JP2009511064A - 生物学的興奮性細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、興奮性細胞の領域に関する。特に、本発明は、細胞のイオンチャネルタンパク質の補体を変化させることにより、細胞の生物学的な興奮性を変更することに関する。
毎年米国では250,000人以上が、心臓の不整脈、典型的には遅いかまたは不規則な心拍動の処置のために、人工ペースメーカーをインプラントしている。生物学的ペースメーカーを用いて、人工ペースメーカーの機能と置き換えるか、またはその機能を増強することができる。
本発明の1つの局面に従って、その両方の親細胞由来の電気特性を有する異核共存体の作製のための方法を提供する。外因性体細胞および膜融合(fusogen)試薬を、哺乳動物内のある部位に注入する。外因性体細胞は、イオンチャネルを発現する。この外因性体細胞は、ある内因性体細胞と融合し、これによってその両方の親由来の電気特性を有する異核共存体を形成する。
本発明者らは、生物学的ペースメーカーにおける使用のための方法および製品を開発してきた。一つの局面において、インビボまたはインビトロの融合を用いて、宿主の内因性興奮性細胞の機能を改善する。別の局面において、自発的振動活動電位を生成するのに共に十分なタンパク質の補体を細胞へ移入することによって、非興奮性細胞を興奮性にする。別の局面において、本発明者らは、過分極の際に活性化し、一価陽イオンに非選択的である電位依存性K+チャネルタンパク質を開発してきた。
プラスミド構築物、およびアデノウイルス調製物、および変異体
XL-4ベクター(OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD)からpTracerCMV2プラスミド(Invitrogen, Carlsbad, CA)のEcoRIとNotI部位の間に、ヒトKv1.4 cDNAをサブクローニングした。アデノウイルスシャトルベクターpAdCGIを、アデノ/S4TK1.4GYS-IRES GFPの生成のために用いた。以前に記載されたように1、アデノウイルスを産生した。部位特異的変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)により、オリゴヌクレオチド変異誘発を実施した。
トランスフェクションの前日に2.0×105/35-mm2の密度で、HEK293細胞を播種した。製造業者のプロトコールに従い、リポフェクタミン2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)により細胞をトランスフェクトした。トランスフェクション後18〜48時間以内に、電位および電流クランプ法を実施した。
以前に記載されたように2、ランゲンドルフ灌流を用いてモルモットの左心室筋細胞を単離した。消化後、高カリウム溶液(K-グルタミン酸120、KCl 25、MgCl2 1、グルコース10、HEPES 10、およびEGTA 1(mmol/L);pH 7.4)中に室温で30分間、細胞を保存した。電気生理学的記録のため、通常のタイロード溶液内に細胞を再懸濁した(以下の電気生理学の項目を参照されたい)。インビトロ融合実験(セクション1)のために次いで、2%FBS(Invitrogen, Carlsbad, CA)を添加した培地199(Invitrogen, Carlsbad, CA)を入れた6ウェルプレート内のラミニンコーティング(20μL/mL; Becton Dickinson, Bedford, MA)カバーガラス上に、筋細胞を配置し、37℃の5%CO2加湿インキュベータ内で1時間、融合実験(セクション1)のために維持した。
Axopatch 200B増幅器(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)により、20 kHzのサンプリングレートおよび5 kHzでの低域ベッセルフィルターで、標準的な微小電極ホールセルパッチクランプ技術3を用いて実験を行った。実験はすべて室温で行った。NaCl 138、KCl 5、CaCl2 2、グルコース10、MgCl2 0.5、およびHEPES 10(mmol/L);pH 7.4を含むタイロード溶液で、細胞を灌流した。マイクロピペット電極溶液は、K-グルタミン酸130、KCl 9、NaCl 8、MgCl2 0.5、HEPES 10、EGTA 2、およびMg-ATP 5(mmol/L);pH 7.2から構成された。