MXPA05006448A - Ensayo para la actividad de h rnasa. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para detectar el desdoblamiento mediado por nucleasa de un acido nucleico objetivo a traves de hibridizar un acido nucleico objetivo a una sonda de oligonucleotido fluorescentemente etiquetada complementariamente al acido nucleico objetivo y que contiene un fluoroforo en una terminacion y un grupo de extincion en la otra terminacion. Cuando la sonda no esta hibridizada al acido nucleico objetivo, la sonda adopta una conformacion que coloca el fluoroforo y el agente de extincion en proximidad tal que el agente de extincion extingue la senal fluorescente del fluoroforo y la formacion del hibrido dirigido por la sonda causa suficiente separacion del fluoroforo y el agente de extincion para reduccion la extincion de la senal fluorescente del fluoroforo. Una vez hibridizada, el metodo pone en contacto el hibrido dirigido por la sonda con un agente que tiene actividad de nucleasa en una cantidad suficiente para desdoblar selectivamente el acido nucleico objetivo y por ello liberar la sonda intacta. Se mide luego el detectar la liberacion de la sonda seguido por una reduccion en la senal fluorescente del fluoroforo en comparacion con la senal del hibrido dirigido por la sonda.

Description

ENSAYO PARA LA ACTIVIDAD DE H RNASA Campo de la Invención La presente invención se refiere a ensayos capaces de detectar y monitorear la actividad de H KNasa en tiempo real. Más específicamente, la invención se refiere a ensayos para monitorear la degradación enzimática de un dúplex ARN-ADN mediante la extinción por fluorescencia.

Antecedentes de la Invención H RNasa. La H KNasa es una enzima conocida que degrada el ARN hibridizado a una plantilla de ADN. Por ejemplo, la enzima Hl de la RNasa de la E. coli es responsable de la eliminación de los cebadores del ARN a partir de hebras de guía y siguientes durante la síntesis del ADN. La RNasa es también una enzima importante para la replicación de genomas bacterianos, virales y humanos. Por ejemplo, la holoenzima de la transcriptasa inversa del VIH tiene una actividad de H RNasa localizada en la subunidad p66 del término C (Hansen et al., EMBO J. 1998, 7:239-243), y la inhibición de la actividad de la enzima afecta al menos tres únicos puntos dentro del ciclo de vida del virus (Schatz et al., FEBS Lett. 1989, 257:311-314; Mizrahi et al., Nucí. Acids Res. 1990, 18:5359-5363; Furfine & Reardon, J. Biol . Chem. 1991, 266:406-412). Por otra parte, las mutaciones que afectan la REF:i64246 actividad de la H RNasa del VIH también suprimen la infectividad viral (Tisdale et al., J. Gen. Virol. 1991, 72:59-56), que enfatiza la utilidad potencial para la enzima como un direccionamiento antiviral . Existe un interés considerable en los métodos y ensayos que son capaces de detectar y monitorear la actividad de la H RNasa y de identificar compuestos que pueden afectar o modular la actividad de la enzima. Sin embargo, los ensayos existentes para la actividad de la H RNasa así como otros métodos para establecer si ha ocurrido y hasta qué punto una división de los ácidos nucleicos resultan típicamente laboriosos y consumidores de tiempo. Por otra parte, los ensayos que existen también son discontinuos y no pueden monitorear la reacción de la RNasa en tiempo real. Esto es particularmente una desventaja en aplicaciones en donde un usuario desea establecer información cinética precisa para la enzima, tal como caracterizar los efectos de un nuevo compuesto inhibidor.

Transferencia de Energía mediante Resonancia por Fluorescencia (FRET) . La hibridización de secuencia específica de las sondas de oligonucleótidos etiquetados ha sido usada como un medio para detectar e identificar las secuencias de nucleótidos seleccionados y la etiquetación de tales sondas con etiquetas fluorescentes ha proporcionado medios no radioactivos relativamente sensibles, para facilitar la detección de la hibridización de la sonda. Los métodos de detección recientes emplean el proceso de transferencia de energía por fluorescencia (FRET por sus siglas en inglés) en lugar de la detección directa de la intensidad de fluorescencia para detectar la hibridización por sonda. La transferencia de la energía de fluorescencia se presenta entre un fluoroforo donador y un colorante de agente de extinción (que puede o no ser un fluoroforo) cuando el espectro de absorción de uno (el agente de extinción "quencher") traslapa el espectro de emisión del otro (el donador) y los dos colorantes se encuentran en proximidad cercana. Los colorantes con estas propiedades son referidos como pares de colorantes que transfieren energía o pares de colorantes donador/agente de extinción. La energía en estado excitado del fluoroforo donador se transfiere mediante una resonancia de interacción dipolar inducida por un dipolo al agente de extinción adyacente. Esto resulta en la extinción de la florescencia del donador. En algunos casos, si el agente de extinción es también un fluoroforo, puede mejorarse la intensidad de esta fluorescencia. La eficiencia de transferencia de energía depende principalmente de la distancia entre el donador y el agente de extinción, y las ecuaciones que predicen estas relaciones han sido desarrolladas por Fóster (¾nn. Phys . 1948, 2:55-75) . La distancia entre el donador y los colorantes agentes de extinción cuya eficiencia de transferencia de energía es del 50% es referida como la distancia Fóster (RO) . Se conocen también otros mecanismos de agente de extinción de fluorescencia que incluyen por ejemplo, transferencia de carga y extinción por colisión. La transferencia de energía y otros mecanismos que dependen de la interacción de dos colorantes en proximidad cercana para producir la extinción son un medio atractivo para detectar o identificar secuencias de nucleótidos, tales ensayos pueden ser conducidos en formatos homogéneos . Los formatos de ensayo homogéneos son más simples que los ensayos de hibridización de sonda convencionales que dependen de la detección de la fluorescencia de una etiqueta fluoróforo sencilla, ya que los ensayos heterogéneos requieren generalmente de etapas adicionales para separar una etiqueta hibridizada a partir de la etiqueta libre. Tradicionalmente, la FRET y los métodos relacionados han dependido del monitoreo de un cambio en las propiedades de la fluorescencia de una o ambas etiquetas cuando se producen junto con la hibridización de dos oligonucleótidos complementarios. En este formato, el cambio en las propiedades de fluorescencia pueden medirse como un cambio en la cantidad de transferencia de energía o como un cambio en la cantidad de agente de extinción por fluorescencia, indicado típicamente como un incremento en la intensidad de la fluorescencia de uno o ambos colorantes. De esta forma, la secuencia de los nucleótidos de interés puede ser detectada sin separar los oligonucleótidos hibridizados o no hibridizados . La hibridización puede presentarse entre dos oligonucleótidos complementarios separados, uno de los cuales se etiquetan con el fluoróforo donador y uno que se etiqueta con el agente de extinción. En la forma de hebra doble, existe una disminución de la fluorescencia del donador (extinción incrementada) y/o transferencia de energía incrementada comparada con los oligonucleótidos de hebra simple. Varios formatos para los ensayos de hibridización FRET se revisan en Nonisotopic DNA Probé Techniques (1992, Academic Press, Inc.; Ver, en particular las páginas 311-352) Alternativamente, el donador y el agente de extinción pueden enlazarse a un oligonucleótido sencillo tal que existe una diferencia detectable en las propiedades de fluorescencia de uno o ambos cuando los oligonucleótidos son no hibridizados contra cuando se hibridiza a su secuencia complementaria. En este formato, la fluorescencia del donador se incrementa típicamente y la transferencia/extinción disminuyen cuando se hibridizan los oligonucleótidos. Por ejemplo, un oligonucleótido autocomplementario etiquetado en cada extremo puede formar una horquilla que produce los dos fluoróforos (es decir, los extremos 5' y 3') en proximidad espacial cercana en donde puede presentarse una transferencia de energía y una extinción. La hibridización del oligonucleótido autocomplementarlo a esta secuencia en un oligonucleótido secundario divide la horquilla e incrementa la distancia entre los dos colorantes, reduciendo así la extinción. Una desventaja de la estructura de horquilla es que es muy estable y la conversión a la forma hibridizada no extinguida es frecuentemente baja y solo requerida moderadamente, resultando generalmente en un pobre desempeño . Tyagi & Kramer (Nature Biotech. 1996, 14:303-308) describen una horquilla etiquetada como es descrita arriba que comprende una secuencia detectora en el rizo entre los brazos autocomplementarios de la horquilla que forman la célula madre. La célula madre de pares base debe fusionarse a la secuencia detectora para hibridizar al objetivo y provocar una reducción en la extinción. Una sonda Me doble horquilla" y métodos de uso se describen en Bagwell et al., (Nucí. Acids Res. 1994, 22:2424-2425; Ver también, la patente de los E.U.A No. 5,607,834). Estas estructuras contienen la secuencia de enlace de direccionamiento dentro de la horquilla y por lo tanto, involucran la hibridización competitiva entre el direccionamiento y las secuencias autocomplementarias de la horquilla. Bagwel resuelve el problema de las cinéticas de hibridización desfavorable mediante la desestabilización de la horquilla con las no coincidencias.

