JP6998863B2 - 深共融溶媒におけるソルターゼaを利用したアミド基転移 - Google Patents
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Description
深共融溶媒(DES)は、100℃未満の融点を有する、水を含まない溶液である。DESは水素結合に基づく。DESにおいては、水および有機溶媒の特性が組み合わせられる。大部分のDESは、生体触媒のために適当な温度において液体である。DESは、水より疎水性であるが、いくつかの場合において、疎水性によって誘導される生体触媒の不活化をもたらさない(Gorke,J.,et al.,Biotechnol.Bioprocess E 15(2010)40-53(非特許文献1))。さらに、深共融溶媒は、水を含まずに作製され得、従って、加水分解に関して不活性である。イオン溶液は、DESと類似した特性を有するが、作製するのがより困難であり、環境にとってより有害である。プロテアーゼは、DESにおいて活性を示した(Zhao,H.,et al.,J.Mol.Catal.B-Enzym 72(2011)163-167(非特許文献2))。
(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:41、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を(任意で、C末端の100アミノ酸残基内に)含む第1のポリペプチド、
(ii)(i)グリシニル化合物、アラニニル化合物、もしくはシステイニル化合物をN末端に含むか(即ち、例えば、NH2もしくはNH3 +としてのフリーなαアミノ基およびペプチド結合の一部であるカルボキシ基を有するシステインアミノ酸残基を1位に含む化合物、もしくは、例えば、NH2もしくはNH3 +としてのフリーなαアミノ基およびペプチド結合の一部であるカルボキシ基を有するアラニンアミノ酸残基を1位に含む化合物、もしくは、例えば、NH2もしくはNH3 +としてのフリーなαアミノ基およびペプチド結合の一部であるカルボキシ基を有するグリシンアミノ酸残基を1位に含む化合物)、または(ii)オリゴグリシンもしくはオリゴアラニンもしくはシステインアミノ酸残基に続く1~3個のグリシンもしくはアラニンアミノ酸残基をN末端に含むか、または(iii)リジンアミノ酸残基をN末端の5アミノ酸残基内に含む第2のポリペプチド、および
(iii)ソルターゼA活性を有する第3のポリペプチド(即ち、ソルターゼAであるか、またはその触媒活性断片、即ち、ソルターゼA活性を有する断片である第3のポリペプチド)
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドの酵素的作製のための方法である。
[本発明1001]
深共融溶媒において、
(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:41、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を含む第1のポリペプチド、
(ii)(i)グリシニル化合物、アラニニル化合物、もしくはシステイニル化合物をN末端に有するか、または(ii)オリゴグリシンもしくはオリゴアラニンもしくはシステインアミノ酸残基に続く1~3個のグリシンもしくはアラニンアミノ酸残基をN末端に有するか、または(iii)リジンアミノ酸残基をN末端の5アミノ酸残基内に有する第2のポリペプチド、および
(iii)ソルターゼA活性を有する第3のポリペプチド
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドの酵素的作製のための方法。
[本発明1002]
ソルターゼA活性を有する第3のポリペプチドが、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ソルターゼAまたはリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)ソルターゼAに由来する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
2種のポリペプチドの酵素的コンジュゲーションのための、本発明1001または1002のいずれかの方法。
[本発明1004]
深共融溶媒が塩化コリンを含む、本発明1001~1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
深共融溶媒が1:2のモル比の塩化コリンとグリセロールとの混合物または1:3のモル比の塩化コリンとエチレングリコールとの混合物である、本発明1001~1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
深共融溶媒が水性共溶媒を含む、本発明1001~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
深共融溶媒が最大30%の共溶媒を含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