内部記録溶液で満たした場合、微小電極は2〜4 MΩの先端抵抗を有した。2.5秒のインターエピソード(interepisode)間隔で、電位-クランプ実験を実施した。活動電位は、対照(GFPのみ)筋細胞と融合した筋細胞上で短い脱分極電流パルス(2〜3 ms、500〜800 pA)によって開始されるか、またはHCN1-線維芽細胞と融合した筋細胞上でI=0モードで記録されるかのいずれかであった。ソフトウェアJCal5を用いて、測定された液間電位差(-18 mV)4に関するデータを収集した。キセノンアークランプを用いて、488/530 nm(励起/発光)でカルセインAM蛍光またはGFPを見た。
アデノウイルスを、モルモットの左心室自由壁に注入した。成熟メスモルモット(250〜300 g)を4%イソフルランで麻酔し、挿管して、1.5〜2%イソフルランを供給する気化器を備える換気装置上に配置した。側方開胸術後、30ゲージ針を左心室の自由壁へ挿入した。3×1010 PFU AdSPCまたは3×1010 PFU GFP(対照群)のアデノウイルスを、左心室に注入した。注入実施の48〜72時間後、左心室の自由壁筋細胞を、標準的な技術を用いて単離した(1 Mitra R, M. M. (1986) Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 5340-4)。落射蛍光画像法を用いてそれらの鮮明な緑色蛍光により確認可能な形質導入した筋細胞の収量は、細胞が電気生理学的記録チャンバー内に分散した場合、視覚的な評価によって判断すると約3〜5%であった。提示した作業は、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドラインに従って実施し、ジョンズ-ホプキンズ大学の動物実験委員会のガイドラインに従って実施した。
以前に記載されたように(Ennis, I. L., Li, R. A., Murphy, A. M., Marban, E. & Nuss, H. B. (2002) J. Clin. Invest. 109, 393-400)、表面ECG(BIOPAC Systems. MP100)をアデノウイルス注入の72時間後に記録した。モルモットをイソフルランで軽く鎮静させ、針電極を皮膚の下に配置した。最大振幅の記録が得られるように、電極の位置を最適化した。標準的な肢誘導I、II、およびIIIからECGを同時に記録した。心室拍動を効果的に検出するため、本発明者らは、メタコリン(Sigma, 0.1〜0.5 mg/g)を腹腔内注入して徐脈を誘導した。本発明者らは、LV自由壁を手持ち式の電極でマッピングすることにより、心室拍動がどこに由来するかを確認した。
HCN1を安定して発現する線維芽細胞(HCN1-線維芽細胞)に、カルセイン-AM(2μL/mL 増殖培地;1 mmol/Lジメチルスルホキシドの原液;Molecular Probes, Eugene, OR)をロードし、サイトゾル蛍光マーカーを増加させた。染色後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、白血球凝集素40μg/mL(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を添加した6 mL培地199に再懸濁した。筋細胞増殖培地を、0.5 mL/ウェルでこのHCN1-線維芽細胞懸濁液と交換した。コプレーティングの1時間後、筋細胞とHCN1-線維芽細胞を、H2O中、予熱した(37℃)40%ポリエチレングリコール1500(PEG)(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)で融合させた。PEGへの曝露の2〜4分後、細胞を高カリウム溶液(筋細胞単離後に用いた溶液と同じもの)で5〜10分間再水和し、次いで通常のタイロード溶液で灌流した(以下を参照されたい)。
