación multiplex utilizando los al menos tres pares de cebadores genera productos de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebador en la que los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP; y en el que al menos uno de los UBP no comprende una base degenerada representada por el código degenerado IUB; y
(b) una polimerasa de ácido nucleico.
En un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de un kit para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con formación reducida de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación multiplex en la realización del procedimiento de la reivindicación 1, en el que el kit comprende:
(a) al menos tres pares de cebadores, cada uno de los cuales comprende un cebador directo y un cebador inverso; en los que cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente; en los que uno o ambos cebadores de al menos un par de cebadores son cebadores de base universal (UBP); en los que el UBP tiene 1-3 nucleótidos de base universal en el que uno o dos de los nucleótidos de base universal están situados en una región central que va del 3° nucleótido al 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está situado en una región que va del 4° nucleótido en el extremo 5'del UBP al 3° nucleótido en el extremo 3' del UBP; en el que los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP; y
(b) una polimerasa de ácido nucleico.
El kit o el uso del kit para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana de la presente invención es para llevar a cabo el procedimiento de la presente invención descrito anteriormente, y las descripciones comunes entre ellos se omiten para evitar una redundancia indebida que lleve a la complejidad de la presente memoria.
Opcionalmente, el kit de la presente invención puede comprender reactivos necesarios para las reacciones de PCR, tales como tampones, ADN polimerasa, cofactores de ADN polimerasa y desoxirribonucleótido-5-trifosfato. Opcionalmente, el kit de la presente invención puede comprender además varias moléculas de polinucleótidos, transcriptasa inversa, varios tampones y reactivos, y un anticuerpo que inhibe la actividad de la a Dn polimerasa. Además, el kit de la presente invención puede comprender además los reactivos necesarios para las reacciones de control positivo y negativo. La cantidad óptima de reactivos utilizados en una reacción particular puede ser fácilmente determinada por un experto en la materia. Típicamente, el kit de la presente invención comprende los componentes descritos anteriormente en un paquete o compartimiento separado.
En un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que contiene instrucciones para configurar un procesador para: diseñar al menos tres pares de cebadores, comprendiendo cada par de cebadores un cebador de directo y un cebador de inverso; en el que cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente; en el que uno o ambos cebadores en al menos un par de cebadores son cebadores de base universal (UBP); en el que el UBP tiene 1-2 nucleótidos de base universal; en el que uno o dos de los nucleótidos de base universal están situados en una región central que va del 3° nucleótido al 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está situado en una región que va del 4° nucleótido en el extremo 5' del UBP al 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP; en el que los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP; en el que al menos uno de los UBP no comprende una base degenerada representada por el código degenerado IUB.
Dado que el medio de almacenamiento está destinado a realizar los presentes procedimientos en un ordenador, se omiten las descripciones comunes entre ellos para evitar una redundancia indebida que lleve a la complejidad de la presente memoria.
El procedimiento de la presente descrito anteriormente se implementa en un procesador, como un procesador en un ordenador independiente, un ordenador conectado a la red o un dispositivo de adquisición de datos como una máquina de PCR en tiempo real.
Los tipos de medios de almacenamiento legibles por ordenador incluyen varios medios de almacenamiento como CD-R, CD-ROM, DVD, memoria flash, disquete, disco duro, disco duro portátil, USB, cinta magnética, MINIDISC, tarjeta de memoria no volátil, EEPROM, disco óptico, medio de almacenamiento óptico, RAM, ROM, memoria del sistema y servidor web.
Las instrucciones para configurar el procesador para realizar la presente invención pueden incluirse en un sistema lógico. Las instrucciones pueden descargarse y almacenarse en un módulo de memoria (por ejemplo, un disco duro u otra memoria como una RAM o ROM local o adjunta), aunque las instrucciones pueden proporcionarse en cualquier medio de almacenamiento de software como un disco duro portátil, USB, disquete, CD y DVD. Un código informático para implementar la presente invención puede implementarse en una variedad de lenguajes de codificación como C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl y XML. Además, se puede utilizar una variedad de lenguajes y protocolos en el almacenamiento externo e interno y en la transmisión de datos y comandos según la presente invención.
Las características y ventajas de la presente invención se resumen como sigue:
(a) Inhibición de la formación de dímeros en una reacción de amplificación de ácido nucleico multiplex El procedimiento de la presente invención inhibe la formación de productos de amplificación inespecíficos, en particular dímeros de cebadores, de manera eficaz en una reacción de amplificación multiplex para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana.
(b) Mejora de la eficacia de la amplificación del ácido nucleico La formación de los dímeros del cebador, en particular los dímeros de cebadores completamente extendidos, impide que los cebadores participen en la amplificación de la diana. Además, a medida que la amplificación progresa, los productos de amplificación no diana producidos por el dímero de cebador se unen competitivamente a una molécula de ácido nucleico diana y consumen los componentes de amplificación que comprenden los cebadores, reduciendo así la eficacia de amplificación para el diana. El procedimiento de la presente invención inhibe dicha formación de dímeros en el ciclo inicial, lo que a su vez mejora la eficacia de la amplificación del ácido nucleico.
(c) Mayor sensibilidad a una baja concentración de la diana Si las moléculas de ácido nucleico diana están presentes inicialmente en pequeñas cantidades en la muestra, la molécula de ácido nucleico diana puede no ser detectada debido a una cantidad de amplificación inferior a la de los pares de cebadores. Sin embargo, cuando la formación de dímeros se reduce mediante el procedimiento de la presente invención, las moléculas de ácido nucleico diana pueden detectarse, incluso si están presentes en pequeñas cantidades, mejorando así la sensibilidad.
(d) Construcción sencilla de un conjunto de cebadores para la amplificación multiplex de ácidos nucleicos con una eficacia de amplificación mejorada
Es considerablemente lento e ineficiente ajustar repetidamente el sitio de hibridación del cebador y la secuencia y longitud del cebador para inhibir la formación de dímeros entre los cebadores y mejorar la eficacia de la amplificación. En particular, para una amplificación multiplex que utilice una pluralidad de cebadores, el cambio de la secuencia o la longitud de un cebador debe realizarse teniendo en cuenta la posibilidad de formación de dímeros con otros cebadores. Por esta razón, es difícil ajustar los cebadores completos para reducir la formación de dímeros y aumentar la eficacia de la amplificación en una reacción de amplificación múltiple.
Por el contrario, el procedimiento de la presente invención es capaz de inhibir la formación de dímeros sin cambiar el sitio de hibridación del cebador o cambiar la secuencia o la longitud del cebador, lo cual es útil para construir un conjunto de cebadores con formación de dímeros inhibida para la reacción de amplificación múltiple.
La presente invención se describirá ahora con más detalle mediante ejemplos. Será obvio para los expertos en la materia que estos ejemplos pretenden ser más concretamente ilustrativos y que el alcance de la presente invención, tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas, no está limitado a o por los ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Identificación del tipo de dímero de cebador que afecta a la amplificación del dímero y a la amplificación de la diana
Los inventores han examinado el efecto del tipo de dímero de cebador y la longitud de los nucleótidos complementarios en el dímero de cebador sobre la amplificación del dímero y la amplificación de la diana.
<1-1> Tipo de cebador para promover la amplificación de dímeros
Los dímeros de cebadores que pueden generarse inadvertidamente en una reacción de amplificación multiplex se clasifican en tres tipos, dependiendo de si cada hebra del cebador está extendida o no: (i) dímero de cebador no extensible; (ii) dímero de cebador extensible de una hebra; y (iii) dímero de cebador extensible de ambas hebras (véase la Fig. 2).
En primer lugar, el dímero de cebador no extensible incluye aquellos en los que ambas hebras de cebador tras la hibridación no son extendidas por una polimerasa de ácido nucleico. Este tipo puede formarse por hibridación entre las porciones 5' de los dos cebadores (véase la fila superior de la Fig. 2). En segundo lugar, los dímeros de cebadores extensibles de una hebra incluyen aquellos en los que una de las dos hebras de cebadores tras la hibridación es extendida por una polimerasa de ácido nucleico. Este tipo puede formarse por hibridación entre la porción 3' de un cebador y la porción media de otro cebador (véase la fila central de la Fig. 2). En tercer lugar, los dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras incluyen aquellos en los que ambas hebras de cebadores después de la hibridación son extendidas por una polimerasa de ácido nucleico. Este tipo puede formarse por hibridación entre las porciones 3' de dos cebadores (véase la fila inferior de la Fig. 2).
Para simular la formación de los tres tipos de dímeros de cebadores, los cebadores convencionales (UP-R1, SEQ ID NÚM.: 1; NG-F4, SEQ ID NO: 12) se prepararon primero para hibridar las secuencias de ácido nucleico diana, ADN genómico deUreaplasma parvum(UP) yNeisseria gonorrhoeae(NG). A continuación, se prepararon cebadores adicionales capaces de formar un dímero de cebador no extensible, un dímero de cebador extensible de una hebra y un dímero de cebador extensible de ambas hebras con los cebadores convencionales. Los cebadores para la formación de dímeros fueron diseñados para tener varias longitudes de nucleótidos complementarios a UP-R1 (SEQ ID NO: 1) y NG-F4 (SEQ ID NO: 12).
Específicamente, se prepararon tres cebadores (denominados UP-N-1, UP-N-2 y UP-N-3 para UP, respectivamente; NG-N-1, NG-N-2 y NG-N-3 para NG, respectivamente) para formar dímeros de cebadores no extensibles con UP-R1 o NG-F4, de tal manera que no tienen nucleótidos sobresalientes que puedan servir de plantilla para un cebador convencional y sus extremos 3' se bloquearon para evitar su extensión. Se prepararon para tener 11, 13 o 15 nucleótidos complementarios a un cebador convencional.
Además, se prepararon tres cebadores (denominados UP-P-1, UP-P-2 y UP-P-3 para UP, respectivamente; NG-P-1, NG-P-2 y NG-P-3 para NG, respectivamente) para formar dímeros de cebadores extensibles de una hebra con UP-R1 o NG-F4, de tal manera que proporcionan nucleótidos que funcionan como plantilla para un cebador convencional, pero sus extremos 3' fueron bloqueados para evitar su extensión. En particular, se prepararon para tener una porción 3' de 5, 7 o 9 nucleótidos complementaria a una porción 3' de un cebador convencional.
Además, se prepararon cuatro cebadores (denominados UP-C-1, UP-C-2, UP-C-3 y UP-C-4 para UP, respectivamente; NG-C-1, NG-C-2, UP-C-3 y UP-C-4 para NG, respectivamente) para formar dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras con UP-R1 o NG-F4 de tal manera que tienen, en su porción 3', 4, 5, 6 o 7 nucleótidos complementarios a una porción 3' de un cebador convencional y sus extremos 3' no fueron bloqueados para su extensión.
En consecuencia, se prepararon conjuntos de cebadores #1 a #20, cada uno de los cuales comprendía uno de UP-R1 y NG-F4 y uno de los cebadores para la formación de dímeros descritos anteriormente para formar los tres tipos de dímeros de cebadores.
Las secuencias de los cebadores utilizados en este Ejemplo se proporcionan en las Tablas 1 y 2, respectivamente.
TABLA 1
TABLA 2
En este Ejemplo, se empleó la PCR en tiempo real utilizando SYBR® Green I (Invitrogen, USA), colorante intercalante, para detectar la formación de dímeros de cebadores en ausencia de cualquier secuencia de ácido nucleico diana. Cuando se forma el dímero de cebador y se amplifica, el SYBR® Green I inactivado se incorpora a los dímeros de cebadores y luego se activa para dar fluorescencia. Se puede obtener una curva de amplificación midiendo las señales de los colorantes activados en los dímeros del cebador. Para la amplificación de los dímeros de los cebadores se utilizó la ADN polimerasaTaq con actividad nucleasa 5'.
La PCR en tiempo real se realizó en un volumen final de 20 pl que contenía cada conjunto de cebadores (3 pmole de uno de los cebadores (SEQ ID NÚM.: 1 y 12) y 10 ppm de uno de los cebadores (Se Q ID Nos: 2-11 y 13-22)), 2 pl de 10X SYBR® Green I, y 5 pl de 4X Master Mix [final, 200 pM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U deTaqADN polimerasa]. Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 minutos a 50°C, se desnaturalizaron durante 15 minutos a 95°C y se sometieron a 50 ciclos de 10 segundos a 95°C, 60 segundos a 57°C y 10 segundos a 72°C. La detección de las señales se realizó a 57°C en cada ciclo.
Las curvas de amplificación obtenidas del experimento anterior se muestran en la Fig. 3.
Como se ve en la Fig. 3, las curvas de amplificación para los dímeros de cebadores no se observaron con los conjuntos de cebadores #1-3 y #11-13 para formar dímeros de cebadores no extensibles (véase la fila superior de la Fig. 3) y los conjuntos de cebadores #4-6 y #14-16 para formar dímeros de cebadores extensibles de una sola hebra (véase la fila central de la Fig. 3).
Por el contrario, las curvas de amplificación de los dímeros de cebadores se observaron con los conjuntos de cebadores #7-10 y #17-20 para formar dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras (véase la fila inferior de la Fig. 3). En particular, la mayor longitud de las secuencias complementarias dentro de los dímeros de los cebadores condujo a una amplificación más temprana de los dímeros.
Estos resultados indican que entre los tres tipos de dímeros de cebadores, los dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras promueven la amplificación del dímero, y que la longitud de 4-7 nucleótidos complementarios en el dímero de cebador explica la amplificación del dímero.
<1-2> Tipo de cebador para afectar a la amplificación de la diana
Se investigó el tipo de dímeros de cebadores que afectan a la amplificación de la diana,es decir,que inhiben la amplificación de la diana.
Un cebador directo y un cebador inverso (SEQ ID NÚM.: 23 y 1 para UP; SEQ ID Nos: 12 y 24 para NG) para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana. A continuación, se utilizaron cebadores adicionales (SEQ ID NOs: 2-11) capaces de formar cada tipo de dímero de cebador con uno de los cebadores directo e inverso se prepararon. Posteriormente, el cebador directo y el cebador inverso se combinaron con uno de los cebadores adicionales para obtener varios conjuntos de cebadores #21-40. Se utilizó como control un conjunto de cebadores sin cebadores adicionales capaces de formar cada tipo de dímeros de cebadores.
Los conjuntos de cebadores utilizados en este Ejemplo se proporcionan en las Tablas 3 y 4.
TABLA 3
En este Ejemplo, se utilizó una sonda TaqMan para detectar la amplificación de la diana como medio generador de señales. Cuando hay un ácido nucleico diana, se escinde una sonda TaqMan y se libera un fragmento marcado. Una sonda TaqMan para cada secuencia de ácido nucleico diana se marcó con una molécula reportera fluorescente en su extremo 5'y una molécula quencher en su extremo 3'(SEQ ID NOs: 25 y 26). Se puede obtener una curva de amplificación midiendo las señales del fragmento marcado.
Las secuencias de las sondas utilizadas adicionalmente en este Ejemplo se proporcionan en la Tabla 5, dada a continuación.
TABLA 5
La PCR en tiempo real se llevó a cabo en un volumen final de 20 |jl que contenía cada conjunto de cebadores (3 pmole de cebador directo, 3 pmole de cebador inverso y 10 pmole de cebador para formar el dímero de cebador), 3 pmole de una sonda TaqMan, una secuencia de ácido nucleico diana (0,1 pg de UP o 0,1 pg de NG) y 5 j l de 4X Master Mix [final, 200 jM de dNTPs, 2 mM de MgCl2, 2 U deTaqADN polimerasa]. Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 minutos a 50°C, se desnaturalizaron durante 15 minutos a 95°C y se sometieron a 50 ciclos de 10 segundos a 95°C, 60 segundos a 57°C y 10 segundos a 72°C. La detección de las señales se realizó a 95°C en cada ciclo.
Las curvas de amplificación obtenidas de los experimentos anteriores se muestran en la Fig. 4.
Como se muestra en la Fig. 4, la formación de dímeros de cebadores no extensibles (conjuntos de cebadores # 21-23 y # 31-33; 2a fila) y de dímeros de cebadores extensibles de una sola hebra (conjuntos de cebadores # 23-26 y # 34 36; 3a fila) no afectó significativamente a la amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana, mientras que la formación de dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras (conjuntos de cebadores # 27-30 y # 37-40; 4a fila) afectó significativamente a la amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana, en comparación con los que utilizaron conjuntos de cebadores de control.
Para comprender mejor el efecto del dímero de cebador en la amplificación de la diana, se calcularon los valores de ACT como se indica a continuación:
El valor CT se obtuvo aplicando un umbral 500; se consideró que un valor ACT superior a 1,0 indicaba que la amplificación de una molécula de ácido nucleico diana estaba inhibida por un dímero de cebador.
Los valores de ACT calculados se proporcionan en la Tabla 6 a continuación.
TABLA 6
Como se muestra en la Tabla 6, los dímeros de cebadores no extensibles y los dímeros de cebadores extensibles de una hebra condujeron a valores de ACT no superiores a 1,0, lo que indica que la formación de dímeros de cebadores no extensibles y que los dímeros de cebadores extensibles de una hebra no afecta significativamente a la amplificación de la diana.
Por el contrario, los dímeros de cebadores extensibles a ambas bandas que tienen secuencias complementarias de al menos 6 polímeros (tanto para UP como para NG) dieron lugar a valores de ACT superiores a 1,0, lo que indica que la formación de dímeros de cebadores extensibles a ambas bandas, en particular con al menos 6 nucleótidos complementarios en un dímero, dificulta la amplificación de la diana.
A partir de los resultados de los Ejemplos <1-1>y <1-2>, se concluiría que la formación de los dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras que tienen 5 o menos nucleótidos complementarios en los mismos promueve la amplificación de dímeros pero no inhibe significativamente la amplificación de la diana; la formación de los dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras que tienen 6 o más nucleótidos complementarios en los mismos promueve la amplificación de dímeros así como inhibe la amplificación de la diana.
En consecuencia, para evitar la inhibición de la amplificación de la diana debido a los dímeros de cebadores extensibles que tienen 6 o más nucleótidos complementarios en sus porciones del extremo 3', se esperaba que fuera eficaz posicionar una base universal(por ejemplo,desoxiinosina) al 6° nucleótido o nucleótido inferior (5°, 4°, 3°, etc.) en el extremo 3' de un cebador.
Ejemplo 2: Evaluación de los efectos de las UBP con nucleótidos de base universal en varias posiciones sobre la amplificación de dímeros y la amplificación de dianas
<2-1> Efectos de las UBP con desoxiinosinas en varias posiciones en la formación de dímeros
En este ejemplo, se compararon los efectos de los UBP con bases universales en varias posiciones sobre la amplificación de los dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras con la de los cebadores convencionales.
Para este experimento, se utilizó uno de los dos pares de cebadores convencionales identificados para formar dímeros de cebadores extensibles a ambas bandas ((i) UP-R1 (SEQ ID NÚM.: 1) en el conjunto de cebadores # 9; (ii) NG-F4 (SEQ ID NO: 12) en el conjunto de cebadores #19) se modificaron para preparar varias UBP. Específicamente, las UBP se prepararon para contener una desoxinosina en la 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a y 8a posición de su extremo 3' sustituyendo un nucleótido natural en la 2a, 3a, 4a, 5a, 6a, 7a y 8a posición de su extremo 3' por desoxinosina.
Uno de los dos pares de cebadores convencionales (UP-C-3 (SEQ ID NÚM.: 10) o NG-C-3 (SEQ ID NO: 23)) se combinó con uno de los UBP para obtener varios conjuntos de cebadores (denominados conjuntos de cebadores #9A-9G y #19A-19G).
Los conjuntos de cebadores utilizados en la presente memoria se proporcionan en la Tabla 7, dada a continuación.
TABLA 7
La PCR en tiempo real se realizó en un volumen final de 20 j l que contenía cada conjunto de cebadores (3 pmole de uno de los cebadores convencionales UP-R1 (SEQ ID N<ú>M.: 2) y UBP (SEQ ID<n>O<s>: 27-33) y 10 ppm de UP-C-3 (SEQ ID NO: 10), o 3 pmole de uno de los cebadores convencionales NG-F4 (SEQ ID NO: 13) o UBp (SEQ ID NOs: 34-40) y 10 ppm de NG-C-3 (SEQ ID NO: 21)), 2 j l de 10X SYBR® Green I, y 5 j l de 4X Master Mix [final, 200 jM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U deTaqADN polimerasa]. Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 minutos a 50°C, se desnaturalizaron durante 15 minutos a 95°C y se sometieron a 50 ciclos de 10 segundos a 95°C, 60 segundos a 57°C y 10 segundos a 72°C. La detección de las señales se realizó a 57°C en cada ciclo.
Las curvas de amplificación para el dímero de cebador obtenido anteriormente se muestran en las Figs. 5A y 5B. Como se muestra en las Figs. 5A y 5B, las curvas de amplificación de los dímeros de cebadores no se observaron o se generaron más tarde con los conjuntos de cebadores #9A-9E y #19A-19E (que comprenden UBP con desoxiinosinas en las posiciones 2a, 3a, 4a, 5a y 6a ), mientras que las curvas de amplificación de los dímeros de cebadores se observaron con los conjuntos de cebadores #9F, #9G, #19F y #19G (que comprenden UBP con desoxiinosinas en las posiciones 7a y 8a).
Para comprender mejor el efecto del UBP en la inhibición de la formación de dímeros de cebadores, se calcularon los valores de ACt como se indica a continuación:
AC<t>= [CT para conjunto de cebador que contiene UBP] - [CT para conjunto de cebador de convención] El valor CT se obtuvo aplicando un umbral 500; se consideró que un valor ACT superior a 1,0 indicaba que la amplificación de dímeros estaba inhibida por el UBP.
Los valores de AC<t>calculados se proporcionan en la Tabla 8, dada a continuación.
TABLA 8
Como se muestra en la Tabla 8, la amplificación de dímeros se inhibió con los conjuntos de cebadores #9A-9E y #19A-19E (que comprenden UBP con desoxiinosinas en las posiciones 2°, 3°,4°, 5°y 6°); sin embargo, no se inhibió con los conjuntos de cebadores #9F, #9G, #19F y #19G (que comprenden UBP con desoxiinosinas en las posiciones 7 y 8). Este resultado demuestra que el UBP que contiene desoxiinosina en las posiciones 2a a 6° de su extremo 3' es eficaz para evitar la amplificación de dímeros.
<2-2> Efectos de los UBP con desoxiinosinas en varias posiciones sobre la amplificación de la dianaEn este ejemplo, se compararon los efectos de los UBP con bases universales en varias posiciones sobre la amplificación de la diana con los cebadores convencionales.
Para este experimento, se prepararon primero dos cebadores convencionales para amplificar una molécula de ácido nucleico diana (conjunto de cebadores #29 para UP o conjunto de cebadores #39 para NG) y un cebador para formar dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras. A continuación, se modificó uno de los dos cebadores convencionales para amplificar una molécula de ácido nucleico diana para preparar varios UBP Los UBP se prepararon para contener desoxiinosinas en varias posiciones, como en el Ejemplo <2-1>.
En consecuencia, se combinaron un cebador convencional y un UBP para amplificar una molécula de ácido nucleico diana con un cebador para formar dímeros de cebadores extensibles a ambas bandas para obtener varios conjuntos de cebadores.
Sondas TaqMan en tiempo real (SEQ ID NÚM.: 25 y 26) se utilizaron además para la detección de la amplificación. Los conjuntos de cebadores utilizados en la presente memoria se proporcionan en la Tabla 9, dada a continuación.
TABLA 9
Específicamente, el PCR en tiempo real se llevó a cabo en el volumen final de 20 j l que contenía cada conjunto de cebadores (3 pmole de un cebador convencional hacia adelante UP-F1 (SEQ ID NÚM.: 23) y 3 pmole de uno de los cebadores inversos convencionales UP-R1 (SEQ ID NO: 1) y UBP (SEQ ID NO: 27-33) para la amplificación de la diana UP, y 10 pmole de un cebador para la formación de dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras (SEQ ID NO: 10); o 3 pmole de un cebador inverso convencional NG-R2 (SEQ ID_NO:14) y 3 pmole de uno de los cebadores directos convencionales NG-F4 (SEQ ID NÚM.: 13) y UBP (SEQ ID NOs: 34-40) para la amplificación de la diana NG, y 10 pmole de un cebador para la formación de dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras (SEQ ID NO: 21)), una secuencia de ácido nucleico diana (0,1 pg de UP o 0,1 pg de NG), y 5 j l de 4X Master Mix [final, 200 jM de dNTPs, 2 mM de MgCl2, 2 U deTaqADN polimerasa]. Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 minutos a 50°C, se desnaturalizaron durante 15 minutos a 95°C y se sometieron a 50 ciclos de 10 segundos a 95°C, 60 segundos a 57°C y 10 segundos a 72°C. La detección de las señales se realizó a 95°C en cada ciclo.
A modo de comparación, el PCR en tiempo real se llevó a cabo con conjuntos de cebadores sin un cebador para la formación de dímeros de cebadores extensibles de ambas hebras (UP-C-3 (SEQ ID NÚM.: 10) o NG-C-3 (SEQ ID NO: 21)).
Las curvas de amplificación obtenidas con cada conjunto de cebadores se muestran en las Figs. 6A y 6B. En las figuras, "-X-" representa los resultados de los conjuntos de cebadores sin un cebador para formar dímeros de cebadores (UP-C-3 o NG-C-3); "-O-" representa los resultados de los conjuntos de cebadores con un cebador para formar dímeros de cebadores (UP-C-3 o NG-C-3). Se aplicaron los valores umbral, 150 y 400, para calcular los valores C<t>de UP y NG, respectivamente, y luego se calcularon los valores ACj como se indica a continuación:
ACj = [Ct en una reacción en presencia de un cebador para formar dímero de cebador] - [Ct en una reacción en ausencia de un cebador para formar dímero de cebador]
Los valores de ACt calculados se proporcionan en las Tablas 10 y 11 siguientes.
TABLA 10
TABLA 11
La detección de una curva de amplificación en ausencia de un cebador para formar dímeros de cebador y el valor de AC<t>no superior a 1,0 indican que una secuencia de ácido nucleico diana se amplifica con éxito, independientemente de la presencia del cebador para formar dímeros de cebadores.
Como se muestra en las Tablas 10 y 11, los conjuntos de cebadores #29 y #39 fueron capaces de amplificar tanto UP como NG en ausencia de un cebador para formar dímero de cebadores, pero no lograron amplificar UP y NG en presencia del cebador para formar dímero de cebadores.
Además, los conjuntos de cebadores #29A y #39A (cada uno de los cuales comprende UBP con desoxinosina en la 2a posición) no lograron amplificar UP y NG incluso en ausencia de un cebador para formar dímero de cebadores; los conjuntos de cebadores #29b-29E y 39B-39E (cada uno de los cuales comprende UBP con desoxinosina en la 3a, 4a, 5a o 6a posición) fueron capaces de amplificar UP y NG en presencia o ausencia de un cebador para formar dímero de cebadores; los conjuntos de cebadores #29F-29G y #39<f>-39G (cada uno con UBP con deoxiinosina en la 7 ' u 8a posición) lograron amplificar UP y NG en ausencia de un cebador para formar dímero de cebadores, pero no lograron amplificar UP y NG en presencia de un cebador para formar dímero de cebadores
Los resultados demuestran que las UBP con desoxiinosina entre la 3° y 6a posición en sus extremos 3'- no afectan significativamente a la amplificación de la diana.
En conjunto, se apreciará que el uso de UBP que contiene un nucleótido de base universal en las posiciones 3° a 6 del extremo 3' del mismo puede mejorar la amplificación de la diana al inhibir la formación de dímeros del cebador.
Ejemplo 3: Verificación del efecto del UBP
Verificamos si el UBP de la presente divulgación que contiene una base universal en el 3° a 6° nucleótido desde el extremo 3'- en un cebador realmente inhibe la formación de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación múltiple.
<3-1> Utilidad del UBP en la reducción de la formación de dímeros de cebadores
Para este experimento, se prepararon tres tipos diferentes de mezclas de cebador como se indica a continuación: (i) Mezcla de cebador convencional; (ii) 1a mezcla UBP; y (iii) 2a mezcla UBP.
Cada una de las mezclas de cebadores (i)-(iii) consistía en cuatro pares de cebadores para amplificar cuatro secuencias de ácido nucleico diana, ADN genómico deUreaplasma urealyticum(UU),Mycoplasma genitalium(MG),Neisseria gonorrhoeae(NG) yChlamydia trachomatis(CT), y cada par de cebadores comprendía un cebador directo y un cebador inverso.
Específicamente, la mezcla de cebadores convencionales consistió en ocho cebadores convencionales que no contenían desoxiinosina en sus secuencias, lo que se utilizó como control. La primera mezcla de UBP consistió en cuatro UBP delanteras (que contenían una desoxinosina) y cuatro cebadores convencionales inversos, y la segunda mezcla de UBP consistió en cuatro UBP delanteras (que contenían dos desoxinosinas) y cuatro cebadores convencionales inversos. Las UBP se prepararon sustituyendo una o dos bases naturales de un cebador convencional por desoxiinosina.
Las secuencias de los cebadores en la mezcla de cebadores convencionales, la primera mezcla de cebadores UBP y la segunda mezcla de cebadores UBP se proporcionan en la Tabla 12, dada a continuación.
TABLA 12
Específicamente, la PCR en tiempo real se llevó a cabo en el volumen final de 20 |jl que contenía 3 pmole de cada cebador en la mezcla de cebadores convencionales (SEQ ID NÚM.: 41-48), la primera mezcla de UBP (SEQ ID Nos: 49, 42, 50, 44, 51, 46, 52 y 48) o la segunda mezcla de UBP (SEQ ID NÚM.: 53, 42, 54, 44, 55, 46, 56 y 48), 2 j l de 10X SYBR® Green I, y 5 j l de 4X Master Mix [final, 200 jM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U deTaqADN polimerasa]. Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 minutos a 50°C, se desnaturalizaron durante 15 minutos a 95°C y se sometieron a 50 ciclos de 10 segundos a 95°C, 60 segundos a 57°C y 10 segundos a 72°C. La detección de las señales se realizó a 57°C en cada ciclo.
Las curvas de amplificación obtenidas del experimento anterior se muestran en la Fig. 7. Posteriormente, para evaluar el grado de amplificación de los dímeros, se empleó un valor umbral, 500, para calcular los valores del umbral de ciclo (Ct).
Como resultado, los valores de Ct para la 1a mezcla UBP, y la 2° mezcla UBP (es decir, 40,36 y 41,2, respectivamente) resultaron ser superiores a los de la mezcla de cebador convencional(es decir,22,71).