Se han descrito también, métodos homogéneos que emplean transferencia de energía u otros mecanismos de agente de extinción por fluorescencia para la detección de amplificación de ácidos nucleicos. (Lee et al., Nuc. Acids Res. 1993, 21:3761-3766) describe un método de detección en tiempo real en el que la sonda detectora doblemente etiquetada se divide en una forma de amplificación específica por direccionamiento durante la PCR. La sonda detectora se hibridiza en la dirección descendente del cebador de amplificación de manera que la actividad de la exonucleasa 5' y 3' de la polimerasa Taq digiere la sonda detectora, separando los colorantes fluorescentes que forman un par de transferencia de energía. La intensidad de la fluorescencia se incrementa conforme se desdobla la sonda. Los cebadores de señal (algunas veces referidos también como sondas detectoras) que hibridizan a la secuencia de direccionamiento en la dirección descendente del sitio de hibridización de los cebadores de amplificación han sido descritos para la detección homogénea de la amplificación de ácidos nucleicos (patente de los E.U. No. 5,547,861). El cebador de señal se extiende de manera similar al de la polimerasa en forma similar al de la extensión de los cebadores de amplificación. La extensión del cebador de amplificación desplaza el producto de extensión del cebador de señal en una forma que depende de la amplificación del direccionamiento, produciendo un producto de amplificación secundario de hebra doble que puede ser detectado como una indicación de la amplificación del direccionamiento . Ejemplos de métodos de detección homogéneos para usarse con lo cebadores de señal de hebra simple se describen en la patente de los E.U. No. 5,550,025 (incorporación de colorantes lipofilicos y sitios de restricción) y la patente de los E.U. No. 5,593,867 (detección de la polarización de fluorescencia). Más recientemente, los cebadores de señal han sido adaptados para la detección del direccionamiento de los ácidos nucleicos usando métodos FRET. La patente de los E.U. 5,691,145 describe estructuras con un cuarteto G que contienen un par de colorantes donador/agente de extinción 5' añadidos a la secuencia de enlace de direccionamiento de un cebador de señal de hebra doble. La síntesis de la hebra complementaria durante la amplificación de direccionamiento desdobla el cuarteto G, incrementando la distancia entre el donador y el colorante de agente de extinción resultando en un incremento detectable en la fluorescencia del donador. También han sido descritos recientemente, cebadores de señal de hebra doble, de hebra sencilla parcialmente, etiquetados con pares de colorante donador/agente de extinción. Por ejemplo, la EP 0 878 554 describe cebadores de señal con pares de colorante donador/agente de extinción que flanquean un sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción de hebra sencilla. En presencia del direccionamiento, el sitio de restricción se vuelve de hebra doble y se divide mediante la endonucleasa de restricción. La división separa el par de colorante y disminuye la extinción del donador. La EP 0 881 302 describe cebadores de señal con una estructura de par de bases intramoleculares anexadas a ellos. El colorante del donador de un par de colorante donador/agente de extinción enlazado a la estructura de un par de bases intramoleculares se apagan cuando la estructura se pliega, pero en presencia de una secuencia de direccionamiento complementaria a la estructura de par de bases complementaria se sintetiza intramoleculármente . Este desdobla la estructura de par de bases intramolecularmente y separa al donador y a los colorantes de extinción, resultando en una disminución de la extinción del donador. Nazarenko, et al. (Patente de los E.U. No. 5,866,336) describe un método similar en donde los cebadores de amplificación se configura con las estructuras de horquilla que llevan pares de colorantes donador/agente de extinción. Existe, por lo tanto, una necesidad continua para que los ensayos y métodos sean capaces de detectar y/o monitorear la degradación de ARN y otros ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante enzimas tales como H RNasa. En particular, existe una necesidad de ensayos y métodos que sean capaces de detectar y monitorear tal actividad en tiempo real.

La cita de cualquier referencia en esta sección o en todo el texto de esta solicitud no constituye un reconocimiento de que tal referencia está disponible como "arte previo" para la invención descrita y reivindicada en la presente .

Breve Descripción de la Invención La presente invención supera las desventajas del arte previo proporcionando un método para detectar un desdoblamiento mediado por la nucleasa de un ácido nucleico de direccionamiento a través de (a) hibridizar un ácido nucleico de direccionamiento a una sonda del. oligonucleótido etiquetado fluorescentemente complementaria al ácido nucleico de direccionamiento que contiene un fluoroforo en un término y un grupo de agente de extinción en el otro término, en donde (i) cuando la sonda no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, la sonda adopta una conformación tal que coloca al fluoroforo y al agente de extinción en tal proximidad que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoroforo, y (ii) la formación del híbrido de la sonda-objetivo provoca una separación suficiente del fluoroforo y un agente de extinción para reducir la extinción de la señal fluorescente del fluoroforo; (b) poner en contacto el híbrido de sonda-objetivo con un agente que tiene actividad nucleasa en una cantidad suficiente para desdoblar selectivamente los ácidos nucleicos de direccionamiento y liberar así, la sonda intacta; y (c) detectar la liberación de la sonda mediante la medición de una disminución en la señal fluorescente del fluoróforo comparada a la señal del híbrido de sonda-objetivo. Otra modalidad de la invención proporciona un método para medir la actividad H RNasa de un agente, mediante la hibridización de un ARN de direccionamiento para una sonda de oligodesoxiribonucleótidos etiquetada fluorescentemente, complementaria al ARN de direccionamiento que contiene un fluoróforo en un término y un agente de extinción en el otro término, en donde (i) cuando la sonda no se hibridiza al ARN de direccionamiento, la sonda adopta una conformación tal que coloca al fluoróforo y al agente de extinción en tal proximidad que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoróforo y (ii) la formación del híbrido de sonda-objetivo provoca una separación suficiente del fluoróforo y el agente de extinción para reducir la extinción de la señal fluorescente del fluoróforo; poner en contacto al híbrido de sonda-objetivo con el agente en una cantidad suficiente para desdoblar eficientemente al ARN objetivo y liberar así, la sonda intacta; y medir una disminución en la señal de fluorescencia del fluoróforo comparada a la señal del híbrido de sonda-ob etivo. En una modalidad, el agente se selecciona del grupo que consiste de H RNasa, transcriptasa inversa, Hl y H2 R asa de la E. coli, Hl y H2 de RNasa de humano, ribozimas, transcriptasa inversa HBV e integrasa. En una modalidad preferida, la transcriptasa inversa es la transcriptasa inversa del VIH. Aún en otra modalidad, la transcriptasa inversa contiene un dominio de RNasa. En una modalidad de la presente invención, la sonda es ADN, y el direccionamiento es el substrato híbrido ADN:ARN. También, en una modalidad de la presente invención, la sonda tiene al menos 18 nucleótidos en longitud. En la presente invención, cuando la sonda no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento o al AR , adopta una estructura secundaria de horquilla con una conformación tal que pone al fluoróforo y al agente de extinción en proximidad. Además, cuando la reacción debida a una nucleasa o mediada por la H RNasa se realiza en presencia de un compuesto, en donde una diferencia en proporción de la disminución en la señal fluorescente del fluoróforo durante la reacción de la nucleasa, en comparación a la disminución observada cuando la misma reacción se conduce en ausencia del compuesto, el método es indicativo de la capacidad del compuesto ya sea para inhibir o mejorar la actividad de la nucleasa del agente. En una modalidad de la invención, el método monitorea la señal de fluorescencia del fluoróforo durante la reacción de la nucleasa o mediada por la H RNasa. La presente invención proporciona también, un método de separación por exclusión para un modulador de la actividad de la nucleasa de un agente mediante la hibridización de un ácido nucleico de direccionamiento para una sonda de oligonucleótidos etiquetada fluorescentemente complementaria a los ácidos nucleicos de direccionamiento que contienen un fluoróforo en un término, y a un grupo agente de extinción en el otro término, en donde (i) cuando la sonda no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, la sonda adopta una conformación que coloca al fluoróforo y al agente de extinción en tal proximidad que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoróforo (ii) formación del híbrido de sonda-objetivo provoca una separación suficiente del fluoróforo y el agente de extinción para reducir la extinción de la señal fluorescente del fluoróforo; preparar dos muestras que contienen el híbrido de sonda-objetivo, poner en contacto el híbrido de sonda-objetivo de una primera muestra con el agente en una cantidad suficiente para desdoblar selectivamente al ácido nucleico de direccionamiento y liberar así a la sonda intacta; poner en contacto al híbrido de sonda-objetivo de una segunda muestra con el agente, en una cantidad suficiente para desdoblar selectivamente a los ácidos nucleicos de direccionamiento y liberar así la sonda intacta en presencia de un compuesto candidato que se prueba por su capacidad para modular la actividad de la nucleasa del agente; detectar la liberación de la sonda en cada muestra mediante la medición de la disminución en la señal fluorescente del fluoróforo comparada a la señal del híbrido de sonda-objetivo, y comparar la proporción de la disminución en la señal fluorescente del fluoróforo en las dos muestras, en donde una diferencia en la proporción de la disminución en la señal fluorescente del fluoróforo durante la reacción de la nucleasa en las dos muestras es indicativa de la capacidad del compuesto ya sea para inhibir o mejorar la actividad de la nucleasa del agente En una modalidad preferida, la magnitud mayor o proporción relativa de disminución de la señal fluorescente del fluoróforo en la segunda muestra comparada a la primera muestra indica que el compuesto candidato es un agente agonista. En otra modalidad, una magnitud menor o proporción relativa de disminución de la señal fluorescente del fluoróforo en la segunda muestra comparada a la primera muestra indica que el compuesto candidato es un agente antagonista. La presente invención proporciona también un kit para medir una actividad de la nucleasa de un agente, que comprende un ácido nucleico de direccionamiento y una sonda de oligonucleótidos etiquetada fluorescentemente, complementaria a los ácidos nucleicos de direccionamiento que contienen un fluoróforo en un término y un agente de extinción en el otro término, en donde (i) cuando la sonda no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, la sonda adopta una conformación que coloca al fluoróforo y al agente de extinción en tal proximidad que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoróforo y (ii) formación del híbrido de sonda-objetivo provoca una separación suficiente del fluoróforo y el agente de extinción para reducir la extinción de la señal fluorescente del fluoróforo. En una modalidad del kit, la sonda es al menos de 18 nucleótidos en longitud. En otra modalidad del kit, la sonda, cuando no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, adopta una conformación tal que pone al fluoróforo y al agente de extinción en proximidad. En una modalidad preferida del kit, la sonda es ADN y el ácido nucleico de direccionamiento es un substrato híbrido de ADN:ARN . En una modalidad del kit, la invención también tiene un agente. En una modalidad preferida, el agente se selecciona del grupo que consiste de H RNasa, transcriptasa inversa, Hl y H2 de la RNasa de E. coli, Hl y H2 de la RNasa de humano, ribozimas de cabeza de martillo, transcriptasa inversa HBV e integrasa. Aún en otra modalidad, la transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa del VIH.