3-プラスミドシステム6を用いて、pLentiV-CAG-HCN1-IRES-GFP、pMD.G、およびpCMVΔR8.91を、HEK293細胞に同時トランスフェクションすることによって、組換えレンチウイルスを生成した。レンチウイルス構築物は、複合プロモーターCAGの制御下でペースメーカーチャネルであるHCN1を発現し、次いで内部リボソーム侵入部位(IRES)の後に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する。モルモット肺線維芽細胞(ATCC, Manassas, VA)を、10%FBS(Invitrogen, Carlsbad, CA)を添加したF12K培地を入れた75 cm2フラスコ内で、80%コンフルエントまで増殖させた。形質導入を容易にする8μg/mLポリブレンにより、線維芽細胞に、10,000 TU/mLの最終濃度でpLentiV-CAG-HCN1-IRES-GFPを安定に形質導入した。HCN1-GFPを形質導入した線維芽細胞を、蛍光標識細胞分取(FACS)を用いて選択した。フローサイトメトリーは、Facstar(Becton Dickinson, Bedford, MA)を用いて実施し、CellQuest(Becton Dickinson, Bedford, MA)を用いて分析した。形質導入していないモルモット肺線維芽細胞を、非蛍光対照として用いた。緑色蛍光タンパク質(GFP)陽性細胞を、その蛍光強度が対照細胞の99.9%の蛍光を超える細胞として測定した(488/530 nm励起/発光)。
lacZ遺伝子によってコードされる大腸菌β-ガラクトシダーゼを、アデノウイルスシャトルベクターpAd-Loxにサブクローニングし、7に記載されるようにCre-4/HEK293細胞内でCre-Lox組換えによりpAd-Lox-LacZを生成した。モルモットの心臓に注入する前に、6時間HCN1-線維芽細胞にAd-lacZを形質導入した。成熟メスモルモット(250〜300 g)を4%イソフルランで麻酔し、挿管して、1.5〜2%イソフルランを供給する気化器を備える換気装置上に配置した。典型的には、1×105HCN1-線維芽細胞の細胞をトリプシン処理(0.05%)し、100 mLの50%PEG 1500に再懸濁し、30G1/2針でモルモットの心臓の尖で心筋内に注入した。
以前に記載されたように9、線維芽細胞注入後1〜6日の間(セクション1)またはアデノウイルス注入の72時間後(セクション3)、表面ECGをMP100(BIOPAC Systems. Goleta, CA)を用いて記録した。モルモットを1.8%イソフルランにより鎮静させた後、2 kHzで2-誘導デジタルECGシステム(誘導1および誘導3, BIOPAC Systems, Goleta, CA)を用いて、標準的な肢誘導IおよびIIIからECGを同時に記録した。Acqknowlege 3.7.3ソフトウェア(BIOPAC Systems, Goleta, CA)を用いてアイントーベンの三角により、誘導2をオフラインで算出した。生物学的ペースメーカーの注入部位に由来する異所的な心室拍動を解放するために(セクション1および3)、本発明者らは、メタコリンの腹膜注入(生理食塩水中で0.1〜0.5 mg/kg体重、Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を実施し、それにより心拍数を低下させた。
HCN1を安定して発現する線維芽細胞(HCN1-線維芽細胞)に、カルセイン-AM(2μL/mL 増殖培地;1 mmol/Lジメチルスルホキシドの原液;Molecular Probes, Eugene, OR)をロードし、サイトゾル蛍光マーカーを増加させた。染色後、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、白血球凝集素40μg/mL(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)を添加した6 mL培地199に再懸濁した。筋細胞増殖培地を、0.5 mL/ウェルでこのHCN1-線維芽細胞懸濁液と交換した。コプレ―ティングの1時間後、筋細胞とHCN1-線維芽細胞を、H2O中、予熱した(37℃)40%ポリエチレングリコール1500(PEG)(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)で融合させた。PEGへの曝露の2〜4分後、細胞を高カリウム溶液(筋細胞単離後に用いた溶液と同じもの)で5〜10分間再水和し、次いで通常のタイロード溶液で洗浄した(以下を参照されたい)。
