KR102072487B1 - 헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 h 활성의 검출 방법 - Google Patents

헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 h 활성의 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102072487B1
KR102072487B1 KR1020180012839A KR20180012839A KR102072487B1 KR 102072487 B1 KR102072487 B1 KR 102072487B1 KR 1020180012839 A KR1020180012839 A KR 1020180012839A KR 20180012839 A KR20180012839 A KR 20180012839A KR 102072487 B1 KR102072487 B1 KR 102072487B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
rnase
dna
hairpin
activity
rna
Prior art date
Application number
KR1020180012839A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190093332A (ko
Inventor
박현규
이창열
정유진
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020180012839A priority Critical patent/KR102072487B1/ko
Publication of KR20190093332A publication Critical patent/KR20190093332A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102072487B1 publication Critical patent/KR102072487B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
    • C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/301—Hairpin oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 헤어핀 자기조립을 이용하여 리보뉴클레아제 H (RNase H) 활성을 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 헤어핀 자기조립 기반의 신호증폭을 통해 RNase H 활성을 표지 없이 고감도로 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 방법은 형광 및 소광제 물질 표지를 필요로 하지 않고, 검출 시스템의 낮은 안정성으로 인한 착오 신호 문제가 발생하지 않기 때문에, 보다 저렴하고 간편하게 안정적 및 고감도로 RNase H 활성 검출이 가능하며, 에이즈 (AIDS) 치료제로서 잠재성을 갖는 RNase H 활성저해제의 선별도 가능하다.

