ES2547053T3 - Enriquecimiento de una secuencia diana - Google Patents

Abstract

Un método para enriquecer una secuencia diana en una mezcla de reacción, comprendiendo dicho método: a. someter una mezcla de reacción sospechosa de tener un dúplex de secuencia diana y un dúplex de secuencia de referencia a una primera temperatura de desnaturalización que está por encima de la temperatura de fusión (Tm) del dúplex de la secuencia de referencia y del dúplex de la secuencia diana, para permitir la desnaturalización de dicho dúplex de secuencia diana y de dicho dúplex de secuencia de referencia, en el que dicho dúplex de secuencia diana comprende una o más inserciones, supresiones o alteraciones y difiere en al menos un nucleótido de dicho dúplex de secuencia de referencia, y en el que dicha secuencia diana es al menos 50% homóloga a dicho dúplex de secuencia de referencia y es amplificable por el mismo par de cebadores que dicho dúplex de secuencia de referencia, y en el que la secuencia diana es menos predominante en la mezcla de reacción que la secuencia de referencia; b. reducir la temperatura de la mezcla de reacción hasta una temperatura de hibridación para permitir la formación de dúplex de hebra diana/hebra de referencia y evitar la unión de dicho par de cebadores a las hebras diana y de referencia desnaturalizadas en la mezcla de reacción, en el que la temperatura de hibridación está por debajo de la temperatura crítica (Tc) y por encima de la temperatura de hibridación del cebador; c. incrementar dicha mezcla de reacción de amplificación hasta una temperatura crítica (Tc) que está por debajo de la Tm de dicho dúplex de secuencia de referencia, para permitir la desnaturalización preferente de dichos dúplex de la etapa (b) para formar hebras diana y de referencia desnaturalizadas; d. reducir la temperatura de la mezcla de reacción hasta una temperatura de hibridación del cebador para permitir que dicho par de cebadores se hibride a dichas hebras diana y de referencia; y e. alargar dicho par de cebadores para enriquecer dicha secuencia diana con respecto a dicha secuencia de referencia; en el que el método se repite durante dos o más ciclos.

Description

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En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para enriquecer una secuencia diana en una muestra de ácido nucleico sospechosa de tener secuencias diana y de referencia. Las secuencias de referencia y diana se pueden amplificar antes de usarlas en el presente método. Esto es, las secuencias de referencia y diana de interés se pueden amplificar a partir de un molde genómico en una reacción de PCR antes de usarlas en el presente método. Una alícuota procedente de esta reacción de PCR se transfiere entonces para uso en el método de enriquecimiento selectivo. Como alternativa, las secuencias de referencia y diana no necesitan ser sometidas a una primera reacción de PCR sino que se pueden usar en su forma nativa (por ejemplo, ADN genómico) en el método de enriquecimiento selectivo. Las secuencias diana y de referencia se pueden obtener a partir de cualquier secuencia de ácido nucleico, incluyendo ADN genómico, ADNc, ADN vírico, ADN de mamífero, ADN fetal, o ADN bacteriano. Mientras que la secuencia de referencia es generalmente el alelo de tipo salvaje y la secuencia diana es el alelo mutante, lo contrario también puede ser cierto. El alelo mutante puede incluir una cualquiera o más supresiones, inserciones o alteraciones nucleotídicas. En algunas realizaciones, el alelo mutante es una mutación somática. En otras realizaciones, la secuencia diana es ADN metilado, mientras que la secuencia de referencia es ADN no metilado. Como alternativa, la secuencia diana es ADN no metilado, mientras que la secuencia de referencia es ADN metilado. Los cebadores usados en el presente método se diseñan generalmente para producir productos de amplificación de las secuencias de referencia y diana de alrededor de 17 a 1000 bases, más preferiblemente alrededor de 25 a 500 bases, y lo más preferible alrededor de 50 a 100 bases de tamaño.

El método incluye someter la mezcla de reacción de amplificación a una primera temperatura de desnaturalización que está por encima de la temperatura de fusión “Tm” de una secuencia de referencia. La Tm de un ácido nucleico se puede determinar mediante experimentación, o se puede estimar por cálculo. El experto estará bien al tanto de numerosos métodos bien conocidos para determinar la Tm de un ácido nucleico, algunos de los cuales se describen aquí. La primera temperatura de desnaturalización se fija según procedimientos estándar usados en PCR. De este modo, la primera temperatura de desnaturalización debería de ser suficientemente alta para permitir la desnaturalización completa de las secuencias diana y de referencia (por ejemplo, 96ºC). En una realización, la primera temperatura de desnaturalización está alrededor de 1ºC a 30ºC por encima de la Tm de la secuencia de referencia, más preferiblemente la Tm de la secuencia de referencia está alrededor de 5ºC a 20ºC por encima de la Tm de la secuencia de referencia.

A continuación, la temperatura de la mezcla de reacción de amplificación se disminuye, permitiendo que las secuencias diana y secuencias de referencia se hibriden.

Esta temperatura de hibridación o temperatura intermedia (estando la temperatura por debajo de la primera temperatura de desnaturalización y Tc pero por encima de la temperatura de hibridación/alargamiento del cebador, por ejemplo alrededor de 60ºC a 80ºC) está por encima de la Tm del par de cebadores, y de este modo permite que las secuencias diana y de referencia se hibriden mientras evita la unión del par de cebadores a las secuencias diana y/o de referencia. Esta etapa de hibridación da como resultado la formación de dúplex de hibridación de secuencias diana-diana, referencia-referencia y diana-referencia bicatenarias. Los dúplex de hibridación de diana-referencia se desnaturalizan entonces preferentemente incrementando la temperatura de la mezcla de reacción hasta la Tc. La Tc

o temperatura crítica está por debajo de la Tm de la secuencia de referencia, y se puede determinar mediante los métodos descritos aquí. En una realización, la Tc está por debajo de alrededor de 0,3ºC-5ºC, y más preferiblemente por debajo de alrededor de 0,5ºC a 1,5ºC de la Tm de la secuencia de referencia. Generalmente, la Tc será alrededor de 70-90ºC. Los dúplex de hibridación de diana-diana también se pueden desnaturalizar preferentemente si la secuencia diana tiene una secuencia nucleotídica que da como resultado una menor Tm en comparación con la secuencia de referencia. A la Tc, los dúplex de secuencia diana-referencia (y los dúplex de secuencia diana-diana solamente si tienen una menor Tm que la secuencia de referencia) están sustancialmente desnaturalizados, mientras que los dúplex de diana-diana (si tienen una Tm igual o mayor que la Tm de la secuencia de referencia) y los dúplex de secuencia de referencia-referencia están sustancialmente no desnaturalizados. “Sustancialmente” significa al menos 60%, preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferible al menos 98% en una forma desnaturalizada o no desnaturalizada. La Tc se aplica generalmente de alrededor de 1 segundo a 5 minutos, más preferiblemente 2 segundos a 1 minuto, y lo más preferible 5 segundos a 30 segundos.

Tras la desnaturalización preferente de los dúplex de hibridación de secuencias diana-referencia y/o diana-diana, la temperatura de la mezcla de reacción se reduce para permitir que un par de cebadores se hibride a la secuencia diana. Los cebadores hibridados se alargan entonces mediante una polimerasa de ácido nucleico, enriqueciendo así la secuencia diana con respecto a la secuencia de referencia en la muestra.

Las etapas del método se repiten generalmente durante múltiples ciclos a fin de obtener una amplificación suficiente de las secuencias diana y de referencia. En una realización, las etapas del método se repiten durante 5-40 ciclos, y más preferiblemente 10-30 ciclos. El número óptimo de ciclos se puede determinar por una persona experta normal en la técnica. Preferiblemente, los presentes métodos se llevan a cabo en un dispositivo de PCR, más preferiblemente en condiciones de reacción en tiempo real en un dispositivo de PCR de detección en tiempo real, tal como el dispositivo de PCR en tiempo real SMARTCYCLER (Cepheid, Sunnyvale, CA) y el dispositivo de PCR en tiempo real Mx3005P (Stratagene, La Jolla, CA). En esta realización, la mezcla de reacción puede incluir un agente de detección de ácido nucleico (por ejemplo, un colorante de detección de ácido nucleico tal como el colorante SYBR Green o el colorante LC-Green, o una sonda acoplada de forma operativa a un colorante fluorescente) para

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A continuación, la temperatura de la mezcla de reacción de amplificación se disminuye, permitiendo que las secuencias diana y las secuencias de referencia se hibriden (Fig. 1B). Esta etapa de hibridación da como resultado la formación de dúplex de hibridación de secuencias diana-diana, referencia-referencia y diana-referencia. La determinación de una temperatura de hibridación es bien conocida por el experto. Los cebadores de la PCR usados en el método se diseñan para que tengan una Tm que evita que se unan a las secuencias diana y de referencia a esta temperatura intermedia, de manera que no interfieran con la hibridación cruzada de las secuencias mutante (diana) y de tipo salvaje (de referencia). Debido a las mutaciones en la secuencia diana, la mayoría de las secuencias diana terminan en una estructura mal apareada con la secuencia de referencia, y de este modo tienen una menor temperatura de fusión, cuando forman un heterodúplex con la secuencia de referencia, que los homodúplex de referencia/referencia completamente apareados.