Axopatch 200B増幅器(Axon instruments)により、20 kHzのサンプリングレートおよび5 kHzでの低域ベッセルフィルターで、標準的な微小電極ホールセルパッチクランプ技術(Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B. & Sigworth, F. J. (1981) Pflugers Arch 391, 85-100)を用いて実験を行った。実験はすべて室温で行った。NaCl 138、KCl 5、CaCl2 2、グルコース10、MgCl2 0.5、およびHEPES 10(mmol/L);pH 7.4を含む通常のタイロード溶液で、細胞を洗浄した。マイクロピペット電極溶液は、K-グルタミン酸130、KCl 9、NaCl 8、MgCl2 0.5、HEPES 10、EGTA 2、およびMg-ATP 5(mmol/L);pH 7.2.から構成された。内部記録溶液で満たした場合、微小電極は2〜4 MΩの先端抵抗を有した。2.5秒のインターエピソード間隔で、電位-クランプ実験を実施した。活動電位は、対照(GFPのみ)筋細胞と融合した筋細胞上で短い脱分極電流パルス(2〜3 ms、500〜800 pA)によって開始されるか、またはHCN1-線維芽細胞と融合した筋細胞上でI=0モードで記録されるかのいずれかであった。測定された液間電位差(-18 mV)に関するデータを収集した(Neher, E. (1992) Methods Enzymol 207, 123-31)。キセノンアークランプを用いて、488/530 nm(励起/発光)でカルセインAM蛍光またはGFPを見た。
モルモットの心臓を切り取り、OCT(VWR Scientific, West Chester, PA)5μmスライスに凍結切断した。置き換えた切片を、免疫組織化学または5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイルβ-D-ガラクトシド(X-gal)による染色のいずれかに用いた。切片を2%ホルムアルデヒド-0.2%グルタルアルデヒド中で15分間室温にて固定し、1.0 mg/ml X-gal、15 mMフェリシアン化カリウム、15 mMフェロシアン化カリウム、および1 mM MgCl2を含むPBS中で6時間37℃にて染色した。染色後、スライスをPBSで二回洗浄した。免疫組織化学のため、β-ガラクトシダーゼに対する200倍希釈したウサギポリクローナル(FITC結合、Abcam, Cambridge, MA)および400倍希釈したマウス心臓ミオシン重鎖(MHC, Abcam, Cambridge, MA)を一次抗体のために用い、AlexaFluor588抗マウス(200倍希釈、Invitrogen, Carlsbad, CA)を心臓MHCに対する二次抗体のために用いた。一次抗体および二次抗体とのインキュベーションの前に、PBS中10%ヤギ血清+0.01%TritonX-100で切片をブロックした。すべての抗体を2%ヤギ血清+0.01%TritonX-100中で希釈し、切片上で室温にて45分間インキュベートした。
電気的ペースメーカーまたは遺伝子療法/幹細胞アプローチの代替の戦略として、本発明者らは、体細胞融合によって心室筋細胞をペースメーカーに変換することの可能性を探索した。このアイデアは、心室筋細胞と、ペースメーカーイオンチャネルであるHCN1を発現するように操作された同系の線維芽細胞との間で、化学的に誘導された融合体を作製することである。
洞房結節のペースメーカー細胞において、電位および時間依存性膜イオン電流は、自発的な活動電位(AP)を生成する。本発明者らは、特定のイオンチャネルの最小補体の異種発現によって、非興奮性細胞をペースメーカーへと変換することができると仮定した。この目的のために、HEK293細胞を遺伝子操作して、以下のイオン電流を発現させた:1)興奮性電流、2)初期再分極電流、および3)内向き整流電流。その遅いゲート開閉カイネティクスおよびその小型cDNAのため、細菌由来のNa+チャネル(NaChBac)17(図4A、左)を興奮性電流について選択し、活性化してNaChBacの脱分極効果に対向する再分極電流についてヒトether-a-go-go関連遺伝子チャネル(hERG)18(図4A、中央)を選択し、拡張期陰電位を支持するためにKir2.119(図4A、右)を選択した。
