CN111032873A - 融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种将任意的抗原结合性肽用作在细胞内稳定地发挥功能的细胞内抗体的技术。使抗原结合性肽与包含10～39个氨基酸且该氨基酸的至少45％为酸性氨基酸的细胞内稳定化肽融合，作为融合蛋白在细胞内表达。

Description

融合蛋白

技术领域

本发明涉及一种在细胞内环境中表达的具有抗原结合性的功能的融合蛋白。

背景技术

在细胞内发挥功能的抗体即细胞内抗体(intra body)能够通过在高等生物的细胞内识别抗原(靶分子)并结合而对细胞的功能产生影响。这些抗原也可以成为能够通过与细胞内抗体结合而失活的重要的细胞内治疗靶标。另外，作为研究方法，细胞内抗体的使用作为用来通过在细胞的内部与抗体结合而直接特异性地阻碍蛋白质的功能的手段受到关注。

关于细胞内抗体，一般来说，首先用标准的方法来制作识别抗原的单克隆抗体产生杂交瘤，然后由其cDNA构建包含编码单链抗体(single chain Fv：scFv)的DNA的细胞内表达载体，将重链(VH)和轻链(VL)的复合体作为细胞内抗体。

抗体通常在血液等体内的细胞外空间巡回地识别细胞外抗原而发挥功能，以在细胞外环境中发挥作用为前提。因此，当抗体在细胞质内表达的情况下，会产生导致表达水平降低及抗体结构域的半衰期限制的折叠及稳定性的问题，因此并非任何抗体都可以期待作为细胞内抗体发挥功能。另外，scFv由于其重链和轻链用柔性的肽接头相连，所以其立体结构未必有原始抗体那样稳定。此外，即使鉴定出在试管内发挥功能的scFv，由于试管内有许多部分不反映细胞内部的环境，所以在细胞内使scFv表达的情况下也未必能发挥符合期待的功能。

因此，为了筛选出作为细胞内抗体发挥功能的抗体，此前研究耐受细胞质条件的抗体的规律性或用来预测的方法。这些方法虽然是选定在细胞内也能发挥功能的抗体的方法，但实际上难以获得在细胞内稳定的抗体，并没有确立将既有的抗体或新分离的抗体用作细胞内抗体的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第03/014960号

发明内容

[发明要解决的课题]

本发明的目的在于提供一种将任意抗原结合性肽用作在细胞内稳定地发挥功能的细胞内抗体的技术。

[用于解决课题的手段]

本发明者等人为了解决上述课题进行了锐意研究。其结果，发现：当使融合了肽标签的抗原结合性肽在细胞内表达时，由于该肽标签引起的抗原结合性肽的净电荷及等电点(pI)的值的变化，作为细胞内抗体的功能稳定性产生变动。尤其是通过相较于细胞质的pH值环境，以内体的细胞质侧表面的pH值环境作为基准，以电荷值和pI值充分变低的方式来设计肽标签，从而成功地使该融合了肽标签的抗原结合性肽作为细胞内抗体在细胞内稳定地发挥功能。

本发明者等人基于上述见解进一步进行了研究，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述：

1)一种融合蛋白，其包含细胞内稳定化肽及抗原结合性肽，

所述细胞内稳定化肽包含10～39个氨基酸，且该氨基酸的至少45％为酸性氨基酸，且

所述抗原结合性肽包含重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、及轻链CDR3中的至少一个。

2)根据1)所述的融合蛋白，其中所述细胞内稳定化肽中所述氨基酸的28％以下为碱性氨基酸、或不含碱性氨基酸。

3)根据2)所述的融合蛋白，其中所述细胞内稳定化肽不含所述碱性氨基酸。

4)根据2)所述的融合蛋白，其中所述细胞内稳定化肽包含至少一个组氨酸作为所述碱性氨基酸。

5)根据1)至4)中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞内稳定化肽包含14～25个氨基酸，该氨基酸的至少50％为酸性氨基酸，且

在所述细胞内稳定化肽中，不存在8个以上所述酸性氨基酸相连的部分、及4个以上酸性氨基酸以外的氨基酸相连的部分。

6)根据5)所述的融合蛋白，其中在所述细胞内稳定化肽中，不存在3个以上所述酸性氨基酸相连的部分、及3个以上酸性氨基酸以外的氨基酸相连的部分。

7)根据1)至6)中任一项所述的融合蛋白，其中所述细胞内稳定化肽在将所述酸性氨基酸设为X_A、将酸性氨基酸以外的氨基酸设为X_n时，

包含以下的氨基酸序列(1)或(2)：

-X_n-X_A-X_A-X_n-X_A-(X_A或X_n)-X_n-X_A-(X_A或X_n)-X_n-(X_A或X_n)-X_A-······(1)、

-X_n-X_A-X_n-X_A-X_n-X_A-X_A-X_n-X_A-X_n-X_n-X_A-X_A-X_n-X_n-X_A-······(2)。

8)根据7)所述的融合蛋白，其中X_A为天冬氨酸或谷氨酸，X_n为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、酪氨酸及缬氨酸所组成的群中选择的任意氨基酸。