Los resultados muestran que el uso del UBP de la presente divulgación, en particular conteniendo una base universal en el 3° al 6° nucleótido desde el extremo 3'- en un cebador, puede inhibir efectivamente la formación de dímeros y la amplificación en comparación con los cebadores convencionales, en una reacción de amplificación múltiple.
<3-2> Utilidad del UBP en el aumento de la amplificación de la diana
En este Ejemplo, se aplicaron sondas TaqMan para detectar la amplificación de dianas múltiples como medio generador de señales.
Las secuencias de sondas utilizadas adicionalmente en este Ejemplo se proporcionan en la Tabla 13, dada a continuación.
TABLA 13
La PCR en tiempo real se realizó en un volumen final de 20 j l que contenía 3 pmole de cada cebador en la mezcla convencional (SEQ ID NÚM.: 41-48), la primera mezcla de UBP (SEQ ID Nos: 49, 42, 50, 44, 51, 46, 52 y 48) o la segunda mezcla de UBP (SEQ ID NÚM.: 53, 42, 54, 44, 55, 46, 56 y 48), 3 pmole de sondas TaqMan (S<e>Q ID NOs: 57-60), cuatro secuencias de ácido nucleico diana (0 (NTC), 0,1, 1 o 10 pg de cada ADN genómico), y 5 j l de 4X Master Mix [final, 200 jM de dNTPs, 2 mM de MgCb, 2 U deTaqADN polimerasa]. Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 minutos a 50°C, se desnaturalizaron durante 15 minutos a 95°C y se sometieron a 50 ciclos de 10 segundos a 95°C, 60 segundos a 57°C y 10 segundos a 72°C. La detección de las señales se realizó a 95°C en cada ciclo.
Las curvas de amplificación obtenidas de los experimentos anteriores se muestran en la Fig. 8. Como se observa en la Fig. 8, la mezcla convencional de cebadores no pudo amplificar la mayoría de las cuatro secuencias de ácido nucleico diana a distintas concentraciones. Por el contrario, tanto la primera mezcla UBP como la segunda fueron capaces de amplificar todas las secuencias de ácido nucleico diana.
A continuación, para comparar la eficacia de amplificación de la diana entre las mezclas de cebadores utilizadas, se aplicaron los valores de umbral, 150, 100, 400 y 50, para calcular los valores de Ct de UU, MG, NG y CT, respectivamente.
Los resultados se presentan en la Tabla 14, dada a continuación.
TABLA 14
Como se muestra en la Tabla 14, la mezcla convencional de cebadores pudo amplificar significativamente unas pocas secuencias de ácido nucleico diana,es decir,10 pg de UU, 10 pg, 1 pg y 0,1 pg de NG, y 10 pg de CT, entre doce secuencias de ácido nucleico diana a varias concentraciones. Por el contrario, la primera mezcla de UBP y la segunda mezcla de UBP, cada una de las cuales contiene UBP de la presente divulgación, pudieron amplificar significativamente las doce secuencias de ácido nucleico diana.
Para evaluar aún más el efecto del procedimiento de la presente invención sobre la eficacia de amplificación de la diana, se calculó la eficacia de amplificación utilizando un programa convencional, LinRegPCR para el análisis de datos de RT-PCR cuantitativa (qPCR) (versión 2017.1).
El programa calcula la eficacia de la amplificación utilizando los datos brutos de entrada y los emite (la eficacia de la amplificación de salida puede convertirse en una base porcentual). En este ejemplo, las eficacias de amplificación para las respectivas reacciones utilizando una de las mezclas de cebadores convencionales, la 1' mezcla UBP y la 2' mezcla UBP se obtuvieron mediante el programa anterior, y a continuación se calculó la tasa de aumento de la eficacia para la1' mezcla UBP o la 2 ' mezcla UBP de la siguiente manera:
Los resultados se presentan en la Tabla 15, dada a continuación.
TABLA 15
Como se muestra en la Tabla 15, algunas de las reacciones que utilizan la1' mezcla UBP y la 2 ' mezcla UBP mostraron marcados índices de aumento de la eficacia en comparación con las que utilizan la mezcla de cebadores convencional (indicados como ">>100%" en la columna "índice de aumento"), porque las eficacias de amplificación no se determinaron para las reacciones que utilizaban la mezcla de cebadores convencional, sino que se determinaron para las reacciones que utilizaban la1a mezcla UBP y la 2a mezcla UBP.
Además, algunas de las reacciones que utilizan la 1° mezcla UBP y la 2a mezcla UBP mostraron tasas de aumento de la eficacia del 3,3% al 59,9% en comparación con las que utilizan la mezcla de cebador convencional.
Los resultados muestran que el uso del UBP de la presente divulgación, en particular conteniendo una base universal en el 3° al 6° nucleótido desde el extremo 3' en un cebador, puede mejorar la eficacia de amplificación de la diana en comparación con los cebadores convencionales, en una reacción de amplificación multiplex.
Claims (19)
1. Un procedimiento para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con formación reducida de dímeros de cebador en una reacción de amplificación multiplex, que comprende los pasos de:
(a) preparar al menos tres pares de cebadores, cada uno de los cuales comprendiendo un cebador directo y un cebador inverso; en el que cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente; en el que cualquiera o ambos de los cebadores en al menos un par de cebadores son cebadores de base universal (UBP); en el que el número de nucleótidos de base universal en el UBP es 1-2; en el que uno o dos de los nucleótidos de base universal están localizados en una región central que oscila del 3° nucleótido al el 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está localizado en una región que oscila del 4° nucleótido en el extremo 5' del UBP hasta el 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP, de manera que una reacción de amplificación multiplex utilizando los al menos tres pares de cebadores genera productos de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebador en la que los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP; y en el que al menos uno de los UBP no comprende una base degenerada representada por el código degenerado IUB; y
(b) realizar una reacción de amplificación multiplex que comprenda al menos dos ciclos de recocido del cebador, extensión del cebador y desnaturalización utilizando los al menos tres pares de cebadores; en el que la reacción de amplificación multiplex genera productos de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebador.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la región del núcleo va desde el 3° nucleótido hasta el 5° nucleótido en el extremo 3' del UBP y el resto se encuentra en una región que va desde el 4° nucleótido en el extremo 5' del UBP hasta el 6° nucleótido en el extremo 3'del UBP
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que ambos cebadores en al menos un par de cebadores son UBP
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que uno o ambos cebadores de cada par de cebadores son UBP
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que al menos el 50% del número total de cebadores utilizados son UBP
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se utilizan al menos cinco pares de cebadores para amplificar al menos cinco moléculas de ácido nucleico diana.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el recocido del cebador en la reacción de amplificación multiplex se realiza a 50°C o más.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento presenta una eficacia de amplificación de la diana de al menos un 3% superior a la de utilizar cebadores que contengan nucleótidos naturales (A, C, G o T (U)) complementarios a la secuencia de ácido nucleico diana en lugar de los al menos un UBP
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el valor Ct obtenido a partir de una reacción utilizando un par de cebadores que contienen el UBP en ausencia de una molécula de ácido nucleico diana se incrementa en 1 o más, en comparación con el que utiliza un par de cebadores compuesto por cebadores convencionales en ausencia de una molécula de ácido nucleico diana.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la reacción de amplificación multiplex se realiza en presencia de al menos tres sondas adicionales para detectar la presencia de las moléculas de ácido nucleico diana; en el que cada una de las al menos tres sondas comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con la molécula de ácido nucleico diana que se va a amplificar y está situada entre el cebador directo y el cebador inverso.