Description

헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 H 활성의 검출 방법 {Method for Detecting Ribonuclease H Activity Using Catalytic Hairpin Assembly}
본 발명은 헤어핀 자기조립을 이용하여 리보뉴클레아제 H (RNase H) 활성을 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 헤어핀 자기조립 기반의 신호증폭을 통해 RNase H 활성을 표지 없이 고감도로 검출하는 방법에 관한 것이다.
리보뉴클레아제 H (Ribonuclease H; RNase H)는 DNA/RNA 이중가닥의 RNA를 특이적으로 분해하는 효소로서 DNA 복제, DNA 수리 및 전사를 포함한 다양한 생물공정에 관여한다. 또한, HIV-1 바이러스 역전사효소의 RNase H 활성이 바이러스 증식에 필수적이므로, RNase H 활성 저해제는 향후 에이즈 치료제로서 개발될 잠재성을 갖는다. 이러한 중요성으로, 최근까지 다양한 광학 기반의 RNase H 활성 검출 기술들이 개발되어 왔다. 대표적으로, 형광 및 소광제 물질이 표지된 U자형의 DNA 프로브인 분자비콘 (molecular beacon)에 기반을 둔 기술이 개발되었다 (J Rizzo et al., Mol . Cell. Probes, 16:277-283, 2002). 이 기술은 RNase H 활성에 의한 분자비콘 내의 RNA 분해에 의해 야기되는 형광신호 변화를 기반으로 RNase H 활성을 검출한다. 하지만, 형광 및 소광제 물질의 표지를 필요로 하기 때문에, 분석이 값비싸고 복잡하다는 단점을 갖는다. 한편, RNase H 활성에 의한 RNA 분해에 따른 금 나노입자의 색 변화에 기반을 둔 검출 기술이 개발되었다 (X Xie et al., Small, 7:1393-1396, 2011). 이 기술은 표지가 필요 없고, 육안 검출이 가능하므로, 분석이 간편하며 저렴하다는 이점을 갖는다. 하지만, 반응 완충 용액 조건 하에서 금 나노입자가 불안정하여 착오 신호가 발생하는 치명적인 문제점을 갖는다. 무엇보다도, 상기의 기존 기술들은 RNase H 활성에 대한 신호증폭 수단의 부재로 낮은 민감도를 갖는다. 따라서, 신호증폭 수단의 도입을 통해, 표지 없이 고감도로 RNase H 활성을 검출할 수 있는 시스템의 개발이 필요한 상황이다.
본 발명에서는 등온 (isothermal), 비 효소 (enzyme-free) 신호증폭 반응인 헤어핀 자기조립 (catalytic hairpin assembly)을 도입하였다. 이는 단일가닥 핵산이 촉매로 작용하여, 두 종의 준 안정적인 헤어핀 프로브에 대해 가닥 치환 반응을 반복적으로 야기하여, 두 종의 헤어핀 프로브가 결합된 형태인 이중가닥 산물을 다량 생성하는 반응으로서, 다양한 생체물질의 고감도 검출 기술 개발에 활용되어 왔다. 하지만, 기존 기술들 대부분은 헤어핀 자기조립에 대해 복잡하고 값비싼 형광 및 소광제 물질 표지를 필요로 한다 (J Huang et al., Anal. Chem ., 84:5939-5943, 2012; D Li et al., Chem . Commun ., 51:12637-12640, 2015; T Hou et al., Anal. Chem., 86:884-890, 2014).
따라서, 향후 다양한 생체물질의 비 효소, 비 표지 (label-free) 및 고감도 검출에 적용하기 위해서는, 헤어핀 자기조립 결과를 표지 없이 확인할 수 있도록 시스템을 설계하는 것이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 상기 언급한 종래 기술들의 한계를 극복하고 비표지 헤어핀 자기조립을 이용하여 RNase H 활성을 검출하고자 예의 노력한 결과, 헤어핀 자기조립 산물이 G-quadruplex 구조를 형성하도록 두 종의 헤어핀 프로브를 설계하고, G-quadruplex에 특이적으로 결합해 강한 형광신호를 보이는 형광분자를 도입하여, RNase H 활성을 표지 없이 고감도로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 헤어핀 자기조립 및 헤어핀 자기조립 산물의 G-쿼드러플렉스 (quadruplex) 구조에 특이적으로 결합하는 형광분자의 신호증폭을 통해 시료 내에 포함되어 있는 RNase H 활성을 표지 없이 고감도로 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) T-DNA/B-RNA 이중가닥을 형성시킨 다음, RNase H에 의해 B-RNA를 분해하는 단계; (b) 상기 생성된 단일가닥의 T-DNA와 5’ 및 3’ 말단에 구아닌이 풍부 (G-rich)한 헤어핀 프로브를 반응시켜 헤어핀 자기조립 유도를 통한 헤어핀 자기조립 산물의 5’ 및 3’ 말단에 G-쿼드러플렉스 (quadruplex) 구조를 가지는 헤어핀 복합체를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 G-쿼드러플렉스 (quadruplex)에 특이적으로 결합하는 형광분자를 도입하여 발생하는 형광신호를 측정하여 RNase H 활성을 검출하는 단계를 포함하는 헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 H (RNase H) 활성의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 방법은 형광 및 소광제 물질 표지를 필요로 하지 않고, 검출 시스템의 낮은 안정성으로 인한 착오 신호 문제가 발생하지 않기 때문에, 보다 저렴하고 간편하게 안정적 및 고감도로 RNase H 활성 검출이 가능하며, 에이즈 (AIDS) 치료제로서 잠재성을 갖는 RNase H 활성저해제의 선별도 가능하다.