ペースメーカーの活性とは、ゲート開閉と浸透特性が組み合わさって安定な振動を生成する脱分極電流と再分極電流間のバランスの産物である。結節性ペースメーカーの一つの重要な要素は、HCNチャネル遺伝子ファミリーによってコードされるペースメーカー電流である。HCNチャネル遺伝子導入を用いて生物学的ペースメーカーを設計する21一方、標的細胞における複数の内因性HCNファミリーメンバーとのヘテロ多量体化の予測不可能な結果により、この戦略が混乱する可能性がある22、23。さらに、野生型チャネルの使用は、設計されたペースメーカーの周波数同調に関して可動性が低い。本明細書において、<2%のコード配列に関わる選択的変異誘発によって、本発明者らは、脱分極活性化K+選択チャネルであるKv1.4を、過分極活性化内向き電流へ変換した。
本発明者らはまず、チャネルを過分極活性化型にするため、Kv1.4のゲート開閉を改変しようと努めた。以前の報告24に基づき、本発明者らは、生理的条件でKv1.4チャネル内に、過分極活性化内向き電流を発現するチャネル(HCNチャネルと同様に)を設計した。Kv1.4バックボーン内で、本発明者らは、三点変異(R447N、L448A、およびR453I)をS4セグメントに導入し、単一変異(G528S)を孔に導入した(図1)(Heginbotham L, M. R. (1993) Biophys J. 65, 2089-96.; Miller AG, A. R. (1996) Neuron 16, 853-8)。S4領域内の三重変異、R447N、L448A、およびR453I(S4TKv1.4)は、HEK293細胞内で発現した場合(図7B)、高K+外部溶液中で過分極活性化内向き電流を示したが、その逆転電位は-80mVのままであった(データ示さず)。電位活性化を正にシフトさせるために、本発明者らはさらに、K+チャネルにおけるイオン選択性に対する以前の研究25に基づき、孔領域を変異させ、チャネルをNa+対K+について非選択的にした。Kv1.4チャネル孔の選択性フィルターにおいて残基を変異させることにより(G528S)、Kv1.4GYS変異チャネルは、負の電位範囲内でわずかな内向き電流を伴う脱分極活性化低外向き電流(野生型Kv1.4の約10分の1)を発現した(図7C)。Kv1.4チャネル内でS4三重変異と孔変異を組み合わせることにより、生理的条件下でS4TKv1.4GYSチャネルは過分極活性化内向き電流を発現した(図7D)。-130mVでのS4TKv1.4GYSの平均電流密度は、-30.3 pA/pF mVであった(n=10)。テール電流電位の関連性は、逆転電位が約0 mVであり、非活性化は-100 mVで非常に弱く、大半は存在しないことを示した(図8AおよびB)。総合すれば、S4TKv1.4GYSチャネルは、-80mVより負の電位で不活性化も非常に弱い非活性化も伴わず、生理的条件下で大きな過分極活性化内向き電流を発現する。本発明者らはさらに、外部溶液として高カリウム(K;130mM、Na;10mM)、等しい濃度のナトリウムおよびカリウム(Na;70mM、K;70mM)、ならびにバリウムを含む通常のタイロード溶液(Na;135mM、K;5mM、Ba;5uM)を用いて、外漕溶液がどのようにS4TKv1.4GYS電流に影響し得るのかを調査した。高カリウム溶液中では(図8C-a)、通常の対照タイロード溶液(データ示さず、図7D、Eを参照)と比較して最大電流密度は劇的に低下し、一方バリウムを含む通常のタイロード溶液中では最大電流密度はほとんど影響されなかった(図8C-c)。等しい濃度のナトリウムとカリウム(図8C-b)中でも同様に、それは60%低下した。これらの結果により、S4TKv1.4GYSがナトリウムの高い透過性を有する非選択チャネルであり、その電流はバリウムに感受性ではないことが確認された。カリウム/ナトリウム透過性割合(PNa/PK)をGoldman-Hodgkin式により算出すると、1.08であった(n=5)。Kv1.4チャネルがHCNチャネルとヘテロ多量体を形成しない23という事実を踏まえて、これらのS4TKv1.4GYSチャネルは、HCNチャネルの不在下でも合成ペースメーカーイオンチャネルとして機能し得る。
本発明者らは、アデノ/S4TKv1.4GYS注入の72時間後にモルモット筋細胞を単離し、GFP陽性細胞をパッチした。注入した動物由来の対照細胞内に、わずかに測定可能なペースメーカー電流があった(図9A)。対照的に、本発明者らは、S4TKv1.4GYSチャネルの過分極活性化内向き電流を検出したが(図9B)、外部バリウムはこの電流の表現型を部分的に改変する可能性があった。この条件下で、-80mVまたは-160mVでの平均電流密度はそれぞれ-7.2 pA/pFまたは-59.7 pA/pF mVであった(各々n=6)。本発明者らはまた、対照GFP陰性細胞(n=13)およびGFP陽性細胞(n=14)の活動電位(AP)を検討した。惹起された活動電位持続期間に有意差はなかった(306.2ms:対照、303.2ms:GFP陽性)。対照細胞は、自発的AP振動を全く示さなかった一方、GFP陽性細胞の半分は、自発的AP振動(図9C)を示したが、この振動は短時間しか継続しなかった(通常10秒未満)。時折、本発明者らはまた、APの速いリズム(平均速度は200 bpm以上であった、図9D)を検出し、これは新生児の心筋細胞由来のAP振動に類似していた。静止膜電位は、AP振動群(n=7)と非AP振動群(n=20)との間で異なった(-61.4±3.4 mV対-73.6±7.6 mV)。