Los dúplex de hibridación de diana-referencia se desnaturalizan entonces preferentemente incrementando la temperatura de la mezcla de reacción hasta la Tc (Fig. 1C). La Tc o temperatura crítica está por debajo de la Tm de la secuencia de referencia, y se puede determinar mediante los métodos descritos aquí. En una realización, la Tc está alrededor de 0,3ºC-5ºC por debajo de la Tm de la secuencia de referencia, y más preferiblemente alrededor de 0,5ºC a 1,5ºC por debajo de de la Tm de la secuencia de referencia. Generalmente, la Tc será alrededor de 70-90ºC. Los dúplex de hibridación de diana-diana también se pueden desnaturalizar preferentemente si la secuencia diana tiene una secuencia nucleotídica que da como resultado una menor Tm en comparación con la secuencia de referencia. La Tc se aplica generalmente de alrededor de 1 segundo a 5 minutos, más preferiblemente 2 segundos a 1 minuto, y lo más preferible 5 segundos a 30 segundos.

Después de la desnaturalización preferente de los dúplex de hibridación de las secuencias diana-referencia y/o diana-diana, la temperatura de la mezcla de reacción se reduce para permitir que uno o más cebadores se hibriden a la secuencia diana (Fig. 1D). Los cebadores hibridados se alargan entonces mediante una polimerasa de ácido nucleico, enriqueciendo así la secuencia diana en la población de ácidos nucleicos contenida en la muestra.

Las etapas del método se repiten generalmente durante múltiples ciclos a fin de obtener la suficiente amplificación de las secuencias diana y de referencia. En una realización, las etapas del método se repiten durante 5-40 ciclos, y más preferiblemente 10-30 ciclos. El número óptimo de ciclos se puede determinar por una persona de pericia normal en la técnica. Preferiblemente, los presentes métodos se llevan a cabo en un dispositivo de PCR, más preferiblemente en condiciones de reacción en tiempo real en un dispositivo de PCR de detección en tiempo real, tal como el dispositivo de PCR en tiempo real SMARTCYCLER (Cepheid, Sunnyvale, CA) y el dispositivo de PCR en tiempo real Mx3005P (Stratagene, La Jolla, CA). En esta realización, la mezcla de reacción puede incluir un agente de detección de ácido nucleico (por ejemplo, un colorante de detección de ácido nucleico tal como el colorante SYBR Green o el colorante LC-Green, o una sonda acoplada de forma operativa a un colorante fluorescente) para cuantificar y/o monitorizar los productos de amplificación de la reacción. Una vez que el enriquecimiento de la secuencia diana está terminado, la muestra se puede procesar adicionalmente, por ejemplo se puede someter a una reacción de secuenciación. Los alelos enriquecidos se pueden procesar adicionalmente mediante una variedad de procedimientos que incluyen: MALDI-TOF, fusión de HR, secuenciación didesoxi, secuenciación de una sola molécula, pirosecuenciación, RFLP, PCR digital y PCR cuantitativa.

Llevando a cabo el método de enriquecimiento en cada ciclo de PCR, la cantidad de secuencias mutantes (secuencia diana) se enriquece gradualmente con respecto a las secuencias (secuencia de referencia). Mediante el método se enriquecen tanto mutaciones homocigotas como heterocigotas. El enriquecimiento en unas 10-60 veces de secuencias que contienen mutaciones con respecto a la realización de la PCR normal a una temperatura de desnaturalización de 94ºC es habitual. A una temperatura de desnaturalización crítica (Tc) dada, el enriquecimiento de las mutaciones se produce simultáneamente en todas las posiciones de la secuencia, no obstante con una eficiencia diferente dependiendo del contexto de la secuencia y del tamaño global del amplicón de PCR. Tanto la temperatura de desnaturalización crítica Tc como el enriquecimiento anticipado en cualquier posición son predecibles usando el software de fusión de ADN apropiado, y se pueden verificar experimentalmente. De este modo, dependiendo de dónde está la mutación, se puede anticipar un enriquecimiento en cierto modo diferente; sin embargo, en todos los casos se logra un enriquecimiento sustancial y por lo tanto mejoran los límites de detección de ensayos aguas abajo, por ejemplo las reacciones de secuenciación.

La Figura 2 ilustra una realización del método para enriquecer una secuencia diana sometiendo una mezcla de reacción de amplificación a múltiples etapas alternas de hibridación y temperatura de desnaturalización crítica. Esta realización aprovecha tanto la desnaturalización preferente a la temperatura crítica como la hibridación cruzada preferente a la temperatura de hibridación.

La mezcla de reacción de amplificación, que tiene una secuencia diana y de referencia, se somete en primer lugar a una primera temperatura de desnaturalización, que está por encima de la Tm de la secuencia de referencia (Fig. 2A).

A continuación, la muestra se cicla entre dos etapas de incubación de temperatura diferente. En la primera etapa de incubación, la temperatura se disminuye para permitir la hibridación preferente de la secuencia diana con la secuencia de referencia (Fig. 2B). En la segunda etapa de incubación, la temperatura se incrementa hasta la Tc (Fig. 2C). Estas etapas primera y segunda se repiten entonces una o más veces, más preferiblemente 3-20 veces, y lo más preferible 5-10 veces.

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La temperatura de hibridación preferente para una secuencia dada es una temperatura a la que los alelos de tipo salvaje se hibridan a sí mismos a una velocidad más rápida que lo que lo hacen los alelos que contienen mutaciones. Debido a que los alelos mutados predominan mucho menos que los alelos de tipo salvaje, la hibridación cruzada de los alelos de tipo salvaje con sí mismos transcurre de forma más rápida que la hibridación cruzada de los alelos con alelos mutantes, o de los alelos mutantes con alelos (formando estos últimos un mal apareamiento). Como resultado, cuando la temperatura de la PCR se reduce hasta una temperatura de hibridación cruzada, los alelos mutantes no se hibridan de forma cruzada en el mismo grado que lo que lo hacen los alelos de tipo salvaje. Esta temperatura de hibridación o temperatura intermedia (estando la temperatura por debajo de la primera temperatura de desnaturalización y de Tc pero por encima de la temperatura de hibridación/alargamiento de los cebadores, por ejemplo alrededor de 60ºC a 80ºC) está por encima de la Tm del par de cebadores, y de este modo permite que las secuencias diana y de referencia se hibriden mientras evita la unión del par de cebadores a las secuencias diana y/o de referencia.

A continuación, la temperatura de la reacción se incrementa hasta la Tc dando como resultado que los dúplex de hibridación de diana-referencia y diana-diana se desnaturalicen preferentemente (Fig. 2C). La Tc o temperatura crítica está por debajo de la Tm de la secuencia de referencia, y se puede determinar mediante los métodos descritos aquí. En una realización, la Tc está alrededor de 0,3ºC-5ºC por debajo de la Tm de la secuencia de referencia, y más preferiblemente alrededor de 0,5ºC a 1,5ºC por debajo de la Tm de la secuencia de referencia. Generalmente, la Tc será alrededor de 70-90ºC. Los dúplex de hibridación de diana-diana también se pueden desnaturalizar preferentemente si la secuencia diana tiene una secuencia nucleotídica que da como resultado una menor Tm en comparación con la secuencia de referencia. La Tc se aplica generalmente de alrededor de 1 segundo a 5 minutos, más preferiblemente 2 segundos a 1 minuto, y lo más preferible 5 segundos a 30 segundos. Este procedimiento se repite varias veces, oscilando entre la temperatura de hibridación (Fig. 2B) y la temperatura crítica (Fig. 2C), generando selectivamente cada vez más secuencias mutantes en la forma monocatenaria que secuencias en la forma monocatenaria.