도 1은 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 반응을 도식화한 것이다.
도 2는 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 실현가능성 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 검출 민감도 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 검출 선택도 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 RNase H 활성저해제 선별 능력 검증 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 반응 조건 확립에 대한 결과를 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 비표지 헤어핀 자기조립을 기반으로 한 신호증폭 반응을 통해 기존 검출 기술들의 문제점을 해결할 수 있는 고감도 RNase H 활성 검출 방법을 개발하였다. 구체적으로는 RNase H 활성에 의해 야기되는 단일가닥 DNA가 신호증폭 수단으로 도입된 헤어핀 자기조립을 유도함으로써, RNase H 활성에 기인한 신호 발생 효율을 극대화시켰다. 이때, 헤어핀 자기조립에 관여하는 두 종의 헤어핀 프로브의 5’ 및 3’ 말단을 다량의 구아닌 염기서열 (G-rich)로 수식하여, 헤어핀 자기조립 산물의 양 말단에 G-쿼드러플렉스 (G-quadruplex) 구조가 형성되도록 두 종의 헤어핀 프로브를 설계하고, G-쿼드러플렉스에 특이적으로 결합해 강한 형광신호를 발생하는 형광분자를 도입하였다. 즉, RNase H 존재하에서 다량의 G-쿼드러플렉스 구조가 형성되고 강한 형광신호가 발생하는 검출 시스템을 구현함으로써, 표지 없이 RNase H 활성을 검출할 수 있도록 하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 본 발명은 (a) T-DNA/B-RNA 이중가닥을 형성시킨 다음, RNase H에 의해 B-RNA를 분해하는 단계; (b) 상기 생성된 단일가닥의 T-DNA와 5’ 및 3’ 말단에 구아닌이 풍부 (G-rich)한 헤어핀 프로브를 반응시켜 헤어핀 자기조립 유도를 통한 헤어핀 자기조립 산물의 5’ 및 3’ 말단에 G-쿼드러플렉스 (quadruplex) 구조를 가지는 헤어핀 복합체를 형성하는 단계; 및 (c) 상기 G-쿼드러플렉스 (quadruplex)에 특이적으로 결합하는 형광분자를 도입하여 발생하는 형광신호를 측정하여 RNase H 활성을 검출하는 단계를 포함하는 헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 H (RNase H) 활성의 검출 방법에 관한 것이다.
상기, 헤어핀 자기조립 기반의 방법은 신호증폭 수단의 도입을 통해 기존 기술의 낮은 민감도 문제를 해결할 수 있다.
이러한 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 반응에 대한 것은 도 1에 나타냈다.
본 발명에서는 RNase H 활성이 T-DNA/B-RNA 이중가닥의 B-RNA를 분해함으로써, 헤어핀 자기조립을 유도하도록 디자인된 T-DNA가 단일가닥 형태로 남게 된다.
상기 T-DNA는 헤어핀 자기조립을 유도하는 개시제 역할을 하며, 상기 B-RNA는 T-DNA에 대한 블로커 및 RNase H에 대한 기질 역할을 하는 것을 특징으로 할 수 있다. B-RNA는 T-DNA에 상보적인 RNA 서열이며, T-DNA의 길이는 15~30개인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 T-DNA, B-RNA 및 헤어핀 1 (HP1), 헤어핀 2 (HP2)는 직접 제작하여 사용이 가능하다.
이러한 T-DNA, HP1 및 HP2는 헤어핀 자기조립이 구동할 수 있는 범위 내에서 자유롭게 서열을 디자인하여 사용할 수 있다.
본 발명의 T-DNA, B-RNA 및 헤어핀 1 (HP1), 헤어핀 2 (HP2)의 서열은 하기 표 1에 나타냈다.
Figure 112018011583595-pat00001