心電図(ECG)を、ウイルス注入後48〜72時間で実施した。材料および方法の項目で記載したように、本発明者らは、メタコリン(0.1〜0.5 mg/g)を腹腔内注入して徐脈を誘導した。本発明者らは、HEK293細胞内でメタコリンがS4TKv1.4GYS電流に影響しないことを確認した(データ示さず)。メタコリン注入後約5分で、洞調律(150 bpm)が変化し、徐脈を伴う完全なAVブロック(<100 bpm)となり、次いで最終的に徐脈性接合部補充調律となった(<75 bpm)。対照動物(Ad-GFP、n=5)は心室からの異所的拍動を示さず、一方Ad/S4TKv1.4GYSウイルスを注入した動物(n=6)は、徐脈相において自発的な心室拍動を示した(対照に対してP<0.05)。代表的な実験(図10A)において、手持ち式電極によるLV自由壁のマッピングは、徐脈性接合部補充調律の間、ウイルス注入部位からの持続性心室拍動(150bpm)を実証した。ECGのマッピング(図10B-c)は、心室拍動(図10-a)と同一ではなかったが、各3つの誘導の極性は、Ad/S4TKv1.4GYSウイルス注入心臓からの異所的心室拍動と同じであり、これは電極が正確に心室拍動の焦点上ではないが、焦点周辺帯に配置されたことを示す。
野生型Kv1.4はHCN遺伝子ファミリーと多量体を形成しないことが以前に報告されている(Xue, T., Marban, E. & Li, R. A. (2002) Circ Res 90, 1267-1273)。SPCのインビボでの使用の前に、本発明者らは、HEK細胞への同時トランスフェクションおよび逆転電位の分析により、SPCがHCN1と多量体を形成できないことを検証した。単独で発現するWtHCN1(図3(A)-a、左)は、-36.1±1.4mVで逆転し、一方SPCと同時トランスフェクトしたHCNは、-22.0±8.0mVの逆転電位を示した(それぞれn=5、テール電流は示さず)。HCN1ホモ多量体をブロックするCsによる灌流は、-11.1±2.3mVで逆転する電流を残し、これはSPCのみの逆転電位から識別不能である。薬理的分離除去は、任意の機能性SPC-HCNヘテロ多量体が存在しないことを示唆する。本発明者らはまた、成熟モルモット筋細胞においてSPC発現が本来のナトリウム、カリウム、またはカルシウム電流に影響し得る可能性を除外した(データ示さず)。
次に、成熟心室におけるそのペースメーカー能力を試験するために、本発明者らは、2シストロン性(GFPタグ付加)SPCアデノウイルス(AdSPC)を作製し、それをモルモット心臓に注入した。ウイルス注入の72時間後、AdSPCを形質導入した単離心室筋細胞を、ホールセル電位クランプにより検討した。注入した動物由来の対照細胞内に、わずかに測定可能なペースメーカー電流があった(データ示さず)。対照的に、本発明者らは、AdSPC形質導入筋細胞内で過分極活性化内向き電流を検出した。-80mVまたは-160mVでの平均電流密度はそれぞれ、-7.2±1.3 pA/pFまたは-59.7±5.5 pA/pF mVに相当した(各々n=5、図3B-b)。本発明者らはまた、対照細胞(n=13)およびSPC形質導入細胞(n=14)における活動電位(AP)を検討した。対照細胞は自発的AP振動(SAPO)を全く示さなかったが、SPC形質導入細胞の半分(14のうち7)はSAPOを示した。本明細書に示す実験において本発明者らは、それぞれ53.6±2.5mVと10.4mV/sの最大拡張期電位(MDP)と相4勾配を伴う迅速なSAPO(平均速度>200 bpm)を検出した。惹起されたAP持続期間に有意差はなかった(306.2±12.5ms:対照、303.2±10.9ms:AdSPC形質導入細胞)。これらの結果から、本発明者らは、SPCがモルモット筋細胞内でペースメーカー活性を誘導することができると結論づけた。