La pxesente invención proporciona también una combinación de ensayos para medir una actividad de la nucleasa de un agente, que comprende un ácido nucleico de direccionamiento y una sonda de oligonucleotidos etiquetada fluorescente, complementaria a los ácidos nucleicos de direccionamiento que contienen un fluoróforo en un término y un grupo de agente de extinción en el otro término, en donde (i) cuando la sonda no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, la sonda adopta una conformación tal que coloca al fluoróforo y al agente de extinción en tal proximidad que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoróforo y (ii) formación del híbrido de sonda-objetivo provoca una separación suficiente del fluoróforo y del agente de extinción para reducir la señal fluorescente del fluoróforo. En una modalidad preferida del ensayo, la sonda es un ADN, y los ácidos nucleicos de direccionamiento son un ARN. Aún en otra modalidad, la sonda y los ácidos nucleicos de direccionamiento se hibridizan entre sí para formar un híbrido de sonda-objetivo. En una modalidad de la combinación del ensayo, también existe un agente. En una modalidad preferida, el agente se selecciona del grupo que consiste de H R asa, transcriptasa inversa, Hl y H2 de la RNasa de E. coli, Hl y H2 de la RNasa de humano, ribozimas de cabeza de martillo, transcriptasa inversa HBV e integrasa. En una modalidad adicional, la transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa del VIH.

Breve Descripción de las Figuras Las figuras 1A-1B muestran el análisis PAGE del substrato de AR sintetizado por una reacción de la polimerasa de ARN T7. La figura 1A muestra el producto del ARN evaluado en un gel desnaturalizado (Urea-poliacrilamida al 15% 7 ) , mientras que la figura IB muestra un gel no desnaturalizado (poliacrilamida al 15% nativo) . Los ácidos nucleicos en ambos geles se detectaron mediante el teñido de bromuro de etidio. Los geles en ambas figuras se cargaron como sigue.: Pista 1: plantilla de ADN de 49 mer (SEC ID NO: 2), Pista 2: ARN control de 125 mer, Pista 3-6: ARN derivado de la reacción de la polimerasa del ARN T7, y Pista 7: plantilla de ADN de 49 mer. Las figuras 2A-2D muestran un substrato de ARN-ADN radioetiquetado por PAGE. La figura 2A ilustra el substrato de la secuencia del nucleótido de ADN (SEC ID NO:2) combinado en pares básicos al ARN del substrato (SEC ID N0:1). La figura 2B muestra la imagen de un gel no desnaturalizado cargado con ARN no etiquetado combinado en pares básicos de ARN al ADN etiquetado en el extremo 33P. Las figuras 2C y 2D muestran geles de poliacrilamida desnaturalizados y no desnaturalizados, respectivamente, que han sido cargados tanto con ADN no etiquetado como con ARN radioetiquetado internamente. El método de la detección de los ácidos nucleicos se realiza mediante fosfoimágenes . Las figuras 3A-3B muestran resultados de un ensayo basado en PAGE para la actividad de la H RNasa. La figura 3A muestra los resultados de una modalidad del ensayo en el cual se usa un substrato de ADN etiquetado en un extremo/ARN no etiquetado, en donde la figura 3B muestra los resultados de una modalidad alternativa que usa un substrato de ADN no etiquetado/ ARN etiquetado. Las figuras 4A-4B muestran imágenes de un gel de poliacrilamida cargado con un híbrido de ADN etiquetado en un extremo/ARN no etiquetado digerido en un ensayo para la actividad de la H RNasa RT del VIH. Las figuras 5A-5B muestran gráficas de la actividad de la H RNasa RT VIH determinada a partir del análisis cuantitativo de los geles PAGE ilustrados en la figura 3A y la figura 4, respectivamente. Las figuras 6A-6C muestran la corrida de los geles PAGE con el substrato ssARN que se incubó con (figura 6A) o sin (figura 6B) la enzima H de la RNasa RT VIH 1 U (19 fmol = 2.2 ng) , y un gel PAGE en el que el substrato del híbrido del ADN-ARN de 2.5 pmol se incubó con la enzima para verificar la actividad de la H R asa (figura 6C) . La figura 7 es un gel PAGE de un ensayo de H RNasa que se corrió con poliA (pistas 2-3) , poliU (pistas 4-5) y ARN 18S (SEC ID NO: 5, pistas 6-7) junto con el substrato híbrido de ARN-ADN radioetiquetado. La figura 8 muestra el gel PAGE de un ensayo de H RNasa que se corrió con oligonucleótidos que contaminan, referidos en la presente como Oligo 1 (SEC ID N0:6, pistas 3-5), Oligo 2 (SEC ID NO: 7, pistas 6-8) y Oligo 3 (SEC ID NO: 8, pistas 9-11) . Las figuras 9A-9D muestran los resultados de un ensayo H RNasa basado en PAGE usando una H RNasa del VIH (figura 9A) , H RNasa MMLV (figura 9B) y H RNasa MMLV mutante (figura 9C) . Un análisis cuantitativo de estos datos se gráfica en la figura 9D. Las figuras 10A-10C proporcionan una ilustración esquemática de un ensayo de la H RNasa en tiempo real preferido de la invención. La figura 10A ilustra un ejemplo del substrato de ARN (SEC ID NO: 10) que combina pares básicos para una sonda de ADN ejemplar (SEC ID NO: 9) que se etiqueta con una porción de fluoróforo (F) y una porción agente de extinción (Q) . Las regiones 5' y 3' de la sonda de ADN son capaces de formar pares básicos entre sí después de que el substrato de ARN ha sido digerido por la H RNasa, colocando la porción de fluoróforo y la porción agente de extinción en proximidad suficiente de manera que la porción agente de extinción absorba al menos parte de la señal detectable emitida por la porción de fluoróforo (figura 10B) . La figura 10C ilustra una señal fluorescente típica, que puede observarse en tiempo real como la H R asa que degrada al substrato del ARN en este ensayo. Las figuras 11A-11B son gráficas de las mediciones de intensidad de fluorescencia a partir de los ensayos de H RNasa en tiempo real de la invención que usan H RNasa RT del VIH (figura 11A) y Hl de la RNasa de E. coli (figura 11B) .

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a un método de un ensayo fluorométrico para el monitoreo en tiempo real de la actividad de la H RNasa. Específicamente, la invención se refiere a una valoración cuantitativa de la actividad de la H RNasa a través de una disminución en la fluorescencia.

Definiciones De acuerdo con la invención, puede emplearse biología molecular convencional, microbiología y técnicas de ADN recombinantes dentro de la habilidad del arte. Tales técnicas se explican completamente en la literatura, y los términos usados en la presente, describen tales técnicas que tendrán generalmente el significado usado normalmente en la técnica.

Ver por ejemplo, Sambrook, Fitsch & aniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (referido en la presente como "Sambrook et al., 1989"); DNS Cloning: A Practlcal Approach, volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985) ; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984) ; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds . 1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986) ; B.E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) ; F.M. Ausuble et al., (eds.), Current Protocols ín Molecular Biology, John Wiley Se Sons, Inc. (1994) . El término "etiqueta fluorescente" o "fluoróforo" como se usa en la presente, se refiere a una substancia o porción de la misma, que es capaz de exhibir fluorescencia en el rango detectable. Ejemplos de fluoróforo que pueden usarse de acuerdo a la invención, incluyen isotiocianato de fluoresceína, amina fluoresceína , eosina, rodamina, dansilo, umbeliferona, rojo de Texas, Cy5, Cy3 y europio. Otras etiquetas fluorescentes se conocerán por el experto en la técnica, Algunos lineamientos generales para diseñar sondas de polinucleó idos etiquetados de luoresceína sensibles, pueden encontrarse en la patente de los E.U. de Heller y Jablonski No. 4,996,143. Esta patente menciona los parámetros de las porciones de fluoresceína (es decir, cuando un par de etiquetas fluorescentes se utilizan en el presente método) , y la longitud del brazo enlazador que conecta a las porciones fluorescentes a las unidades base del oligonucleótido . El término "brazo enlazador" como se usa en la presente se define como la distancia en Angstroms de la base de pirimidina o purina en la que el extremo interno se conecta al fluoróforo en su extremo externo. El término "desdoblamiento mediado por la enzima" se refiere al desdoblamiento del ADN o AR que se cataliza por tales enzimas como DNasas, RNasas, helicasas, exonucleasas , endonucleasas de restricción o integrasas retrovirales . Otras enzimas que efectúan el desdoblamiento de los ácidos nucleicos se conocerán por un experto en la técnica y pueden emplearse en la práctica de la presente invención. Una revisión general de estas enzimas pueden encontrarse en el capítulo 5 de Sambrook et al . supra . Como se usa en la presente, los términos "ácido nucleico" , "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a cebadores, sondas, fragmentos de oligómeros que van a detectarse, controles de oligómeros y oligómeros de bloqueo no etiquetados, que serán genéricos a los polidesoxiribonucleótidos (que contienen 2 -desoxi-D-ribosa) , a los poliribonucleótidos (que contienen D-ribosa) así como a los polinucleótidos quiméricos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa y nucleótidos D-ribosa) , y a cualquier otro tipo de polinucleótido que es un N glucósido de una base de purina o pirimidina, o bases de purina o pirimidina modificadas. No existe una distinción concebida en longitud entre el término "ácido nucleico" , "polinucleótido" y "oligonucleótido" , y estos términos se usan indistintamente. Así, estos términos incluyen ADN de hebra simple y doble, así como ARN de hebra simple y doble. Preferiblemente, los oligonucleótidos usados junto con los ensayos de esta invención serán al menos de 10 nucleótidos en longitud, y más preferiblemente entre aproximadamente 10 y 100 nucleótidos en longitud, con oligonucleótidos entre aproximadamente 25 y 50 nucleótidos en longitud que son los más preferidos . Los oligonucleótidos no se limitan necesariamente a especies derivadas físicamente aisladas a partir de cualquier secuencia natural o existente, pero pueden ser generadas de cualquier forma que incluyen la síntesis química, replicación de ADN, transcripción inversa o una combinación de las mismas. Los términos "oligonucleótido" o "ácidos nucleicos" se refieren a un polinucleótido de ADN o ARN genómico, semisintético u origen sintético que, en virtud de su derivación o manipulación: (1) no se afilia con toda o una porción del polinucleótido que se asocia en naturaleza, y/o (2) se une a un polinucleótido distinto al que se une en la naturaleza; y (3) no es natural (no se encuentra en la naturaleza) . Los oligonucleótidos están compuestos de mononucleótidos que reaccionan para elaborar oligonucleótidos, de tal forma que el fosfato 5' de un anillo pentosa de mononucleótidos se une al oxígeno 3' de su vecino en una dirección vía un enlace de fosfodiéster, referido como el extremo 5' de un oligonucleótido si su fosfato 5' no se enlaza al oxígeno 3' de un anillo de pentosa del mononucleotido y posteriormente referido como "extremo 3 ' " si su oxígeno 3' no se enlaza al fosfato 5' de un anillo de pentosa del mononucleotido posterior. Una secuencia del ácido nucleico, aún si se interna en un oligonucleótido más grande, puede decirse también que tiene extremos 5' y 3'. Dos oligonucleótidos no traslapados distintos que forman pares básicos a dos regiones diferentes de la misma secuencia de los ácidos nucleicos complementarios lineal, de manera que el extremo 3 ' de un oligonucleótido se dirige hacia el extremo 5' del otro, serán llamados oligonucleótidos "en la dirección descendente" y el último oligonucleótido "en la dirección descendente" . En general , "en la dirección descendente" se refiere a una posición localizada en la dirección 3' en un oligonucleótido de hebra simple, o en un oligonucleótido de hebra doble se refiere a una posición localizada en la dirección 3' de la hebra del nucleótido de referencia. El término "cebador" puede referirse a más de un oligonucleótido, si se aisla naturalmente como una digestión de restricción purificada o producida sintéticamente. El cebador debe ser capaz de actuar como un punto de inicio de la síntesis a lo largo de una hebra complementaria (ADN o ARN) cuando se coloca bajo condiciones de reacción, en las que el producto de extensión del cebador sintetizado es complementario a la hebra de los ácidos nucleicos. Estas condiciones de reacción incluyen la presencia de los cuatro trifosfatos desoxiribonucleótidos distintos y un agente que incluye una polimerización tal como una polimerasa de ADN o una transcriptasa inversa. Las condiciones de reacción incorporan el uso de una solución amortiguadora compatible (que incluye componentes que son cofactores, o que afectan el pH, resistencia iónica, etc.) a una temperatura óptima. El cebador es preferiblemente de hebra sencilla para la máxima eficiencia en la reacción de amplificación. Una secuencia de los ácidos nucleicos complementaria se refiere a un oligonucleótido que, cuando se alinea con la secuencia de los ácidos nucleicos tal que el extremo 5' de una secuencia se combina en pares con el extremo 3' del otro. Esta asociación se llama "antiparalelo" . Las bases análogas modificadas no encontradas comúnmente en los ácidos nucleicos pueden incorporarse (enzimáticamente o sintéticamente) en los ácidos nucleicos, pero no se limitan a cebadores, sondas o productos de extensión de la presente invención y pueden incluir por ejemplo, inosina y 7-deazaguanina. La complementariedad de dos hebras de ácidos nucleicos puede no ser perfecta, algunos dúplex estables pueden contener pares de bases no coincidentes o pares de bases sin coincidir y un experto en la técnica en tecnología de ácidos nucleicos, puede determinar su estabilidad hipotética considerando un número de variables que incluyen, la longitud del oligonucleótido, la concentración de las bases de citosina y guanina en el oligonucleótido, resistencia iónica, pH y el número, frecuencia y localización del pares base no coincidentes . La estabilidad de un dúplex de los ácidos nucleicos se mide por la fusión o disociación de la temperatura, o "Tm" . La Tm de un dúplex de los ácidos nucleicos particular bajo condiciones de reacción especificas es la temperatura en la cual la mitad del par de bases se ha disociado . Como se usa en la presente, el término "secuencia objetivo" o "secuencia de ácidos nucleicos de direccionamiento" se refiere a una región de los oligonucleótidos que va a ser amplificada, detectada o ambos. Los residuos de la secuencia de direccionamiento entre las dos secuencias cebadoras usadas para la amplificación o como un producto del cADN de hebra sencilla transcrita inversa. La secuencia de direccionamiento puede derivarse ya sea naturalmente a partir de una muestra o espécimen o producida sintéticamente . Como se usa en la presente, una "sonda" comprende un ribo-oligonucleótido que forma una estructura dúplex con una secuencia en los ácidos nucleicos de direccionamiento, debido a la complementariedad de al menos una secuencia del ribo-nucleótido para una secuencia en la región de direccionamiento. La sonda, no contiene preferiblemente una secuencia complementaria a la secuencia (s) usadas para preparar la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) o la reacción de transcripción inversa (RT) . La sonda puede ser quimérica, esto es, compuesta en parte de ADN. Cuando se usan sondas quiméricas, el extremo 3' de la sonda se bloquea generalmente si este extremo está compuesto de una porción de ADN para prevenir la incorporación de la sonda en el producto de extensión del cebador. La adición de porciones químicas tales como biotina, fluoresceína, rodamina e incluso un grupo fosfato en el hidroxilo 3' de la última base de desoxiribonucleótido puede servir como los grupos de bloqueo de extremo 3' y bajo casos definidos específicos pueden servir simultáneamente como etiquetas detectables o como agentes de extinción. Además, la sonda puede incorporar bases modificadas o enlaces modificados para permitir un mayor control de hibridización, polimerización o hidrolización. El término "etiqueta" se refiere a cualquier átomo o molécula que puede usarse para proporcionar una señal en tiempo real detectable (preferiblemente cuantificable) . La etiqueta detectable puede unirse a una proteina o sonda de los ácidos nucleicos . Las etiquetas proporcionan señales detectables ya sea de fluorescencia, fosforescencia, quimioluminiscencia, radioactividad, colorimétrico (ELISA) , difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática o una combinación de estos. El término "porción agente de extinción/emisor" se refiere a un compuesto que es capaz de absorber la energía luminosa de una longitud de onda mientras emite simultáneamente energía luminosa de otra longitud de onda. Este incluye porciones fluorescentes y fosforescentes. Los requerimientos para elegir los pares absorbente/emisor son: (1) deben ser funcionalizados fácilmente y acoplados a la sonda, (2) el par absorbente/emisor no debe de ninguna manera impedir la hibridización de la sonda funcionalizada a su secuencia de direccionamiento de los ácidos nucleicos complementaria, (3) la emisión final (fluorescencia) debe ser a lo máximo suficiente y dura bastante para ser detectada y medida por un experto en la técnica; y (4) el uso de agentes de extinción compatibles deben permitir una nulificación suficiente de cualquiera de las emisiones adicionales. Como se usa en esta aplicación, "tiempo real" se refiere a la detección de la producción cinética de la señal, que comprende tomar una pluralidad de lecturas para caracterizar la señal durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, una medición en tiempo real puede comprender la determinación del tiempo requerido antes de que la secuencia de direccionamiento se haya amplificado a un nivel detectable. El término "quimioluminiscente y bioluminiscente" incluyen porciones que participan las reacciones que emiten luz. Las porciones quimioluminiscentes (catalizadores) incluyen peroxidasa, luciferasa bacteriana, luciferasa de luciérnaga, derivados de hierro-porfirina funcionalizados y otros . Como se define en la presente, "actividad nucleasa" se refiere a la actividad de una nucleasa de ácidos nucleicos de plantilla específica, H RNasa. Como se usa en la presente, el término "H RNasa" se refiere a una enzima que degrada específicamente la porción de ARN de los híbridos de ADN/ARN. La enzima no desdobla ARN o ADN de hebra doble o sencilla, y un híbrido termoestable esta disponible que permanece activo a temperaturas que se encuentran típicamente durante el PCR. Generalmente, la enzima iniciará la actividad de la nucleasa por medio de la cual los ribonucleótidos se eliminan o los ribo-oligonucleótidos se desdoblan en el dúplex de ARN-ADN formados cuando la sonda forma pares básicos para la secuencia de ADN de direccionamiento. El término "condiciones de hibridización o reacción" se refiere a un ensayo de la solución amortiguadora bajo condiciones que permiten la hibridización selectiva de la sonda etiquetada a su secuencia de ácidos nucleicos de direccionamiento complementarios . Estas condiciones son tal que la hibridizacion específica de la sonda para la secuencia de ácidos nucleicos de direccionamiento se optimiza aun cuando permite simultáneamente pero no se limita al desdoblamiento del híbrido de sonda-obj etivo mediante una enzima de nucleasa o mediante otro agente que tiene una actividad de nucleasa. Las condiciones de reacción se optimizan para los co-factores, resistencia iónica, pH y temperatura .

Ensayo de Cebadores Fluorescentes de la H RNasa En las modalidades preferidas, los ensayos y métodos de la presente invención detectan la actividad de la H RNasa y/o otros desdoblamientos mediados por la nucleasa de ácidos nucleicos en un ensayo que se refiere en la presente como un ensayo de "cebador fluorescente". Una modalidad ejemplar de tal ensayo se ilustra esquemáticamente en las figuras 10A-10C. El ensayo detecta la degradación de un substrato de ácidos nucleicos con, preferiblemente un substrato de ARN que se combina en pares básicos en al menos una región o parte de una sonda de oligonucleótidos . En las modalidades preferidas, la sonda de oligonucleótidos es una sonda de ADN (por ejemplo, una sonda de desoxioligonucleótidos) , que pueden ser referidos también en el contexto de esta invención como la porción del "substrato" del ADN. Típicamente, tanto la sonda de oligonucleótidos como el substrato de ARN serán moléculas de oligonucleótidos que se encuentran entre alrededor de 10 y aproximadamente 100 nucleótidos en longitud y pueden estar por ejemplo, entre aproximadamente 10-50 nucleótidos en longitud, más preferiblemente entre 15-25 nucleótidos en longitud. En las modalidades preferidas, la sonda de oligonucleótidos tiene al menos 18 nucleótidos en longitud. La figura 10A muestra un ejemplo de substrato de ARN que tiene una secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO:10 y forma pares básicos en una sonda de ADN ejemplar que tiene la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO: 9. Sin embargo, estas secuencias son solo un ejemplo, para los propósitos de ilustrar y mejorar la explicación de la presente invención. La secuencia actual del substrato de ARN y/o sonda de oligonucleótidos. no es crítica y aquellos expertos en la técnica serán capaces de diseñar fácilmente otras secuencias apropiadas sin una experimentación indebida.

No obstante, el substrato y las secuencias de sonda tendrán preferiblemente ciertas propiedades. En particular, la sonda de oligonucleótidos comprende preferiblemente regiones de secuencias que son referidas en la presente como la región 5' y la región 3' y se localizan en los extremos 5' y 3' de los oligonucleótidos, respectivamente. Estas regiones 5' y 3' comprenden preferiblemente las secuencias que son complementarias entre sí tal que, cuando la sonda de oligonucleótidos no forma pares básicos en un substrato de ARN, las dos regiones pueden hibridizarse entre sí y formar así, un rizo de horquilla, tal como el rizo de horquilla del ejemplo ilustrado en la figura 10B. La sonda de oligonucleótidos también comprende preferiblemente una tercer región de la secuencia que se sitúa preferiblemente entre la región 5' y su región 3' de la sonda, y es por lo tanto referida en la presente como la "región central" de la sonda de los oligonucleótidos. La secuencia actual de esta región central tampoco es crítica para la práctica de la presente invención. Es suficiente que la región central de la sonda de oligonucleótidos sea lo suficientemente complementaria al menos en una parte del substrato del ADN de manera que las dos moléculas sean capaces de hibridizarse entre sí bajo condiciones de ensayo.

La sonda de los oligonucleótidos usada en un ensayo de cebador fluorescente de esta invención puede comprender también una etiqueta detectable que, en las modalidades preferidas, comprende una porción fluorescente o "fluoróforo" que emite una señal fluorescente detectable. Preferiblemente, la sonda de oligonucleótidos comprende además una porción para extinción "agente de extinción" que, cuando se coloca en proximidad cercana a la porción del fluoróforo es capaz de absorber al menos una parte de la señal fluorescente emitida por la porción de fluoróforo. Las etiquetas fluorescentes adecuadas y de agente de extinción apropiadas para usarse con estas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, la porción de fluoróforo puede ser fluoresceína y la porción del agente de extinción puede ser dabcilo. Ambas de estas etiquetas se encuentran comercialmente disponibles, por ejemplo, de Stratagene (La Jolla, California) . Sin embargo, una variedad de otras porciones está generalmente disponible y/o de otra manera en la técnica, el uso de tales fluoróforo y porciones de agente de extinción se contemplan también en la presente invención. Aquellos expertos en la técnica serán capaces de identificar fácilmente otras etiquetas y agentes de extinción que son adecuados y que pueden usarse en un cebador fluorescente de otros ensayos de esta invención. Las porciones de agente de extinción y de fluoróforo se unen preferiblemente a los extremos opuestos de la sonda de oligonucleótidos. Así, la sonda de oligonucleótidos del ejemplo de la figura 10A ilustrada que tiene la porción de fluoróforo unida a la región 3' (por ejemplo, en el extremo 3') de la sonda de oligonucleótidos aun cuando la porción del agente de extinción se une a la región 5' (por ejemplo, en el extremo 5') de la sonda de oligonucleótidos. Sin embargo, las modalidades en las cuales la porción del agente de extinción se unen a la región 3' y la porción fluoróforo se une a la región 5' se contemplan también y en general se preferirán igualmente . Por lo tanto, no es crítico cual porción del agente de extinción o de fluoróforo particular se une al extremo particular de la sonda de oligonucleótidos . Sin embargo, las dos porciones se colocan preferiblemente tal que, cuando la sonda de oligonucleótidos se combina en pares básicos al substrato de ARN, las porciones de agente de extinción y de fluoróforo son lo suficientemente extrañas entre sí, que la porción del agente de extinción no absorbe una cantidad detectable de señal a partir de la porción de fluoróforo. Sin embargo, cuando las regiones 5' y 3' de la sonda de oligonucleótidos se hibridiza entre sí y/o la sonda de oligonucleótidos forma un rizo de horquilla (como se muestra por ejemplo, en la figura 10B) , las porciones de fluoróforo y de agente de extinción deben estar lo suficientemente juntas de manera que al menos una parte de la señal emitida por el fluoróforo se absorba por el agente de extinción tal que la intensidad de señal fluorescente de la muestra se reduce detectablemente . Por lo tanto, en las modalidades preferidas, un cebador fluorescente del ensayo empezará con una muestra que contiene una sonda de oligonucleótidos y un substrato de ARN bajo condiciones de manera tal que la sonda de oligonucleótidos y el substrato de AR se combinen en pares básicos entre sí, como se ilustra en la figura 10A. Una enzima u otra molécula que tiene o se sospecha que degrada ARN (por ejemplo, una enzima H RNasa) puede entonces añadirse a la muestra y opcionalmente, puede añadirse también un compuesto de prueba que se sospecha que modula la actividad enzimática. La sonda y el substrato se incuban entonces en presencia de la enzima y el compuesto de prueba opcional, y se mide la intensidad de señal fluorescente de la muestra. Sin que se limite a alguna teoría particular o mecanismo de acción, se entiende que cuando el substrato de ARN se digiere en la muestra, una fracción que se incrementa de las sondas de oligonucleótidos se autohibridizará, por ejemplo, para formar rizos de horquilla como los ilustrados en la figura 10B. Así, conforme avanza la reacción de la RNasa, un número creciente de las sondas de oligonucleótidos adoptará una conformación en donde la porción del agente de extinción se pone en proximidad cercana con la porción del fluoróforo, de manera que su señal fluorescente es atenuada efectivamente o "extinguida" . Este efecto puede ser observado como los progresos de la reacción, monitoreando la intensidad de fluorescencia de la muestra. En particular, se comprende que debido a que el substrato de ARN se digiere, la intensidad de la fluorescencia observada disminuirá en el tiempo produciendo un perfil tal como el perfil del ejemplo que se muestra en la figura 10C.

Beneficios y Usos Se ha desarrollado un ensayo cinético o basado en una proporción, para evaluar la actividad de la H R asa. El poder del ensayo se subraya por su capacidad para utilizar fluoróforos múltiples, la aplicación de este ensayo a la separación por exclusión de alto rendimiento para el desarrollo del fármaco y para la evaluación rápida de constantes cinéticas. En combinación con ensayos realizados en un formato radioactivo se ha demostrado que este ensayo es específico para la degradación de ARN en un substrato del híbrido de ARN/ADN. Este ensayo es superior a otros ensayos de H RNasa en la literatura mediante varios criterios (cálculo precipitable sin TCA radioactivo y basado en un gel, y ensayo de captura IGEN) . Primero, el ensayo es rápido y aplicable a la separación por exclusión de alto rendimiento (HTS) en formatos de pozos múltiples, que incluyen pero no se limitan a 96, 384 y 1536 formatos de pozo. Segundo, la sensibilidad de este ensayo es igual o mejor en relación con los ensayos basados en gel de poliacrilamida. Este ensayo pide una magnitud más sensible que los ensayos de liberación radioactiva tradicional (ver por ejemplo, Stavrianopoulos, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1976, 73:1087-1091; Papaphilis & Kamper, Anal. Biochem. 1985 145:160-169; Krug & Berger, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86:3539-3543; Crouch et al., Methods Enzymol. 2001, 341:395-413; Lima, Methods Enzymol . 2001, 341:430-440; Synder & Roth, Methods Enzymol. 2001, 341-440-452) . Tercero, en relación con el ensayo IGEN (formato de 96 pozos) es una determinación directa de la actividad de la H RNasa que no depende de la captura del producto para la detección de la actividad de la enzima o inhibición de la actividad de la enzima. Cuarto, el ensayo se basa en una proporción que permite la determinación directa de las constantes de inhibición. Este ensayo combinado, proporciona la sensibilidad de un ensayo basado en un gel radioactivo con la velocidad más alta que el ensayo de liberación radioactiva y no requiere un segundo evento para la detección de la actividad de la enzima como el ensayo de captura IGEN. El valor comercial de este ensayo es la evolución del fármaco. Las modificaciones de este ensayo permitirán el desarrollo de nuevos ensayos tal como la integrasa de VIH u otras enzimas que metabolizan ADN y ARN.

EJEMPLOS La presente invención se describe también por medio de los siguientes ejemplos. Sin embargo, el uso de estos y otros ejemplos en cualquiera de la especificación son ilustrativos y no limita el alcance y significado de la invención de cualquier término ejemplificado. Así mismo, la invención no se limita a cualquiera de las modalidades preferidas particulares descritas en la presente. De hecho, muchas modificaciones y variaciones de la invención pueden ser aparentes por aquellos expertos en la técnica luego de leer esta especificación y pueden elaborarse sin apartarse del espíritu y alcance. Por lo tanto, la invención sólo se limita por los términos de las reivindicaciones anexadas junto con el alcance total de equivalentes en donde las reivindicaciones son autorizadas.

EJEMPLO; Medición de la actividad de la H RNasa en un ensayo de punto final . Este ejemplo describe experimentos que usan un ensayo basado en un análisis PAGE de punto final para medir las actividades de dos ejemplos de enzimas H RNasa: Hl RNasa de E coli y transcriptasa inversa de VIH. En el VIH, la holoenzima (RT) de la transcriptasa inversa p66/p51 de VIH tiene una actividad RNasa que se localiza en el extremo de la terminal C de la subunidad p66 (Hansen et al., EMBO J. 1988, 7:239-243; Kohltaedt et al., Science 1992,256:1783-1790; y Sarafianos et al., EMBO J. 2001, 20:1449-1461). Las mutaciones que efectúan la actividad de la H RNasa de las enzimas también suprimen la infectividad del virus {Id.), en la que la H RNasa elabora un direccionamiento atractivo para las nuevas terapias antivirales.

Materiales y Métodos La H R asa. Las muestras del heterodímero p66/p51 de VIH se obtuviero de Enzyco, Inc. (Replidyne Inc., Louisville CO) Los métodos de la expresión recombinante, purificación y caracterización de esta enzima se han descrito previamente (Thimming & McHenry, J". Biol. Chem. 1993, 268:16528-16536). La pureza de las muestras de las enzimas se verificó en gel de poliacrilamida . También se ensayó su actividad especifica y se determinó para ser 27 d TP min, que fue comparable a la actividad específica de otras enzimas RT de VIH. Las muestras de la Hl RNasa de E. coli se adquirieron de EPICENTR (Madison, WI) .