Una vez que la etapa de incubación cíclica está terminada, la temperatura de la mezcla de reacción se disminuye para permitir que el uno o más cebadores se hibriden a la secuencia diana (Fig. 2D). Estos cebadores se alargan entonces mediante una polimerasa, enriqueciendo de este modo la secuencia diana. Las etapas del método se repiten generalmente durante múltiples ciclos a fin de obtener una amplificación suficiente de las secuencias diana y de referencia. En una realización, las etapas del método se repiten durante 5-40 ciclos, y más preferiblemente 10-30 ciclos. El número óptimo de ciclos se puede determinar por una persona de pericia normal en la técnica. Preferiblemente, los presentes métodos se llevan a cabo en un dispositivo de PCR, más preferiblemente en condiciones de reacción en tiempo real en un dispositivo de PCR de detección en tiempo real.

Una vez que el enriquecimiento de la secuencia diana está terminado, la muestra se puede someter a procesamiento posterior. El procesamiento posterior incluye MALDI-TOF, fusión de HR, secuenciación didesoxi, secuenciación de una sola molécula, pirosecuenciación, RFLP, PCR digital y PCR cuantitativa.

La PCR digital se puede usar en la detección de mutaciones de niveles ultrabajos en combinación con un procedimiento de enriquecimiento. En la PCR digital, la muestra de ADN se diluye hasta moléculas individuales, de manera que en cada reacción de PCR el material de partida es tipo salvaje o mutante. Tras un gran número de reacciones de PCR del mismo material de partida, las moléculas mutantes se aíslan y se detectan. Fluidigm (South San Francisco, CA) comercializa una variedad de sistemas a base de PCR digital que se pueden usar con la presente invención. En consecuencia, el enriquecimiento en tiempo real se puede llevar a cabo simultáneamente a partir de moléculas individuales en miles de reacciones de enriquecimiento paralelas, permitiendo la identificación de la reacción de PCR que originó el ADN mutante. Tal sistema es particularmente útil para la detección de mutaciones ultrabajas en genomas de cáncer. La combinación de PCR digital con el procedimiento de enriquecimiento puede beneficiar de forma similar a aplicaciones de secuenciación de una sola molécula.

Reacción de amplificación de ácido nucleico

En una realización, una muestra de ácido nucleico utilizada en el método de la invención comprende ADN genómico que tiene una secuencia diana y una secuencia de referencia. En otra realización, la muestra de ácido nucleico del método de la invención comprende una secuencia diana y una secuencia de referencia que se amplificaron previamente en una reacción de amplificación de ácido nucleico. El experto apreciará que hay muchos métodos disponibles para amplificar un ácido nucleico. Quizás el método más popular es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; por ejemplo, véanse, patentes U.S. nos 4.683.195 y 4.683.202, así como Saiki et al., Science 230:1350-1354 (1985) y Gyllensten et al., PNAS (USA) 85:7652-7656 (1985)). Una variación preferida del método de la PCR es la PCR asimétrica (por ejemplo, véanse Mao et al., Biotechniques 27(4):674-678 (1999); Lehbein et al., Electrophoresis 19(8-9):1381-1384 (1998); Lazaro et al., Molec. Cell. Probes 6(5):357-359 (1992); y patente U.S. nº 6.197.499). Otros métodos de amplificación incluyen, pero no se limitan a, amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) (véanse, Walker et al., Nuc. Acids Res. 20(7):1691-1696 (1992), así como las patentes U.S. nos 5.744.311,

5.648.211 y 5.631.147), amplificación por círculo rodante (RCA) (véase la publicación PCT WO 97/19193), la amplificación a base de secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) (véanse Compton, Nature 350:91-92 (1991); así como las patentes U.S. nos 5.409.818 y 5.554.527), amplificación mediada por transcritos (TMA) (véanse Kwoh et al., PNAS (USA) 86:1173-1177 (1989), así como la patente U.S. nº 5.399.491), replicación de secuencia autosostenida

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(3SR) (véase Guatelli et al., PNAS (USA) 87:1874-1879 (1990) y la reacción en cadena de ligasa (LCA) (véanse las patentes U.S. nos 5.427.930 y 5.792.607).

El presente método utiliza una PCR modificada. La PCR se lleva a cabo como se describe en Mullis y Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335. La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se describe en las patentes U.S. nos 4.683.202, 4.683.195 y 4.800.159. En su forma más simple, la PCR es un método in vitro para la síntesis enzimática de secuencias de ADN específicas, usando dos cebadores oligonucleótidos que se hibridan a hebras opuestas y flanquean la región de interés en el ADN diana. Una serie repetitiva de etapas de reacción que implican la desnaturalización del molde, la hibridación del cebador y el alargamiento de los cebadores hibridados mediante ADN polimerasa da como resultado la acumulación exponencial de un fragmento específico cuyos términos se definen mediante los extremos 5’ de los cebadores. Se da a conocer que la PCR es capaz de producir un enriquecimiento selectivo de una secuencia de ADN específica en un factor de 109. El método de la PCR también se describe en Saiki et al., 1985, Science 230:1350.

La PCR se lleva a cabo usando ADN molde (secuencias diana y de referencia) (al menos 1 fg; de forma más útil, 11000 ng) y al menos 25 pmoles de cebadores oligonucleotídicos. Una mezcla de reacción típica incluye: 2 l de ADN, 25 pmoles de cebador oligonucleotídico, 2,5 l de un tampón adecuado, 0,4 l de dNTP 1,25 M, 2,5 unidades de Taq DNA polymerase (Stratagene), y agua desionizada hasta un volumen total de 25 l. La PCR se lleva a cabo usando un ciclador térmico programable.

La duración y temperatura de cada etapa de un ciclo de PCR, así como el número de ciclos, se ajustan según los requisitos de restricción en efecto. La temperatura y tiempo de hibridación se determinan tanto mediante la eficiencia con la que se espera que un cebador se hibride a un molde como por el grado de mal apareamiento que se va a tolerar. La capacidad para optimizar la restricción de las condiciones de hibridación de cebadores está dentro del conocimiento de alguien de pericia moderada en la técnica. Se usa una temperatura de hibridación de entre 30ºC y 72ºC. La desnaturalización inicial de las moléculas del molde se produce normalmente entre 92ºC y 99ºC durante 4 minutos, seguido de 20-40 ciclos que consisten en desnaturalización (94-99ºC durante 15 segundos a 1 minuto), hibridación (temperatura determinada como se explica anteriormente; 1-2 minutos), y alargamiento (72ºC durante 1 minuto). La etapa de alargamiento final se lleva a cabo generalmente durante 4 minutos a 72ºC, y puede ser seguida de una etapa indefinida (0-24 horas) a 4ºC.

La PCR utiliza una polimerasa de ácido nucleico, o enzima que cataliza la polimerización de trifosfatos de nucleósidos. Generalmente, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3’ del cebador hibridado a la secuencia diana, y transcurrirá en la dirección 5’ a lo largo del molde. Las ADN polimerasas conocidas incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, T7 ADN polimerasa, ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus, ADN polimerasa de Thermococcus litoralis, ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) y ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu). La expresión “polimerasa de ácido nucleico” también engloba ARN polimerasas. Si el molde de ácido nucleico es ARN, entonces “polimerasa de ácido nucleico” se refiere a una actividad de polimerización dependiente de ARN, tal como una transcriptasa inversa.

En los métodos de la invención, el protocolo de PCR incluye además una etapa de desnaturalización crítica. Estos protocolos se describen aquí completamente y se ilustran en las Figuras 1 y 2.

Preferiblemente, los procedimientos de enriquecimiento se llevan a cabo en un dispositivo de PCR, más preferiblemente en condiciones de reacción en tiempo real en un dispositivo de PCR en tiempo real. Las condiciones de reacciones en tiempo real utilizan además un agente de detección de ácido nucleico (por ejemplo, colorante o sonda) a fin de medir/detectar el producto de la PCR según se produce.

En una realización, los métodos de enriquecimiento se practican en un formato de múltiplex. La PCR múltiplex es aquella cuando se usa más de un par de cebadores en una reacción de PCR para detectar más de una secuencia diana. El objetivo de la PCR múltiplex es amplificar más de una secuencia diana simultáneamente y de ese modo ahorrar tiempo y minimizar el gasto. Permite la amplificación de múltiples secuencias diana en un solo experimento. Generalmente, el uso de PCR múltiplex junto con la presente invención con el fin de enriquecer simultáneamente los alelos minoritarios en todas las secuencias amplificadas, los cebadores se diseñan de manera que los amplicones de la PCR resultantes comparten todos ellos aproximadamente la misma Tc (temperatura de desnaturalización crítica).