본 발명에 있어서, 상기 T-DNA는 서열번호 1 (5’-AGT CAC ACG GAC TAT A-3’)로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 B-RNA는 서열번호 2 (5’-UAU AGU CCG UGU GAC U-3’)로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 T-DNA는 헤어핀 1 (HP1)의 발판가닥에 결합하며 가닥 치환 반응을 일으키며 HP1을 개방한다. 개방에 의해 노출된 HP1의 단일가닥은 헤어핀 2 (HP2)의 발판가닥에 결합하며, 가닥 치환 반응에 의해 T-DNA는 방출되며, 이중가닥의 HP1/HP2 복합체가 생성된다. 이때, 방출된 T-DNA는 반복적으로 HP1 및 HP2에 대해 가닥 치환 반응을 유도함으로써, 다량의 HP1/HP2 복합체를 생성할 수 있다 (도 2).
본 발명의 HP1 및 HP2는 T-DNA 또는 RNase H가 존재하지 않을 시에는 반응이 일어나지 않도록 설계하여야 하며, HP1 및 HP2의 스템 (stem)부분이 이러한 역할을 한다. 따라서, 스템 부분이 헤어핀 자기조립에 중요한 부위다.
상기 스템 부분은 8~15 mer인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 구아닌이 풍부한 헤어핀 프로브는 서열번호 3 및 4로 표시되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 헤어핀 자기조립이 구동할 수 있는 범위 내에서 자유롭게 서열을 디자인하여 사용할 수 있다.
서열번호 3: 5’-GGG TTT TTT ATA GTC CGT GTG ACT ATG GAC TAT AGG AGT CAC ACG GGC GGG TAG GG-3’
서열번호 4: 5’-GGG TTT TTT GTG TGA CTC CTA TAG TCC ATA GTC ACA CGG ACT ATA GGG CGG GTA GGG-3’
본 발명의 HP1 및 HP2의 5’ 및 3’ 말단은 다량의 구아닌 염기서열로 수식되어 있기 때문에, HP1/HP2 복합체의 양 말단에는 G-쿼드러플렉스 구조가 형성될 수 있다 (도 2).
G-쿼드러플렉스 구조를 형성하는 5 및 3 말단의 구아닌 풍부 부위는 그 개수에 제한은 없으며, 60~70% 이상의 구아닌으로 구성된 것이 바람직하다.
본 발명에서는 G-쿼드러플렉스에 특이적으로 결합해 강한 형광신호를 발생하는 형광분자를 도입함으로써, 형광분자로부터 강한 형광신호를 확인할 수 있다 (도 2).
본 발명에 있어서, 상기 형광분자는 N-메틸 메소포피린 IX (N-methyl mesoporphyrin IX), 프로토포르피린 IX (Protoporphyrin IX,), 티오플라빈 티 (Thioflavin T), 크리스털 바이올렛 (Crystal violet), 말라카이트 그린 (Malachite green) 또는 [Ir(ppy)2(biq)]+인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 헤어핀 자기조립 및 N-메틸 메소포피린 IX 등의 형광분자는 본 기술의 RNase H 활성 검출 효율을 증대시키는데 있어 핵심적인 요인이라고 할 수 있다.
이에, 본 기술의 구동 여부를 실험적으로 검증하여 RNase H 활성을 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다 (도 2).
아울러, 본 발명의 일 실시예에서는 RNase H 활성 검출 기술의 민감도를 검증하고, 본 발명의 RNase H 활성 검출 한계 (0.037 U/mL)를 확인하였다 (도 3).
이를 하기 표 2에 종래 방법들과 비교하여 나타냈다.
방법 signal 검출한계 (U/ml)
Dual-labeled molecular beacon probe Fluoro
metric		 15 J. Rizzo et al., Mol . Cell. Probes, 16:277-283, 2002
Dual-pyrenelabeled beacon Fluoro
metric		 5 Y. Chen et al., ChemBioChem, 9:355-359, 2008
Gquadruplex/NMM complex Fluoro
metric		 0.2 D. Hu et al., Chem . Eur . J., 16:2605-2610, 2010
Target-triggered CHA producing Gquadruplex/NMM complexes Fluoro
metric		 0.037 This work
본 발명은 일 실시예에서, RNase H 활성은 0~1 U/mL 농도 범위 내에서는 RNase H의 정량적인 검출이 가능하다 (도 3). 다만, 민감도가 우수하여 1 U/mL 이상의 RNase H 농도에서는 거의 최대치의 형광신호를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 RNase H의 정량적인 검출보다는 고민감도의 검출을 특징으로 볼 수 있다. 즉, 검출 한계가 낮아서, 선택도 및 민감도가 매우 우수한 기술이다.
[ 실시예 ]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 반응 조건 확립
비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 반응 용액 제조 과정은 다음과 같다.