Substrato de ARN-ADN. Las reacciones iniciales usadas como la molécula ssARN se combinaron en pares básicos a una secuencia de ADN complementaria. De manera breve, las moléculas ssARN que tienen la secuencia del nucleótidos establecida en la SEC ID NO:l (se muestra abajo) se produjo mediante una reacción de la polimerasa de ARN T7 usando un kit de transcripción de alto rendimiento EGAshortscript™ (Ambion Inc., Austin Texas) . De manera breve, los oligómeros combinados en pares básicos (SEC ID NOS: A y B, mostrados abajo) se usaron como el substrato de ADN para la síntesis de la secuencia de ARN establecida en la SEC ID NO : 1 (se muestra bajo) con una polimerasa de ARN T7.

El ARN generado en esta reacción se analizó cuantitativamente en el bromuro de etidio (EtBr) teñido con geles de poliacrilamida desnaturalizados (figura 1A) y no desnaturalizados (figura IB) . Estos geles resuelven el producto del ARN de 29mer deseado, pero también revelan cantidades significativas de un producto de ARN "snapback" estimado para ser de aproximadamente de 45 a 49 nucleótidos en longitud. El ARN radioetiquetado se generó incorporando 33P-ATP en la reacción de la polimerasa del ARN T7, y combinado en pares básicos a un ssADN no etiquetado de 49mer que tiene la secuencia del nucleótido establecida en la SEC ID NO: 2 (se muestra abajo) . En una versión alternativa de estos experimentos, los oligonucleótidos de ADN complementarios (SEC ID NO: 2) se radioetiquetaron con 33P en el extremo 5' por PNK T4 y se combinaron en pares básicos al ssARN de 29 mer no etiquetado (SEC ID N0:1) . 5 ' -GACTAATACGACTCACTATAGGAAGAAAATATCATCTTTGGTGTTAACA-3 ' (SEC ID NO: A) 3 ' -CTGATTATGCTGAGTGATATCCTTCTTTTATAGTAGAAACCACAATTGT-5' (SEC ID NO:B) 5'-GGAAGAAAAUAUCAUCUUUGGUGUUAACA-3' (SEC ID NO:l) 5 ' -TGTTAACACCAAAGATGATATTTTCTTCCTATAGTGAGTCGTATTAGTC-3 ' (SEC ID NO: 2) La calidad de estos substratos híbridos radioetiguetados de ARN-ADN se evaluaron cuantitativamente en geles de poliacrilamida . La figura 2B muestra la imagen de un gel no desnaturalizado cargado con el ARN no etiquetado (SEC ID N0:1) combinado en pares básicos al ADN etiquetado en el extremo 33P (SEC ID NO: 2) , mientras que las figuras 2C-2D muestran imágenes de geles desnaturalizados (figura 2C) y no desnaturalizados (figura 2D) cargados con ARN radioetiquetados (SEC ID NO: 1) combinados en pares básicos a un ADN no etiquetado (SEC ID NO: 2) . Las fosfoimágenes cuantitativas del ARN etiquetado en geles desnaturalizados (figura 2C) indican que el ARN "snapback" contaminante representa aproximadamente del 35 al 40% del ARN total. Como se espera, las especies de ARN "snapback" no se observan en el gel nativo (es decir, gel no desnaturalizado) (figura 2D) , puesto que la separación de las moléculas de ARN en el gel depende tanto de la ' conformación como el tamaño de las especies de ARN diferentes, considerando que la separación en el gel desnaturalizado de la figura 2C depende de la conformación de las moléculas nativas.

Resultados ; Degradación del ARN Dependiente del Tiempo Mediante la H RNasa. Las alícuotas que contenían 0.5 pmol del substrato de ADN-ARN radioetiquetado (concentración 25 nM) y 0.1 U de la transcriptasa inversa del VIH (concentración 1.9 fmol a 0.095 M) se incubaron en una solución amortiguadora Tri (pH 8) con 10 mM de MgCl2, el KCl (entre 0 y 30 rti ) , 3% de glicerol, NP-40 al 0.2%, 50 µg/ml de BSA y 1 ram de DTT. En un experimento paralelo, las alícuotas que contenían 0.5 pmol del substrato de ADN-ARN etiquetado (concentración 25 n ) se incubaron también con 0.01 U de la enzima Hl de R asa de E. coli en una solución amortiguadora Tris (pH 7.5) que contenía 100 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, glicerol al 3%, NP-40 al 0.02% y 50 µg/ml de BSA. Las distintas alícuotas se incubaron a 37°C para 0 (es decir, < 30 segundos), 5, 10, 20, 30, 40 y 60 minutos para permitir la degradación del AR mediante las enzimas de la H RNasa, después de este tiempo, las reacciones se apagaron mediante la adición de un volumen igual de EDTA 100 mM. Los productos de la reacción se analizaron por PAGE. Los resultados se presentan en las figuras 3A-3B. Eri particular, la figura 3A muestra la imagen de una corrida de gel de poliacrilamida para un substrato de ADN etiquetado en un extremo/ARN no etiquetado digerido con la H RNasa RT de VIH (pistas 1-7) y la Hl de RNasa de E. coli (pistas 9-14) . La pista 8 muestra los resultados de un experimento de control en donde no está presente la enzima (NE) . Como se esperaba, la intensidad de las bandas que corresponden al híbrido ARN-ADN como alícuotas se incubaron durante tiempos prolongados, mientras que la intensidad de las bandas que corresponden al ADN etiquetado solo se incrementa.

La figura 3B muestra la imagen de una corrida de gel de poliacrilamida idéntica para un substrato híbrido de ADN no etiquetado/ARN etiquetado digerido con la RNasa RT de VIH 3U (66 fmol en 6.6 nM) con 50 m de HEPES (pH 8) , 10 mM de MgOAc, 0.02% de NP-40, 5 g/µ? de BSA, 3% de glicerol y DTT 2m . Los productos de desdoblamiento de la enzima de RNasa son visibles y se degradaron en una forma de relación similar que depende de la proporción como en la figura 3A. Para investigar la capacidad del ensayo y distinguir los distintos niveles de la actividad RNasa, experimentos adicionales se realizaron usando diferentes concentraciones del substrato y/o enzima RT-VIH. 150 nM de substrato híbrido de ADN etiquetado en su extremo/ARN no etiquetado se incubaron con 0.3 ó 0.1 U de la enzima RT-VIH bajo las condiciones descritas en supra. Los resultados cuantitativos de aquellos experimentos se muestran en las figuras 4A-B. En particular, la figura 4A muestra la imagen de un gel de poliacrilamida cargado con un substrato que se digirió con 0.3 U de la enzima RT-VIH, considerando que la figura 4B muestra la imagen de un gel de poliacrilamida cargado con un substrato digerido por 0.1 U de la enzima RT-VIH. Los gráficos cuantitativos de estos datos, demuestran que el % de ssADN observado como digestión progresó con el tiempo, los cuales se proporcionan en las figuras 5A-B. Como se esperaba, el ensayo detectó niveles bajos de digestión durante periodos idénticos de tiempo cuando se usaron concentraciones de enzimas de RNasa inferiores . La H RNasa RT VIH no degrada ssAR . Los experimentos se realizaron también para determinar si puede haber alguna degradación de ARN no específica por la enzima H RNasa que pudiera haber afectado los resultados descritos arriba. En la presente, alícuotas de 0.1 µ? del substrato de ssARN radioetiquetado se incubaron con la enzima H RNasa RT VIH 1U bajo las condiciones descritas para los experimentos previos, supra, y los productos de reacción se corrieron en gel de poliacrilamida desnaturalizado (figura 6A) . Como control, las alícuotas ssARN idénticas se incubaron bajo la misma condición pero sin la H RNasa, y estas alícuotas de control se incubaron bajo la misma condición pero sin la H RNasa, y estas alícuotas de control se corrieron también en gel desnaturalizado (figura 6B) . La cantidad de substrato de ARN radioetiquetado detectado fue similar a cada tiempo de reacción y no se observaron productos de degradación más pequeños, indicando que el ssARN no se degrada por la enzima H RNasa. La magnitud de la actividad de la H RNasa se monitoreo en un experimento paralelo con un substrato del híbrido ARN-ADN (figura 7C9 y confirma que la enzima usada en estos experimentos fue funcional .

Los contaminantes de ARN y ADN de hebra sencilla no afectan la actividad de la H RNasa. Los experimentos se realizaron también para determinar si los contaminantes de ssADN y/o ssARN o productos de reacción podrían afectar las mediciones de la actividad de la H RNasa, por ejemplo, mediante la inhibición de la enzima. Primero, las alícuotas que contenían 0.1 ii (5 pmol) del substrato del híbrido de ADN-ARN y 1 U (2.2 ng de 3 fmol) de la. enzima RT VIH se incubaron con 5, 10 y 50 pmol de ya sea poliA homopolimérico (SEC ID NO: 3) o poli U (SEC ID NO:4) o heteropolimérico (18S) ARN (SEC ID NO: 5), de manera que las proporciones molares del substrato híbrido de ARN-ADN fueron 1:1, 2:1 y 10:1, respectivamente . PoliA homopolimérico 5'-(A)n-3' (n ¡» 500 a 1000) (SEC ID NO: 3) PoliU homopolimérico 5'-(U)n-3' (n « 500 a 1000) (SEC ID NO: 4) 18S ARN (SEC ID NO: 5) 5'- CCCUCUCUCUCUCUUAAUGGGAGUGAUUUCCCUCCUCUUCGAAUAGGGUUCUAGGUUGAUG CUCGAAAAAUUGACGUCGUUGAAAUUAUAUGCGAUAACCUCGACCUUAAAGGCGCCGACGA CAAG-3' Cada alícuota se incubó a 37°C y los productos de la reacción se corrieron en gel de poliacrilamida (figura 7) . La titulación de la muestra con ARN 18S de 125 mer que contenía una estructura secundaria significativa no inhibió la H RNasa RT VIH en una forma que depende de la dosis, determinada por la cantidad medida de ssADN etiquetada en un extremo después de cada reacción. Sin embargo, es incierto que tales contaminantes se presenten en cualquier ensayo de H RNasa "real" . La U y A homopolimérica que no exhiben cualquier estructura secundaria, no inhiben la actividad de la H RNasa RT VIH. Experimentos similares se realizaron también con alícuotas que contenían 0.1 µ? (5 pmol) del substrato híbrido ARN-ADN y una enzima RT VIH 1 U (2.2 ng o 19 fmol) se incubó con uno de los oligonucleótidos de ADN de hebra sencilla establecidos en la tabla 1 de abajo. Estos oligonucleótidos que son referidos en la presente como Oligo 1, Oligo 2 y Oligo 3 se identificaron también por la SEC ID NO: 6-8, respectivamente. La proporción molar de cada oligómero ssADN en el substrato en las diferentes alícuotas fue de 1.1, 2:1 y 10:1 (es decir, 5, 10 y 50 pmol). Nuevamente, las alícuotas se incubaron a 37°C para permitir la degradación de ARN por la H RNasa y después de apagarse después de 30 minutos y analizados por PAGE (figura 8) . Los resultados indicaron que la actividad de la H RNasa RT VIH no se inhibe por ssADN. Así, la presencia de ARN de hebra sencilla o ssADN en el ensayo (generado, por ejemplo, como una consecuencia de la actividad de la enzima) solo afectará siquiera en lo mínimo la valoración de la actividad de la RNasa.