Determinación de la Tm y de la Tc

La Tm se puede definir como la temperatura a la que la mitad de los pares de bases de Watson-Crick en una molécula de ácido nucleico dúplex se rompen o se disocian (es decir, se “funden”) mientras que la otra mitad de los pares de bases de Watson-Crick permanece intacta en una conformación bicatenaria, mientras que la “temperatura crítica”, “temperatura de desnaturalización crítica” o “Tc” se refiere a una temperatura por debajo de la Tm de la secuencia de referencia. La Tc se aplica para desnaturalizar selectivamente la secuencia diana bicatenaria o el dúplex bicatenario de secuencia diana/secuencia de referencia en una muestra de ácido nucleico para permitir el enriquecimiento selectivo de la secuencia diana durante una reacción de amplificación.

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La Tm de un par dado de hebras de ácido nucleico es indicativa de la estabilidad de la unión de hebra a hebra, y depende de la complementariedad de las hebras, de la longitud de la secuencia, del contenido de GC, de la presencia o ausencia de mal apareamientos en la región bicatenaria, y de otros factores de menor importancia, por ejemplo la concentración salina de la muestra (Lewin, Genes V, Capítulo 5, Oxford University Press and Cell Press: Nueva York, (1994) p. 109-126; SantaLucia, 1998).

La temperatura del punto de fusión se determina habitualmente de forma experimental sometiendo la muestra a un incremento constitutivo de temperatura y midiendo continuamente la disociación del dúplex de hibridación en hebras individuales. La disociación se puede detectar mediante una variedad de diferentes métodos, por ejemplo mediante un desplazamiento en la absorbancia de UV, mediante la fluorescencia de colorantes que se unen al ADN bicatenario, mediante resonancia de plasmones de superficie, o preferiblemente por medio de fluorescencia. En este último caso, la sonda de hibridación se marca habitualmente con una entidad fluorescente, y la generación de una señal fluorescente depende en cierto modo de la formación del dúplex de hibridación.

La Tm se puede determinar experimentalmente, o se puede estimar basándose en métodos bien definidos conocidos por aquellos de pericia normal en la técnica. Los métodos para observar y analizar las transiciones de la desnaturalización de ácidos nucleicos incluyen: medir el cambio de entalpía en una muestra a medida que se desnaturaliza mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC) (Kulinski et al., Nucleic Acids Res. 19(9):2449-2455 (1991); Paner et al., Biopolymers 29:1715-1734 (1990); Volker et al., Biopolymers 50:303-318 (1999)), midiendo la fluorescencia de pares de fluoróforos unidos covalentemente (Vamosi y Clegg, Biochemistry 37:14300-14316 (1998)), y monitorizando el cambio en la hipercromicidad de los ácidos nucleicos (Haugland, “In Vitro Applications for Nucleic Acid Stains and Probes”, en Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6ª ed., Molecular Probes Inc, Eugene OR (1996) p. 161-174).

Los valores de Tm de los ácidos nucleicos bicatenarios también se pueden observar monitorizando la fluorescencia de colorantes específicos del ADN bicatenario combinados con los ácidos nucleicos (Wittwer et al., 1996). Los colorantes específicos bicatenarios son fluoróforos que se unen a ácidos nucleicos. Típicamente, la fluorescencia de estos colorantes aumenta cuando se unen a ácidos nucleicos en forma de dúplex (Wittwer et al., BioTechniques 22:176-181 (1997)). Ririe et al. (1997) demostraron que los productos post-PCR se pueden diferenciar mediante análisis de la curva de fusión usando el colorante de unión a ácidos nucleicos bicatenarios SYBR® Green I. SYBR® Green I se une preferentemente a ácido nucleico bicatenario (Haugland, 1996). Otros colorantes adecuados para determinar la Tm de un ácido nucleico bicatenario incluyen SYBR® Gold, bromuro de etidio, naranja de acridina, bromuro de propidio, PicoGreen®, Hoechst 33258, Hoechst 33342, Hoechst 34580, YO-PRO®-1 y YOYO®-1. Cada uno de estos colorantes está comercialmente disponible. Por ejemplo, el Capítulo 8 del catálogo de Molecular Probes (Eugene, Oreg.) Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Decimoctava Edición (en CD-ROM, mayo de 2001) enumera una multitud de colorantes que se pueden usar en la presente invención.

Como apreciarán los expertos, la fusión de cualquier estructura de ácido nucleico bicatenario se produce generalmente en una proporción sustancial de una población de ácidos nucleicos similares a lo largo de un intervalo limitado de temperatura, y tendrá típicamente un pico de fusión (transición más rápida) a aproximadamente la Tm para ese ácido nucleico. Por lo tanto, tales picos de cambio en la emisión de fluorescencia se pueden usar para calcular la Tm para ácidos nucleicos bicatenarios.

Un perfil de temperatura de fusión se puede representar gráficamente dibujando -dF/dT frente a T, en el que dF es el cambio en la emisión de fluorescencia medida, dT es el cambio en la temperatura del ácido nucleico, y T es la temperatura del ácido nucleico. Tal representación gráfica mostrará picos a temperaturas a las que se producen los cambios más rápidos en la fluorescencia, indicando temperaturas de fusión.

En la técnica se conocen otros métodos para determinar la Tm de un ácido nucleico bicatenario, incluyendo aquellos descritos en las patentes U.S. nos 7.226.736 y 6.030.115.

La Tm se puede predecir a partir de ecuaciones empíricas. Se sabe que la Tm depende de la longitud de la secuencia de un par de bases complementarias formadoras de ácido nucleico (n), del contenido de G y C en la secuencia, de las concentraciones de sal () y del agente desnaturalizante (% FA) en la disolución de la muestra, y, en general, sigue una ecuación empírica Tm = 81,5 + 16,6 log () + 0,41 (% GC)-500/n-0,61 (% FA). La Tm se puede estimar mediante un número de métodos, por ejemplo mediante un cálculo de vecino más próximo de acuerdo con Wetmur 1991 (Wetmur, J. G. 1991. DNA probes: applications of the principles of nucleic acid hybridization. Crit Rev Biochem Mol Biol 26: 227-259) y mediante programas comerciales, incluyendo Oligo™ Primer Design y programas disponibles en internet.

La “temperatura crítica” o “Tc” se refiere a una temperatura por debajo de la Tm de la secuencia de referencia. La Tc se aplica para desnaturalizar preferentemente el dúplex de secuencia diana bicatenario o el dúplex bicatenario de secuencia diana/secuencia de referencia con respecto al dúplex de secuencia de referencia/referencia, para permitir el enriquecimiento selectivo de la secuencia diana durante una reacción de amplificación. La temperatura crítica aprovecha la menor Tm de la secuencia diana bicatenaria o del dúplex de ADN bicatenario hibridado de forma cruzada de diana-referencia. Cuando la secuencia diana o la secuencia de referencia se hibridan de forma cruzada, diferencias de secuencia menores de uno o más mal apareamientos de un solo nucleótido en cualquier parte a lo

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largo de una secuencia de ADN bicatenaria corta (por ejemplo, < 200 pb) generarán un cambio pequeño pero predecible en la temperatura de fusión (Tm) para esa secuencia (Lipsky, R.H., et al. (2001) Clin Chem, 47, 635-644; Liew, M., et al. (2004) Clin Chem, 50, 1156-1164). Dependiendo del contexto exacto de la secuencia y de la posición del mal apareamiento, son habituales cambios de temperatura de fusión de 0,5-1,5ºC para secuencias de hasta 200 pb. De este modo, la hibridación de la secuencia diana-referencia, debido a los mal apareamientos, tendrá esencialmente una menor Tm que el alelo conocido (por ejemplo, secuencia de referencia). Al menos en parte, la presente invención aprovecha la pequeña diferencia de Tm entre secuencias completamente apareadas y secuencias mal apareadas. Debido a que la desnaturalización crítica se lleva a cabo en cada ciclo de PCR, el enriquecimiento diferencial de alelos que contienen mutaciones se realiza exponencialmente, y resulta en una gran diferencia en la eficiencia de la amplificación global entre alelos mutantes y de tipo salvaje al final del ciclo. La Tc está alrededor de 0,1-20ºC por debajo de la Tm de la secuencia de referencia. Más preferiblemente, la Tc está alrededor de 0,1-15ºC, 0,1-10ºC, 0,1-9ºC, 0,1-8ºC, 0,1-7ºC, 0,1-6ºC, 0,2C-5ºC, 0,3ºC-4,5ºC, 0,4-4ºC, 5-3,5ºC, 0,5-3ºC, 0,5-3ºC, 0,5-2,5ºC, 0,5-2ºC, 0,5-1,5ºC, 0,5-1ºC por debajo de la Tm de la secuencia de referencia.