반응 용액은 D.W 3 μL, 28 μM B-RNA (서열번호 2, 바이오니아) 5 μL, 20 μM T-DNA (서열번호 1, 바이오니아) 5 μL 및 10X 반응 완충 용액 2 μL를 혼합하여 제작하였으며, 제작된 반응 용액을 80℃에서 5 분 동안 가열한 후 0.1℃/s의 속도로 37℃까지 천천히 냉각하여 15 분 동안 보관하였다. 이후, 반응 용액에 RNase H 5 μL를 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 반응을 진행한 후, 70℃에서 20 분 동안 가열하여 효소 반응을 종결하였다.
다음으로, 상기 반응 용액에 D.W 17 μL, 6 μM 헤어핀 프로브 1 (HP1) 2.5 μL, 6 μM 헤어핀 프로브 2 (HP2) 2.5 μL, 및 10X 반응 완충 용액 3 μL를 첨가하고, 37℃에서 1 시간 동안 헤어핀 자기조립 반응을 진행하였다. 이후, 반응 용액에 200 mM KCl 2.5 μL 및 30 μM NMM (N-methyl mesoporphyrin IX) 2.5 μL를 첨가하고 상온에서 30 분 동안 보관하였다.
상기 사용한 반응 완충 용액은 1X 농도에서 10 mM Tris-HCl (pH 7.9), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2 및 1 mM DTT를 포함한다.
본 실시예에서 확립한 반응 조건들은 도 6에 나타냈다.
반응이 완료된 후, NMM으로부터 발생하는 형광신호를 측정함으로써, RNase H 활성을 분석하였다.
실시예 2. 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 민감도 검증
실시예 1의 반응 조건을 이용하여 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 민감도 검증 실험을 진행하였다 (도 3).
다양한 농도 (0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1, 5, 10, 30 U/mL)의 RNase H를 포함하는 분석 시료 50 μL에 대해 분석 반응을 수행한 결과, 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 RNase H 활성 검출 한계 (limit of detection, LOD)는 0.037 U/mL인 것을 확인되었으며, 이는 기존 기술들에 비해 우수한 수준이다 (표 2).
실시예 3. 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 선택도 검증
실시예 1의 반응 조건을 이용하여 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 선택도 검증 실험을 진행하였다 (도 4).
50 U/mL의 표적이 아닌 효소 (Deoxyribonuclease I, uracil DNA glycosylase, exonuclease I, exonuclease III 및 Hind III) 및 10 U/mL의 RNase H 각각을 포함하는 분석 시료 50 μL에 대해 분석 반응을 수행한 결과, RNase H를 포함하는 분석 시료만 강한 형광신호를 발생하였다. 즉, 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술을 기반으로 RNase H 활성을 선택적으로 검출해낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 RNase H 활성저해제 선별 능력 검증
실시예 1의 반응 조건을 이용하여 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술의 RNase H 활성저해제 선별 능력 검증 실험을 진행하였다 (도 5).
10 U/mL의 RNase H에 대해 다양한 농도의 옥소글라우신 (oxoglaucine) (0, 1, 2, 3, 5, 6 μM) 또는 엘립티신 (ellipticine) (0, 1, 2, 3, 5, 6 μM)을 포함하는 분석 시료 50 μL에 대해 분석 반응을 수행한 결과, 옥소글라우신 또는 엘립티신의 농도가 증가함에 따라 분석 시료의 형광신호가 감소하였다. 즉, 비표지 헤어핀 자기조립 기반의 RNase H 활성 검출 기술을 기반으로 RNase H 활성저해제를 선별해낼 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Detecting Ribonuclease H Activity Using Catalytic Hairpin Assembly <130> P18-B005 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-DNA <400> 1 agtcacacgg actata 16 <210> 2 <211> 16 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B-RNA <400> 2 uauaguccgu gugacu 16 <210> 3 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP1 <400> 3 gggtttttta tagtccgtgt gactatggac tataggagtc acacgggcgg gtaggg 56 <210> 4 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HP2 <400> 4 gggttttttg tgtgactcct atagtccata gtcacacgga ctatagggcg ggtaggg 57