9)一种多核苷酸，其编码所述1)至8)中任一项所述的融合蛋白。

10)一种表达载体，其包含所述9)所述的多核苷酸。

11)一种制造在细胞内表达抗原结合性肽的细胞的方法，其包括

将9)所述的多核苷酸或10)所述的表达载体导入细胞的步骤。

12)一种细胞，其表达所述1)至8)中任一项所述的融合蛋白。

附图说明

图1是表示scFv-A36的表达及结合能力的评估结果的图。

图2是表示scFv-A36的V_H区的CDR的氨基酸序列信息的图。

图3是表示对scFv-GFPA36及scFv-GFPM4在培养神经细胞内的表达和靶分子的功能阻碍活性进行评估的结果的图。

图4是确认scFv-GFPA36在小鼠脑神经的细胞内形成聚集的图。

图5是表示对scFv-A36及scFv-M4的pI及净电荷以及细胞内的聚集性进行评估的结果的图。

图6是表示通过使用scFv-A36蛋白序列进行NCBI blast检索获得其它94种scFv蛋白序列，使用它们对由附加s3Flag及HA肽标签所产生的低pH值环境下细胞内抗体的净负电荷增加效果的普遍性进行调查的结果的图。

图7是表示对s3Flag-scFvA-36-HA构建物的生物化学性质进行调查的结果的图。

图8是表示对s3Flag-scFv-A36-HA及s3Flag-scFv-M4-HA在小鼠脑神经的细胞内的表达进行调查的结果的图。

图9是对s3Flag-scFv-A36-HA及s3Flag-scFv-M4-HA在黑质区中的表达模式进行调查的图。

图10是对s3Flag-scFv-A36-HA及s3Flag-scFv-M4-HA双方在多巴胺神经中的长时间(6个月)表达进行观察的图。

图11是表示对在多巴胺神经中，在体内(in vivo)s3Flag-scFv-A36-HA对Syt I具有功能活性进行调查的结果的图。

图12是表示表达s3Flag-scFv-A36-HA的小鼠及表达s3Flag-scFv-M4-HA的小鼠的运动行动测试及免疫组织染色的结果的图。

图13是表示对STAND-Y13-259的表达及抗肿瘤活性进行调查的结果的图。

图14是表示对DE2.0-Y13-259-HA的表达及抗肿瘤活性进行调查的结果的图。

图15是表示对scFv-6E的净负电荷因scFv-6E与标签融合而变化进行调查的结果的图。

图16是表示对STAND-6E-LYS及DE5.0-6E在细胞内的表达进行观察的结果的图。

图17是表示α-突触核蛋白(α-synuclein)聚集分析的结果的图。

图18是表示对α-突触核蛋白聚集化进行评估的结果的图。

具体实施方式

＜0.定义＞

(肽)

本说明书中，“肽”也可换称为“多肽”或“蛋白质”。“肽”包含氨基酸进行肽键结而成的结构，但也可以进一步包含例如糖链、或类异戊二烯基等结构。“肽”在没有特别说明的情况下，包括含有能够和天然存在的氨基酸同样发挥功能的、天然存在的氨基酸的已知类似物的肽。

(酸性氨基酸)

本说明书中，“酸性氨基酸”是指其等电点为3.99以下的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸、也可以是天然存在的氨基酸的类似物。作为天然存在的酸性氨基酸，可以列举天冬氨酸和谷氨酸。

(碱性氨基酸)

本说明书中，“碱性氨基酸”是指其等电点为7.40以上的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，也可以是天然存在的氨基酸的类似物。作为天然存在的碱性氨基酸，可以列举组氨酸、赖氨酸、及精氨酸。

(酸性氨基酸及碱性氨基酸以外的氨基酸)

本说明书中，当着眼于氨基酸本身的pH值时，将既不符合上述酸性氨基酸的定义也不符合碱性氨基酸的定义的氨基酸统称为“酸性氨基酸及碱性氨基酸以外的氨基酸”或“大致中性氨基酸”。即，这些氨基酸的等电点超过3.99且小于7.40。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，也可以是天然存在的氨基酸的类似物。

(A及/或B)

本说明书中，“A及/或B”是包含A及B与A或B双方的概念，也可以换称为“A及B的至少一个”。

＜1.融合蛋白＞

本发明的融合蛋白包含细胞内稳定化肽及抗原结合性肽，

所述细胞内稳定化肽包含10～39个氨基酸，且该氨基酸的至少45％为酸性氨基酸，

所述抗原结合性肽包含重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、及轻链CDR3中的至少一个。

本发明的融合蛋白通过在任意的细胞中表达而具有作为细胞内抗体的功能。

[细胞内稳定化肽]

(肽的长度和酸性氨基酸的含有)

构成细胞内稳定化肽的氨基酸数没有特别限定，优选为包含至多50个氨基酸的肽，更优选为包含10～39个氨基酸的肽。这里，构成细胞内稳定化肽的所有氨基酸的至少45％为酸性氨基酸。

构成细胞内稳定化肽的所有氨基酸中酸性氨基酸所占的比率没有特别限定，优选为50％以上。构成细胞内稳定化肽的所有氨基酸中酸性氨基酸所占的比率例如可为53％以上或55％以上，有优选为60％以上的情况，有优选为65％以上或70％以上的情况。如果酸性氨基酸的比率变高，那么一般包含该酸性氨基酸的多肽的等电点会降低。

构成细胞内稳定化肽的酸性氨基酸的个数只要满足构成细胞内稳定化肽的所有氨基酸中酸性氨基酸所占的上述比率的任一个即可，没有特别限定，例如为6个或7个以上，优选为8个或9个以上，更优选为10个或其以上，进一步优选为11个或其以上，特别优选为12个或其以上。