En algunas realizaciones, la Tc puede estar por debajo de la Tm tanto de la secuencia de referencia como de la secuencia diana. Por ejemplo, en un caso, la Tm de una secuencia de tipo salvaje fue 84ºC y la Tm de la secuencia mutada fue 83,8ºC. Cuando se usó una versión rápida de un procedimiento de enriquecimiento, la Tc óptima fue 83,5ºC.

En algunas realizaciones preferidas, la Tc se escoge de manera que está por debajo de la Tm tanto de la secuencia de referencia como de todas las posibles secuencias diana. Por ejemplo, en un caso, la Tm de una secuencia de tipo salvaje fue 84ºC, y la Tm de secuencias mutadas en diferentes posiciones (mutaciones de un solo punto) fue 83,8ºC, 83,7ºC, 83,9ºC, 83,6ºC, 83,75ºC. Cuando se usó una versión rápida de un procedimiento de enriquecimiento, la Tc óptima fue 83,5ºC.

La temperatura de desnaturalización crítica (Tc) es la temperatura por debajo de la cual la eficiencia de la PCR cae abruptamente para una secuencia de ácido nucleico dada. Por ejemplo, una secuencia de p53 de 167 pb se amplifica bien si la temperatura de desnaturalización de la PCR se fija a 87ºC, se amplifica de forma modesta a 86,5ºC, y no produce ningún producto detectable si la desnaturalización de la PCR se fija a 86ºC o menos.

Al igual que la Tm, la Tc para una secuencia dada se puede identificar experimentalmente o mediante cálculo. Para identificar experimentalmente la Tc para un producto de PCR dado, se lleva a cabo una curva de fusión en tiempo real en presencia de un colorante intercalante (LC-GREEN o SYBR-Green), para obtener la temperatura de fusión media Tm de la secuencia (véase anteriormente con respecto a la determinación de Tm). Las temperaturas de alrededor de 0,5-1,5ºC menores que Tm son habitualmente temperaturas de desnaturalización críticas Tc apropiadas que dan como resultado el enriquecimiento de secuencias diana.

La Tc también se puede estimar determinando el Tm para una secuencia de ADN debido a su mal apareamiento de pares de bases, como estaría presente en el dúplex de diana-referencia hibridado de forma cruzada. Esta diferencia es de alrededor de 0,1ºC a alrededor de 12,5ºC en comparación con un apareamiento perfecto de secuencia de referencia/referencia. De este modo, en una realización, Tc se puede representar mediante la ecuación Tc = Tm-Tm, en la que Tm es la temperatura de fusión del dúplex de secuencia de referencia/referencia, y Tm es el cambio en la Tm de la secuencia de referencia como resultado de uno o más mal apareamientos de pares de bases que se pueden formar durante la hibridación cruzada de las secuencias diana/referencia. Se ha encontrado que el Tm depende de la longitud del dúplex de secuencia diana/referencia, del porcentaje de contenido de guanina-citosina (%GC), y también de la localización de la mutación de punto o del mal apareamiento de los pares de bases en el dúplex. Por ejemplo, si el mal apareamiento se encuentra hacia el extremo del dúplex, Tm será generalmente menor, típicamente en el intervalo de alrededor de 0,1ºC a alrededor de 8ºC. Si el mal apareamiento se encuentra hacia el centro del dúplex, Tm será relativamente mayor, típicamente en el intervalo de alrededor de 0,2ºC a alrededor de 11ºC. El Tm es equivalente en general a alrededor de 0,5ºC a alrededor de 1,5ºC por porcentaje de mal apareamiento de bases en el dúplex hibridado de forma cruzada de diana-referencia. Se ha de apreciar que Tm variará dependiendo no solo de la longitud del dúplex y de la localización de la mutación, sino que también variará dependiendo del orden específico de la secuencia. Consiguientemente, todas las citas diferencias están dentro del alcance de la descripción.

Secuencias de ácidos nucleicos útiles en la invención

La invención proporciona métodos para enriquecer una secuencia diana en una muestra de ácido nucleico, y también utiliza cebadores para amplificar una secuencia de ácido nucleico molde.

Como se usa aquí, las expresiones “ácido nucleico”, “polinucleótido” y “oligonucleótido” se refieren a cebadores, sondas, y fragmentos oligoméricos a detectar, y deben ser genéricas a polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2desoxi-D-ribosa), a polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y a cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glucósido de una base purínica o pirimidínica, o bases purínicas o pirimidínicas modificadas (incluyendo sitios abásicos). No hay ninguna distinción pretendida en longitud entre la expresión “ácido nucleico”, “polinucleótido” y “oligonucleótido”, y estas expresiones se usarán de forma intercambiable. Estas expresiones se refieren solamente a

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la estructura primaria de la molécula. De este modo, estos términos incluyen ADN mono y bicatenario, así como ARN mono y bicatenario.

El oligonucleótido no deriva necesariamente de forma física de ninguna secuencia existente o natural, sino que se puede generar de cualquier manera, incluyendo síntesis química, replicación de ADN, transcripción inversa, o una combinación de las mismas. Las expresiones “oligonucleótido” o “ácido nucleico” significan un polinucleótido de ADN

o ARN genómico, ADNc, origen semisintético o sintético que, en virtud de su origen sintético o manipulación: (1) no está asociado con todo o con una porción del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza; y/o (2) está ligado a un polinucleótido distinto de aquel al que está ligado en la naturaleza.

En una realización, los ácidos nucleicos usados en el método contienen nucleótidos modificados para incrementar las diferencias de temperatura de desnaturalización entre el homodúplex de secuencia de referencia/referencia y el heterodúplex de secuencia diana/referencia. Tales modificaciones potenciarían el enriquecimiento de la secuencia diana. Los nucleótidos modificados o no naturales se pueden incorporar antes o durante el procedimiento de enriquecimiento. Los nucleótidos modificados contemplados para uso en los métodos de la invención incluyen: análogos de diamino-purina (por ejemplo 2’-O-metil-2,6-diaminopurina), uracilo, análogos de ácidos nucleicos peptídicos, análogos de los anteriores modificados con biotina, análogos de los anteriores modificados con fluoróforos, inosina, 7-desazaguanina, nucleótidos de ácido 2’-desoxi-2’-fluoro--D-arabinonucleico (2’F-ANA), ácidos nucleicos bloqueados (LNAs), ENAs: ácidos nucleicos con puentes de 2’-O,4’-C-etileno y otros. Los nucleótidos modificados se pueden incorporar en cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención, incluyendo ácidos nucleicos molde, cebadores y sondas.

Estas modificaciones pueden incrementar la diferencia de Tm entre bases apareadas y mal apareadas, y de ese modo pueden incrementar el enriquecimiento obtenido con los presentes métodos. Por ejemplo, los ácidos nucleicos bloqueados representan una clase de análogos nucleotídicos conformacionalmente restringidos descritos, por ejemplo, en el documento WO 99/14226, que incrementan la temperatura de fusión de un ácido nucleico. Los oligonucleótidos que contienen el nucleótido bloqueado se describen en Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998),

54: 3607-3630) y Obika, S. et al., Tetrahedron Lett. (1998), 39: 5401-5404), las cuales se incorporan aquí como referencia. La introducción de un nucleótido bloqueado en un oligonucleótido mejora la afinidad por secuencias complementarias e incrementa la temperatura de fusión en varios grados (Braasch, D.A. y D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7). La invención se puede llevar a cabo con cualquiera de los LNAs conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en el documento WO 99/14226 y en Latorra D, et al., 2003. Hum. Mutat. 22: 79-85.

La complementariedad no necesita ser perfecta; los dúplex estables pueden contener pares de bases mal apareados o bases no apareadas. Los expertos en la técnica de tecnología de ácidos nucleicos pueden determinar empíricamente la estabilidad del dúplex considerando un número de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud del oligonucleótido, la composición y secuencia de las bases del oligonucleótido, la fuerza iónica, y la incidencia de pares de bases mal apareados. La estabilidad de un dúplex de ácido nucleico se mide mediante la temperatura de fusión, o “Tm”.

La invención usa cebadores oligonucleotídicos para amplificar una secuencia de ácido nucleico molde.

El término “cebador” se puede referir a más de un cebador, y se refiere a un oligonucleótido, ya sea de origen natural, como en una digestión de restricción purificada, o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis a lo largo de una hebra complementaria cuando se coloca en condiciones en las que está catalizada la síntesis de un producto de alargamiento del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico. Tales condiciones incluyen la presencia de cuatro trifosfatos de desoxirribonucleósidos diferentes y un agente inductor de la polimerización, tal como ADN polimerasa o transcriptasa inversa, en un tampón adecuado (“tampón” incluye sustituyentes que son cofactores, o que afectan al pH, fuerza iónica, etc.), y a una temperatura adecuada. El cebador es preferiblemente monocatenario para una eficiencia máxima en la amplificación.