心臓の他の領域へ送達されるアデノウイルス-HCN2による以前の研究とは異なり(Qu, J., Plotnikov, A. N., Danilo, P., Jr, Shlapakova, I., Cohen, I. S., Robinson, R. B. & Rosen, M. R. (2003) Circulation 107, 1106-1109.; Plotnikov, A. N., Sosunov, E. A., Qu, J., Shlapakova, I. N., Anyukhovsky, E. P., Liu, L., Janse, M. J., Brink, P. R., Cohen, I. S., Robinson, R. B., Danilo, P., Jr & Rosen, M. R. (2004) Circulation 109, 506-512)、本発明者らは、心室筋内でSPCによるバイオペースメーカー活性を誘導した。代替のアプローチは、心室への遺伝子送達のための基盤として間葉幹細胞を用いることであった(Potapova, I., Plotnikov, A., Lu, Z., Danilo, P., Jr, Valiunas, V., Qu, J., Doronin, S., Zuckerman, J., Shlapakova, I. N., Gao, J., Pan, Z., Herron, A. J., Robinson, R. B., Brink, P. R., Rosen, M. R. & Cohen, I. S. (2004) Circ Res 94, 952-959)。そのような細胞は十分に心臓細胞に分化せず(しかしそれらは、骨、軟骨、または脂肪組織に分化することができる(Deans RJ, M. A. (2000) Exp Hematol 28, 875-84))、それらの経時的な持続性は実証されていない。SPCの直接遺伝子導入は、これらの潜在的な複雑性および不確定度の多くを回避する(確かにその他は導入するが)。SPCの別の潜在的な利点は、合成ペースメーカー戦略の周波数同調に対するその可動性である。本発明者らは、3つのパターンのS4変異と5種の孔変異を調査し、S4変異と孔変異の合計15の可能な組み合わせを得た。これらの他の変異のいくつかは同様に、生理的条件下で過分極活性化内向き電流を発現した。例えば、S4三重変異と別の孔変異との組み合わせ(V525S, VGYG→SGYG)は、HEK細胞内で-25 mVの膜逆転電位を伴い、-100 mVで-6.1 pA/pFの電流密度を有する。本発明者らはまた、インビボでそれを試験し、短期間で遅い心室固有リズム(55 bpm)を検出した。これらの結果は、特定の変異がインビボで特定の心拍数を支持し得ることを示した。様々なS4変異を孔変異と組み合わせることにより、本発明者らは合成ペースメーカーのための幅広い候補を用意し、治療目的、すなわち任意の所与の望ましい基本心拍数でのペーシングを達成するのに最も適したものを選択した。
Claims (39)
- 以下の段階を含む、両方の親細胞由来の電気特性を有する異核共存体を作製する方法:
外因性体細胞および膜融合(fusogen)試薬を哺乳動物内の部位に注入する段階であって、外因性体細胞がイオンチャネルを発現し、かつ内因性体細胞と融合し、それによってその両方の親由来の電気特性を有する異核共存体が形成される、注入段階。 - 部位が心臓内にある、請求項1記載の方法。
- 内因性細胞がイオンチャネルを発現しない、請求項1記載の方法。
- イオンチャネルがカルシウムチャネルである、請求項1記載の方法。
- イオンチャネルが、過分極活性化サイクリックヌクレオチドゲート(HCN)イオンチャネル1(HCN1)である、請求項1記載の方法。
- 外因性体細胞が、該細胞に対して外因性でありイオンチャネルをコードする核酸配列を発現する、請求項1記載の方法。
- 内因性細胞が心室筋細胞である、請求項1記載の方法。
- 膜融合物質(fusogen)がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項1記載の方法。
- PEGが500〜2000の分子量を有する、請求項8記載の方法。
- PEGが1250〜1750の分子量を有する、請求項8記載の方法。