构成细胞内稳定化肽的酸性氨基酸优选为从由天冬氨酸及谷氨酸所组成的群中选择。

就提高融合蛋白中细胞内稳定化肽的贡献的观点来说，构成细胞内稳定化肽的氨基酸的数量优选为14个或其以上，更优选为15个或其以上，进一步优选为18个或其以上，特别优选为20个或其以上。另外，从抑制融合蛋白的尺寸的观点来说，构成细胞内稳定化肽的氨基酸的数量优选为35个以下，更优选为30个以下，进一步优选为25个以下。此外，细胞内稳定化肽的长度(参与构成的氨基酸的个数)如果为9个氨基酸以下，那么就融合蛋白中细胞内稳定化肽的贡献的观点来说有不足够的情况。就制作识别细胞稳定化肽的抗体等、视需要所期望的细胞内稳定化肽的特异抗原性的观点来说也有不足够的情况。另外，如果细胞内稳定化肽的长度为40个氨基酸以上，那么融合蛋白的尺寸超过必要地变大，在利用后述抗原结合性肽进行抗原识别时可能会成为空间位阻。但当在细胞内稳定化肽与抗原结合性肽之间以不妨碍抗原识别的方式连结有成为接头的肽的情况下，也可以使用40个氨基酸以上的细胞内稳定化肽。这时，也可以将多个细胞内稳定化肽(可以有多个相同细胞内稳定化肽，也可以是不同细胞内稳定化肽的组合)通过在各细胞内稳定化肽之间经由间隔子连结而加以使用。

(含有碱性氨基酸的情况)

构成细胞内稳定化肽的所有氨基酸中碱性氨基酸所占的比率没有特别限定，优选为28％以下，更优选为27％以下或26.5％以下，进一步优选为25％以下、20％以下、15％以下、或10％以下，特别优选为9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下或3％以下。在特别优选的一形态中，细胞内稳定化肽不含碱性氨基酸。

构成细胞内稳定化肽的碱性氨基酸的个数的优选范围只要满足构成细胞内稳定化肽的所有氨基酸中碱性氨基酸所占的上述比率的任一个即可，没有特别限定，例如为6个以下，优选为5个或4个以下，更优选为3个以下，进一步优选为2个以下，特别优选为1个以下。

在细胞内稳定化肽包含碱性氨基酸的情况下，该碱性氨基酸优选从由赖氨酸及组氨酸所组成的群中选择，更优选包含至少一个组氨酸作为该碱性氨基酸。组氨酸具有在天然存在的碱性氨基酸之中等电点最低的特性。在细胞内稳定化肽包含多个碱性氨基酸的情况下，该碱性氨基酸中组氨酸所占的比率优选为30％以上，更优选为50％以上，进一步优选为60％以上，特别优选为100％。细胞内稳定化肽所含的组氨酸的个数例如为6个、5个、4个、3个、2个或1个。

(酸性氨基酸及碱性氨基酸以外的氨基酸)

细胞内稳定化肽也可以包含上述酸性氨基酸及碱性氨基酸以外的氨基酸(统称为“大致中性氨基酸”)。

构成细胞内稳定化肽的所有氨基酸中大致中性氨基酸所占的比率为55％以下，优选为50％以下，更优选为45％以下。在细胞内稳定化肽包含大致中性氨基酸的情况下，构成该肽的所有氨基酸中大致中性氨基酸所占的比率的下限没有特别限定，在一方式中为15％以上、20％以上、或25％以上。

在考虑到细胞内稳定化肽作为抗原的特性的情况下，构成细胞内稳定化肽的所有氨基酸中疏水性氨基酸(即无极性的大致中性氨基酸)所占的比率优选为25％以下，更优选为20％以下，进一步优选为15％以下。但在考虑到细胞内稳定化肽中的亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的平衡的情况下，也有优选为以满足上述疏水性氨基酸的比率为前提，包含1个以上疏水性氨基酸的情况。在细胞内稳定化肽包含疏水性氨基酸的情况下，其个数例如为1个、2个、3个、或4个。此外，有疏水性氨基酸彼此相连至多3个的情况，有更优选为至多2个的情况。

在细胞内稳定化肽包含天然存在的大致中性氨基酸的情况下，该大致中性氨基酸优选为从由天冬酰胺、苯丙氨酸(疏水性氨基酸)、谷氨酰胺、酪氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸(疏水性氨基酸)、色氨酸(疏水性氨基酸)、缬氨酸(疏水性氨基酸)、甘氨酸(疏水性氨基酸)、亮氨酸(疏水性氨基酸)、异亮氨酸(疏水性氨基酸)、及脯氨酸(疏水性氨基酸)所组成的群中选择，更优选为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、及脯氨酸所组成的群中选择，进一步优选为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、缬氨酸、及脯氨酸所组成的群中选择。在某一方式中，细胞内稳定化肽包含至少1个(优选为1个或2个)脯氨酸、及至少1个(优选为8个以下，为7个、6个、5个、4个、3个、或2个)从天冬酰胺、谷氨酰胺及酪氨酸中选择的氨基酸、及至少1个(优选为1个或2个)脯氨酸以外的疏水性氨基酸。

此外，优选的大致中性氨基酸的种类及其配置例如考虑到形成的细胞内稳定化肽的稳定性(对氧化或水解等的耐性)、有无形成分子内S-S键、有无形成分子内氢键、有无形成不期望的基序(motif)等来决定即可。

(等电点)

细胞内稳定化肽的等电点可以根据构成该细胞内稳定化肽的氨基酸的种类计算。细胞内稳定化肽的等电点例如可以依据Protein Caluculator(http://protcalc.sourceforge.net)等的记载进行计算。