Claims (8)

  1. 다음 단계를 포함하는 헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 H (RNase H) 활성의 검출 방법:
    (a) B-RNA와 상보적인 염기서열을 가지는 T-DNA와 T-DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 B-RNA를 T-DNA/B-RNA 이중가닥으로 형성시킨 다음, RNase H에 의해 B-RNA를 분해하여, 단일가닥의 T-DNA를 생성시키는 단계;
    (b) 상기 생성된 단일가닥의 T-DNA와 ① 루프; 스템(stem); 및 구아닌이 풍부한 3'말단과 5' 말단으로 구성되고, 상기 스템의 발판가닥은 T-DNA와 상보적인 서열을 가지는 헤어핀 프로브 1과 ② 루프; 스템; 및 구아닌이 풍부한 3'말단과 5'말단으로 구성되고, 상기 루프 및 스템은 헤어핀 프로브 1의 루프 및 스템과 상보적인 서열을 가지는 헤어핀 프로브 2를 반응시켜 헤어핀 자기조립 유도를 통한 5' 및 3' 말단에 G-쿼드러플렉스 (G-quadruplex) 구조를 가지는 헤어핀 프로브 1과 헤어핀 프로브 2의 복합체를 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 복합체의 G-쿼드러플렉스 (G-quadruplex) 구조에 특이적으로 결합하는 형광분자를 도입하여 발생하는 형광신호를 측정하여 RNase H 활성을 검출하는 단계:
    여기서, 상기 G-쿼드러플렉스 (G-quadruplex)에 특이적으로 결합하는 형광분자는 N-메틸 메소포피린 IX (N-methyl mesoporphyrin IX), 프로토포르피린 IX (Protoporphyrin IX,), 티오플라빈 티 (Thioflavin T), 크리스털 바이올렛 (Crystal violet), 말라카이트 그린 (Malachite green) 및 [Ir(ppy)2(biq)]+으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 함.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 T-DNA는 서열번호 1로 표시되고, 상기 B-RNA는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 헤어핀 프로브 1은 서열번호 3으로 표시되며, 상기 헤어핀 프로브 2는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a) 내지 (c) 단계는 Tris-HCl (pH 7.9), NaCl, MgCl2 및 DTT를 포함하는 완충 용액에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 다음을 포함하는 리보뉴클레아제 H (RNase H) 활성 검출용 조성물.
    (i) B-RNA와 상보적인 염기서열을 가지는 T-DNA;
    (ii) T-DNA와 상보적인 염기서열을 가지는 B-RNA;
    (iii) 루프; 스템(stem); 및 구아닌이 풍부한 3'말단과 5' 말단으로 구성되고, 상기 스템의 발판가닥은 T-DNA와 상보적인 서열을 가지는 헤어핀 프로브 1; 및
    (iv) 루프; 스템; 및 구아닌이 풍부한 3'말단과 5'말단으로 구성되고, 상기 루프 및 스템은 헤어핀 프로브 1의 루프 및 스템과 상보적인 서열을 가지는 헤어핀 프로브 2.
  7. 제6항에 있어서, 상기 T-DNA는 서열번호 1로 표시되고, 상기 B-RNA는 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 헤어핀 프로브 1은 서열번호 3으로 표시되며, 상기 헤어핀 프로브 2는 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 조성물.