- 哺乳動物において異核共存体内のイオンチャネルの活性を検出する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 注入部位が哺乳動物の心臓であり、膜融合物質がポリエチレングリコール(PEG)であり、かつ外因性体細胞がSEQ ID NO:1もしくはSEQ ID NO:5に示す過分極活性化サイクリックヌクレオチドゲート(HCN)イオンチャネル1(HCN1)を発現する同系または自己の線維芽細胞である、請求項1記載の方法。
- 外因性体細胞が、HCN1を発現する非ウイルス性プラスミドDNA構築物を安定にトランスフェクトされた線維芽細胞である、請求項1記載の方法。
- 外因性体細胞が、HCN1を発現するウイルスを安定に形質導入された線維芽細胞である、請求項1記載の方法。
- 注入段階の前に外因性細胞をトリプシン処理する、請求項1記載の方法。
- 内因性体細胞が神経細胞である、請求項1記載の方法。
- 以下の段階を含む、生物学的ペースメーカーを作製する方法:
筋細胞、ポリエチレングリコール(PEG)、およびSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:5に示す過分極活性化サイクリックヌクレオチドゲート(HCN)イオンチャネル1(HCN1)を発現する同系または自己の線維芽細胞を混合する段階であって、それによって筋細胞と線維芽細胞を融合させる、混合段階。 - 混合の前に線維芽細胞をトリプシン処理する、請求項17記載の方法。
- PEGが500〜2000の分子量を有する、請求項17記載の方法。
- PEGが1250〜1750の分子量を有する、請求項17記載の方法。
- 混合をインビトロで実施する、請求項17記載の方法。
- 混合をインビボで実施する、請求項17記載の方法。
- 以下の段階を含む、生物学的ペースメーカーを作製する方法:
細胞膜を脱分極させる第一のタンパク質、細胞膜を再分極させる第二のタンパク質、および細胞を自発的かつ反復して興奮させる第三のタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸分子を非興奮性哺乳動物細胞にトランスフェクトする段階であって、それによって哺乳動物細胞が自発的に振動する活動電位を示す、トランスフェクション段階。 - 第一のタンパク質が、電位依存性ナトリウムチャネル、電位依存性カルシウムチャネル、およびリガンド開口型陽イオンチャネルからなる群より選択され、第二のタンパク質が、カリウムチャネルおよびクロライドチャネルからなる群より選択され、第三のタンパク質が、HCNファミリーメンバーからなる群より選択される、請求項23記載の方法。
- 1つまたは複数の核酸分子が1つまたは複数のプラスミドである、請求項23記載の方法。
- 哺乳動物細胞がヒト胚性腎細胞である、請求項23記載の方法。
- 3つのイオンチャネルの各々に対するコード配列を含むプラスミドであって、3つのイオンチャネルが、HCN1(SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:5)、NaChBac(SEQ ID NO:2)、およびKir2.1(SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:6)である、プラスミド。
- 過分極の際に活性化し、一価陽イオンに非選択的である、非天然の電位依存性K+チャネルタンパク質。
- 請求項28記載のチャネルタンパク質をコードする核酸。
- 請求項29記載の核酸を含む核酸ベクター。
- ウイルスベクターである、請求項30記載の核酸ベクター。
- ウイルスを哺乳動物に注入する段階を含む、請求項31記載の核酸ベクターを投与する方法。
- SEQ ID NO:4に記載のKv1.4タンパク質の野生型配列に対する4つの変異を含む過分極活性化内向き電流チャネルタンパク質であって、4つの変異がR447N、L448A、R453I、およびG528Sである、過分極活性化内向き電流チャネルタンパク質。
- 請求項33記載の過分極活性化内向き電流チャネルタンパク質をコードする核酸。
- 請求項34記載の核酸を含む核酸ベクター。
- ウイルスベクターである、請求項35記載の核酸ベクター。
- ウイルスを哺乳動物の心臓に注入する段階を含む、請求項36記載の核酸ベクターを投与する方法。
- ウイルスを哺乳動物心臓の心房に注入する、請求項37記載の方法。
- ウイルスを哺乳動物心臓の左心室に注入する、請求項37記載の方法。
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