Los cebadores oligonucleotídicos útiles según la invención son moléculas de ADN o ARN monocatenarias que son hibridables a una secuencia de ácido nucleico molde y ceban la síntesis enzimática de una hebra de ácido nucleico. El cebador es complementario a una porción de una molécula diana presente en un conjunto de moléculas de ácido nucleico. Se contempla que los cebadores oligonucleotídicos se preparen mediante métodos sintéticos, ya sea químicos o enzimáticos. Como alternativa, tal molécula o un fragmento de la misma es de origen natural, y se aísla de su fuente natural o se adquiere de un proveedor comercial. Los cebadores oligonucleotídicos tienen una longitud de 5 a 100 nucleótidos, idealmente de 17 a 40 nucleótidos, aunque son de uso cebadores de diferente longitud. Los cebadores para la amplificación tienen preferiblemente alrededor de 17-25 nucleótidos. Los cebadores útiles según la invención también se pueden diseñar para que tengan una temperatura de fusión (Tm) particular mediante el método de estimación de la temperatura de fusión. Los programas comerciales, incluyendo Oligo□, Primer Design y programas disponibles en internet, incluyendo Primer3 y Oligo Calculator, se pueden usar para calcular una Tm de una secuencia de ácido nucleico útil según la invención. Preferiblemente, la Tm de un cebador de amplificación útil según la invención, según se calcula por ejemplo mediante Oligo Calculator, está preferiblemente entre alrededor de 45 y 65ºC, y más preferiblemente entre alrededor de 50 y 60ºC.

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También tras el enriquecimiento selectivo de la secuencia diana, el ácido ribonucleico (ARN) complementario se puede transcribir o fabricar a partir del ADN. En una realización preferida, la transfección del ARN se lleva a cabo empleando un cebador con una región promotora de la ARN polimerasa unida a la secuencia del cebador estándar para el ADN de interés en la reacción de amplificación (etapa tres). El ARN complementario al ADN se transcribe entonces a partir de la región promotora adjunta. En un método alternativo, el ADN del alelo amplificado se clona en un vector de expresión, y se transcribe el ARN complementario al ADN. Además, como una realización preferida opcional, el ARN complementario se usa en una reacción de traducción in vitro para fabricar proteína asociada a tumor o específica del tumor.

La caracterización del alelo, la amplificación del ADN derivado de tumor o asociado a tumor, y la caracterización, transcripción del ARN complementario, y traducción a proteína asociada a tumor o específica de tumor proporciona utilidad significativa, tanto la asignación de la terapia como en el desarrollo de terapias específicas de tumor. La secuenciación de ADN extracelular o la transcripción de ARN complementario permite la asignación o desarrollo de compuestos antisentido, incluyendo oligonucleótidos sintéticos y otros constructos antisentido apropiadamente específicos para el ADN extracelular, tal como mediante la construcción de un plásmido de expresión tal como adaptando el método de Aoki et al. (1995, Cancer Res. 55: 3810 3816). De forma similar, la definición de las características tumorales permite la asignación de terapias de vacunas o de anticuerpos monoclonales específicas apropiadamente específicas para el ADN amplificado. La producción de proteína inmunológica correspondiente se puede usar en el desarrollo de anticuerpos monoclonales específicos de tumor. De forma similar, la proteína traducida se puede usar en el desarrollo de una vacuna específica de tumor.

Especialmente importante, la invención permite el desarrollo y aplicación de estas terapias o diagnósticos específicos de tumor incluso cuando están presentes solamente tumores premalignos, cánceres tempranos, o cánceres ocultos. De este modo, la invención permite la intervención terapéutica cuando la carga tumoral es baja, la función inmunológica está relativamente intacta, y el paciente no está comprometido, incrementando todo ello el potencial para la cura.

Procesamiento posterior de secuencias enriquecidas

La combinación de los presentes métodos con MALDI-TOF, fusión de alta resolución o secuenciación de una sola molécula abordaría 3 necesidades distintas en la detección de mutaciones: la detección rápida de mutaciones somáticas conocidas o sospechosas de estar correlacionadas con el resultado clínico (MALDI-TOF); el escaneado rápido de muestras de pacientes individuales en busca de mutaciones somáticas desconocidas (fusión de HR), seguido de la secuenciación selectiva de unos pocos exones; y la secuenciación masivamente paralela (secuenciación de una sola molécula, SMS) de múltiples genes en “muestras difíciles”, es decir, en muestras procedentes de tumores con heterogeneidad, contaminación estrómica o fluidos corporales en los que las mutaciones clínicamente relevantes pueden estar al nivel de 0,5-5%.

Espectrometría de masas

En una realización, una secuencia diana enriquecida se somete a secuenciación mediante MALDI-TOF. La espectrometría de masas (MS) ha surgido como una herramienta poderosa en la secuenciación del ADN. Los espectrómetros de masas producen una medida directa de la masa, que se puede adquirir en segundo o minutos en el intervalo de femtomolar a picomolar. La MS con analizador de tiempo de vuelo (TOF) y desorción/ionización mediante láser asistida por matriz (MALDI) se ha usado con éxito para la secuenciación rápida del ADN y la determinación eficiente de los tamaños de moléculas de ADN. El advenimiento de la MS de MALDI-TOF ha hecho más fácil ionizar moléculas de ADN grandes intactas y medir sus relaciones masa a carga. Productos monocatenarios y bicatenarios de la reacción en cadena de polimerasa (PCR®) de 500 nucleótidos (nt) de longitud se han detectado mediante MS de MALDI-TOF. Usando combinaciones optimizadas de matriz-láser que reducen la fragmentación del ADN, se han dado a conocer espectros de masas mediante MALDI con infrarrojos de ADN sintético, fragmentos de enzimas de restricción de ADN plasmídico, y transcritos de ARN de hasta un tamaño de 2180 nt con una exactitud de ±0,5-1%. Aunque se han detectado oligómeros grandes mediante MS de MALDI-TOF, generalmente se acepta que actualmente es habitual hasta un 100-mero.

Para varios genes, las mutaciones clínicamente importantes no se producen aleatoriamente en el genoma (por ejemplo, mutaciones puntuales de ganancia de función que se producen en el oncogén más conocido). En su lugar, los cambios que afectan a un número relativamente pequeño de codones dan cuenta a menudo de la mayoría de las mutaciones somáticas. En principio, entonces, un número limitado de ensayos genéticos juiciosamente diseñados debería de interrogar eficazmente una gran proporción de mutaciones clínicamente relevantes. Por ejemplo, Garraway y colegas (Thomas, R.K., et al. (2007) Nat Genet, 39, 347-351) mostraron que 16-44 ensayos de MALDI-TOF por gen en RAS, EGFR y BRAF capturaron el 90%-99% del predominio mutacional observado hasta ahora para estos genes en neoplasias humanas. Por lo tanto, se propone que el genotipado de alto rendimiento puede proporcionar un medio eficaz para detectar mutaciones cancerosas críticas y/o “dianizables” a gran escala en muestras clínicas. MALDI-TOF es idealmente adecuado para la detección de mutaciones previamente identificadas en muestras tumorales no heterogéneas. Sin embargo, aunque no hay dudas sobre la fiabilidad de MALDI-TOF para la identificación de mutaciones de línea germinal o de SNP, la experiencia a la hora de detectar mutaciones somáticas es relativamente reciente. De este modo, la fiabilidad de MALDI-TOF disminuye sustancialmente cuando

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se usan muestras heterogéneas con <10% de células mutadas (por ejemplo, cáncer pancreático, de pulmón o de próstata), o cuando se va a identificar ADN procedente de fluidos corporales. Al mejorar la sensibilidad, el presente método de enriquecimiento permite que MALDI-TOF detecte mutaciones somáticas de bajo nivel, y también proporcionará la fiabilidad requerida que es necesaria para la identificación de muestras tumorales quirúrgicas convencionales.

Fusión de alta resolución

En otra realización, una secuencia diana enriquecida se somete a fusión de alta resolución. Los genes que contienen mutaciones clínicamente relevantes en numerosas posiciones a lo largo de los exones, tales como p53, se identifican de forma más fácil vía el escaneado mutacional que mediante el genotipado de mutaciones individuales. La fusión de HR es una tecnología de escaneado mutacional de alto rendimiento introducida en los últimos años recientes, con excelentes capacidades para descubrir SNPs o mutaciones de línea germinal (Chou, L.S., et al. (2005); Am J Clin Pathol, 124, 330-338; Wittwer, C.T., et al. (2003); Clin Chem, 49, 853-860; Reed, G.H. y Wittwer,

C.T. (2004); Clin Chem, 50, 1748-1754).

Inmediatamente tras la amplificación mediante PCR de una región genómica de interés en presencia de un colorante fluorescente intercalante (LC Green o Sybr-Green), la presencia de una mutación se identifica en tiempo real mediante el análisis cuidadoso de la curva de fusión y mediante comparación con el tipo salvaje sin ningún tratamiento post-amplificación. Además, el análisis de fusión de alta resolución logra el escaneado génico y el genotipado mutacional (es decir, identificación de SNPs) simultáneos en una fracción del tiempo requerido cuando se usan métodos tradicionales, a la vez que mantiene un entorno de tubo cerrado. La PCR necesita <30 min. (capilares) o 1,5 h (placas de 96 o de 384 pocillos), y la adquisición por fusión tarda 1-2 min. por capilar o 5 min. por placa.

Sin embargo, al igual que con MALDI-TOF, las ventajas de usar fusión de HR no se pueden aprovechar para mutaciones somáticas por debajo de aproximadamente 20% de relaciones de mutante a tipo salvaje; de ese modo, varias clases de muestras clínicas no se pueden identificar de forma fiable vía la fusión de HR. Al incrementar los límites de detección, la presente invención permite que la conveniencia y el rendimiento de la fusión de HR se apliquen a la identificación de muestras tumorales quirúrgicas convencionales y también para detectar mutaciones somáticas de bajo nivel en muestras clínicas “difíciles” con contaminación estrómica o ADN procedente de fluidos corporales.

Secuenciación de una sola molécula

La secuencia diana enriquecida se puede someter a secuenciación de una sola molécula (Thomas, R.K., et al. (2006); Nat Med, 12, 852-855). Las capacidades de la secuenciación de una sola molécula también se beneficiarían de la incorporación de la presente invención. Por ejemplo, para la identificación de mutaciones en muestras de pacientes, todavía es necesaria la PCR de los exones seleccionados en una máquina de PCR normal a partir de ADN genómico antes de iniciar la secuenciación de la segunda generación. Además, la detección de mutaciones a nivel de una relación de mutante a tipo salvaje de 1-5% en muestras clínicas requiere la secuenciación repetida de numerosos “sucesos individuales” a fin de lograr estadísticas aceptables. Esto reduce básicamente las capacidades de rendimiento, y, para mutaciones al nivel de 1%, solo se pueden identificar simultáneamente 10-20 secuencias, contrariamente a las 4.000 secuencias si las mutaciones fuesen predominantes (por 454 Life Sciences, Technical Service). Al llevar a cabo la presente invención antes de la secuenciación de una sola molécula, aumentará el predominio de mutaciones en 1-2 órdenes de magnitud como una fracción del número global de alelos, incrementando de ese modo el rendimiento de la secuenciación de una sola molécula hasta un grado equivalente.

El método de enriquecimiento selectivo de la invención se puede aplicar durante la etapa en emulsión de una reacción de secuenciación de una sola molécula. Las secuencias diana enriquecidas se someten entonces a pirosecuenciación.

Alargamiento del cebador

La secuencia diana enriquecida se puede someter a una reacción de secuenciación de alargamiento del cebador. En el alargamiento del cebador, se usan oligonucleótidos para evaluar la variación en secuencia en una posición predeterminada de la misma con respecto a un ácido nucleico, cuya secuencia es conocida. Se proporciona un oligonucleótido de muestra como una molécula monocatenaria, la molécula monocatenaria se mezcla con un agente inductor, un nucleótido marcado, y un cebador que tiene una secuencia idéntica a una región que flanquea la posición predeterminada para formar una mezcla, teniendo la mezcla una ausencia esencial de nucleótidos constituidos por bases distintas de la base de la que está constituido el nucleótido marcado. La mezcla se somete entonces a condiciones que conduzcan a la hibridación del cebador a la molécula monocatenaria y la formación de un producto de alargamiento del cebador que incorpora el nucleótido marcado, y la mezcla se analiza en busca de la presencia de producto de alargamiento del cebador que contiene nucleótido marcado (patente U.S. nº 5.846.710).

Tampones

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enriquecimiento aumenta a medida que disminuye la relación de mutante a tipo salvaje, indicando una dependencia no lineal del factor de enriquecimiento con la concentración inicial de mutaciones.

Tabla I

Mutaciones de p53. Se indica el % de alelo mutante o de tipo salvaje para diversas mutaciones del exón 8 de p53

RESULTADO DE MALDI-TOF

mutación del exón 8 de p53=14484G>A

PCR DE ENRIQUECIMIENTO

DILUCIONES DE ESTIRPES CELULARES IDENTIFICADAS

%A mutante %G tipo salv. ENRIQUECIMIENTO

Relación SW480-tipo salv. 1:5 PCR normal

15 85

Relación SW480-tipo salv. 1:10 PCR normal

5 (límite del espec. masas) 95

Relación SW480-tipo salv. 1:33 PCR normal

0 100

Relación SW480-tipo salv. 1:10 PCR CO.L.D

45 55 9

Relación SW480-tipo salv. 1:100 PCR CO.L.D

33 67 >10

Relación SW480-tipo salv. 1:300 PCR CO.L.D

31 69 >30

TIPO SALVAJE SOLAMENTE, PCR CO.L.D

0 100 Ninguno

RESULTADO DE MALDI-TOF

mutación del exón 8 de p53=14483C>T

PCR CO.L.D

DILUCIONES DE ESTIRPES CELULARES IDENTIFICADAS

%T mutante %C tipo salv. ENRIQUECIMIENTO

Relación CT7-tipo salv. 1:5 PCR normal

28 72 N/A

Relación CT7-tipo salv. 1:10 PCR normal

18 82 N/A

Relación CT7-tipo salv. 1:33 PCR normal

5 (límite del espec. masas) 95 N/A

Relación CT7-tipo salv. 1:100 PCR CO.L.D

45 54 18

Relación CT7-tipo salv. 1:200 PCR CO.L.D

28 72 40

Relación CT7-tipo salv. 1:300 PCR CO.L.D

27 73 60

TIPO SALVAJE SOLAMENTE, PCR CO.L.D

0 100 Ninguno

RESULTADO DE MALDI-TOF

mutación del exón 8 de p53=14486G>T

PCR CO.L.D

DILUCIONES DE ESTIRPES CELULARES IDENTIFICADAS

%G mutante %T tipo salv. ENRIQUECIMIENTO

Relación DU145-tipo salv. 1:5 PCR normal

28 72 N/A

Relación DU145-tipo salv. 1:10 PCR normal

18 82 N/A

Relación DU145-tipo salv. 1:33 PCR normal

0 100 N/A

Relación DU145-tipo salv. 1:33 PCR CO.L.D

27 73 7

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Relación DU145-tipo salv. 1:100 PCR CO.L.D

12 88 >10

Relación DU145-tipo salv. 1:300 PCR CO.L.D

0 100 indetectable

TIPO SALVAJE SOLAMENTE, PCR CO.L.D

0 100 Ninguno

Mutaciones Kras

Se indica el % de alelo mutante o de tipo salvaje para mutaciones del codón 12 de Kras

RESULTADO DE MALDI-TOF

mutación del codón 12 de Kras=GGT>AGT

PCR CO.L.D

DILUCIONES DE ESTIRPES CELULARES IDENTIFICADAS

%A mutante %G tipo salv. ENRIQUECIMIENTO

Relación A549-tipo salv. 1:10 PCR normal

25 75 N/A

Relación A549-tipo salv. 1:33 PCR CO.L.D

40 60 5,5

Relación A549-tipo salv. 1:100 PCR CO.L.D

25 75 10

Relación A549-tipo salv. 1:200 PCR CO.L.D

12 88 10

mutación del codón 12 de Kras=GGT>GTT

PCR CO.L.D

DILUCIONES DE ESTIRPES CELULARES IDENTIFICADAS

%A mutante %G tipo salv. ENRIQUECIMIENTO

Relación SW480-tipo salv. 1:10 PCR normal

15 85 N/A

Relación SW480-tipo salv. 1:33 PCR CO.L.D

15 85 3

Relación SW480-tipo salv. 1:100 PCR CO.L.D

7 93 5

Relación SW480-tipo salv. 1:200 PCR CO.L.D

5 95 7

TIPO SALVAJE SOLAMENTE, PCR CO.L.D

0 100 Ninguno

Comparación del PCR de enriquecimiento-MALDI-TOF con PCR normal-MALDI-TOF.