深共融溶媒が最大約25体積%の共溶媒を含む、本発明1006~1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
第2のポリペプチドがN末端にアミノ酸配列GGG、AAA、CGG、CAA、KGG、またはKAAを有する、本発明1001~1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
第1のポリペプチドがアミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:41、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)をC末端に含む、本発明1001~1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
第1のポリペプチドがアミノ酸配列LPETG(SEQ ID NO:04)またはLPETA(SEQ ID NO:42)をC末端に含む、本発明1001~1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが相互に独立に、抗体可変ドメイン、抗体重鎖Fab断片、抗体Fc領域、タグ、ならびに、アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:41、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)、リンカー、および非ソルターゼモチーフ部分を含むペプチドからなる群より選択される、本発明1001~1011のいずれかの方法。
本発明は、深共融溶媒が、アミド基転移反応、具体的には、ソルターゼによって触媒される反応を実施するために使用され得るという所見に少なくとも一部分基づく。
「に由来する」という用語は、それぞれのアミノ酸配列が、同一のアミノ酸配列を含むか、または1~10箇所のアミノ酸配列の変化を含有しているか、または親アミノ酸配列の短縮バリアントもしくは融合バリアントであることを示す。
深共融溶媒(DES)とは、組み合わせられた時に減少した融解温度を有する極性成分(液体または固体)を含む混合物である。DESは、塩化コリン(ChCl)を、有機水素ドナー、例えば、アミン、アミド、アルコール、またはカルボン酸と混合することによって作製され得る(例えば、Abbott,A.P.,et al.,J.Am.Chem.Soc.126(2004)9142-9147;ibid.Chem.Commun.(2003)70-71を参照すること)。DESは、DESがイオン性溶媒の特性および有機溶媒の特性の両方を有するよう、陰イオン、陽イオン、および中性成分を含む(Zhang et al.,Angew.Chem.Int.Ed.48(2009)3486-3490)。
インビボでは共有結合で会合していない2種の要素を含む共有結合コンジュゲート(すなわち、融合ポリペプチド)を、酵素ソルターゼ、特に、ソルターゼAを使用することによって、インビトロで入手することができる。
黄色ブドウ球菌由来のソルターゼAを、ヘキサン、トリエチルアミン、アセトン、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、DES(塩化コリン:グリセロール1:2、塩化コリン:エチレングリコール、塩化コリン:グルコース/フルクトース1:1、および塩化コリン:2,3-ブタンジオール2,3-ブタンジオール1:4)、または水と混合し、可溶性について分析した。Sa-SrtAは、DESおよび水において高度に可溶性であるが、他の溶媒においてはそうでない。
本明細書において報告される一つの局面は、深共融溶媒において、
(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:41、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を(任意で、C末端の100アミノ酸残基内に)含む第1のポリペプチド、
(ii)(i)グリシニル化合物、アラニニル化合物、もしくはシステイニル化合物をN末端に有するか、または(ii)オリゴグリシンもしくはオリゴアラニンもしくはシステインアミノ酸残基に続く1~3個のグリシンもしくはアラニンアミノ酸残基をN末端に有するか、または(iii)リジンアミノ酸残基をN末端の5アミノ酸残基内に有する第2のポリペプチド、および
(iii)ソルターゼA活性を有する第3のポリペプチド
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドの酵素的作製のための方法である。
(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:41、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を(任意で、C末端の100アミノ酸残基内に)含む第1のポリペプチド、