(细胞内稳定化肽的更具体的例示)

以下，对细胞内稳定化肽的更具体的例示进行说明。此外，在以下的说明中，X_A是指酸性氨基酸，X_n是指不为酸性氨基酸的氨基酸，即指上述碱性氨基酸与大致中性氨基酸。

此外，这里具体例示的细胞内稳定化肽能够符合[细胞内稳定化肽]栏中记载的所有事项。例如，X_A符合作为上述酸性氨基酸所记载的所有事项，X_n符合作为上述碱性氨基酸与大致中性氨基酸所记载的所有事项。另外，细胞内稳定化肽的长度等也能够符合上述所有事项。具体而言，例如这里例示的细胞内稳定化肽可以上述氨基酸的28％以下为碱性氨基酸，也可以不含碱性氨基酸(即全部X_n为大致中性氨基酸)。另外，上述细胞内稳定化肽也可以包含至少一个组氨酸作为碱性氨基酸。

(1)第一方式

满足以下所有条目的条件的细胞内稳定化肽。

·细胞内稳定化肽包含10～39个氨基酸，优选包含14～25个氨基酸。

·构成细胞内稳定化肽的氨基酸的至少45％为酸性氨基酸，优选至少50％为酸性氨基酸。

·在细胞内稳定化肽中，不存在8个以上X_A相连的部分、及4个以上X_n相连的部分。即，在细胞内稳定化肽中，X_A相连至多7个，X_n相连至多3个。

(2)第二方式

满足第一方式的条件且满足以下条目的条件的细胞内稳定化肽。

·在细胞内稳定化肽中，不存在6个以上X_A相连的部分、及4个以上X_n相连的部分。即，在细胞内稳定化肽中，X_A相连至多5个，X_n相连至多3个。

(3)第三方式

满足上述第一方式的条件且满足以下条目的条件的细胞内稳定化肽。

·在细胞内稳定化肽中，不存在6个以上X_A相连的部分、及3个以上X_n相连的部分。即，在细胞内稳定化肽中，X_A相连至多5个，X_n相连至多2个。

(4)第四方式

满足上述第一方式的条件且满足以下条目的条件的细胞内稳定化肽。

·在细胞内稳定化肽中，不存在3个以上X_A相连的部分、及3个以上X_n相连的部分。即，在细胞内稳定化肽中，X_A相连至多2个，X_n相连至多2个。

(5)第五方式

满足以下所有条目的条件的细胞内稳定化肽。此外，第五方式可以符合第一～第四方式中的任一个，也可以不符合。

·细胞内稳定化肽包含10～39个氨基酸，优选包含14～25个氨基酸。

·构成细胞内稳定化肽的氨基酸的至少45％为酸性氨基酸，优选至少50％为酸性氨基酸。

·包含以下所示的氨基酸序列：

-X_n-X_A-X_A-X_n-X_A-(X_A或X_n)-X_n-X_A-(X_A或X_n)-X_n-(X_A或X_n)-X_A-·····(1)。

(6)第六方式

满足上述第五方式的条件，且在第五方式所示的氨基酸序列(1)的左侧进一步具有3个～7个X_A或X_n，在右侧进一步具有0个～6个X_A或X_n。

(7)第七方式

满足以下所有条目的条件的细胞内稳定化肽。此外，第七方式可以符合第一～第四方式中的任一个，也可以不符合。

·细胞内稳定化肽包含10～39个氨基酸，优选包含14～25个氨基酸。

·构成细胞内稳定化肽的氨基酸的至少45％为酸性氨基酸，优选至少50％为酸性氨基酸。

·包含以下所示的氨基酸序列：

-X_n-X_A-X_n-X_A-X_n-X_A-X_A-X_n-X_A-X_n-X_n-X_A-X_A-X_n-X_n-X_A-·······(2)。

(8)第八方式

满足上述第七方式的条件，且在第七方式所示的氨基酸序列(2)的左侧进一步具有0个～9个X_A或X_n，在右侧进一步具有0个～9个X_A或X_n。其中，有时位于氨基酸序列(2)的左侧与右侧的氨基酸的个数的合计优选为10个以下，更优选为9个以下，进一步优选为6个或5个以下。

(9)第九方式

符合上述第一～第八方式中的任一个，且X_A为天冬氨酸或谷氨酸，X_n为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、酪氨酸、及缬氨酸所组成的群中选择的任意氨基酸。

(10)第十方式

符合上述第五～第六方式中的任一个，且X_A为天冬氨酸或谷氨酸，X_n中的从氨基酸序列(1)的左侧起第2～6个(优选为第2～4个、更优选为第2～3个)X_n之一或其以上为脯氨酸，不为脯氨酸的X_n为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、及缬氨酸所组成的群中选择的任意氨基酸。例如，从氨基酸序列(1)的左侧起第2～3个X_n之一为脯氨酸，氨基酸序列(1)所含的其它X_n为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、缬氨酸、及酪氨酸所组成的群中选择的任意氨基酸。进而，例如从氨基酸序列(1)的左侧起第2～3个X_n之一为脯氨酸，氨基酸序列(1)所含的其它X_n为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、及酪氨酸所组成的群中选择的任意氨基酸。

(11)第十一方式

符合上述第七～第八方式中的任一个，且X_A为天冬氨酸或谷氨酸，X_n中的从氨基酸序列(2)的左侧起第3～6个(优选为第3～5个、更优选为第4～5个)X_n之一或其以上为脯氨酸，不为脯氨酸的X_n为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、及缬氨酸所组成的群中选择的任意氨基酸。例如，从氨基酸序列(2)的左侧起第4～5个X_n之一为脯氨酸、另一个X_n为缬氨酸，氨基酸序列(2)所含的其它X_n为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、及酪氨酸所组成的群中选择的任意氨基酸。

(12)第十二方式

细胞内稳定化肽包含以下任意氨基酸序列。

MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(序列编号1)；

EEDQDDEDDEDQDD(序列编号2)；

NDEYEDPDEQDDEND(序列编号3)；

QDEVDEPEDEEDNDD(序列编号4)；

QDEVDEPEDEDENDD(序列编号5)；

QDEVDEPEDEDENQD(序列编号6)；

QDNVDEPEDNDENQD(序列编号7)；

QDNYDEPEDNDENQD(序列编号8)；

EDNYDEPEDNDENQD(序列编号9)；

DNNYDEQDENEQPED(序列编号10)；

QENDYDEPEVNDENQD(序列编号11)；

DEQENDYDEPEVNDENQD(序列编号12)；

DEQENDYDEPEVNDENQDYDE(序列编号13)。

(13)第十三方式

满足以下所有条目的条件的细胞内稳定化肽。

·细胞内稳定化肽包含10～39个氨基酸，优选包含14～25个氨基酸。

·构成细胞内稳定化肽的氨基酸全部为酸性氨基酸。

[抗原结合性肽]

(结构)

已知典型的抗体构建物单元包含四聚体。各四聚体由同一2对多肽链构成，各对具有1条轻链(一例中为约25kDa)及1条重链(一例中为约50～70kDa)。各链的氨基末端部分具有约100个氨基酸以上的可变区，该可变区主要负责识别抗原(靶分子)的作用。各链的羧基末端部分规定主要负责效应子功能的作用的恒定区。轻链分类为κ或λ任一种。重链分类为γ、μ、α、Δ或ε，将抗体的同种型规定为IgG、IgM、IgA、IgD、及IgE。轻链及重链中，可变区与可变区通过约12个氨基酸以上的J区连结，重链还包含约10个氨基酸以上的D区。各轻链/重链对的可变区形成抗体结合位点。这些链全部显示由3个高变区(也称为互补决定区或CDR)连结的相对保守的构架区(FR)这一相同的一般结构。通过由构架区将源自各对的2条链的CDR进行排列，能够向特定的表位结合。

“抗原结合性肽”是指任意单克隆抗体或与单克隆抗体同样地和抗原(靶分子)特异性结合的肽中有助于与抗原结合的肽，且具有该抗体的有抗原结合能力的所有区域或一部分区域。本发明中，“抗原结合性肽”例如包含任意单克隆抗体的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、及轻链CDR3中的至少一个。优选为包含这些中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、或这些全部。

成为本发明的抗原结合性肽的基础的单克隆抗体可以是天然型抗体或使用基因重组技术制造的抗体。天然型抗体没有特别限定，可源自包含人、小鼠、大鼠、猴、山羊、兔、骆驼、美洲驼、牛及鸡等在内的生物物种。作为使用基因重组技术制造的抗体，没有特别限定，可列举基于天然型抗体所制作的合成抗体、重组抗体、及突变抗体等。也包括对于已使用基因重组技术制造的抗体实施了与如上所述对天然型抗体进行基因修饰的情况相同的修饰的抗体。本发明的抗原结合性肽是包含源自这些抗体的F(ab')₂、F(ab')、Fab'、Fab、Fv(variable fragment of antibody，抗体的可变片段)、scFv、dsFv(disulphidestabilized Fv，二硫键稳定的Fv)、dAb(single domain antibody，单域抗体)、双功能抗体、微抗体或VHH的全长或其一部分的肽。作为“与单克隆抗体同样地和抗原特异性结合的肽”，可列举对抗原的结合特异性高的肽适体、具有与靶分子的结合特异性的源自活体的蛋白质(例如纤连蛋白)的结合结构域等。

[进一步的功能肽]

本发明的融合蛋白可以进一步含有细胞内稳定化肽及抗原结合性肽以外的1种以上功能肽。作为这种功能肽，可列举：纯化标签肽、检测用肽、分解促进肽(例如HSC70结合肽、XIAP RING结构域肽)、Neh2结构域肽(源自Nrf2的肽)、氧依赖性分解结构域(源自Hif1α的肽)等应激响应性分解肽、及药剂结合性肽等。

作为纯化标签肽，没有特别限定，可列举HA标签序列(YPYDVPDYA(序列编号14))、PA标签序列(GVAMPGAEDDVV(序列编号15))等包含15％以上酸性氨基酸的纯化标签肽。通过含有包含15％以上酸性氨基酸的标签序列，从而即便是在低pH值下，也使融合蛋白的负电荷进一步增加。纯化标签肽更优选包含20％以上酸性氨基酸。

作为检测用肽，没有特别限定，例如可列举荧光蛋白、因反应而放出光或产生颜色变化的酶等。作为荧光蛋白，可列举：BFP、EBFP、CFP、ECFP、Cypet、AmCyan1、GFP、EGFP、YFP、Venus、mKO、mOrange、RFP、DsRed、tdTomato、mcherry、mStrawberry、Azalea、mPlum、mAG、Kaede、Dronpa、Keima、KikG、KikGR、UnaG等，但不限于这些。作为因反应而放出光或产生颜色变化的酶，可列举：过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、青霉素酶、过氧化氢酶、脱辅基葡萄糖氧化酶、脲酶、荧光素酶及乙酰胆碱酯酶等，但不限于这些。

[融合蛋白的结构]

“融合蛋白”是指具有通过共价键直接或经由接头连结的至少2种异种肽的蛋白质。接头没有特别限定，优选为为了提供柔软性而例如主要含有甘氨酸、丙氨酸、及丝氨酸等具有低分子侧链的氨基酸。优选为接头序列的80％、90％、或其以上含有甘氨酸残基、丙氨酸残基、或丝氨酸残基，尤其是含有甘氨酸残基或丝氨酸残基。

融合蛋白所含的细胞内稳定化肽及抗原结合性肽的连结顺序任意。可从融合蛋白的N末端侧起以细胞内稳定化肽-抗原结合性肽的顺序、或抗原结合性肽-细胞内稳定化肽的顺序配置。另外，也可以配置成细胞内稳定化肽及/或抗原结合性肽本身的N末端-C末端的朝向相对于融合蛋白的N末端-C末端的朝向相反。另外，可以在抗原结合性肽的两端配置多个细胞内稳定化肽(可以有多个相同的细胞内稳定化肽，也可以是不同细胞内稳定化肽的组合)。

进一步的功能肽的配置也是任意的。在功能肽是包含15％以上酸性氨基酸的纯化标签肽的情况下，优选为配置在和细胞内稳定化肽隔着抗原结合性肽的位置(细胞内稳定化肽-抗原结合性肽-纯化标签肽、或纯化标签肽-抗原结合性肽-细胞内稳定化肽)。通过像这样进行配置，取得融合蛋白整体的电荷的位置上的平衡。因此，能够在细胞内更稳定地维持融合蛋白。检测用肽的配置也是任意的，但从检测灵敏度的观点来说，优选为位于融合蛋白的最N末端侧或最C末端侧。

另外，也可以在抗原结合性肽的N末端侧和C末端侧双方连结有同一或不同的细胞内稳定化肽。这时，即便是在更低的pH值下，融合蛋白的负电荷也会变多，因此更能防止细胞内的聚集。

本发明的融合蛋白通过包含细胞内稳定化肽，等电点比抗原结合性肽单独存在的情况降低。因此，在细胞内，比使抗原结合性肽单独表达的情况抑制聚集，能够稳定地作为细胞内抗体发挥功能。

本发明的融合蛋白在一例中，优选pH值7.4下的净电荷为负，更优选pH值6.6下的净电荷为负，更优选pH值6.0下的净电荷为负，进一步优选pH值5.0下的净电荷为负。

构成“融合蛋白”的氨基酸的数量没有特别限定，例如为1000个以下，优选为600个以下，更优选为550个以下。构成“融合蛋白”的氨基酸的数量例如为100个以上、250个以上、或300个以上。

＜2.多核苷酸＞

本发明的多核苷酸编码本发明的融合蛋白。“多核苷酸”可以是DNA分子、RNA分子、及DNA与RNA的杂交分子中的任一种。另外，“多核苷酸”可以是单链，也可以是双链。

本发明的多核苷酸可以通过公知的基因工程方法或化学合成方法等制备。本发明的多核苷酸的具体碱基序列可以根据目标融合蛋白的氨基酸序列，例如参照密码子表由本领域技术人员容易地设计。

另外，也可以视需要包含启动子(SV40启动子、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子、CMV启动子等)、增强子、核糖体结合位点、剪切信号、及终止子等调节性序列、以及选择标记序列等。

另外，通过视需要附加定位于细胞核或线粒体、内质网或质膜正下方的信号肽序列，能够通过本发明的融合蛋白的定位化而控制作为细胞内抗体发挥功能的细胞内的位置。

本发明的多核苷酸可引入至载体。“载体”是指用来将所需的多核苷酸导入至宿主细胞，使其在宿主细胞中表达的媒介。作为载体，可以列举病毒载体、以及质粒载体、细菌载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、及粘粒载体等非病毒载体系载体。作为病毒载体，可列举：腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(RSV、MMTV、及MOMLV等)、慢病毒、仙台病毒、单纯疱疹病毒等。当在体内将本发明的多核苷酸导入至细胞的情况下，优选使用病毒载体。当在体外将本发明的多核苷酸导入至细胞的情况下，可以使用病毒载体及非病毒载体系载体中的任一种。

载体除了要表达的DNA以外，例如也可以包含启动子(SV40启动子、MMTV-LTR启动子、EF1α启动子、CMV启动子等)、增强子、核糖体结合位点、剪切信号、及终止子等调节性序列、以及视需要的选择标记序列(氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等)等。启动子可以是恒定的，也可以是诱导性的。

表达载体的构建例如可以使用公知的基因工程方法来进行。

＜3.利用方法＞

[药学上的用途]

(药学组合物)

本发明又提供一种药学组合物，其包含上述融合蛋白、多核苷酸或载体。

本发明的药学组合物可以进一步含有除上述融合蛋白、多核苷酸或载体以外的其它成分。该其它成分没有特别限定，例如可列举药学上可接受的载体、润滑剂、保存剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、渗透压调整用的盐类、缓冲剂、稳定剂、保存剂、赋形剂、抗氧化剂、粘度调整剂、着色剂、香味料、及甜味料等。当药学组合物形成为水溶液的情况下，可以将纯水(灭菌水)、生理盐水、或磷酸缓冲生理盐水等用作载体。当药学组合物形成为其它适当的溶液的情况下，可以将能导入至活体内的有机酯、例如二醇、甘油、或橄榄油等用作载体。