El enriquecimiento de mutaciones ganado se da en la última columna.

Ejemplo 6: Comparación de PCR en tiempo real normal basada en TAQMAN y de PCR en tiempo real basadaen el enriquecimiento

Se llevaron a cabo reacciones de amplificación de ácido nucleico para comparar ensayos de sondas TAQMAN en

5 PCR en tiempo real normal y una PCR en tiempo real basada en el enriquecimiento. Para comparar los dos métodos de detección en tiempo real, tanto el ADN genómico como las muestras tumorales clínicas que tienen una mutación G>A en el exón 8 de p53 se ensayaron a diversas diluciones en la secuencia de tipo salvaje. Se realizaron diluciones en serie (1:3, 1:10, 1:30, 1:100 y 1:300) de ADN genómico procedente de SW480 en ADN de tipo salvaje. Específicamente, las reacciones de PCR en tiempo real se llevaron a cabo directamente a partir de 20 ng de ADN

10 genómico en presencia de 0,2 M de sonda Taqman 5’-6-Fam-TTT GAG GTG CAT GTT TGT GCC-BHQ_1-3’ que tiene un apareamiento total con la secuencia que contiene la mutación p53 en ADN procedente de células SW480. Las concentraciones finales de otros reactivos fueron: 1X de tampón GoTaq Flexi (Promega), 1X GoTaq polymerase (Promega) 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 M de cebador directo, 5’-TGG TAA TCT ACT GGG ACG-3’, 0,2 M de cebador inverso, 5’-CGG AGA TTC TCT TCC TCT-3’, MgCl2 3 mM, más ADN. El tamaño del amplicón de la PCR fue

15 87 pb y Tc = 83,5ºC. El ciclo de la PCR COLD rápido fue: 95ºC, 120 s; (95ºC, 15 s; 58ºC lectura de fluorescencia ON, 60 s) x 25 ciclos; (83,5ºC 15 s; 58ºC lectura de fluorescencia ON, 60 s) x 25 ciclos. Para el ciclo de la PCR normal, se empleó el mismo programa, pero la temperatura de desnaturalización a lo largo de la PCR fue 95ºC. Los experimentos se repitieron al menos 5 veces en experimentos independientes.

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En la FIG. 8A y 8B se representan gráficas de amplificación que ilustran la sensibilidad de la PCR en tiempo real normal y enriquecida según se aplica a ADN genómico procedente de la estirpe celular de cáncer de colon SW480. La FIG. 8B demuestra que la PCR en tiempo real enriquecida puede detectar la presencia de la mutación a una relación de alelo mutante a alelo de tipo salvaje de 1:300. Por el contrario, la PCR en tiempo real normal realizada en condiciones idénticas, con la excepción de la etapa de Tc, solamente puede detectar el mutante a dilución máxima de 1:10 (FIG. 8A). Por lo tanto, la sensibilidad del ensayo es 30 veces mejor usando el procedimiento de enriquecimiento.

En la FIG. 8C y 8D se ilustran gráficas de amplificación que comparan la sensibilidad de la PCR en tiempo real normal y enriquecida en muestras tumorales clínicas que tienen la mutación del exón 8 de p53 (una de las cuales se sabe que contiene una mutación de bajo nivel (5% de mutante a tipo salvaje) en el exón 8 de p53, CT20). La PCR en tiempo real enriquecida fue capaz fácilmente de detectar la mutación (FIG. 8D), mientras que la PCR normal no lo hizo (FIG. 8C). La muestra restante (TL6, TL8 y TL18), que se sabía que eran muestras de tipo salvaje, no se amplificaron (FIG. 8C) en las mismas condiciones.

Ejemplo 7: Escaneado de mutaciones vía PCR en tiempo real con enriquecimiento

Se crearon mezclas de reacción de amplificación de ácidos nucleicos para comparar la capacidad de la PCR en tiempo real normal y enriquecida que utiliza colorantes de detección de ADN para detectar muestras que contienen mutaciones en cualquier parte a lo largo del exón 8 de p53. El método proporciona un método rápido y conveniente para identificar mutaciones desconocidas o SNPs heterocigotos. De este modo, el presente método se puede adaptar por alguien de pericia normal en la técnica para escanear grandes números de genes en busca de mutaciones de línea germinal o somáticas para una variedad de diferentes aplicaciones (por ejemplo, escaneado en busca de mutaciones BRCA1/2 en poblaciones con riesgo elevado de desarrollar CA de mama/ovárico, escaneado de rutas genéticas completas para identificar mutaciones, etc).

La FIG. 9A y 9B ilustran gráficas de amplificación que comparan PCR en tiempo real tanto normal como enriquecida que usa el colorante LC-Green en una variedad de estirpes celulares y muestras clínicas que se sabe que contienen mutaciones en el exón 8 de p53. Los datos muestran que la PCR normal en tiempo real (FIG. 9A) es incapaz de distinguir entre las muestras mutantes (SW480, TL6 y CT20) y las de tipo salvaje (R27, TL8, TL18, TL81 y TL82), mientras que la PCR en tiempo real enriquecida sí lo hace (FIG. 9B). El método de enriquecimiento proporciona una detección umbral más temprana para las muestras que contienen mutaciones que para las muestras de tipo salvaje.

La FIG. 9C y 9D ilustran los resultados de reacciones de amplificación preparadas en condiciones de reacción idénticas a las ilustradas en la FIG. 9A y 9B, pero aquí las muestras son todas tumores pulmonares. Los datos muestran que la PCR normal en tiempo real (FIG. 9C) no puede diferenciar entre las muestras mutantes y las de tipo salvaje, mientras que la PCR enriquecida en tiempo real (FIG. 9D) sí lo hace. El método de enriquecimiento proporciona una detección umbral más temprana para las muestras que contienen mutaciones que para las muestras de tipo salvaje.

Además, el método de detección enriquecido fue capaz de identificar una mutación C>T previamente desconocida en la muestra TL6.

Ejemplo 8: Los disolventes orgánicos incrementan el enriquecimiento de mutaciones durante PCR en tiemporeal normal y potenciada

Se prepararon mezclas de reacción de amplificación de ácidos nucleicos para evaluar el impacto de disolventes orgánicos sobre la PCR en tiempo real normal y enriquecida. Las reacciones se llevaron a cabo en presencia o en ausencia de un disolvente orgánico (3% de DMSO). El procedimiento usado fue el mismo que el descrito en el Ejemplo 7 y representado en la FIG. 9C y 9D, excepto por la adición de 3% de DMSO.

La presencia del disolvente orgánico potenció la discriminación entre las gráficas de amplificación de muestras que contienen las secuencias mutadas con aquellas que contienen secuencias de tipo salvaje (FIG. 10). Por ejemplo, la diferencia umbral entre muestras de tipo salvaje y muestras mutantes aumentó desde 5 ciclos (enriquecimiento en tiempo real sin DMSO; véase la FIG. 9A) hasta más de 10 ciclos (enriquecimiento en tiempo real con DMSO; véase la FIG. 10A).

Ejemplo 9: Detección de mutaciones de nivel ultrabajo usando RFLP en combinación con PCR de enriquecimiento

La PCR de enriquecimiento combinada con RFLP-PCR se puede usar para la identificación mejorada de mutaciones de nivel ultrabajo, por ejemplo para identificar mutaciones aleatorias en un genoma canceroso, o mutaciones de resistencia en muestras de cáncer en una etapa muy temprana, es decir, antes del tratamiento.

Por ejemplo, muestras que contienen el exón 19 de EGFR de tipo salvaje se digirieron selectivamente con la enzima TaqI. Entonces, diluciones de hasta 1:10.000 de ADN mutante a genómico se sometieron a PCR en un formato de enriquecimiento (Tc = 81,5 o 81ºC) o en un formato de PCR normal (95ºC). El enriquecimiento de la mutación se cuantificó mediante la digestión con TaqI seguido de dHPLC (FIG. 11). La cantidad de mutación presente se

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cuantificó por la presencia de un pico de mutación separado a un tiempo de retención de alrededor de 7 min. Tras el procedimiento de enriquecimiento, el pico de mutación es mucho más evidente que tras la PCR normal. En conclusión, el procedimiento de enriquecimiento mejoró sustancialmente la detección de mutaciones de nivel muy bajo identificadas vía RFLP-PCR.

Aunque esta invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencias a realizaciones preferidas de la misma, se entenderá por los expertos en la técnica que se pueden realizar en ella diversos cambios en forma y detalles sin separarse del alcance de la invención englobado por las reivindicaciones anejas.

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