(ii)(i)グリシニル化合物、アラニニル化合物、もしくはシステイニル化合物をN末端に有するか、または(ii)オリゴグリシンもしくはオリゴアラニンもしくはシステインアミノ酸残基に続く1~3個のグリシンもしくはアラニンアミノ酸残基をN末端に有するか、または(iii)リジンアミノ酸残基をN末端の5アミノ酸残基内に有する第2のポリペプチド、および
(iii)SEQ ID NO:05またはSEQ ID NO:06またはSEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有し、任意で、SEQ ID NO:32のC末端タグを含む(可溶性)ソルターゼ
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ソルターゼAによって触媒されるポリペプチドの作製のための方法である。
ソルターゼモチーフ(アミノ酸配列)は、これらの分子、治療剤(薬)、細胞傷害性薬剤(例えば、ドキソルビシンもしくは百日咳毒素のような毒素)、フルオレセインもしくはローダミンのような蛍光色素のようなフルオロフォア、イメージングもしくは放射線治療のための金属のキレート剤、ペプチド性もしくは非ペプチド性の標識、タグ、またはポリエチレングリコールの様々な異性体のようなクリアランス修飾剤、第3の成分に結合するペプチド、もう一つの炭水化物もしくは親油性薬剤、または、例えば、合成低分子(例えば、アセチルサリチル酸)のような低分子のうちの一つに直接含まれていない場合、コンジュゲートされてもよいしまたは組み入れられてもよい。モチーフがコンジュゲーションを介して組み入れられる場合、コンジュゲーションは、直接的であってもよいしまたは介在リンカーを介していてもよい。さらに、第1および/または第2のポリペプチドは、組換えによって作製されてもよいし、または合成であってもよいし、または半合成、即ち、組換えによって作製され、その後、化学的に修飾されたものであってもよい。
治療剤は、例えば、抗体、細胞傷害性もしくは細胞分裂阻害性の化合物のような、治療効果を有する任意の化合物、部分、または基であり得る。抗体は、全長のもしくは完全な抗体であってもよいしまたはそれらの抗原結合断片であってもよい。
非ソルターゼモチーフ部分は、標識であり得る。ソルターゼアミノ酸配列に共有結合で付着し得る任意の標識部分が使用され得る(例えば、Singh et al(2002)Anal.Biochem.304:147-15;Harlow E.and Lane,D.(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Lundblad R.L.(1991)Chemical Reagents for Protein Modification,2nd ed.CRC Press,Boca Raton,Fla.を参照すること)。標識は、(i)検出可能なシグナルを提供するか;(ii)第1もしくは第2の標識によって提供される検出可能なシグナルを修飾するため、例えば、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)を与えるため、第2の標識と相互作用するか;(iii)電荷、疎水性、形、もしくはその他の物理的パラメータによって、移動度、例えば、電気泳動移動度もしくは細胞透過性に影響を与えるか、または(iv)例えば、イオン複合体化をモジュレートするため、キャプチャー部分を提供するよう、機能し得る。
(i)過酸化水素が色素前駆物質(例えば、オルトフェニレンジアミン(OPD)または3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン塩酸塩(TMB))を酸化する、過酸化水素を基質として用いる西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP);
(ii)発色性基質としてパラニトロフェニルリン酸を用いるアルカリホスファターゼ(AP);および
(iii)発色性基質(例えば、p-ニトロフェニル-(3-D-ガラクトシダーゼ)または蛍光発生性基質4-メチルウンベリフェリル-(3-D-ガラクトシダーゼを用いる(3-D-ガラクトシダーゼ((3-D-Gal)。
「リンカー」という用語は、第1の部分を第2の部分とコンジュゲート(連結)するために使用され得る二官能性または多官能性の部分を意味する。2種の反応官能性を有するリンカーを使用して、連結されたコンジュゲートを便利に調製することができる。
ChCl:グリセロールおよび25%(v/v)の水性共溶媒を含むDESを、いずれも高度に親油性の2種の化合物のコンジュゲーションのために使用した。等モル(0.15mM)量の基質を利用し、反応を経時的に分析した。時間経過は図8に示される。25%水性共溶媒を含むDESにおいては39%の変換を入手することができたが、100%水性系においては、変換を検出することができなかった。
ChCl:グリセロールおよび25%(v/v)の水性共溶媒を含むDESを、いずれも高度に親油性の2種の化合物のコンジュゲーションのために使用した。