药学组合物可以与使用说明书一起收容在容器、包装、或分配器等中。

(用于治疗及预防疾病)

上述药学组合物例如能用于治疗及/或预防与抗原相关的疾病。

作为本发明的药学组合物的一个方式，将本发明的多核苷酸或载体导入至对象细胞中，使本发明的融合蛋白在对象细胞内表达，通过抗原结合性肽对与疾病相关的抗原的功能进行控制(即抑制或活化；优选为抑制)，治疗及/或预防疾病。

作为本发明的药学组合物的另一方式，通过利用用来将抗体从细胞外环境运向细胞内的机制，本发明的融合蛋白能够侵入至靶细胞内，作为细胞内抗体发挥功能，治疗及/或预防疾病。

作为本发明的药学组合物的另一方式，在从细胞外环境转移到细胞内并再次运送向细胞外环境的机制(再循环机制)中，能够提高本发明的融合蛋白在靶细胞内的稳定性，在细胞内及/或细胞外作为抗体发挥功能，治疗及/或预防疾病。

作为本发明的药学组合物的另一方式，是一种对采集的细胞以表达本发明的融合蛋白的方式进行处理所得的细胞，通过将表达本发明的融合蛋白的该细胞向对象施用，能够治疗及/或预防疾病。在所述方式中，采集的细胞可以是从成为施用对象的个体采集的同种同系细胞(自体细胞)，也可以是从与施用对象不同的个体采集的异种同系细胞(异体细胞)。

在任一方式中，在使本发明的融合蛋白在细胞内表达时，均可附加定位用转移信号以定位于特定的细胞器。

“治疗”的一个方面包括使与对象疾病相关的至少一个症状减轻或缓和、延缓发展、及治愈等。“预防”的一个方面包括防止与对象疾病相关的至少一个症状发病。

作为治疗及/或预防的对象生物，例如可列举人及非人动物，更具体而言，可列举鱼类、鸟类及哺乳类等脊椎动物。作为哺乳类，可列举：小鼠、大鼠、兔、豚鼠及除人以外的灵长类等实验动物；狗及猫等伴侣动物(宠物)；猪、牛、山羊、绵羊及马等家畜；或人。

作为治疗或预防的疾病，例如可列举：癌症、肿瘤、神经系统疾病(中枢神经系统疾病、周围神经系统疾病)、感染(病毒感染、细菌感染等)性疾病、自体免疫疾病或过敏疾病、及炎症性疾病等。

作为癌症或肿瘤，例如可列举：舌癌、牙龈癌、恶性淋巴瘤、恶性黑色素瘤(melanoma)、上颌癌、鼻癌、鼻腔癌、喉癌、咽癌、神经胶质瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡癌、甲状腺髓样癌、原发性肺癌、鳞状细胞癌、腺癌、肺泡上皮癌、大细胞未分化癌、小细胞未分化癌、类癌、睾丸肿瘤、前列腺癌、乳癌(例如乳头状腺癌、粉刺状癌、粘液癌、髓样癌、小叶癌、硬癌肉瘤、转移肿瘤)、乳房柏哲氏病、乳房肉瘤、骨肿瘤、甲状腺癌、胃癌、肝癌、急性骨髓性白血病、急性前骨髓性白血病、急性骨髓性单核细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性淋巴性白血病、急性未分化性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、成人型T细胞白血病、恶性淋巴瘤(例如淋巴肉瘤、网状肉瘤、霍奇金病等)、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症、小儿白血病、食道癌、胃癌、胃/大肠平滑肌肉瘤、胃/肠恶性淋巴瘤、胰腺/胆囊癌、十二指肠癌、大肠癌、原发性肝癌(例如肝细胞癌、胆管细胞癌等)、肝母细胞瘤、子宫上皮内癌、宫颈部鳞状细胞癌、子宫腺癌、子宫腺鳞状细胞癌、子宫体部腺棘皮癌、子宫肉瘤、子宫癌肉瘤、子宫破坏性葡萄胎、子宫恶性绒毛上皮瘤、子宫恶性黑色素瘤、卵巢癌、中胚叶混合肿瘤、肾癌、肾盂移行上皮癌、输尿管移行上皮癌、膀胱乳头状癌、膀胱移行上皮癌、尿道鳞状细胞癌、尿道腺癌、威尔姆斯瘤、横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、滑膜肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、尤因肉瘤、皮肤鳞状细胞癌、皮肤基底细胞癌、皮肤鲍文病、皮肤佩吉特病、皮肤恶性黑色素瘤、恶性间皮癌、转移性腺癌、转移性鳞状细胞癌、转移性肉瘤、间皮瘤(例如胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤等)等，但不限于这些。

作为中枢神经系统疾病，可列举：帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、朊毒体病、额颞叶型失智症、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、脊髓延髓肌肉萎缩症(SBMA或肯尼迪氏病)、齿状红核苍白球萎缩症(DRPLA)、脊髓小脑运动失调(例如SCA-1～SCA-7)、痴呆症、精神分裂症、抑郁症、躁狂抑郁症、神经官能症、心身疾病、脑梗塞、多发性硬化症、进行性核上性麻痺、多系统萎缩症、脊髓小脑变性症、小脑变性症、脑代谢异常、脑循环异常、植物神经失调症、中枢神经系统参与的各种内分泌系统的异常、睡眠障碍、神经症状(恶心、呕吐、口渴、食欲不振、眩晕等)、运动障碍、学习障碍等，但不限于这些。