KR1020180012839A 2018-02-01 2018-02-01 헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 h 활성의 검출 방법 KR102072487B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180012839A KR102072487B1 (ko) 2018-02-01 2018-02-01 헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 h 활성의 검출 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180012839A KR102072487B1 (ko) 2018-02-01 2018-02-01 헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 h 활성의 검출 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190093332A KR20190093332A (ko) 2019-08-09
KR102072487B1 true KR102072487B1 (ko) 2020-02-04

Family

ID=67613653

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180012839A KR102072487B1 (ko) 2018-02-01 2018-02-01 헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 h 활성의 검출 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102072487B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112553295B (zh) * 2019-09-26 2023-12-19 菲鹏生物股份有限公司 核糖核酸酶的检测方法与试剂盒及其应用
KR102476525B1 (ko) 2021-02-24 2022-12-13 한국생명공학연구원 체액 검사 기반 퇴행성 뇌질환 진단 및 모니터링 기술

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006511223A (ja) 2002-12-23 2006-04-06 ワイス Ｒｎａｓｅ活性のアッセイ
US20140011189A1 (en) 2003-01-02 2014-01-09 University Of Rochester Hybridization-based biosensor containing hairpin probes and use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006511223A (ja) 2002-12-23 2006-04-06 ワイス Ｒｎａｓｅ活性のアッセイ
US20140011189A1 (en) 2003-01-02 2014-01-09 University Of Rochester Hybridization-based biosensor containing hairpin probes and use thereof

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chem Soc Rev. 2011 Dec, 40(12):5867-5892
J Mol Biol, 2017 Jul 7, 429(14): 2127-2147
Nanoscale. 2017 Nov 2, 9(42):16149-16153
Nucleic Acids Research, Volume 45, Issue 1, January 2017, Pages 26-38

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190093332A (ko) 2019-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6457564B2 (ja) エキソヌクレアーゼを用いた近接伸長アッセイ
EP0469755B1 (en) Method producing a polynucleotide for use in single primer amplification
EP1972693B1 (en) Method and kit for detecting a target protein using a DNA aptamer
EP4077717B1 (en) Method of detecting an analyte
US20210198723A1 (en) Methods of detecting an analyte
KR102592367B1 (ko) 게놈 및 치료학적 적용을 위한 핵산 분자의 클론 복제 및 증폭을 위한 시스템 및 방법
KR101041106B1 (ko) 핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법
US8367416B2 (en) Nucleic acid based fluorescent sensor for mercury detection
JPH02268683A (ja) 単一プライマーを用いる核酸の増幅
EP2137321B1 (en) Methods for detecting a target nucleotide sequence in a sample utilising a nuclease-aptamer complex
EP3098322A1 (en) Method to detect activity of a polymerase
Gong et al. Target recycling amplification for label-free and sensitive colorimetric detection of adenosine triphosphate based on un-modified aptamers and DNAzymes
CN116829735A (zh) 检测靶核酸序列的方法
KR102072487B1 (ko) 헤어핀 자기조립을 이용한 리보뉴클레아제 h 활성의 검출 방법
CN109097446A (zh) 一种检测miRNA的方法及试剂盒
CA2394428A1 (en) Method for detecting target nucleotide sequences
Xue et al. Highly sensitive protein detection based on aptamer probe and isothermal nicking enzyme assisted fluorescence signal amplification
WO2024140120A1 (zh) 一种用于核酸检测的探针组合和方法
CN109863252B (zh) 用于检测或定量丙型肝炎病毒的组合物和方法
CN117904261A (zh) 一种单核苷酸多态性检测生物传感器
CN114592042B (zh) 一种微rna检测方法及试剂盒
KR101249493B1 (ko) 핵산효소-분자비콘을 이용한 핵산의 검출방법
KR20230063086A (ko) 분할된 t7 프로모터를 이용한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 검출 및/또는 이의 돌연변이 검출용 등온 단일 반응 프로브 세트 및 이의 용도
KR102570655B1 (ko) 토홀드 스위치 시스템을 이용한 생물학적 지표 검출용 키트 및 검출방법
Kimoto et al. Genetic Alphabet Expansion of Nucleic Acids

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant