JP2020504621A - プライマーダイマー形成を減少させ、増幅効率を増加させる方法 - Google Patents

Abstract

本発明はマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するための方法に関するものである。本発明の方法は少なくとも３個のターゲット核酸分子に対するマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマー形成及び非特異的増幅産物の生成を効果的に抑制することができる。【選択図】図１

Description

本願は大韓民国特許庁に２０１６年１２月２９日に出願された大韓民国特許出願第２０１６−０１８２９５５号の優先権を主張し、その開示内容はその全体が参照として本願に含まれている。

本発明は、プライマーダイマー形成を減少させ、増幅効率を増加させる方法に関するものである。

核酸増幅は分子生物学で広範囲な方法のための必須な過程であって、多様な増幅方法が提示された。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈ． Ｉ．ら（ＷＯ８９／０６７００）は、プロモーター／プライマー配列をターゲット単一鎖ＤＮＡ（“ｓｓＤＮＡ”）に混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）させた後、前記配列の多くのＲＮＡコピーを転写する過程を含む核酸配列増幅方法を開示している。他の公知の核酸増幅方法は転写−基盤増幅システムを含む（Ｋｗｏｈ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８６：１１７３（１９８９）；及びＧｉｎｇｅｒａｓ Ｔ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８８／１０３１５）。

重合酵素連鎖反応（以下、“ＰＣＲ”と称する）として公示された最も多く用いられる核酸増幅方法は、二重鎖ＤＮＡの変性、ＤＮＡ鋳型へのオリゴヌクレオチドプライマーアニーリング及びＤＮＡ重合酵素によるプライマー延長の反復されたサイクル過程を含む（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号；Ｓａｉｋｉら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０、１３５０−１３５４）。

ＰＣＲ−基盤技術はターゲットＤＮＡ配列の増幅だけでなく、生物学及び医学研究分野で科学的応用または方法に広く利用されており、例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、分別ディスプレイＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）、ＰＣＲによる公知または未知の遺伝子のクローニング、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）、任意的プライミングＰＣＲ（ＡＰ−ＰＣＲ）、マルチプレックスＰＣＲ、ＳＮＰゲノムタイピング、及びＰＣＲ−基盤ゲノム分析がある（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｍｏｌｌｅｒ， （２０００） ＰＣＲ． ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， ＮＹ）。

前記ＰＣＲ−基盤技術はターゲット核酸分子の増幅を伴うので、ターゲット配列のみを正確に、そして効率よく増幅することが要求される。このために、適切な配列及び長さのプライマーを選択し、使用する成分（例えば、ＤＮＡ重合酵素、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇイオン、及びバッファ）の類型及び含量及び反応温度／時間を適切に調節して増幅反応を実施することが必要である。しかしながら、一部の場合、最適の反応条件を選択し難く、選択された反応条件下でも満足すべき増幅効率が達成できないことがある。より効率よい増幅のために多様な方法が開発された。

一方、プライマーダイマーの形成により増幅効率の減少が誘発できる。これと関連して、Ｌｅｂｅｄｅｖ ａｔ ａｌは初期反応で低温条件下に発生するプライマーの非特異的な混成化を防止するために、プライマーの３’末端ホスホジエステール連結、または２番目のホスホジエステール連結に４−ヨウ素−１−ペンチル（ＯＸＰ）ホスホスリーエステール（ＰＴＥ）基が導入されたプライマーを使用することによって特異度及び増幅効率を改善する方法を開示している（参照：Ｌｅｂｅｄｅｖ ａｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００８；３６：ｅ１３１）。

プライマーはターゲット分子に特異的に混成化（ｈｙｂｒｉｄｉｚｅ）して、その増幅を開示するので、増幅反応の特異度及び効率に有意な影響を及ぼす。特に、多数のプライマーを使用するマルチプレックス増幅反応でプライマーの重要性はより強調される。

典型的に、プライマーダイマー形成を最小化するためにプライマーが混成化される部位を変更するか、またはプライマーの配列または長さを調節する方法が使われてきたが、マルチプレックス増幅反応に使われるプライマーデザインに適用することには限界がある。したがって、プライマーダイマー形成を効果的に抑制する新たな方法が相変らず必要であり、このような方法は単独に、または前記記載された公示の方法と組合せてより経済的で、かつ簡便な方式により増幅効率を改善する。

本出願の全般に、多数の特許及び引用文献が参照され、その引用が括弧に提供されている。これら特許及び引用文献の開示内容は本発明及び本発明が属する技術分野をより詳細に技術するためにその全体が参照として本願に含まれている。

本発明者らはマルチプレックス増幅反応、特に少なくとも３個のターゲット核酸分子に対するマルチプレックス増幅反応で、プライマーダイマー形成を効果的に減少させることができる方法を開発しようと努力した。その結果、本発明者らはマルチプレックス増幅反応でユニバーサル塩基ヌクレオチドを含有するプライマーの使用がプライマーダイマー形成を抑制させ、これで増幅効率を増加させることができることを発見した。

したがって、本発明の目的はプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅する方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、少なくとも３個のターゲット核酸分子に対するマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマー形成を減少させる方法を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、マルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するためのキットを提供することにある。

本発明の更に他の目的は、マルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するためのキットの用途を提供することにある。

本発明の他の目的は、プライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するための方法に使用するためにプロセッサがプライマー対をデザインするように構成された命令を含むコンピュータ読取可能な格納媒体を提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、添付した請求範囲及び図面と共に以下の詳細な説明から明確になる。

本発明の一態様において、本発明は、次のステップを含む、マルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅する方法を提供する：
（ａ）各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対を製造するステップ；前記各々のプライマー対は該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含み；前記少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマーはユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）であり；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲に位置し、前記少なくとも３個のプライマー対を使用したマルチプレックス増幅反応はプライマーダイマーの形成を減少させ、ターゲット核酸分子の増幅産物を生成し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的であり；
（ｂ）前記少なくとも３個のプライマー対を使用してプライマーアニーリング、プライマー延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）及び変性の少なくとも２サイクルを含むマルチプレックス増幅反応を実施するステップ；前記マルチプレックス増幅反応はプライマーダイマーの形成を減少させ、ターゲット核酸分子の増幅産物を生成する。

本発明者らはマルチプレックス増幅反応、特に少なくとも３個のターゲット核酸分子に対するマルチプレックス増幅反応で、プライマーダイマー形成を効果的に減少させることができる方法を開発しようと努力した。その結果、本発明者らはマルチプレックス増幅反応でユニバーサル塩基ヌクレオチドを含有するプライマーの使用がプライマーダイマー形成を抑制させ、これで増幅効率を増加させることができることを発見した。

従来の核酸増幅反応で、プライマーダイマーのような非特異的副産物がプライマー間混成化により偶然に生成できる。本発明は、非特異的副産物のうち、プライマーダイマーを抑制することに関するものである。

本願に使われたように、用語“プライマーダイマー（ｐｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒ）”は２つのプライマーの相互混成化（ｉｎｔｅｒ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により、または単一プライマーの内部混成化（ｉｎｔｒａ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｓｅｌｆ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）により形成された混成化物（ｈｙｂｒｉｄ）を称する。特に、プライマーダイマーは同一または相異するターゲット核酸分子に混成化するプライマーの対により形成される混成化物を含む。また、本願に使われたようなプライマーダイマーは２つのプライマーの混成化物自体だけでなく、混成化物を構成する１つまたは２つのプライマー鎖が延長された延長産物を含む。

プライマーダイマーの各々のプライマー鎖が延長されるか、否かによって、プライマーダイマーは３個のカテゴリーに分類できる：（ｉ）非延長可能なプライマーダイマー；（ｉｉ）一本鎖延長可能なプライマーダイマー；及び（ｉｉｉ）二本鎖延長可能なプライマーダイマー（図２参照）。

本願に使われたような非延長可能なプライマーダイマーは、混成化後、２つのプライマー鎖が核酸重合酵素により延長されないことを称する（図２の上部列参照）。本願に使われたように、一本鎖延長可能なプライマーダイマーは、混成化後、２つのプライマー鎖のうちの１つが核酸重合酵素により延長されることを称する（図２の中間列参照）。二本鎖延長可能なプライマーダイマーは、混成化後、２つのプライマー鎖が核酸重合酵素により延長されることを称する（図２の下部列参照）。

本発明者らの実験によれば、非延長可能なプライマーダイマーまたは一本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成は、ターゲット核酸分子の増幅に有意な影響を及ぼさない一方、二本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成は核酸増幅反応でプライマーがターゲット核酸分子に混成化する（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）ことを妨害する。また、二本鎖延長可能なプライマーダイマーの増幅は、ターゲット核酸増幅反応に使われる酵素、ｄＮＴＰなどの浪費を誘発し、プライマーとの結合に対してターゲット核酸分子と競争する非特異的増幅産物を増加させて、正常な核酸増幅反応の効率を悪化させることがある。

したがって、本発明は二本鎖延長可能なプライマーダイマーの所望しない形成及び増幅を抑制してターゲット増幅効率を改善することに焦点を合せる。

本発明の特徴及び利点を要約すると、次の通りである：
（ａ）マルチプレックス核酸増幅反応でのダイマー形成の抑制
本発明の方法は少なくとも３個のターゲット核酸分子に対するマルチプレックス増幅反応で非特異的増幅産物、特にプライマーダイマーの形成を効果的な方式により抑制する。
（ｂ）核酸増幅効率の向上
プライマーダイマー、特に完全に延長されたプライマーダイマーの形成はプライマーがターゲットの増幅に参加することを防止する。また、増幅が進行されるにつれて、プライマーダイマーにより生成された非ターゲット増幅産物はターゲット核酸分子に競争的に結合し、プライマーを含む増幅成分を消費して、ターゲットの増幅効率を減少させる。本発明の方法はこのようなダイマー形成を初期サイクルで抑制して核酸増幅効率を向上させる。
（ｃ）低濃度ターゲットに対する敏感度向上
ターゲット核酸分子がサンプル内に初期に少量で存在する場合、ターゲット核酸分子がプライマー対より低い増幅量によって検出されないことがある。しかしながら、本発明の方法によりダイマー形成が減少する場合、ターゲット核酸分子が少量で存在してもターゲット核酸を検出することができるので、敏感度を改善することができる。
（ｄ）改善された増幅効率でマルチプレックス核酸増幅のためのプライマーセットの容易な構成
プライマーの間のダイマー形成を抑制し、増幅効率を改善するためにプライマーの混成化部位（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）及びプライマーの配列及び長さを反復して調節することは相当に時間消耗的で、かつ非効率的である。特に、複数のプライマーを使用したマルチプレックス増幅反応の場合、１つのプライマーの配列または長さの変更は他のプライマーとのダイマー形成可能性を考慮して遂行されなければならない。このような理由のため、マルチプレックス増幅反応でダイマー形成を減少させ、増幅効率の増加に全体プライマーを調節することは困難である。
一方、本発明の方法はプライマーの混成化部位を変えるか、またはプライマーの配列または長さを変更せず、ダイマー形成を抑制することができるので、マルチプレックス増幅反応のためにダイマー形成が抑制されたプライマーセットを構成することに有用である。

本発明に従うユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）の概略的な構造を示す。ＵＢＰは両末端にユニバーサル塩基のない２つの領域及びコア領域を含むユニバーサル塩基領域を含む。 マルチプレックス増幅反応で偶然に生成できるプライマーダイマーの３種類の類型を示す：非延長可能なプライマーダイマー（上部列）；一本鎖延長可能なプライマーダイマー（中間列）；及び二本鎖延長可能なプライマーダイマー（下部列）。 非延長可能なプライマーダイマー対を形成するためのプライマーセット＃１−３（上部左側）及び＃１１−１３（上部右側）、一本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマーセット＃４−６（中間左側）及び＃１４−１６（中間右側）、及び二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマーセット＃７−１０（下部左側）及び＃１７−２０（下部右側）を各々使用して収得された、プライマーダイマーに対する増幅曲線を示す。 ＵＰ対照群プライマーセット及びＮＧ対照群プライマーセット（最初の列）；非延長可能なプライマーダイマー対を形成するためのプライマーセット＃２１−２３及び＃３１−３３（２番目の列）、一本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマーセット＃２４−２６及び＃３４−３６（３番目の列）、及び二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマーセット＃２７−３０及び＃３７−４０（４番目の列）を各々使用して収得された、ターゲット核酸分子（ＵＰ及びＮＧ）に対する増幅曲線を示す。 プライマーセット＃９（最初の列、左側）、プライマーセット＃９Ａ（最初の列、右側）、プライマーセット＃９Ｂ（２番目の列、左側）、プライマーセット＃９Ｃ（２番目の列、右側）、プライマーセット＃９Ｄ（３番目の列、左側）、プライマーセット＃９Ｅ（３番目の列、右側）、プライマーセット＃９Ｆ（４番目の列、左側）、及びプライマーセット＃９Ｇ（４番目の列、右側）を各々使用して収得された、プライマーダイマーに対する増幅曲線を示す。 プライマーセット＃１９（最初の列、左側）、プライマーセット＃１９Ａ（最初の列、右側）、プライマーセット＃１９Ｂ（２番目の列、左側）、プライマーセット＃１９Ｃ（２番目の列、右側）、プライマーセット＃１９Ｄ（３番目の列、左側）、プライマーセット＃１９Ｅ（３番目の列、右側）、プライマーセット＃１９Ｆ（４番目の列、左側）、及びプライマーセット＃１９Ｇ（４番目の列、右側）を各々使用して収得された、プライマーダイマーに対する増幅曲線を示す。 プライマーセット＃２９（最初の列、左側）、プライマーセット＃２９Ａ（最初の列、右側）、プライマーセット＃２９Ｂ（２番目の列、左側）、プライマーセット＃２９Ｃ（２番目の列、右側）、プライマーセット＃２９Ｄ（３番目の列、左側）、プライマーセット＃２９Ｅ（３番目の列、右側）、プライマーセット＃２９Ｆ（４番目の列、左側）、及びプライマーセット＃２９Ｇ（４番目の列、右側）を各々使用して収得された、ターゲット核酸分子ＵＰに対する増幅曲線を示す。比較のために、二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマー（ＵＰ−Ｃ−３）のないプライマーセット＃２９及び＃２９Ａ−＃２９Ｇを使用して増幅曲線を収得した。図面で、プライマーセット＃２９及び＃２９Ａ−＃２９Ｇに対する結果が“−Ｏ−”と表示されており；プライマーダイマーを形成するためのプライマー（ＵＰ−Ｃ−３）のないプライマーセットに対する結果が“−Ｘ−”と表示されている。 プライマーセット＃３９（最初の列、左側）、プライマーセット＃３９Ａ（最初の列、右側）、プライマーセット＃３９Ｂ（２番目の列、左側）、プライマーセット＃３９Ｃ（２番目の列、右側）、プライマーセット＃３９Ｄ（３番目の列、左側）、プライマーセット＃３９Ｅ（３番目の列、右側）、プライマーセット＃３９Ｆ（４番目の列、左側）、及びプライマーセット＃３９Ｇ（４番目の列、右側）を各々使用して収得された、ターゲット核酸分子ＮＧに対する増幅曲線を示す。比較のために、二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマー（ＮＧ−Ｃ−３）のないプライマーセット＃３９及び＃３９Ａ−＃３９Ｇを使用して増幅曲線を収得した。図面で、プライマーセット＃３９及び＃３９Ａ−＃３９Ｇに対する結果が“−○−”と表示されており；プライマーダイマーを形成するためのプライマー（ＮＧ−Ｃ−３）のないプライマーセットに対する結果が“−Ｘ−”と表示されている。 従来のプライマー混合物（−○−）、第１のＵＢＰ混合物（−△−）及び第２のＵＢＰ混合物（−□−）を使用して収得された、プライマーダイマーに対する増幅曲線を示す。 １０ｐｇ（−○−）、１ｐｇ（−△−）、０．１ｐｇ（−□−）及びＮＴＣ（−Ｘ−）の濃度のターゲット核酸分子の存在下に従来のプライマー混合物（左側コラム）、第１のＵＢＰ混合物（中間コラム）及び第２のＵＢＰ混合物（右側コラム）を使用して収得された、ターゲット核酸分子ＵＵ、ＭＧ、ＮＧ、及びＣＴに対する増幅曲線を示す。

本発明の方法を各ステップ別に詳細に説明すると、次の通りである：

ステップ（ａ）：少なくとも３個のプライマー対の製造
本発明によれば、まず増幅する少なくとも３個のターゲット核酸分子を決定する。

本発明の方法は多様なマルチプレックス増幅反応に適用できるが、本発明の方法の特徴及び長所は少なくとも３個のターゲット核酸分子に対する増幅反応で明確になる。

本願に使われたように、用語“ターゲット核酸分子”、“ターゲット分子”または“ターゲット核酸”は最終的に増幅または検出される核酸分子を意味する。本願で使われたように、“ターゲット核酸分子”または“核酸分子”は各々“ターゲット核酸配列”または“核酸配列”と相互交換的に使われることができる。ターゲット核酸分子は二重鎖だけでなく、単一鎖を含む。ターゲット核酸分子は試料内にはじめから存在する核酸配列だけでなく、反応で新しく生成された核酸配列を含む。

ターゲット核酸分子は任意のＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子及びこれらの混成化物（キメラ核酸）を含むことができる。前記分子は二重鎖または単一鎖形態でありうる。出発物質として核酸が二重鎖である場合、二重鎖を単一鎖または部分的な単一鎖形態に作ることが好ましい。鎖を分離する方法は、加熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリオキサール処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）及び結合蛋白質を含むが、これに限定されるのではない。例えば、鎖分離は８０−１０５℃の温度で加熱することによって達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。

ターゲット核酸配列は任意の自然発生原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザーウイルス、エプスタイン−バールウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸またはビロイド核酸を含む。また、ターゲット核酸分子は再組合により生成されるか、生成できるか、化学的に合成されたか、または合成できる任意の核酸分子でありうる。したがって、核酸配列は自然で発見されるか、または発見されないことがある。

ターゲット核酸分子は与えられた時点に公知の配列または与えられた時点に利用可能な配列を制限することと解析されてはならず、代りに現在または未来のどの時点に利用可能であるか、または公知できる配列を含むものとして解析されなければならない。即ち、ターゲット核酸分子は本発明の方法を実施する時点に公知されるか、または公知されないことがある。公知されないターゲット核酸の場合、その配列は本発明の方法を実施する前に従来のシーケンシング方法のうちの１つにより決定できる。

ターゲット分子がターゲット核酸分子である場合、サンプルは当業界に公知された核酸抽出過程を経ることができる（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （２００１））。核酸抽出過程はサンプルの類型によって変わることができる。また、抽出された核酸がＲＮＡである場合、ｃＤＮＡを合成するための逆転写過程が追加で実施できる（参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ３ｒｄ ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （２００１））。

本発明の一具現例によれば、ターゲット核酸配列はヌクレオチド変異を含む。

本願で使われた用語“ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）”は、配列の類似な連続的なＤＮＡセグメントの中で特定位置でのＤＮＡ配列内の単一または複数のヌクレオチド置換、欠失、または挿入を意味する。このような連続的なＤＮＡセグメントは、１つの遺伝子または染色体の任意の他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は変異または多型対立遺伝子変異を含む。例えば、本発明で検出されるヌクレオチド変異はＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、変異、欠失、挿入、置換、及び転座を含む。例示的なヌクレオチド変異は人間ゲノム内の多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病源体の薬剤耐性と関連した変異及び癌発生−関連変異を含む。本願に使われた用語“ヌクレオチド変異”は核酸配列内の特定位置での任意の変異を含む。即ち、用語“ヌクレオチド変異”は核酸配列内の特定位置での自然型及びその任意の変異型を含む。

本願に使われたように、表現“増幅される少なくとも３個のターゲット核酸分子を決定すること”はどんな核酸配列が増幅されるかを決定する過程、即ち多数の核酸分子の中で増幅される少なくとも３個のターゲット核酸分子を選択する過程を意味する。

本発明の一具現例で、増幅されるターゲット核酸分子は少なくとも３個のターゲット核酸分子、少なくとも４個のターゲット核酸分子、少なくとも５個のターゲット核酸分子、少なくとも６個のターゲット核酸分子、少なくとも７個のターゲット核酸分子、または少なくとも８個のターゲット核酸分子である。例えば、増幅されるターゲット核酸分子は３−２０、３−１８、３−１５、３−１２、３−１０、３−８、３−５、４−２０、４−１８、４−１５、４−１２、４−１０、４−８、４−５、５−２０、５−１８、５−１５、５−１２、５−１０、または５−８個のターゲット核酸分子である。

本発明の一具現例で、少なくとも３個のプライマー対、少なくとも４個のプライマー対、少なくとも５個のプライマー対、少なくとも６個のプライマー対、少なくとも７個のプライマー対、または少なくとも８個のプライマー対が各々少なくとも３個のターゲット核酸分子、少なくとも４個のターゲット核酸分子、少なくとも５個のターゲット核酸分子、少なくとも６個のターゲット核酸分子、少なくとも７個のターゲット核酸分子、または少なくとも８個のターゲット核酸分子を増幅することに使われる。

一具現例によれば、本発明の方法により増幅され検出されるターゲット核酸分子の数は本発明の方法で使われるプライマー対の数と同一である。

本発明によれば、少なくとも３個のプライマー対が少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するために製造され、各々のプライマー対は正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む。各々のプライマーは該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含む。

本発明の一具現例によれば、本願に使われる少なくとも３個のプライマー対は３個のプライマー対、４個のプライマー対、５個のプライマー対などである。

本願で使われたように、用語“プライマー”は核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件、即ち、ヌクレオチドとＤＮＡ重合酵素のような重合剤の存在、そして適合した温度とｐＨに置かれる時、合成の開示点として作用できるオリゴヌクレオチドを意味する。好ましくは、プライマーは単一鎖のデオキシリボヌクレオチドである。本発明で使われるプライマーは自然発生（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（即ち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチドまたは非−自然ヌクレオチドを含むことができる。また、プライマーはリボヌクレオチドを含むことができる。

プライマーは重合剤の存在下で延長産物の合成をプライミングさせることができる程度に十分に長くなければならない。プライマーの適合した長さは多くの要素、例えば、温度、応用分野、及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）によって変わるはずである。本願に使われたように、用語“アニーリング”または“プライミング”は鋳型核酸にオリゴヌクレオチドまたは核酸を並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）させることを意味し、前記並置は重合酵素がヌクレオチドを重合させて鋳型核酸またはその一部分に相補的な核酸分子を形成するようにする。

用語“相補的”は所定のアニーリングまたは混成化条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的に混成化する程度に十分に相補的なものを意味し、用語“実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”及び“完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”であるものを包括し、好ましくは完全に相補的なものを包括する。

本願に使われた用語“混成化”は相補的な単一鎖の核酸から二重鎖の核酸を形成することを意味する。混成化は完全にマッチされるか、または一部のミスマッチを有して実質的にマッチされた２つの核酸鎖の間で発生できる。混成化のための相補性は混成化条件、特に温度によって変わることができる。

用語“アニーリング”と“混成化”は差がなく、これら用語は相互交換的に使われる。

本願に使われたように、用語“プライマー対”、“プライマーの対”、“１つのプライマー対”及び“１つの類型のプライマー対”は正方向プライマーと逆方向プライマーの対を含む。プライマー対は１つのターゲット核酸分子に対する増幅反応に使われることができる。

また、本願に言及されたような複数のプライマー対、例えば、（少なくとも）２つのプライマー対、（少なくとも）３個のプライマー対、（少なくとも）４個のプライマー対などはプライマー対の数が複数であり、プライマー対が互いに相異するということを意味する。したがって、本願に使われたような用語“少なくとも３個のプライマー対”はプライマー対の数が少なくとも３個であり、プライマー対が互いに相異するということを意味する。

表現“プライマー対が互いに相異する”ということは、（ｉ）プライマー対が互いに実質的に相異する、または（ｉｉ）プライマー対が互いに完全に相異するという意味を包括することができる。

表現“プライマー対が互いに実質的に相異する”ということは、１つのプライマー対の正方向プライマーが他のプライマー対の正方向プライマーと相異するということ、または１つのプライマー対の逆方向プライマーが他のプライマー対の逆方向プライマーと相異するということを意味する。

表現“プライマー対が互いに完全に相異する”ということは、１つのプライマー対の正方向プライマーが他のプライマー対の正方向プライマーと相異し、１つのプライマーの逆方向プライマーが他のプライマー対の逆方向プライマーと相異するということを意味する。

本発明の方法は一般的に互いに完全に相異する少なくとも３個のプライマー対を使用するが、互いに実質的に相異する少なくとも３個のプライマー対の使用を排除しない。

一具現例によれば、本発明のプライマー対は互いに完全に相異する。

２つの相異するプライマー対は、“２つのプライマー対”と表現されることができ、３個の相異するプライマー対は“３個のプライマー対”と表現できる。

また、表現“プライマーが互いに相異する”ということは、プライマーの長さが相異するか、またはプライマーが１つの配列で表示されないか、プライマーが内部に５個以下の縮退性塩基（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｂａｓｅ）を含む１つの配列で表示されないことを意味する。

例えば、保存領域内に一部の変異を有する核酸を増幅するためにプライマーを特定部位に縮退性塩基を含むように設計する場合、前記プライマーは同一なプライマー、即ち単一プライマーとして考慮されるが、これらは同一な長さの配列を有し、５個以下の縮退性塩基を含む１つの配列で表示されるためである。本発明の一具現例によれば、用語“単一または１つのプライマー”は特定長さを有し、１つの配列で表示されるか、５個以下、特に４個以下、さらに特に３個以下の縮退性塩基を含む配列で表示されるプライマーである。

核酸塩基に対するＩＵＢ縮退性コードが本願に使われる。このコードで、Ｒはプリン塩基ＡまたはＧを意味し；Ｙはピリミジン塩基ＣまたはＴを意味し；Ｍはアミノ塩基ＡまたはＣを意味し；Ｋはケト塩基ＧまたはＴを意味し；Ｓはより強い水素結合パートナーＣまたはＧを意味し；Ｗはより弱い水素結合パートナーＡまたはＴを意味し；ＨはＡ、Ｔ、またはＣを意味し；ＢはＧ、Ｔ、またはＣを意味し；ＤはＧ、Ａ、またはＴを意味し；ＶはＧ、Ａ、またはＣを意味し；ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴを意味する。

本発明で、少なくとも３個のターゲット核酸分子に対するマルチプレックス増幅反応で使われる、各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む少なくとも３個のプライマー対は複数のプライマーを含む。一般的に、プライマーの総数はプライマー対の総数の２倍である。しかしながら、プライマー対の間に１つ以上の同一なプライマーが存在する場合、プライマーの総数はプライマー対の総数の２倍未満でありうる。

本発明の一具現例によれば、本願に使われた少なくとも３個のプライマー対は４、５、または６個のプライマーを含む。

本発明の一具現例によれば、本願に使われた少なくとも５個のプライマー対は６、７、８、９、または１０個のプライマーを含む。

本発明の一具現例によれば、本願に使われた少なくとも７個のプライマー対は８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のプライマーを含む。

通常的に、デオキシイノシンまたはイノシンのようなユニバーサル塩基は４個の標準ヌクレオチド塩基の各々と非差別的に対を形成する能力のため、‘縮退性塩基’として広く利用されてきた。特に、イノシンを含有するプライマーはターゲットコドンの高い比率の縮退性を補償し、全体プライマー縮退性だけでなく、誤ったプライミング及び非ターゲット遺伝子増幅を実質的に減少させることができる（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ， Ｄ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．， １９９６． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３４：２９９０−２９９６； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ． Ｇ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９４． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８）。しかしながら、本発明のようにイノシンのようなユニバーサル塩基をプライマーのコア領域に含めてマルチプレックス増幅反応でダイマー形成を抑制する試みはなかった。

本発明の方法はユニバーサル塩基ヌクレオチドを含むプライマーを用いてプライマーダイマー、特に二本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成を減少させ、ターゲット増幅効率を改善する。本発明によれば、ユニバーサル塩基ヌクレオチドをプライマー内に精巧に配置することは相応する従来プライマー（即ち、ユニバーサル塩基ヌクレオチドの代りにターゲットに相補的な自然発生塩基を含むプライマー）の特性（例えば、相補的配列への特異的結合及び重合酵素による延長）は維持しながらプライマーダイマーの形成を効果的に抑制することができる。

本発明により提示された戦略によって製造されたプライマーはユニバーサル塩基プライマー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂａｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：ＵＢＰ）と呼ばれる。本願に使われたように、用語“ユニバーサル塩基プライマー（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｂａｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ：ＵＢＰ）”はプライマー内の少なくとも１つのヌクレオチドが自然発生塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ（Ｕ））の代りにユニバーサル塩基を含有するプライマーを意味する。本発明で、ＵＢＰはプライマーダイマー形成に対する抑制剤として作用する。特に、ユニバーサル塩基のうち、デオキシイノシンまたはイノシンを含むプライマーはイノシンプライマー（Ｉｎｏｓｉｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ；ＩＰｍ）と称される。一方、本願に使われたように、用語“従来プライマー”は自然発生ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ（Ｕ））のみで構成されたよく使われるプライマーを意味する。本願に使われたようなプライマーは内部で合成されるか、またはプライマーを合成する第３者により合成できる。

本発明によってプライマー内にユニバーサル塩基を含めることは、少なくとも３個のプライマー対に対するマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマー形成を抑制し、増幅効率を増加させることに寄与する。

核酸増幅過程の場合、プライマーダイマーはプライマーの一部の配列間の混成化により形成できる。ユニバーサル塩基と自然発生塩基との間の結合強度は２つの相補的な自然発生塩基の間の結合強度より相対的に一層低いので、少なくとも１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドを適切な位置、即ちプライマーのコア領域に含めることはプライマーダイマーのＴ_ｍを低めて、プライマーダイマーの形成を抑制する。

本発明によれば、ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有する。一具現例で、ＵＢＰは１−２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドを有する。

用語“ユニバーサル塩基ヌクレオチド”は自然発生塩基の代りにユニバーサル塩基を含むヌクレオチドを意味する。前記用語は“ユニバーサルヌクレオチド”、“ユニバーサル塩基−含有ヌクレオチド”、“ユニバーサル塩基−含みヌクレオチド”などと相互交換的に使われることができる。

ＵＢＰ内に少なくとも４個のユニバーサル塩基を含めることは、ユニバーサル塩基ヌクレオチドの高い割合によってターゲットとプライマーとの間の混成化効率を減少させることがあるので、好ましくない。したがって、３個以下、特に２つ以下のユニバーサル塩基ヌクレオチドを含めることがターゲットとプライマーとの間の安定した混成化を維持することに適切である。

本発明によれば、ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基を有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうち、１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置する。

本願に使われたように、用語“コア領域”はプライマーダイマー形成、特に二本鎖延長可能なプライマーダイマー形成の抑制を達成するためにＵＢＰ内に１つまたは２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドを位置させるための最適位置範囲を意味する。即ち、コア領域は１つまたは２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドが最大効果を発揮するために位置するＵＢＰ内の特定領域を意味する。

プライマーダイマー、特に二本鎖延長可能なプライマーダイマーを構成する２つのプライマー鎖は延長反応の間消費されてターゲット核酸分子を増幅することに使われることができない。本発明者らは１つまたは２つのプライマー鎖のコア領域に１つ以上のユニバーサル塩基ヌクレオチドを位置させることによって、３’−末端部分が二本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成に参加する可能性が最小化できることを発見した。

本発明者らの実験結果によれば、ターゲット核酸分子の増幅は二本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成により大きく影響を受けることと確認された。二本鎖延長可能なプライマーダイマーは、一般的に２つのプライマー鎖の３’−末端部分の間の混成化により生成されるので、１つまたは２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドを３’−末端部分に位置させることが二本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成を抑制することに好ましいと明かされた。

本発明で、ＵＢＰ内のコア領域の正確な位置はターゲット増幅及びプライマーダイマー形成の面で決定された。即ち、ＵＢＰ内のコア領域の正確な位置はターゲット核酸分子の増幅に否定的な影響を及ぼさない、かつプライマーダイマーの形成を抑制することに重要な領域を確認することによって決定された。

本発明の方法によれば、ＵＢＰ内のコア領域はＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチドの範囲である。

一般的に、プライマーの３’−末端にある最初のヌクレオチドまたは２番目のヌクレオチドはプライマーの延長に有意な影響を及ぼす。例えば、プライマーの３’−末端にある最初のヌクレオチドまたは２番目のヌクレオチドがターゲット核酸分子の相応するヌクレオチドに相補的でない場合、プライマーの３’−末端にある最初のヌクレオチドまたは２番目のヌクレオチドがターゲット核酸分子の相応するヌクレオチドに混成化せず、前記３’−末端は延長されないものであり、これは結局、ターゲット増幅効率を格段に減少させることがある。類似するように、本発明のＵＢＰの場合、ユニバーサル塩基ヌクレオチドをＵＢＰの３’−末端にある最初の位置または２番目の位置に位置させることは３’−末端にある最初のヌクレオチドまたは２番目のヌクレオチドがターゲット核酸分子の相応するヌクレオチドに結合することを減少させてターゲット増幅効率を低める。したがって、本発明の一具現例によれば、ターゲット増幅効率に照らしてみる時、ユニバーサルヌクレオチドが位置するコア領域はＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至その以上のヌクレオチド（例えば、４番目、５番目、６番目、７番目以上のヌクレオチド）である。

一方、ターゲット増幅に対する二本鎖延長可能なプライマーダイマーの効果はプライマーダイマー内の相補的（オーバーラップ）ヌクレオチドの数によって変わる。本発明者らの実験結果は内部に４個の相補的なヌクレオチドを含有するプライマーダイマー（４個のオーバーラップヌクレオチドを有するプライマーダイマー）はターゲット増幅に有意な影響を及ぼさない一方、内部に５個の相補的なヌクレオチドを含有するプライマーダイマー（５個のオーバーラップヌクレオチドを有するプライマーダイマー）はターゲットの類型によってターゲット増幅に影響を及ぼすことができ；内部に６個の相補的なヌクレオチドを含有するプライマーダイマー（６個のオーバーラップヌクレオチドを有するプライマーダイマー）はターゲット増幅に有意な影響を及ぼすということを突き止めた。したがって、ターゲット増幅に大きく影響を及ぼすダイマー類型である内部に６個の相補的なヌクレオチドを有するダイマープライマーの形成を抑制するために、ユニバーサル塩基ヌクレオチドは６番目のヌクレオチド以下に位置することができる。

本発明によれば、ユニバーサル塩基ヌクレオチドをＵＢＰの３’−末端にある最初のヌクレオチドまたは２番目のヌクレオチドに位置させることがターゲット増幅効率を減少させるので好ましい。一方、ユニバーサル塩基ヌクレオチドを三番目のヌクレオチドに位置させることは各プライマー鎖の３’−末端にある３個以上の相補的なヌクレオチドを有するプライマーダイマーの形成を抑制することができ；ユニバーサル塩基ヌクレオチドを４番目のヌクレオチドに位置させることは各々のプライマー鎖の３’−末端にある４個以上の相補的なヌクレオチドを有するプライマーダイマーの形成を抑制することができ；ユニバーサル塩基ヌクレオチドを５番目のヌクレオチドに位置させることは各々のプライマー鎖の３’−末端にある５個以上の相補的なヌクレオチドを有するプライマーダイマーの形成を抑制することができ；ユニバーサル塩基ヌクレオチドを６番目のヌクレオチドに位置させることは各々のプライマー鎖の３’−末端にある６個以上の相補的なヌクレオチドを有するプライマーダイマーの形成を抑制することができる。

一具現例によれば、本発明は２つのプライマー鎖が混成化することを防止することができ、したがって、二本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成を防止することができる。

前記記載されたように、内部に４個以下の相補的なヌクレオチドを有するプライマーダイマーの形成はターゲット増幅効率に有意に影響を及ぼさないということに留意しなければならない。例えば、ユニバーサル塩基ヌクレオチドをＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチドに位置させることは各プライマー鎖の３’−末端にある２つの相補的なヌクレオチドを含有するプライマーダイマーの形成を抑制しないが、前記プライマーダイマーの形成はターゲット増幅効率に影響を及ぼさない。代りに、上記のように位置したユニバーサル塩基ヌクレオチドを有するＵＢＰは内部に３個以上の相補的なヌクレオチドを有するプライマーダイマーの形成を抑制することができるので、本発明の目的を達成することに適している。

本発明の一具現例によれば、コア領域はＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド乃至５番目のヌクレオチド、３番目のヌクレオチド乃至４番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド、４番目のヌクレオチド乃至５番目のヌクレオチド、５番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド、特にＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至５番目のヌクレオチドの範囲である。

コア領域の定義及びユニバーサル塩基ヌクレオチドの位置と関連して、プライマーの３’−末端にある最初のヌクレオチドは３’−末端にあるヌクレオチド、即ち３’最終（ｕｌｔｉｍａｔｅ）ヌクレオチド（３’−末端ヌクレオチド）を意味する。順次に、ＵＢＰの３’−末端にある２番目のヌクレオチドは最後から２番目の位置にあるヌクレオチド、即ち３’の終わりから２番目の（ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）ヌクレオチドを意味し、ＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチドは最後から３番目の位置にあるヌクレオチド、即ち３’の終わりから３番目の（ａｎｔｅｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）ヌクレオチドを意味し、ＵＢＰの３’−末端にある４番目のヌクレオチドは最後から４番目の位置にあるヌクレオチド、即ち３’の終わりから４番目の（ｐｒｅａｎｔｅｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ）ヌクレオチドを意味し、ＵＢＰの３’−末端にある５番目のヌクレオチドは最後から５番目の位置にあるヌクレオチドを意味する。前記位置の説明はプライマーの５’−末端に同一に適用される。

一例で、下記の配列５’−ＡＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＴ−３’（Ａ：アテニン、Ｇ：グアニン、Ｎ：任意のヌクレオチド、Ｃ：シトシン；Ｔ：チミン）を有するプライマーを仮定すれば、“Ａ”はプライマーの５’−末端にある最初のヌクレオチドに該当し、“Ｇ”はプライマーの５’−末端にある２番目のヌクレオチドに該当し、“Ｃ”はプライマーの３’−末端にある２番目のヌクレオチドに該当し、“Ｔ”はプライマーの３’−末端にある最初のヌクレオチドに該当する。

更に他の例で、下記の配列５’−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＧＡＡ−３’（Ａ：アテニン、Ｇ：グアニン）を有するプライマーを仮定すれば、３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域は“ＧＧＧＧＧ”である。

本発明によれば、ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的である。これは、ＵＢＰ内のユニバーサル塩基ヌクレオチドが互いに直ぐ隣接しないということを意味する。

本発明によれば、１つまたは２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域に位置することができる。

本発明によれば、表現“ユニバーサル塩基ヌクレオチドがＵＢＰで非連続的である”ということは、表現“ユニバーサル塩基ヌクレオチドがＵＢＰで互いに離隔して位置する”と相互交換的に使われることができる。本願に使われたように、表現“ユニバーサル塩基ヌクレオチドがＵＢＰで互いに離隔して位置する”ということは、２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドの間に他のヌクレオチドが存在するということを意味する。例えば、“ユニバーサル塩基ヌクレオチドがＵＢＰで互いに２つのヌクレオチド離隔して位置する”ということは、前記２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドの間に２つの他のヌクレオチドが存在するということを意味する。

本発明の一具現例で、ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで互いに少なくとも１、２、３、５、８、１０、１２、１５、及び２０ヌクレオチド離隔して位置する。

本発明の一具現例で、ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで互いに１−１０ヌクレオチド、例えばＵＢＰで互いに１−８ヌクレオチド、１−６ヌクレオチド、１−４ヌクレオチド、２−１０ヌクレオチド、２−８ヌクレオチド、２−６ヌクレオチド、２−４ヌクレオチド、３−１０ヌクレオチド、３−８ヌクレオチド、３−６ヌクレオチド、または３−４ヌクレオチド離隔して位置する。

本発明によれば、コア領域に存在するユニバーサル塩基ヌクレオチドを除外した他のユニバーサル塩基ヌクレオチドは、存在する場合、ＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチド範囲の領域に位置する。

コア領域の限界が変わることができるということを考慮する時、残りの（他のユニバーサル塩基ヌクレオチド）はコア領域、ＵＢＰの５’−末端にある３個の連続的なヌクレオチド、ＵＢＰの３’−末端にある２つの連続的なヌクレオチドを除外した領域に位置することができる。即ち、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチドからコア領域の５’の最後のヌクレオチドに直ぐ隣接したヌクレオチド（横のヌクレオチド）までの範囲の領域に位置する。

コア領域に位置しない残りのユニバーサル塩基ヌクレオチドの位置は、次の通り決定される：
（ｉ）ユニバーサル塩基ヌクレオチドをＵＢＰの３’−末端にある最初のヌクレオチド位置または２番目のヌクレオチドの位置に位置させることはターゲット増幅を有意に妨害し；
（ｉｉ）ユニバーサル塩基ヌクレオチドをＵＢＰの５’−末端にある最初のヌクレオチド位置（５’ ｕｌｔｉｍａｔｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、２番目のヌクレオチド位置（５’ ｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、または３番目のヌクレオチド位置（５’ ａｎｔｅｐｅｎｕｌｔｉｍａｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に位置させることは、前記位置での混成化により形成されたプライマーダイマーが短い延長によってターゲット増幅に大きく影響を及ぼさないので、ターゲット増幅を改善することに充分でない。

総合すると、残りはコア領域、ＵＢＰの５’−末端にある３個の連続的なヌクレオチド、ＵＢＰの３’−末端にある２つの連続的なヌクレオチドを除外した領域に位置する。

本発明によれば、ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチド範囲の領域に位置する。

一具現例によれば、ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至５番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある６番目のヌクレオチド範囲の領域に位置する。

ＵＢＰ内のユニバーサル塩基の数によって、ＵＢＰ内の１乃至３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドの位置は、次の通り記述できる：

（ｉ）ＵＢＰが１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドを有する場合：
ユニバーサル塩基はコア領域に位置する。

（ｉｉ）ＵＢＰが２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドを有する場合：
一具現例で、２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域に位置する。

代案的な具現例で、１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域に位置し、他のユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域、ＵＢＰの５’−末端にある３個の連続的なヌクレオチド、及びＵＢＰの３’−末端にある２つの連続的なヌクレオチドを除外した領域に位置する。コア領域がＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチドの範囲である場合、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置する。コア領域がＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至５番目のヌクレオチド範囲である場合、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある６番目のヌクレオチド範囲の領域に位置する。

（ｉｉｉ）ＵＢＰが３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有する場合：
一具現例で、１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域に位置し、２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域、ＵＢＰの５’−末端にある３個の連続的なヌクレオチド、ＵＢＰの３’−末端にある２つの連続的なヌクレオチドを除外した領域に位置する。

代案的な具現例で、２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域に位置し、１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域、ＵＢＰの５’−末端にある３個の連続的なヌクレオチド、ＵＢＰの３’−末端にある２つの連続的なヌクレオチドを除外した領域に位置する。

ＵＢＰが２つまたは３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有する具現例は、次の通り詳細に説明される：

（ｉ）ＵＢＰが２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドを有する場合：
一具現例で、２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域に位置する。

更に他の具現例で、１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰのコア領域に位置し、他のユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰのコア領域の５’の最後のヌクレオチドローから５’方向に５、１０以上のヌクレオチド以内に位置する。例えば、コア領域がＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲である場合、他のユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰの３’−末端にある１１番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、または１６番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチドに位置する。この場合、ＵＢＰの３’部分が更に他のプライマーと混成化する可能性がより減少できる。

代案的な具現例によれば、１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰのコア領域に位置し、他のユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰの５’部分または３’部分に位置し、前記５’部分及び３’部分はＵＢＰのヌクレオチド長さを二等分することによって決定できる。この場合、他のプライマーがＵＢＰと混成化する可能性がより減少できる。

ユニバーサル塩基ヌクレオチドの位置に対する限定と関連して、本発明の一具現例はＵＢＰの全体ヌクレオチド長さを二等分することを用いる。ＵＢＰの総長さが偶数の場合、ＵＢＰは均等に二等分される一方、ＵＢＰの総長さが奇数の場合、ＵＢＰは均等に二等分できない。ＵＢＰが均等に二等分できない場合、１つのヌクレオチドの追加または除去が使われることができる。即ち、５’−末端にある任意のヌクレオチドを除去するか、または５’−末端に任意の仮想のヌクレオチドを追加することによってＵＢＰは正確に二等分できる。任意のヌクレオチドの追加または除去は単にＵＢＰの正確な二等分のためのものであるので、ユニバーサル塩基ヌクレオチドは追加または除去されたヌクレオチドに位置すると解析されない。代案的に、ＵＢＰは３’−末端にある任意のヌクレオチドを除去するか、または３’−末端に任意の仮想のヌクレオチドを添加することによって二等分できる。

（ｉｉ）ＵＢＰが３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有する場合：
一具現例によれば、１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはコア領域に位置し、２つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰのコア領域の５’の最後のヌクレオチドから５’方向に５、１０以上のヌクレオチド以内に位置する。例えば、ＵＢＰの３’−末端にある１１番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、１２番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、１３番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、１４番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、１５番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド、または１６番目のヌクレオチド乃至７番目のヌクレオチド。

代案的な具現例によれば、１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰのコア領域に位置し、更に他のユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰのコア領域の５’最後のヌクレオチドローから５’方向に５、１０以上のヌクレオチド以内に位置し、前記５’部分及び３’部分は１つのヌクレオチドを追加または除去するか、または追加または除去せずにヌクレオチド長さを二等分することによって決定できる。

更に他の具現例によれば、１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰのコア領域に位置し、更に他のユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰの５’部分、中間部分、または３’部分に位置し、前記３個の部分は１つまたは２つのヌクレオチドを追加または除去するか、または追加または除去せずにＵＢＰのヌクレオチド長さを三等分することによって決定され、他のユニバーサル塩基ヌクレオチドは前記更に他のヌクレオチドと同一または相異する部分に位置する。例えば、１つのユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰのコア領域に位置し、更に他のユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰの５’部分に位置し、他のユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰの中間部分に位置する。

前記記載されたようなユニバーサル塩基の位置は例示的なものとして意図され、ユニバーサル塩基ヌクレオチドの他の位置が当業者により考慮できる。

前記記載されたように、ユニバーサル塩基ヌクレオチドを位置させることは少なくとも３個のプライマー対を使用したマルチプレックス増幅反応がプライマーダイマーの形成を減少させ、ターゲット核酸分子の増幅産物を生成できるようにする。

特に、前記記載されたように、ＵＢＰの５’部分にユニバーサル塩基を位置させることは一本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成を抑制し、その結果、重合酵素及びｄＮＴＰのようなＰＣＲ反応の成分の消耗を防止することができる。

本発明の一具現例によれば、ＵＢＰのうちの少なくとも１つは縮退性塩基を含まない。一具現例によれば、マルチプレックス増幅反応に使われるＵＢＰのうちの少なくとも１、２、３、４、５、６、８、１０、または１２個は縮退性塩基を含まない。本発明の一具現例によれば、マルチプレックス増幅反応に使われるＵＢＰのうちの少なくとも５０％、６０％、または７０％は縮退性塩基を含まない。本発明の一具現例によれば、ＵＢＰが縮退性塩基を有する場合、縮退性塩基の数は１つを超過しない。更に他の具現例によれば、全てのＵＢＰは縮退性塩基を含まない。ユニバーサル塩基ヌクレオチドを本願のプライマーに含めることは縮退性塩基を使用する必要性を減少させることがある。

本発明の一具現例によれば、プライマー対のうち、少なくとも１つのプライマー対、少なくとも２つのプライマー対、少なくとも３個のプライマー対、少なくとも４個のプライマー対、または少なくとも５個のプライマー対での正方向プライマー及び逆方向プライマー全てはＵＢＰである。

本発明の一具現例によれば、各プライマー対での正方向プライマー及び逆方向プライマーのうちの１つまたは２つ全てはＵＢＰである。

本発明の一具現例によれば、使われたプライマーの総数の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％はＵＢＰである。

本発明の一具現例によれば、プライマーは全てユニバーサル塩基プライマーである。

本発明の一具現例によれば、本願に使われた少なくとも３個のプライマー対は少なくとも２つのＵＢＰを含む。具体的に、本願に使われた少なくとも３個のプライマー対は、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、または少なくとも６個のＵＢＰを含む。

本発明の一具現例によれば、本願に使われた少なくとも４個のプライマー対は少なくとも３個のＵＢＰを含む。具体的に、本願に使われた少なくとも４個のプライマー対は少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個または少なくとも８個のＵＢＰを含む。

本発明の一具現例によれば、本願に使われた少なくとも５個のプライマー対は少なくとも３個のＵＢＰを含む。具体的に、本願に使われた少なくとも５個のプライマー対は少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個のＵＢＰを含む。

本発明の一具現例によれば、本願に使われた少なくとも７個のプライマー対は、少なくとも４個のＵＢＰを含む。具体的に、本願に使われた少なくとも７個のプライマー対は、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、または少なくとも１４個のＵＢＰを含む。

本発明に使われたプライマーの長さはプライマー合成の便宜性及び費用、及び増幅反応の正確性及び敏感性のような幾つかの因子によって変わることができる。例えば、本発明で使われたプライマーの長さは、非制限的に、少なくとも１２個のヌクレオチド、少なくとも１５個のヌクレオチド、少なくとも１８個のヌクレオチド、少なくとも２０個のヌクレオチド、少なくとも２２個のヌクレオチド、少なくとも２４個のヌクレオチド、最大６０個のヌクレオチド、最大５０個のヌクレオチド、最大４０ヌクレオチド、最大３５ヌクレオチド、最大３０ヌクレオチド、または最大２５ヌクレオチドである。

本発明の一具現例によれば、プライマーの長さは１２−６０、１２−５０、１２−４０、１２−３５、１２−３０、１２−２５、１５−６０、１５−５０、１５−４０、１５−３５、１５−３０、１５−２５、２０−６０、２０−５０、２０−４０、２０−３５、２０−３０、２０−２５、２２−６０、２２−５０、２２−４０、２２−３５、２２−３０、２２−２５、２４−６０、２４−５０、２４−４０、２４−３５、または２４−３０個のヌクレオチド、具体的に２０−３０個のヌクレオチドである。

本発明の一具現例によれば、本発明で用いられるユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、７−ジアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロール、２’−Ｆ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−ベータ−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロピロール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ ５−ニトロインドール、２’−Ｆ ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホラミダイト−５−ニトロインドール、ホスホラミダイト−ネブラリン、ホスホラミダイト−イノシン、ホスホラミダイト−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホラミダイト−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及びその組合せからなる群より選択される。より具体的に、前記ユニバーサル塩基は、デオキシイノシン、イノシン、またはその組合せである。

ステップ（ｂ）：少なくとも３個のプライマー対を用いたマルチプレックス増幅反応
次に、ステップ（ａ）の少なくとも３個のプライマー対を用いてマルチプレックス増幅反応を実施し、前記反応はプライマーアニーリング、プライマー延長及び変性の少なくとも２サイクルを含む。

ステップ（ｂ）で、マルチプレックス増幅反応は減少したプライマーダイマーの形成によりターゲット核酸分子の増幅産物を生成する。

本発明のマルチプレックス増幅反応は密閉された単一容器で実施される。

ターゲット核酸分子のマルチプレックス増幅は当業界に公知された多様なプライマー−関与核酸増幅方法により実施されることができ、これは重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＬＣＲ））（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ， １９９０））、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＤＡ））（Ｗａｌｋｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０（７）：１６９１−６（１９９２）； Ｗａｌｋｅｒ ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ３（１）：１−６（１９９３））、転写媒介増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｐｈｙｆｆｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３４：８３４−８４１（１９９６）； Ｖｕｏｒｉｎｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３３：１８５６−１８５９（１９９５））、核酸配列基盤増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ））（Ｃｏｍｐｔｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３５０（６３１３）：９１−２（１９９１））、ローリングサークル増幅（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ＲＣＡ）（Ｌｉｓｂｙ， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２（１）：７５−９９（１９９９）； Ｈａｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． １５（２）：３５−４０（１９９９））及びＱ−ｂｅｔａレプリカーゼ（Ｑ−Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ）（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７ （１９８８））を含む。

本発明のマルチプレックス増幅反応はリアルタイムＰＣＲ方法によって実施することができる（参照：米国特許５，２１０，０１５、５，５３８，８４８、及び６，３２６，１４５）。用語“マルチプレックス増幅”は単一重合酵素反応混合物内のマルチプレックスＤＮＡターゲットを同時に増幅することを意味する。

マルチプレックス増幅用ターゲット核酸分子は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡまたはｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子及びこれらの混成化物（キメラ核酸）を含むことができる。配列は二重鎖または単一鎖でありうる。出発物質として核酸が二重鎖の場合、２つの鎖を単一鎖形態に、または部分的な単一鎖形態に作ることが好ましい。鎖を分離する方法は、加熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア、及びグリオキサール処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）及び結合蛋白質を含むが、これに限定されるのではない。例えば、鎖分離は８０−１０５℃の温度で加熱することによって達成できる。このような処理を達成するための一般的な方法は Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）により提供される。

ｍＲＮＡが出発物質に用いられる場合、アニーリングステップの前に逆転写ステップが必要であり、逆転写ステップの詳細な内容はＪｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）、 Ｎｏｏｎａｎ， Ｋ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０３６６（１９８８）に開示されている。逆転写ステップのために、ｍＲＮＡに混成化可能（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）なオリゴヌクレオチドｄＴプライマー、ランダムヘキサマー、またはターゲット核酸分子の相補的なオリゴヌクレオチドが使われることができる。

オリゴヌクレオチドｄＴプライマーはｄＴＭＰからなっており、ｄＴプライマーがプライマーとして作用できる限り、ｄＴＭＰのうちの１つ以上は他のｄＮＭＰに代替できる。逆転写ステップはＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する逆転写酵素によりなされることができる。ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する酵素を用いる場合、反応条件を注意深く選択することによって、個別的なＲＮａｓｅ Ｈ切断ステップを省略することができる。

本発明に使われるプライマーは鋳型の一部位に混成化またはアニーリングされて二重鎖構造を形成する。このような二重鎖構造を形成することに適合した核酸混成化条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）及びＨａｙｍｅｓ， Ｂ． Ｄ．，ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．（１９８５）に記載されている。

多様なＤＮＡ重合酵素が本発明の増幅ステップに使われることができ、これは例えばＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ重合酵素Ｉのクレノウ断片、熱安定性ＤＮＡ重合酵素、及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡ重合酵素を含む。具体的に、重合酵素は多様なバクテリア種から得ることができる熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。これら酵素の大部分はバクテリア自体から分離できるか、または商業的に利用可能である。また、本発明に使われる重合酵素は前記重合酵素を暗号化するクローニング遺伝子を高い水準に発現する細胞から収得できる。

重合反応を実施する時、反応容器に反応に必要な成分を過量で提供することができる。増幅反応に必要な成分の過量は、増幅反応が前記成分の濃度に実質的に制限されない程度の量を意味する。Ｍｇ^２＋のような助因子、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのようなｄＮＴＰは希望の増幅程度を達成する量で反応混合物に提供されることが要求される。

増幅反応に使われる全ての酵素は同一な反応条件で活性でありうる。事実、緩衝液は全ての酵素が最適の反応条件に近接するようにする。したがって、本発明のマルチプレックス増幅過程は反応物の添加のような条件の変化無しに単一反応で実施できる。

本発明で、アニーリングまたは混成化はターゲット核酸配列とプライマーの間に特異的結合を可能にする厳格条件下で実施される。アニーリングのための厳格条件は配列−依存的であり、環境的変数によって多様である。

本発明の一具現例によれば、ステップ（ｂ）でのマルチプレックス増幅反応でプライマーアニーリングは５０℃以上で実施する。

本発明の方法での増幅反応は、ＵＢＰがユニバーサル塩基を含有するにもかかわらず、プライマーダイマー形成を防止するために相対的に高いアニーリング温度で実施できる。ステップ（ｂ）のマルチプレックス増幅反応で、プライマーアニーリングは５０℃以上、５２℃以上、５５℃以上、または５７℃以上で実施する。具体的に、ステップ（ｂ）のマルチプレックス増幅反応で、プライマーアニーリングは８５℃以下、８０℃以下、７５℃以下、７０℃以下、６５℃以下、及び６０℃以下で実施し、例えば５０−８５℃、５０−８０℃、５０−７５℃、５２−７５℃、５５−７５℃、５０−７０℃、５２−７０℃、５５−７０℃、５０−６０℃、５２−６０℃、５５−６０℃、または５７−６０℃で実施する。

ユニバーサル塩基プライマーを使用する少なくとも３個のターゲット核酸分子に対するマルチプレックス増幅反応は、各々のターゲット核酸分子の存在を検出するための追加的な少なくとも３個のプローブの存在下で実施される。前記少なくとも３個のプローブの各々は相応するターゲット核酸分子に対する混成化配列（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有し、ターゲット核酸分子を増幅するための正方向プライマー及び逆方向プライマーの間に位置する。本発明のＵＢＰを使用したマルチプレックス増幅反応で、プローブの使用はターゲット核酸分子の検出特異性をより高めることができる。プローブの使用は当業界に公知の多様な方法により実施できる。前記方法の例には、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ方法（米国特許第５，２１０，０１５号）、分子ビーコン方法（Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖ．１４ ＭＡＲＣＨ １９９６）、ＣＰＴ（Ｄｕｃｋ Ｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ９：１４２−１４８（１９９０））、ＬＮＡ方法（米国特許第６，９７７，２９５号）、プレクサ（Ｐｌｅｘｏｒ）方法（Ｓｈｅｒｒｉｌｌ ＣＢら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １２６：４５５０−４５５６（２００４））、Ｈｙｂｅａｃｏｎｓ^ＴＭ（Ｄ． Ｊ． Ｆｒｅｎｃｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （２００１） １３， ３６３−３７４、及び米国特許第７，３４８，１４１号）、二重標識された自家−クェンチングされたプローブ（Ｄｕａｌ−ｌａｂｅｌｅｄ， ｓｅｌｆ−ｑｕｅｎｃｈｅｄ ｐｒｏｂｅ；米国特許第５，８７６，９３０号）、混成化プローブ（Ｂｅｒｎａｒｄ ＰＳ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０００， ４６， １４７−１４８）、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方法（ＷＯ２０１２／０９６５２３）、ＰＣＥ−ＳＨ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＷＯ２０１３／１１５４４２）、ＰＣＥ−ＮＨ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＷＯ２０１４／１０４８１８）、及びＣＥＲ方法（ＷＯ２０１１／０３７３０６）を挙げることができる。

本発明の一具現例によれば、少なくとも３個のプローブはユニバーサル塩基ヌクレオチドを有しない。

本発明の一具現例によれば、プローブは標識を含有したり含有しないことがある。本発明の一具現例によれば、ターゲット核酸分子の存在によって、プローブはダウンストリーム反応（例えば、ＰＴＯＣＥ反応）を媒介することができる。

本発明の方法は、従来のプライマーを使用した増幅反応と比較して減少したプライマーダイマーの形成を示す。

具体的に、減少したプライマーダイマーの形成はプライマーダイマーの形成により伴われたシグナルの変化を測定することによって評価できる。代案的に、Ｃｔ値の変化、最大ＲＦＵの変化、シグナルの変化率が減少したプライマーダイマーの形成を評価することに使われることができる。

一具現例で、減少したプライマーダイマーの形成はターゲット核酸分子の不在下に本発明のＵＢＰを使用する反応とターゲット核酸分子の不在下に自然発生ヌクレオチドで構成された従来のプライマーを使用する反応の間のＣｔ値を比較することによって評価できる。前記比較のために、ユニバーサル塩基ヌクレオチドの代りに、ターゲット核酸分子内のヌクレオチドに相補的な自然発生ヌクレオチドを含有する従来のプライマーが使われることができる。

本発明の一具現例によれば、ターゲット核酸分子の不在下にＵＢＰを含有するプライマー対を使用した反応から収得されたＣｔ値（即ち、プライマーダイマーのＣｔ値）はターゲット核酸分子の不在下に従来のプライマーで構成されたプライマー対を使用したものと比較して１以上増加する。ターゲット核酸分子の不在下にＵＢＰを含有するプライマー対を使用した反応から収得されたＣｔ値はターゲット核酸分子の不在下に従来のプライマーで構成されたプライマー対を使用したものと比較して２以上、３以上、４以上、５以上、または６以上、例えば３乃至２０、５乃至１５、または８乃至１２増加する。

用語“プライマーダイマーのＣｔ値”は任意の鋳型の不在下にＰＣＲ反応混合物を使用する増幅反応により収得されたプライマーダイマーの増幅曲線から計算されたＣｔ値を意味する。したがって、プライマーダイマーのＣｔ値の増加はプライマーダイマーの形成が抑制または減少したことを示す。

Ｃｔ値を収得する方法は当業界に公知されている（参照： Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１））。

プライマーダイマー形成の抑制または減少が非常に効果的な場合、プライマーダイマーの低い増幅によってプライマーダイマーの増幅曲線でＣｔ値が収得されないことがある。この場合、プライマーダイマーのＣｔ値は１以上増加したことと見なされる。

本発明の方法はＵＢＰの代りに従来のプライマーを使用するターゲット増幅反応と比較して増加したターゲット増幅効率を示す。増加したターゲット増幅効率は自然発生ヌクレオチドを含有するプライマーを使用してターゲット核酸分子を増幅させて収得されるシグナル及びユニバーサル塩基プライマーを使用してターゲット核酸分子を増幅させて収得されるシグナル間の差（例えば、Ｃｔ値の変化、最大ＲＦＵの変化、シグナルの変化率など）を比較することによって評価できる。

本願に使われたように、用語“増幅効率”は増幅反応の効率を示すことができる限り、任意の値を含む。

増幅効率は当業界に公知された多様な方法により計算できる。

一具現例で、増幅の効率は希釈熱の線形回帰傾きに基づいて増幅速度を計算し、以下の方程式に基づいて増幅効率を計算することによって推定できる（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ， ２００１）：
（式１）
Ｅ＝１０^{−１／傾き}
前記の式で、Ｅは増幅効率を示し、傾き（ｓｌｏｐｅ）はターゲットの初期コピー数に対してＣｔ値をプロッティングした標準曲線の傾きを示す。

更に他の具現例で、増幅効率は当業界に公知された任意のプログラムにより推定できる。例えば、増幅効率は定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）データ分析用ＬｉｎＲｅｇＰＣＲ（バージョン２０１７．１）により計算できる。

ＬｉｎＲｅｇＰＣＲを増幅効率の収得に使用する場合、原始（即ち、ベースライン修正されていない）ＰＣＲデータを分析に使用する。ベースライン修正は初期サイクルの選択に基づいたベースライン趨勢を用いて実施される。各個別サンプルに対するＰＣＲ効率はＬｉｎＲｅｇＰＣＲを使用してログ−線形期内のベースライン修正されたデータ地点のサブセットに対してフィッティングされた回帰線の傾きから導出される。前記プログラムは典型的に個別線形ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ−ｏｆ−ｌｉｎｅａｒｉｔｙ）を使用するが、一部サンプルの場合、個別線形ウィンドウの上限及び下限が設定できる。

前記方法の１つにより収得されたＵＢＰを使用した反応の効率は従来のプライマーを使用した反応の効率と比較できる。ＵＢＰを使用した反応の効率は従来のプライマーを使用した反応対比増加率として表現できる。前記増加率は以下の式により計算できる：
（式２）
効率の増加率（％）＝［ＵＢＰを使用した反応の効率／従来のプライマーを使用した反応の効率］−１］＊１００

本発明の一具現例によれば、マルチプレックス増幅反応でＵＢＰを使用してターゲット核酸分子を増幅させることは自然発生ヌクレオチドで構成されたプライマーを使用したものと比較して３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％以上の効率の増加率を示す。

本発明の一具現例によれば、各反応の増幅効率はＬｉｎＲｅｇＰＣＲにより計算され、ＵＢＰを使用した反応の効率の増加率は従来のプライマーを使用した反応と比較して計算される。

本発明の第２態様において、本発明は次のステップを含む少なくとも３個のターゲット核酸分子に対するマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマー形成を減少させる方法を提供する：
（ａ）増幅される少なくとも３個のターゲット核酸分子を決定するステップ；
（ｂ）各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対のヌクレオチド配列を決定するステップ；前記各々のプライマーは該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み；
（ｃ）前記少なくとも３個のプライマー対のうち、少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマー内の１−３個のヌクレオチドをユニバーサル塩基ヌクレオチドに置換してユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）を製造するステップ；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドへの置換はプライマーダイマー形成を抑制し；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置し、前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的であり；
（ｄ）前記少なくとも３個のプライマー対を用いてプライマーアニーリング、プライマー延長及び変性の少なくとも２サイクルを含むマルチプレックス増幅反応を実施するステップ；前記マルチプレックス増幅反応はプライマーダイマーの形成を減少させ、ターゲット核酸分子の増幅産物を生成する。

本発明の一具現例で、前記コア領域はＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至５番目のヌクレオチド範囲である。

本発明の一具現例で、前記少なくとも１つのプライマー対で２つのプライマーはＵＢＰである。

本発明の一具現例で、前記各々のプライマー対で１つまたは２つのプライマーはＵＢＰである。

本発明の一具現例で、使われたプライマーの総数の少なくとも５０％はＵＢＰである。

本発明の一具現例で、前記ＵＢＰのうち、少なくとも１つは縮退性塩基を含まない。

本発明の一具現例で、少なくとも５個のプライマー対が少なくとも５個のターゲット核酸分子を増幅することに使われる。

本発明の一具現例で、前記マルチプレックス増幅反応でプライマーアニーリングは５０℃以上で実施される。

本発明の一具現例で、前記方法は前記少なくとも１つのＵＢＰの代りに前記ターゲット核酸配列に相補的な自然発生ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ（Ｕ））を含有するプライマーを使用するより少なくとも３％高いターゲット増幅効率を示す。

本発明の一具現例で、前記ターゲット核酸分子の不在下にＵＢＰを含有するプライマー対を使用した反応から収得されたＣｔ値は前記ターゲット核酸分子の不在下に従来のプライマーからなるプライマー対を使用したものと比較して１以上増加する。

本発明の一具現例で、前記マルチプレックス増幅反応は前記ターゲット核酸分子の存在を決定するために少なくとも３個の追加のプローブの存在下に実施され；前記少なくとも３個のプローブの各々は増幅されるターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み、正方向プライマー及び逆方向プライマーの間に位置する。

本発明の一具現例で、前記少なくとも３個のプローブはユニバーサル塩基ヌクレオチドを有しない。

本発明の一具現例で、前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドは、デオキシイノシン、イノシン、７−ジアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ ３−ニトロピロール、２’−Ｆ ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−ベータ−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロピロール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ ５−ニトロインドール、２’−Ｆ ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホラミダイト−５−ニトロインドール、ホスホラミダイト−ネブラリン、ホスホラミダイト−イノシン、ホスホラミダイト−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホラミダイト−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及びその組合せからなる群より選択される。

本発明の一具現例で、前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドは、デオキシイノシン、イノシン、またはその組合せを含む。

本発明の第２態様である“マルチプレックス増幅反応でプライマーダイマー形成を減少させる方法”は前述した第１態様の応用である。したがって、これらの間に共通した説明は本明細書の複雑性を引き起こす過度な重複を避けるために省略する。

本発明の第３態様において、本発明は次を含むマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するためのキットを提供する：
（ａ）各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対；各々のプライマーは該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み；少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマーはユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）であり；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的であり；
（ｂ）核酸重合酵素。

本発明の第４態様において、本発明は次を含む、第１項の方法の実施でマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するためのキットの用途を提供する：
（ａ）各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対；各々のプライマーは該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み；少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマーはユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）であり；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的であり；
（ｂ）核酸重合酵素。

本発明の少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するためのキットまたはキットの用途は前述した本発明の方法を実施するためのものであって、これらの間の共通した説明は本明細書の複雑性を引き起こす過度な重複を避けるために省略する。

選択的に、本発明のキットはＰＣＲ反応に必要な試薬、例えば、緩衝液、ＤＮＡ重合酵素、ＤＮＡ重合酵素助因子、及びデオキシリボヌクレオチド−５’−トリホスフェートを含むことができる。選択的に、本発明のキットは多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様な緩衝液及び試薬、ＤＮＡ重合酵素の活性を抑制する抗体を含むことができる。また、本発明のキットは陽性及び陰性対照群反応に必要な試薬を追加で含むことができる。特定反応に使われる試薬の最適量は当業界で通常の技術を有する者により容易に決定できる。典型的に、本発明のキットは分離されたパッケージまたは区画内に前述した成分を含む。

本発明の第５態様において、本発明は以下を遂行するように構成される命令を含むコンピュータ読取可能な格納媒体を提供する：
各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対をデザインすること；各々のプライマーは該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み；少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマーはユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）であり；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的である。

格納媒体は本発明の方法をコンピュータで実施するためのものであるので、これらの間の共通した説明は本明細書の複雑性を引き起こす過度な重複を避けるために省略する。

前記記載された本発明の方法はプロセッサ、例えば独立型コンピュータ、ネットワークに連結されたコンピュータ、またはリアルタイムＰＣＲ機器のようなデータ収集装置内のプロセッサで実行される。

コンピュータ読取可能な記録媒体の類型は、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリ、フロッピーディスク、ハードドライブ、携帯用ＨＤＤ、ＵＳＢ、マグネチックテープ、ＭＩＮＩＤＩＳＫ、不揮発性メモリカード、ＥＥＰＲＯＭ、光学ディスク、光学記録媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、システムメモリ、及びウェブサーバのような多様な記録媒体を含む。

本発明を実行するプロセッサを具現する指示はロジックシステムに含まれることができる。前記指示は、たとえ携帯用ＨＤＤ、ＵＳＢ、フロッピーディスク、ＣＤ、及びＤＶＤのような如何なるソフトウェア記録媒体上に提供できるが、ダウンロード可能であり、メモリモジュール（例えば、ハードドライブまたはローカルまたは付着ＲＡＭやＲＯＭのような他のメモリ）に格納できる。本発明を実行するためのコンピュータコードは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、ＶＢＳｃｒｉｐｔ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｐｅｒｌ、及びＸＭＬのような多様なコーディング言語で実行できる。また、多様な言語及びプロトコルは本発明に従うデータと命令の外部及び内部格納と転送に利用できる。

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は専ら本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に当たって自明である。

実施例１：ダイマー増幅及びターゲット増幅に影響を及ぼすダイマーの類型の確認
本発明者らはダイマー増幅及びターゲット増幅に対するプライマーダイマーの類型及びプライマーダイマー内の相補的ヌクレオチドの長さの影響を調べた。

＜１−１＞ダイマー増幅を促進するプライマーダイマー類型
マルチプレックス増幅反応で偶然に生成できるプライマーダイマーは各々のプライマー鎖が延長されるか否かによって３種類の類型に分類できる：（ｉ）非延長可能なプライマーダイマー；（ｉｉ）一本鎖延長可能なプライマーダイマー；及び（ｉｉｉ）二本鎖延長可能なプライマーダイマー（図２参照）。

第１に、非延長可能なプライマーダイマーは、混成化後、２つのプライマー鎖が核酸重合酵素により延長されないことを含む。このような類型は２つのプライマーの５’部分間の混成化により形成できる（図２の上部列参照）。第２に、一本鎖延長可能なプライマーダイマーは、混成化後、２つのプライマー鎖のうちの１つが核酸重合酵素により延長されることを含む。このような類型は１つのプライマーの３’部分と更に他のプライマーの中間部分の間の混成化により形成できる（図２の中間列参照）。第３に、二本鎖延長可能なプライマーダイマーは、混成化後、２つのプライマー鎖が核酸重合酵素により延長されることを含む。このような類型は２つのプライマーの３’部分間の混成化により形成できる（図２の下部列参照）。

前記３種類の類型のプライマーダイマーの形成を摸写するために、ターゲット核酸配列であるＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｐａｒｖｕｍ（ＵＰ）及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡに混成化するための従来のプライマー（ＵＰ−Ｒ１、配列番号：１；ＮＧ−Ｆ４、配列番号：１２）を製造した。その後で、従来のプライマーと非延長可能なプライマーダイマー、一本鎖延長可能なプライマーダイマー、及び二本鎖延長可能なプライマーダイマーのうちの１つを形成することができる追加のプライマーを製造した。ダイマー形成のためのプライマーはＵＰ−Ｒ１（配列番号：１）及びＮＧ−Ｆ４（配列番号：１２）に対する多様な長さの相補的なヌクレオチドを有するように設計した。

具体的に、ＵＰ−Ｒ１またはＮＧ−Ｆ４と非延長可能なプライマーダイマーを形成するための３個のプライマー（ＵＰに対し、各々ＵＰ−Ｎ−１、ＵＰ−Ｎ−２及びＵＧ−Ｎ−３；ＮＧに対し、各々ＮＧ−Ｎ−１、ＮＧ−Ｎ−２、及びＮＧ−Ｎ−３）をこれらが従来のプライマーに対する鋳型として作動可能な突出（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）ヌクレオチドを有しないように製造しており、これらの３’−末端を延長を防止するためにブロッキングした。これらは従来のプライマーに対し、１１、１３、または１５個の相補的なヌクレオチドを有するように製造した。

また、ＵＰ−Ｒ１またはＮＧ−Ｆ４と一本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するために３個のプライマー（ＵＰに対し、各々ＵＰ−Ｐ−１、ＵＰ−Ｐ−２及びＵＰ−Ｐ−３；ＮＧに対し、各々ＮＧ−Ｐ−１、ＮＧ−Ｐ−２、及びＮＧ−Ｐ−３）をこれらが従来のプライマーに対する鋳型として作動するヌクレオチドを提供するように製造しており、これらの３’−末端を延長を防止するためにブロッキングした。特に、これらは従来のプライマーの３’−部分に相補的な５、７、または９個の３’部分を有するように製造した。

また、ＵＰ−Ｒ１またはＮＧ−Ｆ４と二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するために４個のプライマー（ＵＰに対し、各々ＵＰ−Ｃ−１、ＵＰ−Ｃ−２、ＵＰ−Ｃ−３及びＵＰ−Ｃ−４；ＮＧに対し、各々ＮＧ−Ｃ−１、ＮＧ−Ｃ−２、ＮＧ−Ｃ−３、及びＮＧ−Ｃ−４）をこれらが３’部分に従来のプライマーの３’部分に相補的な４、５、６、または７個のヌクレオチドを有するように製造した。

その結果、各々ＵＰ−Ｒ１及びＮＧ−Ｆ４のうちの１つと前記記載されたダイマー形成のためのプライマーのうちの１つを含むプライマーセット＃１乃至＃２０を３種類の類型のプライマーダイマーの形成のために製造した。

本実施例に使われたプライマーの配列が各々表１及び表２に提供されている。

本実施例では、インターカレーティング染料であるＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いたリアルタイムＰＣＲを使用して任意のターゲット核酸配列の不在下にプライマーダイマー形成を検出した。プライマーダイマーが形成され、増幅される場合、不活性化されたＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉがプライマーダイマー内に混入された後、活性化されて蛍光を出す。増幅曲線はプライマーダイマー内の前記活性化された染料からのシグナルを測定することによって収得できる。５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素をプライマーダイマー増幅に使用した。

リアルタイムＰＣＲを各々のプライマーセット（３ｐｍｏｌｅのプライマー（配列番号：１及び１２）のうちの１つ及び１０ｐｍｏｌｅのプライマー（配列番号：２−１１及び１３−２２）のうちの１つ）、２μｌのＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ、及び５μｌの４Ｘマスターミックス［ｆｉｎａｌ、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ＵのＴａｑ ＤＮＡ重合酵素］を含有する最終体積２０μｌで遂行した。反応混合物を含有するチューブをリアルタイム熱循環機（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で５０℃で５分間置いて、９５℃で１５分間変成させ、９５℃で１０秒、５７℃で６０秒、７２℃で１０秒の５０サイクルを遂行した。シグナルの検出を各サイクルで５７℃で実施した。

前記実験から収得された増幅曲線が図３に示されている。

図３に示すように、非延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマーセット＃１−３及び＃１１−１３（図３の上部列参照）及び一本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマーセット＃４−６及び＃１４−１６（図３の中間列参照）の場合、プライマーダイマーに対する増幅曲線が観察されなかった。

一方、両鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマーセット＃７−１０及び＃１７−２０の場合、プライマーダイマーに対する増幅曲線が観察された（図３の下部列参照）。特に、プライマーダイマー内の相補的配列の長さが長いほどより早いダイマー増幅を引き起こした。

これら結果は３種類の類型のプライマーダイマーのうち、二本鎖延長可能なプライマーダイマーがダイマー増幅を促進するということと、プライマーダイマー内の４−７個の相補的なヌクレオチドの長さがダイマー形成の原因であるということを示す。

＜１−２＞ターゲット増幅に影響を及ぼすプライマーダイマー類型
ターゲット増幅に影響を及ぼす、即ちターゲット増幅を抑制するプライマーダイマーの類型を調べた。

ターゲット核酸配列を増幅するための正方向プライマー及び逆方向プライマー（ＵＰの場合、配列番号：２３及び１；ＮＧの場合、配列番号：１２及び２４）を先に製造した。その後で、正方向及び逆方向プライマーのうちの１つと各々の類型のプライマーダイマーを形成することができる追加のプライマー（配列番号：２−１１）を製造した。以後、前記正方向プライマー及び逆方向プライマーを前記追加のプライマーのうちの１つと組合せて多様なプライマーセット＃２１−４０を収得した。各々の類型のプライマーダイマーを形成することができる追加のプライマーのないプライマーセットを対照群として使用した。

本実施例に使われたプライマーセットが表３−１、表３−２、表４−１及び表４−２に提供されている。

本実施例で、ＴａｑＭａｎプローブをシグナル発生手段としてターゲット増幅を検出することに使用した。ターゲット核酸が存在する場合、ＴａｑＭａｎプローブは切断され標識された断片が放出される。各々のターゲット核酸配列に対するＴａｑＭａｎプローブをその５’−末端に蛍光レポーター分子とその３’−末端にクェンチャー分子で標識した（配列番号：２５及び２６）。増幅曲線は前記標識された断片からのシグナルを測定することによって収得できる。

本実施例に追加的に使われたプローブの配列が以下の表５に提供されている。

リアルタイムＰＣＲを各々のプライマーセット（３ｐｍｏｌｅの正方向プライマー及び３ｐｍｏｌｅの逆方向プライマー及び１０ｐｍｏｌｅのプライマーダイマーを形成するためのプライマー）、３ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブ、ターゲット核酸配列（０．１ｐｇのＵＰまたは０．１ｐｇのＮＧ）及び５μｌの４Ｘマスターミックス［ｆｉｎａｌ、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ＵのＴａｑ ＤＮＡ重合酵素］を含有する最終体積２０μｌで遂行した。反応混合物を含有するチューブをリアルタイム熱循環機（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で５０℃で５分間置いて、９５℃で１５分間変成させ、９５℃で１０秒、５７℃で６０秒、７２℃で１０秒の５０サイクルを遂行した。シグナルの検出を各サイクルで９５℃で実施した。

前記実験から収得された増幅曲線が図４に示されている。

図４に示すように、非延長可能なプライマーダイマー（プライマーセット＃２１−２３及び＃３１−３３；２番目の列）及び一本鎖延長可能なプライマーダイマー（プライマーセット＃２３−２６及び＃３４−３６；３番目の列）はターゲット核酸分子の増幅に有意に影響を及ぼさない一方、二本鎖延長可能なプライマーダイマー（プライマーセット＃２７−３０及び＃３７−４０；４番目の列）は対照群プライマーセットを使用したことと比較してターゲット核酸分子の増幅に有意に影響を及ぼす。

ターゲット増幅に対するプライマーダイマーの影響をよりよく理解するために、△Ｃ_Ｔ値を以下の通り計算した：
△Ｃ_Ｔ＝［プライマーダイマーを形成するためのプライマーを有する反応でのＣ_Ｔ］−［プライマーダイマーを形成するためのプライマーダイマーのない反応でのＣ_Ｔ］

前記Ｃ_Ｔ値は閾値５００を適用して収得しており；１．０より大きい△Ｃ_Ｔ値はターゲット核酸分子の増幅がプライマーダイマーにより抑制されるということを示すことと見なされた。