Tabla I: Secuencias de Desoxioligonucleotidos titulados con el substrato H RNasa Oligo 1 (SEC ID NO: 6) . 5' -CTGAGGGTAATTCTCTCTCTCCCAAACCCAAA-3' . Oligo 2 (SEC ID NO: 7) . 5 ' -ATCTTGGGATAAGCTTCTCCTCCC-3 ' Oligo 3 (SEC ID NO: 8) . 5 ' -TTGCTGCAGTTAAAAAGCTCGTAG-3 ' .

La degradación de ARN requiere de una actividad de H RNasa competente. Para confirmar que la degradación del ARN observada en estos experimentos se debe actualmente a la H RNasa y no a alguna otra actividad de la holoenzima RT, los ensayos se realizaron usando la enzima RT de distintas fuentes. Específicamente, 0.1 µ? (5 pmol) del substrato de ARN-ADN se incubaron ya sea con 1 U de la enzima RT VIH (2.2 ng o 19 fmol) , 1 U de la enzima Rt MMLV (10 ng o 15 fmol) obtenidas de Promega ( adison, WI) . Un experimento idéntico se realizó también usando una cantidad equivalente de una enzima RT MMLV mutante que ha sido descrita previamente y caracterizada, que no tiene una actividad H RNasa (Roth et al., J. Biol. Che . 1985, 260:9326; Ta ese et al., Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 1988, 85:1977). Las alícuotas de cada muestra se incubaron a 37°C durante < 30 segundos, 10, 20, 30 y 60 minutos, tiempo después del cual la reacción se apagó y los productos de la reacción se analizaron por PAGE como se describe, supra, en los experimentos previos . Los resultados de los experimentos se muestran en la figura 9A (H RNasa de VIH) , figura 9B (H RNasa MMLV) y la figura 9C (H RNasa mutante LV) . La cantidad de substrato restante en cada alícuota después de la reacción se determinó cuantitativamente mediante el análisis de volumen siguiendo la formación de imágenes mediante fósforo usando la fórmula: % de substrato restante = ( (substrato) / (substrato + producto) x 100%. Los resultados de este análisis cuantitativo se graficaron en la figura 9D y confirman que la degradación aparente de ARN de los híbridos de ARN-ADN observados en estos ensayos es el resultado de una actividad H RNasa funcional .

EJEMPLO 2 i Ensayo en tiempo real para la actividad de la H RNasa Este ejemplo demuestra las modalidades particulares de un ensayo preferido que es capaz de detectar y monitorear la actividad de la H RNasa en tiempo real. El ensayo del ejemplo usa un substrato híbrido de ARN-ADN que comprende una porción de fluoróforo y una porción del agente de extinción. La porción de fluoróforo comprende una porción que es capaz de emitir una señal fluorescente u otra señal detectable . En contraste, la porción del agente de extinción comprende una porción que es capaz de absorber la señal generada por la porción del fluoróforo. Por ejemplo, en la modalidad del ejemplo descrita en la presente, la porción de fluoróforo es fluoresceína y la porción del agente de extinción es dabcilo, ambas de las cuales se encuentran comercialmente disponibles, por ejemplo, de Stratagene (La Jolla, CA) . Sin embargo, la identidad precisa de las porciones de agente de extinción y fluorescentes no es crítica, y una variedad de tales porciones que pueden usarse para la presente invención se encuentran comercialmente disponibles y/o se conocen generalmente en la técnica. Ejemplos de otros fluoróforos comunes que pueden usarse incluyen pero no se limitan a Cy3, Cy3.5, Cy5 y Cy5.5 (disponibles de Amersham Biosciences Corp., Piscataway NJ) también rojo de Texas, fluoresceína, 6-FAM, HEX, TET, TAMRA, Rojo de Rodamina, Verde de Rodamina, Carboxirodamina, BODIPY, 6-SOE, Verde de Oregon y Cumarina, todos se encuentran comercialmente disponibles, por ejemplo, de Molecular Probes (Eurgene, OR) o Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO) . Ejemplos de porciones de agente de extinción incluyen DABCYL (disponible de Sigma-Aldrich Corp., St . Louis MO o de Molecular Probes Eugene OR) así como Black Hole Quenchers ("BSQ", disponible de Biosearch Technologies, Inc., Novato CA tal como BHQ-1, BHQ-2 y BHQ-3. Una modalidad de ejemplo de un substrato híbrido de ADN-ARN que puede usarse en tal ensayo se ilustra esquemáticamente en la figura 10A. En este ejemplo, el substrato de ADN comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO: 9, en donde el substrato de ARN comprende la secuencia de nucleótidos establecida en la SEC ID NO: 10. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la secuencia exacta del substrato de ADN-ARN no es crítica para practicar la invención. Sin embargo, las secuencia tendrán preferiblemente ciertas propiedades. En particular, la secuencia del substrato de ADN comprende preferiblemente una región 5' y una región 3' que se localizan en los extremos 3' y 5' de los desoxioligonucleótidos, respectivamente. Preferiblemente, la región 3' y región 5' son complementarias y capaces de hibridizar entre sí bajo las condiciones del ensayo. El substrato del ADN comprende también preferiblemente una región central que es complementaria a al menos una parte del substrato del ARN de manera que el substrato del ADN y el substrato de ARN son capaces de hibridizar entre sí bajo las condiciones del ensayo, formando así el substrato del híbrido de ADN-ARN. Para los propósitos de ilustración, el substrato de ADN de ejemplo se ilustra en la figura 10A que tiene la porción de fluoróforo unida en la región 3' (por ejemplo, en el extremo 3' del oligonucleótido) que tiene la porción del agente de extinción unida a la región 5' (por ejemplo, en el extremo 5' del desoxioligonucleótido) . Sin embargo, las modalidades en la que la porción del agente de extinción se une a la región 3 ' (por ejemplo, en el extremo 3' del desoxioligonucleótido) y la porción de fluoróforo se une a la región 5' (por ejemplo, en el extremo 5' del desoxioligonucleótido) se contemplan también y en general , se prefieren igualmente . Sin que se limite cualquier teoría particular o mecanismo de acción, se cree que una H RNasa degrada ARN en el substrato del híbrido de ARN-ADN, las regiones 3' y 5' del ADN combina pares básicos entre si de manera que la sonda de oligonucleótidos adopta una conformación tal que se ilustra en la figura 10B, colocando la porción de fluoróforo y la porción del agente de extinción en proximidad suficiente de manera que la porción del agente de extinción absorbe al menos parte de la señal detectable emitida por la porción de fluoróforo. Consecuentemente, la actividad de la H RNasa puede detectarse y monitorearse detectando una atenuación o disminución en la fluorescencia (figura 10C) . Para demostrar su eficacia, tanto la H RNasa RT VIH y la Hl ENasa de E. coli se examinaron usando este formato de ensayo. Las enzimas de la H RNasa y el substrato de ARN (SEC ID NO: 10) se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 de arriba. Una sonda de oligonucleótidos de ADN (SEC ID NO: 9) se preparó también de acuerdo a los métodos de rutina y etiquetados en el extremo 3 ' con fluoresceina y con dabcilo en el extremo 5', ambos de los cuales se encuentran disponibles de Stratagene (La Jolla, CA) . En un primer conjunto de experimentos, una sonda de oligonucleótidos (SEC ID NO: 9) etiquetada con rojo de fluoróforo y una porción del agente de extinción DABCYL se combinó en pares básicos al ARN (SEC ID NO: 10) en relaciones molares de 1:1 y 1:2 (ADN:ARN) . Cada ensayo se llevó a cabo a 25°C en un volumen final de 25 µ? de 50 mM de solución amortiguadora Tris (pH 8) con MgCl2 10 mM, Cl opcional (0 a 30 mM) , glicerol al 3%, DTT 1 mM, NP-40 0.02% y 50 g/ml de BSA que contiene un substrato y un inhibidor en las cantidades o concentraciones indicadas. La hidrólisis del substrato se monitoreó durante la reacción como una función de tiempo usando un lector de microplaca de fluorescencia Wallac Victor (Perkin Elmer Life Sciences, Inc., Boston MA) con excitación y una emisión de un conjunto de longitud de ondas con filtros a 585 y 615 nm, respectivamente, y con un paso de banda de 10 nm. El substrato se añadió a la muestra de enzimas para iniciar la reacción. La colección de datos del instrumento se monitoreó con una computadora personal compatible con un software Workstation Windows de 32 bits diseñado para utilizar las capacidades completas de Windows™ 95/98/NT. Las mediciones de fluorescencia se tomaron cada 30 segundos y se graficaron en la figura 11A. Un conjunto similar de experimentos se realizaron también en los cuales. 0.1 ? y 0.3 µ? del substrato de ADN-ARN se incubaron con 0.0003 y 0.001 U de la Hl R asa de E. coli en una solución amortiguadora Tri 50 mM (pH 7.5) que contenía 100 mM de NaCl, MgCl2 10 mM, 3% de glicerol, 0.02% de NP-40, 50 µg/ml de BSA. La señal fluorescente medida en estas muestras se gráfico como una función en tiempo real en la figura 11B. Estos datos muestran que el formato de ensayo descrito arriba es válido y efectivo. Una disminución en la señal de fluorescencia se observa que es una función tanto del tiempo de incubación y de la concentración de la enzima, y es consistente con la proporción de la degradación del ARN mediante la enzima.