(i)アミノ酸配列LPXTG(SEQ ID NO:01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)またはLPXTA(SEQ ID NO:41、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を(任意で、C末端の100アミノ酸残基内に)含むポリペプチドを、
(iii)ソルターゼA活性を有する第2のポリペプチド
と共にインキュベートし、それによって、グリセロールにコンジュゲートされたポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドとグリセロールとの酵素的コンジュゲーションのための方法である。
例えばオリゴグリシンモチーフ(GG(SEQ ID NO: 28)、GGG(SEQ ID NO: 29)、GGGG(SEQ ID NO: 30)、GGGGG(SEQ ID NO: 31))などの求核性アミノ酸配列をN末端に含む任意のポリペプチドドメイン(例えば、scFv、scFab、もしくはdarpinのような単鎖抗原結合ポリペプチド、またはdsFvもしくはFabのような多鎖抗原結合ポリペプチド)を、発現させ、真核細胞(例えば、HEK293細胞、CHO細胞)の上清から精製することができる。ポリペプチドが、単離されたポリペプチドであるか、それとも多量体またはヘテロマーの要素に含まれているかは、重要でない。
Sambrook,J.et al.,Molecular cloning:A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989に記載されているような標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に従って使用された。
所望の遺伝子セグメントは、Geneart GmbH(Regensburg,Germany)において、化学合成によって調製された。合成された遺伝子断片を、増大/増幅のため、大腸菌プラスミドへクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。あるいは、化学合成されたオリゴヌクレオチドのアニーリングによって、またはPCRによって、短い合成DNA断片を組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドは、metabion GmbH(Planegg-Martinsried,Germany)によって調製された。
所望の遺伝子/タンパク質(例えば、全長抗体重鎖、全長抗体軽鎖、またはN末端にオリゴグリシンを含有しているFc鎖)の発現のため、以下の機能要素を含む転写単位を使用する:
-イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-発現させるべき遺伝子/タンパク質(例えば、黄色ブドウ球菌の短縮型ソルターゼA)、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
-大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18由来の複製開始点、および
-大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβラクタマーゼ遺伝子。
ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、280nmにおける光学濃度(OD)を決定することによって、精製されたポリペプチドのタンパク質濃度を決定した。
ソルターゼAのための発現プラスミドの生成
黄色ブドウ球菌由来ソルターゼA
ソルターゼ遺伝子は、N末端が短縮された黄色ブドウ球菌ソルターゼA(60~206)分子(SEQ ID NO:05のアミノ酸配列)をコードする。
-T5プロモーター、
-精製タグ、
-N末端が短縮された黄色ブドウ球菌ソルターゼAをコードする核酸、ならびに
-Toおよびfdの終結配列。
-イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-精製タグをコードする核酸、
-N末端が短縮された黄色ブドウ球菌ソルターゼAをコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ソルターゼ遺伝子は、N末端が短縮された化膿性連鎖球菌ソルターゼA分子(SEQ ID NO:06のアミノ酸配列)をコードする。
-T5プロモーター、
-精製タグ、
-N末端が短縮された化膿性連鎖球菌ソルターゼAをコードする核酸、ならびに
-Toおよびfdの終結配列。
-イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-精製タグをコードする核酸、
-N末端が短縮された化膿性連鎖球菌ソルターゼAをコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ソルターゼ遺伝子は、N末端が短縮されたリステリア・モノサイトゲネスソルターゼA(73-222)分子(SEQ ID NO:38のアミノ酸配列)をコードする。
-T5プロモーター、
-精製タグ、
-リステリア・モノサイトゲネスソルターゼAバリアントをコードする核酸、ならびに
-Toおよびfdの終結配列。
-イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P-CMV)由来の最初期エンハンサーおよびプロモーター、
-ヒト重鎖免疫グロブリン5'非翻訳領域(5'UTR)、
-マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
-精製タグをコードする核酸、
-N末端短縮型L.モノサイトゲネスソルターゼAをコードする核酸、ならびに
-ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
一過性発現および分析的特徴決定
大腸菌:
それぞれのソルターゼ発現プラスミドによって形質転換された大腸菌細胞を37℃でおよそ0.9のOD578にまで増殖させること(予備培養)によって、ソルターゼの組換え作製を実施した。このおよそ0.9のOD578で、2mM IPTGを添加し、28℃においてさらに24時間細胞を増殖させることによって、タンパク質発現を誘導した。その後、細胞を遠心分離によって採集し、ホモジナイザーを使用して高圧を介して溶解した。細胞片を除去するため、細胞溶解物を遠心分離し、その後、精製まで、低温(例えば、-80℃)で細胞溶解物を保管した。可溶性ソルターゼを、Ni-NTAクロマトグラフィ後のサイズ排除クロマトグラフィを使用して精製した。内毒素の枯渇のため、陰イオン交換クロマトグラフィをフロースルーモードで実施した。アミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を使用して、280nmでの光学濃度(OD)を測定することによって、ソルターゼ調製物のタンパク質濃度を決定した。還元剤(5mM 1,4-ジチオスレイトール)の存在下および非存在下でのSDS-PAGEならびにクーマシーブリリアントブルーによる染色によって、ソルターゼの純度および完全性を決定した。
F17培地(Invitrogen Corp.)において培養されたHEK293細胞(ヒト胎児腎臓細胞株293由来)の一過性トランスフェクションによって、組換え作製を実施した。トランスフェクションのため、「293-Fectin」トランスフェクション試薬(Invitrogen)を使用した。製造業者の説明書に指定されたように、トランスフェクションを実施した。細胞培養上清をトランスフェクションの3~7日後に採集した。上清を低温(例えば、-80℃)で保管した。
深共融溶媒におけるソルターゼによって媒介されるアミド基転移
この実施例におけるDES-1は、1:2のモル比でグリセロールと混合された塩化コリンである。
ソルターゼモチーフ含有化合物:LCR640-ULPETGGRRC(SEQ ID NO:45)
求核剤:GGGWW-BHQ2(SEQ ID NO:46)
ソルターゼ1:可溶性黄色ブドウ球菌ソルターゼA(SEQ ID NO:05)
ソルターゼ2:可溶性リステリア・モノサイトゲネスソルターゼA(SEQ ID NO:38)
水性溶液におけるソルターゼによって媒介されるアミド基転移
50mMトリスpH7.5、150mM NaCl、10mM CaCl2中の0.5mMのポリペプチドLCR640-ULPETGGGRRC(βアラニン(U)にコンジュゲートされたLCR640フルオロフォア;SEQ ID NO:45)、LPETGソルターゼモチーフ(SEQ ID NO:04)を含むFc領域断片、1.5mMのC末端ビオチン化アミノ酸配列CAAA(SEQ ID NO:03)を有するN末端ビオチン化N末端システインを含むペプチド、および50μM黄色ブドウ球菌ソルターゼAを含む反応混合物を、37℃で18時間インキュベートした。
動力学的アッセイ
この実施例においては、2種の深共融溶媒を試験した。DES-1は、1:2のモル比でグリセロールと混合された塩化コリンである。DES-2は、1:3のモル比でエチレングリコールと混合された塩化コリンである。
レポーター固定化アッセイ
ソルターゼA酵素活性の決定は、欧州特許出願EP14198535に報告され、以下に概説されるようなレポーター固定化アッセイ(REIA)を使用して行われ得る。
20μM当該ポリペプチド
100μM求核剤(GGGG/AAAA/CAAA)
20μM C末端ソルターゼモチーフ(LPXTG)を有するグルコース脱水素酵素
250mM MESNA
0.5mM TCEP。
異なる溶媒における反応
トリメチルアミン、アセトン、イソプロパノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、DES(ChCl:グリセロール1:2、ChCl:エチレングリコール1:3、およびChCl:2,3-ブタンジオール)および水を、溶媒として使用した。ヘキサンに加えて、(15%水、200mM NaCl、10mM CaCl2、および50mMトリス/HCl pH7.5)が補足された溶媒。0.1mM Sa-SrtA、2mM ULPETGGRR、および4mM GGGG-PEG-ビオチンを使用した。ヘキサンの場合、Sa-SrtAを凍結乾燥させて使用した。反応物を、800rpmで37℃で6時間インキュベートし、反応ミックスに0.2M HCl 1:1(v:v)を添加することによって停止させた。20μlを、HPLC系のAeris C18カラムに注入し、2%から100%への緩衝液Bの31分の直線勾配(緩衝液A(v/v):95%水、5%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA);緩衝液B(v/v):5%水、95%アセトニトリル、0.1%TFA)によって分離した。ピークを、同一条件下でLC-MS-ESI系を使用して同定した。
水含量の影響
(ChCl:グリセロール)DESと水(10%、20%、30%、40%、および50%)との混合物を調製し、添加剤を(200mM NaCl、10mM CaCl2、および50mMトリス/HCl pH7.5)の最終濃度で添加した。0.05mM Sa-SrtA、0.5mM LCRed640-LPETGGRRC、および5mM GGGG-PEG-ビオチンを使用した。0.5時間後、1.5時間後、2.5時間後、6時間後、および20時間後に、反応ミックスへ0.2M HCl 1:1(v:v)を添加することによって、反応を停止させた。20μlを、HPLC系のAeris C18カラムへ注入し、2%から100%への緩衝液Bの31分の直線勾配(緩衝液A(v/v):95%水、5%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA);緩衝液B(v/v):5%水、95%アセトニトリル、0.1%TFA)によって分離した。ピークをLC-MS-ESI系を使用して同定した。保持時間:8.1分 Sort-タグ(ULPETGGRR)、8.6分 求核剤(GGGG-Peg-ビオチン)、10.2 ライゲーション生成物(ULPETGGGG-Peg-ビオチン)、および13.5分 Sa-SrtA。
2種の親油性基質のカップリング
(200mM NaCl、10mM CaCl2、および50mMトリス/HCl pH7.5)と共にDES(ChCl:グリセロール)中に25%および100%の水を含有している緩衝液を使用し、0.15mMの両基質(LCRed640-LPETGGRRCおよびGGWWK-BHQ2)を計量した。混合物を、40℃で1時間、振とうし遠心分離した。反応を開始させるため、30μM Sa-SrtAを上清に添加し、37℃でインキュベートした。示された時点で、(20μl)をHPLC系のAeris C18カラムに注入し、8分で5%から48%へ、そして15分で48%から95%への緩衝液Bの直線勾配(緩衝液A(v/v):95%水、5%アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA);緩衝液B(v/v):5%水、95%、0.1%TFA)によって分離した。ピークをLC-MS-ESI系を使用して同定した。
Claims (7)
- (a)1:2のモル比の塩化コリンとグリセロールとからなる深共融溶媒と、
(b)最大30%(v/v)の水性共溶媒と
の混合物である溶媒において、
(i)アミノ酸配列LPXTG(配列番号01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)を含む第1のポリペプチド、
(ii)オリゴグリシンをN末端に有する、第2のポリペプチド、および
(iii)黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ソルターゼAまたはリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)ソルターゼAに由来するソルターゼA活性を有する第3のポリペプチド
をインキュベートし、それによって、ポリペプチドを作製する工程
を含む、ポリペプチドの酵素的作製のための方法。 - 2種のポリペプチドの酵素的コンジュゲーションのための、請求項1記載の方法。
- 溶媒が最大約25%(v/v)の水性共溶媒を含む、請求項1~2のいずれか一項記載の方法。
- 第2のポリペプチドがN末端にアミノ酸配列GGGを有する、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
- 第1のポリペプチドがアミノ酸配列LPXTG(配列番号01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)をC末端に含む、請求項1~4のいずれか一項記載の方法。
- 第1のポリペプチドがアミノ酸配列LPETG(配列番号04)をC末端に含む、請求項1~5のいずれか一項記載の方法。
- 第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドが相互に独立に、抗体可変ドメイン、抗体重鎖Fab断片、抗体Fc領域、タグ、ならびに、アミノ酸配列LPXTG(配列番号01、Xは任意のアミノ酸残基であり得る)、リンカー、および非ソルターゼモチーフ部分を含むペプチドから選択される、請求項1~6のいずれか一項記載の方法。
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