11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las al menos tres sondas no tienen un nucleótido de base universal.
12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el nucleótido de base universal se selecciona del grupo que consiste en deoxiinosina, inosina, 7-deaza-2'-deoxiinosina, 2-aza-2'-deoxiinosina, 2'-OMe inosina, 2'-F inosina, deoxi 3-nitropirrol, 3-nitropirrol, 2'-OMe 3-nitropirrol, 2'-F 3-nitropirrol, 1-(2'-deoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol, deoxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2'-OMe 5-nitroindol, 2'-F 5-nitroindol, deoxi 4-nitrobenzimidazol, 4-nitrobenzimidazol, deoxi 4-aminobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, deoxi nebularina, 2'-F nebularina, 2'-F 4-nitrobenzimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobenzimidazol, PNA-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolinonebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato-inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2'-O-metoxietil inosina, 2'-O-metoxietil nebularina, 2'-O-metoxietil 5-nitroindol, 2'-O-metoxietil 4-nitrobenzimidazol, 2'-O-metoxietil 3-nitropirrol, y sus combinaciones.
13. Un procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación multiplex para al menos tres moléculas de ácido nucleico diana, que comprende los pasos de:
(a) determinar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana a ser amplificadas;
(b) determinar las secuencias de nucleótidos de al menos tres pares de cebadores, cada uno de los cuales comprende un cebador directo y un cebador inverso; en el que cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente;
(c) sustituir 1-3 nucleótidos en uno o ambos cebadores en al menos un par de cebadores entre los al menos tres pares de cebadores con nucleótidos de base universal para preparar nucleótidos de base permite la inhibición de la formación de dímeros de cebadores; en el que el UBP tiene 1 a 3 nucleótidos de base universal; en el que uno o dos de los nucleótidos de base universal están situados en una región central que va del 3° nucleótido al 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está situado en una región que va del 4° nucleótido en el extremo 5'del UBP al 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP; en el que los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP; y
(d) realizar una reacción de amplificación multiplex que comprenda al menos dos ciclos de recocido del cebador, extensión del cebador y desnaturalización utilizando los al menos tres pares de cebadores; en la que la reacción de amplificación multiplex genera productos de amplificación de las moléculas de ácido nucleico diana con una formación reducida de dímeros de cebador.
14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que la región central va desde el 3° nucleótido hasta el 5° nucleótido en el extremo 3'del UBP.
15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que ambos cebadores en al menos un par de cebadores son UBP
16. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que uno o ambos cebadores de cada par de cebadores son UBP
17. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que al menos el 50% del número total de cebadores utilizados son UBP
18. Un kit para amplificar al menos tres moléculas de ácido nucleico diana con formación reducida de dímeros de cebadores en una reacción de amplificación múltiple, que comprende:
(a) al menos tres pares de cebadores, cada uno de los cuales comprende un cebador directo y un cebador inverso; en los que cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente; en los que uno o ambos cebadores de al menos un par de cebadores son cebadores de base universal (UBP); en los que el UBP tiene 1-3 nucleótidos de base universal en el que uno o dos de los nucleótidos de base universal están situados en una región central que va del 3° nucleótido al 6° nucleótido en el extremo 3' del UBP, y el resto está situado en una región que va del 4° nucleótido en el extremo 5' del UBP al 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP; en el que los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP; en el que al menos uno de los UBP no comprende una base degenerada representada por el código degenerado IUB; y
(b) una polimerasa de ácido nucleico.