計算された△Ｃ_Ｔ値が以下の表６に提供されている。

表６に示したように、非延長可能なプライマーダイマー及び一本鎖延長可能なプライマーダイマーは１．０以下の△Ｃ_Ｔ値を引き起こしており、これは非延長可能なプライマーダイマー及び一本鎖延長可能なプライマーダイマーがターゲット増幅に有意に影響を及ぼさないということを示す。

一方、少なくとも６−ｍｅｒの相補的配列を有する二本鎖延長可能なプライマーダイマー（ＵＰ及びＮＧ全ての場合）は１．０を超過する△Ｃ_Ｔ値を引き起こしており、これは二本鎖延長可能なプライマーダイマー、特にダイマー内に少なくとも６個の相補的ヌクレオチドを有する二本鎖延長可能なプライマーダイマーがターゲット増幅を妨害するということを示す。

実施例＜１−１＞及び＜１−２＞の結果から、内部に５個以下の相補的ヌクレオチドを有する二本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成はダイマー増幅を促進するが、ターゲット増幅を有意に抑制せず；内部に６個以上の相補的なヌクレオチドを有する二本鎖延長可能なプライマーダイマーの形成はダイマー増幅を促進するだけでなく、ターゲット増幅を抑制すると結論を下す。

したがって、その３’−末端部分に６個以上の相補的ヌクレオチドを有する延長可能なプライマーダイマーによるターゲット増幅の抑制を防止するために、プライマーの３’−末端にある６番目またはその未満のヌクレオチド（５番目、４番目、３番目など）にユニバーサル塩基（例えば、デオキシイノシン）を配置することが効果的であると推定された。

実施例２：ダイマー増幅及びターゲット増幅に対する多様な位置にユニバーサル塩基ヌクレオチドを有するＵＢＰの影響の評価
＜２−１＞ダイマー形成に対する多様な位置にデオキシイノシンを有するＵＢＰの影響
本実施例では、二本鎖延長可能なプライマーダイマーの増幅に対する多様な位置にユニバーサル塩基を有するＵＢＰの影響を従来のプライマーと比較した。

本実験のために、二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成することと確認された２つの従来のプライマー対のうちの１つ（（ｉ）プライマーセット＃９でＵＰ−Ｒ１（配列番号：１；プライマーセット＃１９でＮＧ−Ｆ４（配列番号：１２））を変形して多様なＵＢＰを製造した。具体的に、ＵＢＰをその３’−末端の２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、及び８番目の位置にある自然発生ヌクレオチドをデオキシイノシンに置換して、その３’−末端の２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、及び８番目の位置に１つのデオキシイノシンを含有するように製造した。

２つの従来のプライマー対のうちの１つ（ＵＰ−Ｃ−３（配列番号：１０）またはＮＧ−Ｃ−３（配列番号：２３））をＵＢＰのうちの１つと組合せて多様なプライマーセット（プライマーセット＃９Ａ−９Ｇ及び１９Ａ−１９Ｇと称される）を収得した。

本願に使われたプライマーセットが以下の表７に提供されている。

リアルタイムＰＣＲを各々のプライマーセット（３ｐｍｏｌｅの従来のプライマーＵＰ−Ｒ１（配列番号：２）及びＵＢＰ（配列番号：２７−３３）のうちの１つ及び１０ｐｍｏｌｅのＵＰ−Ｃ−３（配列番号：１０）、または３ｐｍｏｌｅの従来のプライマーＮＧ−Ｆ４（配列番号：１３）またはＵＢＰ（配列番号：３４−４０）のうちの１つ及び１０ｐｍｏｌｅのＮＧ−Ｃ−３（配列番号：２１））、２μｌのＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ、及び５μｌの４Ｘマスターミックス［ｆｉｎａｌ、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ＵのＴａｑ ＤＮＡ重合酵素］を含有する最終体積２０μｌで遂行した。反応混合物を含有するチューブをリアルタイム熱循環機（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で５０℃で５分間置いて、９５℃で１５分間変成させ、９５℃で１０秒、５７℃で６０秒、７２℃で１０秒の５０サイクルを遂行した。シグナルの検出を各サイクルで５７℃で実施した。

前記収得されたプライマーダイマーに対する増幅曲線が表５Ａ及び５Ｂに示されている。

図５Ａ及び５Ｂに示すように、プライマーダイマーに対する増幅曲線はプライマーセット＃９Ａ−９Ｅ及び＃１９Ａ−１９Ｅ（２番目、３番目、４番目、５番目及び６番目の位置にデオキシイノシンを有するＵＢＰ含み）の場合、観察または生成されない一方、プライマーダイマーに対する増幅曲線はプライマーセット＃１９Ｆ及び＃１９Ｇ（７番目及び８番目の位置にデオキシイノシンを有するＵＢＰ含み）の場合、観察された。

プライマーダイマー形成の抑制に対するＵＢＰの影響をよりよく理解するために、△Ｃ_Ｔ値を以下の通り計算した：
△Ｃ_Ｔ＝［ＵＢＰ含有プライマーセットに対するＣ_Ｔ］−［従来のプライマーセットに対するＣ_Ｔ］

前記Ｃ_Ｔ値は閾値５００を適用して収得しており；１．０より大きい△Ｃ_Ｔ値はダイマー増幅がＵＢＰにより抑制されるということを示すことと見なされた。

計算された△Ｃ_Ｔ値が以下の表８に提供されている。

表８に示したように、ダイマー増幅はプライマーセット＃９Ａ−９Ｅ及び＃１９Ａ−１９Ｅ（２番目、３番目、４番目、５番目、及び６番目の位置にデオキシイノシンを有するＵＢＰ含み）の場合は抑制されたが、プライマーセット＃９Ｆ、＃９Ｇ、＃１９Ｆ、及び＃１９Ｇ（７番目及び８番目の位置にデオキシイノシンを有するＵＢＰ含み）の場合は抑制されなかった。

この結果はその３’−末端の２番目乃至６番目の位置にデオキシイノシンを含有するＵＢＰがダイマー増幅を防止することに効果的であることを立証する。

＜２−２＞ターゲット増幅に対する多様な位置でデオキシイノシンを有するＵＢＰの影響
本実施例では、多様な位置にユニバーサル塩基を有するＵＢＰがターゲット増幅に及ぼす影響を従来のプライマーと比較した。

本実験のために、ターゲット核酸分子を増幅するための２つの従来のプライマー（ＵＰの場合はプライマーセット＃２９またはＮＧの場合はプライマーセット＃３９）及び二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するための１つのプライマーを先に製造した。次に、ターゲット核酸分子を増幅するための２つの従来のプライマーのうちの１つを変形して多様なＵＢＰを製造した。ＵＢＰは実施例＜２−１＞のように多様な位置にデオキシイノシンを含有するように製造した。

その結果、ターゲット核酸分子を増幅するための従来のプライマー及びＵＢＰを二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマーと組合せて多様なプライマーセットを収得した。

ＴａｑＭａｎリアルタイムプローブ（配列番号：２５及び２６）を増幅の検出に追加で使用した。

使われたプライマーセットが以下の表９−１及び表９−２に提供されている。

具体的に、リアルタイムＰＣＲを各々のプライマーセット（ＵＰ−ターゲット増幅のための３ｐｍｏｌｅの従来の正方向プライマーＵＰ−Ｆ１（配列番号：２３）及び３ｐｍｏｌｅの従来の逆方向プライマーＵＰ−Ｒ１（配列番号：１）及びＵＢＰ（配列番号：２７−３３）のうちの１つ、及び１０ｐｍｏｌｅの二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマー（配列番号：１０）、またはＮＧ−ターゲット増幅のための３ｐｍｏｌｅの従来の逆方向プライマーＮＧ−Ｒ２（配列番号：１４）及び３ｐｍｏｌｅの従来の正方向プライマーＮＧ−Ｆ４（配列番号：１３）及びＵＢＰ（配列番号：３４−４０）のうちの１つ、及び１０ｐｍｏｌｅの二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマー（配列番号：２１））、ターゲット核酸配列（０．１ｐｇのＵＰまたは０．１ｐｇのＮＧ）、及び５μｌの４Ｘマスターミックス［ｆｉｎａｌ、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ＵのＴａｑ ＤＮＡ重合酵素］を含有する最終体積２０μｌで遂行した。反応混合物を含有するチューブをリアルタイム熱循環機（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で５０℃で５分間置いて、９５℃で１５分間変成させ、９５℃で１０秒、５７℃で６０秒、７２℃で１０秒の５０サイクルを遂行した。シグナルの検出を各サイクルで９５℃で実施した。

比較のために、リアルタイムＰＣＲを二本鎖延長可能なプライマーダイマーを形成するためのプライマー（ＵＰ−Ｃ−３（配列番号：１０）またはＮＧ−Ｃ−３（配列番号：２１））のないプライマーセットを用いて遂行した。

各々のプライマーセットから収得された増幅曲線が図６Ａ及び６Ｂに示されている。図面で、“−Ｘ−”はプライマーダイマーを形成するためのプライマー（ＵＰ−Ｃ−３またはＮＧ−Ｃ−３）のないプライマーセットに対する結果を示し；“−Ｏ−”はプライマーダイマーを形成するためのプライマー（ＵＰ−Ｃ−３またはＮＧ−Ｃ−３）を有するプライマーセットに対する結果を示す。閾値１５０及び４００を適用して各々ＵＰ及びＮＧのＣ_Ｔ値を計算した後、△Ｃ_Ｔ値を以下の通り計算した：
△Ｃ_Ｔ＝［プライマーダイマーを形成するためのプライマーの存在下に反応でのＣ_Ｔ］−［プライマーダイマーを形成するためのプライマーの不在下に反応でのＣ_Ｔ］

計算された△Ｃ_Ｔ値が以下の表１０及び１１に提供されている。

プライマーダイマーを形成するためのプライマーの不在下に増幅曲線の検出及び１．０以下の△Ｃ_Ｔ値はターゲット核酸配列がプライマーダイマーを形成するためのプライマーの存在にかかわらず成功的に増幅されることを示す。

表１０及び表１１に示すように、プライマーセット＃２９及び＃３９はプライマーダイマーを形成するためのプライマーの不在下にＵＰ及びＮＧ全てを増幅することができたが、プライマーダイマーを形成するためのプライマーの存在下にＵＰ及びＮＧを増幅できなかった。

一方、プライマーセット＃２９Ａ及び＃３９Ａ（各々２番目の位置にデオキシイノシンを有するＵＢＰ含み）はプライマーダイマーを形成するためのプライマーの不在下にもＵＰ及びＮＧを増幅できなかったが；プライマーセット＃２９Ｂ−２９Ｅ及び３９Ｂ−３９Ｅ（各々３番目、４番目、５番目、または６番目の位置にデオキシイノシンを有するＵＢＰ含み）はプライマーダイマーを形成するためのプライマーの存在または不在下にＵＰ及びＮＧを増幅することができ；プライマーセット＃２９Ｆ−２９Ｇ及び＃３９Ｆ−３９Ｇ（各々７番目または８番目の位置にデオキシイノシンを有するＵＢＰ含み）はプライマーダイマーを形成するためのプライマーの不在下にＵＰ及びＮＧを成功的に増幅したが、プライマーダイマーを形成するためのプライマーの存在下にＵＰ及びＮＧを増幅できなかった。

前記結果は内部の３’−末端の３番目乃至６番目の位置にデオキシイノシンを有するＵＢＰがターゲット増幅に有意に影響を及ぼさないということを立証する。

総合すれば、内部の３’−末端から３番目乃至６番目の位置にユニバーサル塩基ヌクレオチドを含有するＵＢＰの使用がプライマーダイマー形成を抑制することによってターゲット増幅を改善できることが分かる。

実施例３：ＵＢＰの効果の検証
本発明者らはプライマー内の３’−末端から３番目乃至６番目のヌクレオチドにユニバーサル塩基を含有する本発明のＵＢＰがマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を実際的に抑制するかを検証した。

＜３−１＞プライマーダイマー形成を抑制するに当たってＵＢＰの有用性
本実験のために、３種類の相異する類型のプライマー混合物を以下のように製造した：（ｉ）従来のプライマー混合物；（ｉｉ）第１のＵＢＰ混合物；及び（ｉｉｉ）第２のＵＢＰ混合物。

前記プライマー混合物（ｉ）−（ｉｉｉ）の各々は４個のターゲット核酸配列であるＵｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ（ＵＵ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ＭＧ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）、及びＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のゲノムＤＮＡを増幅するための４個のプライマー対で構成されており、各々のプライマー対は正方向プライマー及び逆方向プライマーを含んでいる。

具体的に、従来のプライマー混合物は配列内にデオキシイノシンを含有しない８個の従来のプライマーで構成されており、対照群として使われた。第１のＵＢＰ混合物は４個の正方向ＵＢＰ（１つのデオキシイノシン含有）及び４個の逆方向従来のプライマーで構成されており、第２のＵＢＰ混合物は４個の正方向ＵＢＰ（２つのデオキシイノシン含有）及び４個の逆方向従来のプライマーで構成された。ＵＢＰは従来のプライマー内の１つまたは２つの自然塩基をデオキシイノシンに置換することによって製造された。