REFERENCIAS CITADAS Las numerosas referencias que incluyen patentes, solicitudes de patente y varias publicaciones se citan y discuten en la descripción de esta invención. La cita y/o discusión de tales referencias se proporciona solo para aclarar la descripción de la presente invención y no se admite que cualquier referencia sea un "arte previo" para la invención descrita en la presente. Todas las referencias citadas y discutidas en esta especificación se incorporan en la presente por la referencia en su totalidad y a tal grado, como si cada referencia fuera incorporada individualmente mediante la referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito .la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para detectar un desdoblamiento mediado por la nucleasa de un ácido nucleico, caracterizado porgue el método comprende: (a) hibridizar un ácido nucleico de direccionamiento a una sonda de oligonucleótidos etiquetada fluorescentemente complementaria al ácido nucleico de direccionamiento que contiene un fluoroforo en un término y un grupo de extinción en otro términos, en donde (1) cuando la sonda no se ibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, la sonda adopta una conformación que coloca al fluoroforo y al agente de extinción en tal proximidad que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoroforo y (ii) la formación del híbrido sonda-objetivo provoca una separación suficiente del fluoroforo y el agente de extinción para reducir la extinción de la señal fluorescente del fluoroforo; (b) poner en contacto al híbrido sonda-objetivo con un agente que tiene actividad nucleasa en una cantidad suficiente para desdoblar selectivamente al ácido nucleico de direccionamiento y liberar así la sonda intacta; y (c) detectar la liberación de la sonda midiendo el decremento en la señal fluorescente del fluoroforo comparada a la señal del híbrido sonda-objetivo.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente es una enzima que tiene una actividad de H RNasa.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el agente se selecciona del grupo que consiste de la transcriptasa inversa del VIH, la Hl RNasa de E. coli, H2 RNasa de E. coli, Hl RNasa de humano, H2 RNasa de humano, ribozimas tipo de cabeza de martillo, transcriptasa inversa de HBV e integrasa.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda es un ADN, y el direccionamiento es el substrato híbrido ADN:ARN.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda es de al menos 18 nucleótidos en longitud.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sonda, cuando no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, adopta una conformación de estructura secundaria de horquilla que pone en proximidad al fluoróforo y al agente de extinción.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la reacción de la nucleasa se realiza en presencia de un compuesto, en donde una diferencia en la proporción de la disminución en la señal fluorescente del fluoroforo durante la reacción de la nucleasa, comparada a la disminución observada cuando la misma reacción se conduce en ausencia del compuesto, es indicativa de la capacidad del compuesto ya sea para inhibir o mejorar la actividad de la nucleasa del agente.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende monitorear la señal fluorescente del fluoroforo durante la reacción de la nucleasa.
9. 9. Un método para medir una actividad de H R asa de un agente, el método caracterizado porque comprende: (a) hibridizar un ARN de direccionamiento a una sonda de oligodesoxiribonucleótidos etiquetada fluorescentemente complementaria al ARN de direccionamiento que contiene un fluoroforo en un término y un agente de extinción en el otro término, en donde (i) cuando la sonda no se hibridiza al ARN de direccionamiento, la sonda adopta una conformación que coloca al fluoroforo y al agente de extinción en una proximidad tal que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoroforo y (ii) la formación del híbrido de sonda-objetivo provoca una separación suficiente del fluoroforo y el agente de extinción para reducir la extinción de la señal fluorescente del fluoroforo; (b) poner en contacto al híbrido de sonda-objetivo con el agente en una cantidad suficiente para desdoblar selectivamente al ??? de direccionamiento y liberar así la sonda intacta; y (c) medir la disminución en la señal fluorescente del fluoroforo comparada con la señal del híbrido de sonda-obj etivo .
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el agente es una enzima que tiene una actividad de H RNasa.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el agente se selecciona del grupo que consiste de transcriptasa inversa de VIH, Hl RNasa de E. coli, H2 RNasa de E. coli, Hl RNasa de humano, H2 RNasa de humano, ribozima de cabeza de martillo, transcriptasa inversa de HBV e integrasa.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 9 , caracterizado porque la sonda tiene al menos 18 nucleótidos en longitud.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación , caracterizado porque la sonda, cuando no se hibridiza al ARN de direccionamiento, adopta una conformación de estructura secundaria de horquilla que pone en proximidad al fluoroforo y al agente de extinción.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la reacción mediada por la H RNasa se realiza en presencia de un compuesto, en donde una diferencia en la proporción de la disminución en la señal fluorescente del fluoroforo durante la reacción mediada por la H RNasa comparada con la disminución observada cuando la misma reacción se conduce en ausencia del compuesto, es indicativa de la capacidad del compuesto ya sea para inhibir o mejorar la actividad de la H KNasa del agente.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 9 , caracterizado porque comprende además, monitorear la señal fluorescente del fluoroforo durante la reacción mediada por la H RNasa.
16. 16. Un método de separación por exclusión para un modulador de la actividad de la nucleasa de un agente, caracterizado porgue el método comprende: (a) hibridizar un ácido nucleico de direccionamiento a una sonda de oligonucleótidos etiquetada fluorescentemente complementaria al ácido nucleico de direccionamiento que contiene un fluoroforo en un término y un grupo de extinción en el otro término, en donde (i) cuando la sonda no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, la sonda adopta una conformación tal que pone al fluoroforo y al agente de extinción en tal proximidad que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoroforo y (ii) la formación del híbrido de sonda-objetivo provoca una separación suficiente del fluoroforo y el agente de extinción para reducir la extinción de la señal fluorescente del fluoroforo; (b) preparar dos muestras que contienen el híbrido de sonda-objetivo; (c) poner en contacto al híbrido de sonda-objetivo de una primer muestra con el agente en una cantidad suficiente para desdoblar selectivamente al ácido nucleico de direccionamiento y liberar así, la sonda intacta; (d) poner en contacto al híbrido de sonda-objetivo de una segunda muestra con el agente, en una cantidad suficiente para desdoblar selectivamente al ácido nucleico de direccionamiento y liberar así a la sonda intacta en presencia de un compuesto candidato, que se prueba por su capacidad para modular la actividad de la nucleasa del agente; (e) detectar la liberación de la sonda en cada muestra midiendo la disminución en la señal fluorescente del fluoroforo comparada a la señal del híbrido de sonda-objetivo; y (f) comparar la proporción de disminución en la señal fluorescente del fluoroforo en las dos muestras, en donde una diferencia en la proporción de la disminución en la señal fluorescente del fluoroforo durante la reacción de la nucleasa en las dos muestras, es indicativa de la capacidad del compuesto ya sea para inhibir o mejorar la actividad de la nucleasa del agente.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque una magnitud mayor o proporción relativa a la disminución de la señal fluorescente del fluoroforo en la segunda muestra comparada con la primera muestra indica que el compuesto candidato es un agente agonista.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque una magnitud menor o proporción relativa a la disminución de la señal fluorescente del fluoróforo en la segunda muestra comparada a la primera muestra, indica que el compuesto candidato es un agente antagonista.
19. 19. Un kit para medir una actividad de la nucleasa de un agente, caracterizado porque comprende un ácido nucleico de direccionamiento y una sonda de oligonucleótidos etiquetada fluorescentemente complementaria al ácido nucleico de direccionamiento que contiene un fluoróforo en un término y un agente de extinción en el otro término, en donde (i) cuando la sonda no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, la sonda adopta una conformación que coloca al fluoróforo y al agente de extinción en tal proximidad que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoróforo y (ii) la formación del híbrido de sonda-objetivo provoca una separación suficiente del fluoróforo y el agente de extinción para reducir la extinción de la señal fluorescente del fluoróforo .
20. 20. El kit de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la sonda es al menos de 18 nucleotidos en longitud.
21. 21. El kit de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la sonda, cuando no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, adopta una conformación de estructura secundaria de horquilla que pone en proximidad al fluoróforo y al agente de extinción.
22. 22. El kit de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la sonda es ADN, y el ácido nucleico de direccionamiento es un substrato híbrido de ADN:ARN.
23. 23. El kit de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque comprende el agente.
24. 24. El kit de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el agente se selecciona del grupo que consiste de H KNasa, transcriptasa inversa, Hl y H2 KNasa de E. coli, Hl y H2 KNasa de humano, ribozimas de cabeza de martillo, transcriptasa inversa de HBV e integrasa.
25. 25. El kit de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa VIH.
26. 26. Una mezcla de ensayos para medir la actividad de la nucleasa de un agente, caracterizada porque comprende un ácido nucleico de direccionamiento y una sonda de oligonucleótidos etiquetados fluorescentemente complementaria al ácido nucleico de direccionamiento que contiene un fluoróforo en un término y un grupo de agente de extinción en el otro término, en donde (i) cuando la sonda no se hibridiza al ácido nucleico de direccionamiento, la sonda adopta una conformación que pone al fluoróforo y al agente de extinción en tal proximidad que el agente de extinción extingue la señal fluorescente del fluoróforo y (ii) la formación del híbrido de sonda-ob etivo provoca una separación suficiente del fluoróforo y agente de extinción para reducir la extinción de la señal fluorescente del fluoróforo .
27. 27. La mezcla del ensayo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la sonda es un AON, y el ácido nucleico de direccionamiento es un ARN.
28. 28. La mezcla del ensayo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la sonda y el ácido nucleico de direccionamiento se hibridizan entre sí para formar un híbrido de sonda-objetivo.
29. 29. La mezcla del ensayo de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque comprende además al agente .
30. 30. La mezcla del ensayo de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el agente se selecciona del grupo que consiste de H RNasa, transcriptasa inversa, Hl y H2 RNasa de E. coli, Hl y H2 RNasa de humano, ribozimas de cabeza de martillo, transcriptasa inversa de HBV e integrasa.
31. 31. La mezcla del ensayo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque la transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa VIH.