19. Un medio de almacenamiento legible por ordenador que contiene instrucciones para configurar un procesador para: diseñar al menos tres pares de cebadores, comprendiendo cada par de cebadores un cebador directo y un cebador inverso; en el que cada cebador comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación con una molécula de ácido nucleico diana correspondiente; en el que uno o ambos de los cebadores en al menos un cebador universal son cebadores de base universal (UBP); en el que el número de nucleótidos de base universal en el UBP es 1-2; en el que uno o dos de los nucleótidos de base universal están situados en una región central que oscila del 3° nucleótido hasta el 6° nucleótido en el extremo 3'del UBP, y el resto está situado en una región que oscila del 4° nucleótido en el extremo 5' del UBP hasta el 7° nucleótido en el extremo 3' del UBP; en el que los nucleótidos de base universal no son consecutivos en el UBP; en el que al menos uno de los UBP no comprende una base degenerada representada por el código degenerador IUB.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20160182955 | 2016-12-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2972231T3 true ES2972231T3 (es) | 2024-06-11 |
Family
ID=62711074
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES21205358T Active ES2972231T3 (es) | 2016-12-29 | 2017-12-22 | Procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar la eficacia de la amplificación |
| ES17886256T Active ES2903538T3 (es) | 2016-12-29 | 2017-12-22 | Procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar la eficacia de la amplificación |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES17886256T Active ES2903538T3 (es) | 2016-12-29 | 2017-12-22 | Procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar la eficacia de la amplificación |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20190316193A1 (es) |
| EP (3) | EP4293127A3 (es) |
| JP (1) | JP6938641B2 (es) |
| KR (4) | KR102535892B1 (es) |
| CN (1) | CN110168103B (es) |
| AU (3) | AU2017385830B2 (es) |
| BR (1) | BR112019012432A2 (es) |
| CA (1) | CA3046303A1 (es) |
| ES (2) | ES2972231T3 (es) |
| IL (2) | IL302090A (es) |
| WO (1) | WO2018124665A1 (es) |
Family Cites Families (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
| ATE92538T1 (de) | 1988-01-21 | 1993-08-15 | Genentech Inc | Verstaerkung und nachweis von nukleinsaeuresequenzen. |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| US20030165888A1 (en) * | 2001-07-18 | 2003-09-04 | Brown Bob D. | Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes |
| GB9812768D0 (en) | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
| WO2000063365A1 (en) | 1999-04-21 | 2000-10-26 | Pangene Corporation | Locked nucleic acid hybrids and methods of use |
| EP2322666A3 (en) * | 1999-09-28 | 2011-08-10 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Highly conserved gene and its use to generate species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes for microorganisms. |
| DK1715063T3 (da) | 2000-03-29 | 2011-05-16 | Lgc Ltd | Hydridiseringsbeacon og fremgangsmåde til hurtig sekvensdetektion og distinktion |
| EP1442137A4 (en) * | 2001-11-07 | 2005-08-31 | Applera Corp | UNIVERSAL NUCLEOTIDES FOR NUCLEIC ACID ANALYSIS |
| US20030175749A1 (en) | 2001-12-08 | 2003-09-18 | Jong-Yoon Chun | Annealing control primer and its uses |
| WO2006095941A1 (en) * | 2005-03-05 | 2006-09-14 | Seegene, Inc. | Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide |
| US20070087339A1 (en) * | 2005-10-17 | 2007-04-19 | Rangarajan Sampath | Compositions for use in identification of influenza viruses |
| US9447457B2 (en) | 2009-09-24 | 2016-09-20 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequences by cyclic exonucleolytic reactions |
| WO2011046972A2 (en) * | 2009-10-12 | 2011-04-21 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for suppressing primer interactions |
| WO2011078439A1 (en) * | 2009-12-24 | 2011-06-30 | Seegene, Inc. | Real-time multiplexing detection of target nucleic acid sequences with elimination of false signals |
| MX2017015093A (es) | 2011-01-11 | 2023-03-10 | Seegene Inc | Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto. |
| EP2785860B1 (en) * | 2011-11-29 | 2015-06-03 | Life Technologies Corporation | Methods and compositions for multiplex pcr |
| KR20130101952A (ko) | 2012-02-02 | 2013-09-16 | 주식회사 씨젠 | Ｐｔｏ 절단과 연장-의존적 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출 |
| US10072305B2 (en) * | 2012-05-03 | 2018-09-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Real-time PCR for the detection of pathogens |
| CN104903465B (zh) | 2012-12-27 | 2017-04-26 | Seegene株式会社 | 基于寡核苷酸切割及延伸‑依赖性非‑杂交探测的靶核酸序列的检测 |
| EP3102699B1 (en) * | 2014-02-07 | 2018-10-31 | Qiagen Sciences, LLC | Pcr primers |
| CN114250274A (zh) * | 2015-04-24 | 2022-03-29 | 阿提拉生物系统公司 | 利用有限核苷酸组成的引物扩增 |
-
2017
- 2017-12-22 BR BR112019012432A patent/BR112019012432A2/pt active Search and Examination
- 2017-12-22 ES ES21205358T patent/ES2972231T3/es active Active
- 2017-12-22 KR KR1020227017356A patent/KR102535892B1/ko active IP Right Grant
- 2017-12-22 AU AU2017385830A patent/AU2017385830B2/en active Active
- 2017-12-22 US US16/474,168 patent/US20190316193A1/en not_active Abandoned
- 2017-12-22 CN CN201780081416.2A patent/CN110168103B/zh active Active
- 2017-12-22 WO PCT/KR2017/015386 patent/WO2018124665A1/en active Application Filing
- 2017-12-22 KR KR1020217022054A patent/KR102402712B1/ko active IP Right Grant
- 2017-12-22 EP EP23204943.7A patent/EP4293127A3/en active Pending
- 2017-12-22 JP JP2019535871A patent/JP6938641B2/ja active Active
- 2017-12-22 IL IL302090A patent/IL302090A/en unknown
- 2017-12-22 KR KR1020197022318A patent/KR102279689B1/ko active IP Right Grant
- 2017-12-22 IL IL267372A patent/IL267372B2/en unknown
- 2017-12-22 EP EP17886256.1A patent/EP3562958B1/en active Active
- 2017-12-22 KR KR1020237015908A patent/KR102651626B1/ko active IP Right Grant
- 2017-12-22 CA CA3046303A patent/CA3046303A1/en active Pending
- 2017-12-22 EP EP21205358.1A patent/EP4001428B1/en active Active
- 2017-12-22 ES ES17886256T patent/ES2903538T3/es active Active
-
2021
- 2021-06-25 AU AU2021204329A patent/AU2021204329B2/en active Active
-
2024
- 2024-02-23 AU AU2024201214A patent/AU2024201214A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7221199B2 (ja) | マルチプレックスｐｃｒの実施方法 | |
| JP6544861B2 (ja) | 高い選択性の核酸増幅プライマー | |
| ES2547053T3 (es) | Enriquecimiento de una secuencia diana | |
| ES2972231T3 (es) | Procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar la eficacia de la amplificación | |
| JP2013509885A (ja) | 熱安定性ポリメラーゼとともに二本鎖核酸複合体を用いてデオキシリボヌクレオチド鎖を合成するための組成物および方法 | |
| KR101943623B1 (ko) | 멜팅 피크 분석을 이용한 타겟 핵산서열의 정량 | |
| CN115702250A (zh) | 使用循环探针的指数基数-3及以上的核酸扩增 | |
| KR102651224B1 (ko) | 단일 신호로 2가지 이상의 다중 표적핵산을 검출하기 위한 pcr 방법 | |
| US10106841B2 (en) | Quantification of target nucleic acid using common internal control | |
| JP2024059627A (ja) | 核酸の増幅のための試薬、混合物、キット、および方法 |