従来のプライマー混合物、第１のＵＢＰプライマー混合物、及び第２のＵＢＰプライマー混合物内のプライマーの配列が以下の表１２に提供されている。

（Ｉ：デオキシイノシン）

具体的に、リアルタイムＰＣＲ反応を従来のプライマー混合物（配列番号：４１−４８）、第１のＵＢＰ混合物（配列番号：４９、４２、５０、４４、５１、４６、５２、及び４８）または第２のＵＢＰプライマー（配列番号：５３、４２、５４、４４、５５、４６、５６、及び４８）内の各々のプライマー３ｐｍｏｌｅ、２μｌのＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ、及び５μｌの４Ｘマスターミックス［ｆｉｎａｌ、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ＵのＴａｑ ＤＮＡ重合酵素］を含有する最終体積２０μｌで遂行した。反応混合物を含有するチューブをリアルタイム熱循環機（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で５０℃で５分間置いて、９５℃で１５分間変成させ、９５℃で１０秒、５７℃で６０秒、７２℃で１０秒の５０サイクルを遂行した。シグナルの検出を各サイクルで５７℃で実施した。

前記実験から収得された増幅曲線が図７に示されている。以後、ダイマー増幅程度を評価するために、閾値５００を適用してサイクル閾値（Ｃ_Ｔ）を計算した。

その結果、第１のＵＢＰ混合物、第２のＵＢＰ混合物に対するＣ_Ｔ値（即ち、各々４０．３６及び４１．２）は従来のプライマー混合物に対するＣ_Ｔ値（即ち、２２．７１）より高いことと示された。

前記結果は本発明のＵＢＰ、特にプライマー内の３’−末端から３番目乃至６番目のヌクレオチドにユニバーサル塩基を含有する本発明のＵＢＰの使用がマルチプレックス増幅反応で従来のプライマーと比較してダイマー形成及び増幅を効果的に抑制できることを示す。

＜３−２＞ターゲット増幅を増加させるに当たってＵＢＰの有用性
本実施例では、ＴａｑＭａｎプローブをシグナル発生手段として適用して多重ターゲット増幅を検出した。

本実施例に追加的に使われたプローブの配列が以下の表１３に提供されている。

具体的に、リアルタイムＰＣＲ反応を従来のプライマー混合物（配列番号：４１−４８）、第１のＵＢＰ混合物（配列番号：４９、４２、５０、４４、５１、４６、５２、及び４８）または第２のＵＢＰプライマー（配列番号：５３、４２、５４、４４、５５、４６、５６、及び４８）内の各々のプライマー３ｐｍｏｌｅ、３ｐｍｏｌｅのＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：５６−５９）、４個のターゲット核酸配列（０（ＮＴＣ））、０．１、１または１０ｐｇの各々のゲノムＤＮＡ）、及び５μｌの４Ｘマスターミックス［ｆｉｎａｌ、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ＵのＴａｑ ＤＮＡ重合酵素］を含有する最終体積２０μｌで遂行した。反応混合物を含有するチューブをリアルタイム熱循環機（ＣＦＸ９６、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で５０℃で５分間置いて、９５℃で１５分間変成させ、９５℃で１０秒、５７℃で６０秒、７２℃で１０秒の５０サイクルを遂行した。シグナルの検出を各サイクルで９５℃で実施した。

前記実験から収得された増幅曲線が図８に示されている。図８に示すように、従来のプライマー混合物は多様な濃度の４個のターゲット核酸配列の大部分を増幅できなかった。一方、第１のＵＢＰ混合物及び第２のＵＢＰ混合物全ては全てのターゲット核酸配列を増幅することができた。

以後、使われたプライマー混合物の間のターゲット増幅効率を比較するために、閾値１５０、１００、４００、及び５０を各々適用してＵＵ、ＭＧ、ＮＧ、及びＣＴのＣ_Ｔ値を計算した。

結果が以下の表１４に提供されている。

表１４に示したように、従来のプライマー混合物は多様な濃度の１２個のターゲット核酸配列のうち、幾つかのターゲット核酸配列、即ち１０ｐｇのＵＵ、１０ｐｇ、１ｐｇ、及び０、１ｐｇのＮＧ、及び１０ｐｇのＣＴを有意に増幅することができた。一方、各々本発明のＵＢＰを含有する第１のＵＢＰ混合物及び第２のＵＢＰ混合物は１２個のターゲット核酸配列を全て有意に増幅することができた。

本発明の方法がターゲット増幅効率に及ぼす影響を追加で評価するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）データの分析のための従来のプログラムであるＬｉｎＲｅｇＰＣＲ（バージョン２０１７．１）を使用して増幅効率を計算した。

前記プログラムは入力原始データを使用して増幅効率を計算し、これを出力する（出力された増幅効率はパーセント基準に変換できる）。本実施例で、従来のプライマー混合物、第１のＵＢＰ混合物、及び第２のＵＢＰ混合物のうちの１つを使用した各々の反応に対する増幅効率を前記プログラムにより収得した後、第１のＵＢＰ混合物または第２のＵＢＰ混合物の効率の増加率を以下のように計算した。

（式２）
増幅増加率（％）＝［（ＵＢＰを使用した反応の効率／従来のプライマーを使用した反応の効率）−１］＊１００

結果が以下の表１５に提供されている。

表１５に示したように、第１のＵＢＰ混合物及び第２のＵＢＰ混合物を使用した反応のうちの一部は従来のプライマー混合物より著しい効率の増加率を示したが（“増加率”コラムで“＞＞１００％”と表示される）、従来のプライマー混合物を使用した反応の場合、増幅効率が決定されなかったが、第１のＵＢＰ混合物及び第２のＵＢＰ混合物を使用した反応の場合、決定されたためである。

また、第１のＵＢＰ混合物及び第２のＵＢＰ混合物を使用した反応のうちの一部は従来のプライマー混合物を使用した反応と比較して３．３％−５９．９％の効率の増加率を示した。

前記結果は本発明のＵＢＰ、特にプライマー内の３’−末端から３番目乃至６番目のヌクレオチドにユニバーサル塩基を含有する本発明のＵＢＰの使用がマルチプレックス増幅反応で従来のプライマーと比較してターゲット増幅効率を改善させることができることを示す。

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に当たってこのような具体的な技術は単に好ましい具現例であり、これに本発明の範囲が制限されるのでないことは明らかである。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物により定義されるということができる。

Claims (31)

1. 次のステップを含む、マルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅する方法：
   （ａ）各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対を製造するステップ；前記各々のプライマー対は該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み；前記少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマーはユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）であり；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲に位置し、前記少なくとも３個のプライマー対を使用したマルチプレックス増幅反応はプライマーダイマーの形成を減少させ、ターゲット核酸分子の増幅産物を生成し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的であり；
   （ｂ）前記少なくとも３個のプライマー対を使用してプライマーアニーリング、プライマー延長及び変性の少なくとも２サイクルを含むマルチプレックス増幅反応を実施するステップ；前記マルチプレックス増幅反応はプライマーダイマーの形成を減少させ、ターゲット核酸分子の増幅産物を生成する。
2. 前記コア領域はＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至５番目のヌクレオチド範囲であり、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある６番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記少なくとも１つのプライマー対で２つのプライマーはＵＢＰであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
4. 各々のプライマー対で１つまたは２つのプライマーはＵＢＰであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 使われたプライマーの総数の少なくとも５０％はＵＢＰであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 前記ＵＢＰのうちの少なくとも１つは縮退性塩基を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
7. 少なくとも５個のプライマー対が少なくとも５個のターゲット核酸分子を増幅することに使われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. 前記マルチプレックス増幅反応でプライマーアニーリングは５０℃以上で実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. 前記方法は前記少なくとも１つのＵＢＰの代りに前記ターゲット核酸配列に相補的な自然発生ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ（Ｕ））を含有するプライマーを使用するより少なくとも３％高いターゲット増幅効率を示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
10. ターゲット核酸分子の不在下にＵＢＰを含有するプライマー対を使用した反応から収得されたＣｔ値はターゲット核酸分子の不在下に従来のプライマーで構成されたプライマー対を使用したものと比較して１以上増加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
11. 前記マルチプレックス増幅反応は前記ターゲット核酸分子の存在を検出するために少なくとも３個の追加のプローブの存在下に実施され；前記少なくとも３個のプローブの各々は増幅されるターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み、正方向プライマー及び逆方向プライマーの間に位置することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
12. 前記少なくとも３個のプローブはユニバーサル塩基ヌクレオチドを有しないことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドは、デオキシイノシン、イノシン、７−ジアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ ３−ニトロピロール、２’−Ｆ ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−ベータ−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロピロール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ ５−ニトロインドール、２’−Ｆ ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホラミダイト−５−ニトロインドール、ホスホラミダイト−ネブラリン、ホスホラミダイト−イノシン、ホスホラミダイト−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホラミダイト−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及びその組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
14. 前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドは、デオキシイノシン、イノシン、またはその組合せを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. 次のステップを含む少なくとも３個のターゲット核酸分子に対するマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマー形成を減少させる方法：
    （ａ）増幅される少なくとも３個のターゲット核酸分子を決定するステップ；
    （ｂ）各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対のヌクレオチド配列を決定するステップ；前記各々のプライマーは該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み；
    （ｃ）前記少なくとも３個のプライマー対のうち、少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマー内の１−３個のヌクレオチドをユニバーサル塩基ヌクレオチドに置換してユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）を製造するステップ；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドへの置換はプライマーダイマー形成を抑制し；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置して、前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的であり；
    （ｄ）前記少なくとも３個のプライマー対を用いてプライマーアニーリング、プライマー延長及び変性の少なくとも２サイクルを含むマルチプレックス増幅反応を実施するステップ；前記マルチプレックス増幅反応はプライマーダイマーの形成を減少させ、ターゲット核酸分子の増幅産物を生成する。
16. 前記コア領域はＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至５番目のヌクレオチド範囲であることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 前記少なくとも１つのプライマー対で２つのプライマーはＵＢＰであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
18. 各々のプライマー対で１つまたは２つのプライマーはＵＢＰであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
19. 使われたプライマーの総数の少なくとも５０％はＵＢＰであることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
20. 前記ＵＢＰのうちの少なくとも１つは縮退性塩基を含まないことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
21. 少なくとも５個のプライマー対が少なくとも５個のターゲット核酸分子を増幅することに使われることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
22. 前記マルチプレックス増幅反応でプライマーアニーリングは５０℃以上で実施されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
23. 前記方法は前記少なくとも１つのＵＢＰの代りに前記ターゲット核酸配列に相補的な自然発生ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ（Ｕ））を含有するプライマーを使用するより少なくとも３％高いターゲット増幅効率を示すことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
24. ターゲット核酸分子の不在下にＵＢＰを含有するプライマー対を使用した反応から収得されたＣｔ値はターゲット核酸分子の不在下に従来のプライマーで構成されたプライマー対を使用したものと比較して１以上増加することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
25. 前記マルチプレックス増幅反応は前記ターゲット核酸分子の存在を検出するために少なくとも３個の追加のプローブの存在下に実施され；前記少なくとも３個のプローブの各々は増幅されるターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み、正方向プライマー及び逆方向プライマーの間に位置することを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
26. 前記少なくとも３個のプローブはユニバーサル塩基ヌクレオチドを有しないことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
27. 前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドは、デオキシイノシン、イノシン、７−ジアザ−２’−デオキシイノシン、２−アザ−２’−デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−Ｆイノシン、デオキシ３−ニトロピロール、３−ニトロピロール、２’−ＯＭｅ ３−ニトロピロール、２’−Ｆ ３−ニトロピロール、１−（２’−デオキシ−ベータ−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、デオキシ５−ニトロピロール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ ５−ニトロインドール、２’−Ｆ ５−ニトロインドール、デオキシ４−ニトロベンズイミダゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、デオキシ４−アミノベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、デオキシネブラリン、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ ４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−５−イントロインドール、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンズイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルフォリノ−５−ニトロインドール、モルフォリノ−ネブラリン、モルフォリノ−イノシン、モルフォリノ−４−ニトロベンズイミダゾール、モルフォリノ−３−ニトロピロール、ホスホラミダイト−５−ニトロインドール、ホスホラミダイト−ネブラリン、ホスホラミダイト−イノシン、ホスホラミダイト−４−ニトロベンズイミダゾール、ホスホラミダイト−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロベンズイミダゾール、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロール、及びその組合せからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
28. 前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドは、デオキシイノシン、イノシン、またはその組合せを含むことを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
29. 次を含む、マルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するためのキット：
    （ａ）各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対；各々のプライマーは該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み；少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマーはユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）であり；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的であり；
    （ｂ）核酸重合酵素。
30. 次を含む、請求項１の方法の実施でマルチプレックス増幅反応でプライマーダイマーの形成を減少させ、少なくとも３個のターゲット核酸分子を増幅するためのキットの用途：
    （ａ）各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対；各々のプライマーは該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み；少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマーはユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）であり；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的であり；
    （ｂ）核酸重合酵素。
31. 以下を遂行するように構成された命令を含むコンピュータ読取可能な格納媒体：
    各々正方向プライマー及び逆方向プライマーを含む、少なくとも３個のプライマー対をデザインすること；各々のプライマーは該当するターゲット核酸分子に対する混成化ヌクレオチド配列を含み；少なくとも１つのプライマー対で１つまたは２つのプライマーはユニバーサル塩基プライマー（ＵＢＰ）であり；前記ＵＢＰは１−３個のユニバーサル塩基ヌクレオチドを有し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドのうちの１つまたは２つはＵＢＰの３’−末端にある３番目のヌクレオチド乃至６番目のヌクレオチド範囲のコア領域に位置し、残りはＵＢＰの５’−末端にある４番目のヌクレオチド乃至ＵＢＰの３’−末端にある７番目のヌクレオチドの範囲の領域に位置し；前記ユニバーサル塩基ヌクレオチドはＵＢＰで非連続的である。