作为感染性疾病，例如可列举：感染人免疫缺陷病毒(HIV)、人T细胞白血病病毒(例如HTLV-I)、肝炎病毒(例如A型、B型、C型、D型及E型肝炎病毒)、流感病毒、单纯疱疹病毒、西尼罗河病毒、人乳头瘤病毒、脑炎病毒、埃博拉病毒等病原性病毒所引起的疾病、感染衣原体、分枝杆菌、军团菌等病原性细菌所引起的疾病、感染曲霉菌、念珠菌等病原性酵母所引起的疾病、感染疟原虫、椎体虫等病原性原虫所引起的疾病等，但不限于这些。

施用途径/方法没有特别限定，可根据对象疾病适当选择。可对患处直接施用，也可以间接施用。另外，也可以施用表达本发明的融合蛋白的细胞。在一例中，作为施用途径，例如可列举：经口、静脉内、肌内、皮下、肿瘤内、直肠、动脉内、门脉内、心室内、透粘膜、透皮、鼻内、腹腔内、肺内及子宫内等途径，也可以列举局部施用、使用基因枪的方法等。

用量及施用次数可以根据症状的程度、年龄、性别、体重、施用形态、疾病的具体种类等适当选择。

[作为研究工具的用途]

(研究用试剂)

本发明又提供一种研究用试剂，其包含上述多核苷酸或载体。研究用试剂可以进一步包含除上述多核苷酸或载体以外的其它成分。该其它成分可以参照上述(药学组合物)中说明的成分。

研究用试剂可以与使用说明书一起收容在容器、包装、或分配器等中。

(作为研究工具的利用方法)

本发明的融合蛋白可用于细胞内的抗原(例如蛋白质或多肽等)的功能分析。在一例中，能够通过使针对作为功能分析对象的抗原的抗原结合性肽制成本发明的融合蛋白在细胞内表达，控制抗原的功能(优选为阻碍)，从而进行抗原的功能分析。

对象细胞没有特别限定。作为对象细胞，例如可列举人细胞及非人动物细胞，更具体而言，可列举鱼类细胞、鸟类细胞及哺乳类细胞等脊椎动物细胞。作为哺乳类细胞，可列举：小鼠、大鼠、兔、豚鼠及除人以外的灵长类等实验动物；狗及猫等伴侣动物(宠物)；猪、牛、山羊、绵羊及马等家畜；或人的细胞。另外，细胞可以是培养细胞，也可以是活体细胞(活体内的没有分离出的细胞)。细胞的优选一例为人的培养细胞、人的活体细胞、非人病理模型动物的培养细胞、非人病理模型动物的活体细胞。

在将病毒载体导入至靶细胞的情况下，可列举将病毒载体悬浮于细胞培养液中的方法。在将非病毒载体系载体导入至靶细胞的情况下，例如可以通过电穿孔法、显微注射法、脂质体转染法、磷酸钙法、DEAE葡聚糖法等方法进行。

作为阻碍抗原功能的结果的指标，可列举细胞、组织、或个体出现的表型的变化，可基于这些指标进行抗原的功能分析。作为细胞变化的指标，可列举细胞表型的变化、例如产生物质的量及/或质的变化、增生活性的变化、细胞数的变化、形态的变化、特性的变化、细胞凋亡的诱导等。作为产生物质，可使用分泌蛋白、表面抗原、细胞内蛋白、mRNA等。作为形态的变化，可使用突起形成及/或突起数量的变化、扁平率的变化、伸长率/纵横比的变化、细胞大小的变化、内部结构的变化、细胞集群的异形性/均一性、细胞密度的变化等。这些形态的变化可以通过显微镜下的观察来确认。作为特性的变化，可以使用支架依赖性、细胞因子依赖性响应性、激素依赖性、药剂耐性、细胞运动性、细胞游走活性、搏动性、细胞内物质的变化等。作为细胞运动性，可列举细胞浸润活性、细胞游走活性。另外，作为细胞内物质的变化，可使用酶活性、mRNA量、Ca²⁺或cAMP等细胞内信息传递物质量、细胞内蛋白量等。作为组织系统的指标，可以将与使用组织对应的功能变化作为检测指标。作为活体系统的指标，可以使用组织重量变化、血液系统的变化、例如血球细胞数的变化、蛋白量、或酶活性、电解质量的变化、以及循环器官系统的变化、例如血压、心率的变化等。

作为测定这些检测指标的方法，没有特别限制，可以使用吸光、发光、显色、荧光、放射活性、荧光偏光度、表面等离子体共振信号、时间分辨荧光度、质量、吸收光谱、光散射、荧光共振能量转移等。这些测定方法对本领域技术人员来说是众所周知的，可以根据目的适当选择。例如吸收光谱可以通过一般使用的光度计或读板仪等测定，发光可以通过发光仪等测定，荧光可以通过荧光仪等测定。质量可以使用质谱仪测定。放射活性可以根据放射线的种类使用γ计数器等测定仪器测定，荧光偏光度可以通过BEACON(宝酒造)测定，表面等离子体共振信号可以通过BIACORE测定，时间分辨荧光、荧光共振能量转移等可以通过ARVO等测定。进而，流式细胞仪等也可以用于测定。这些测定方法可以用一个测定方法测定2种以上的检测指标，只要简便，那么也可以通过同时及/或连续进行2种以上的测定来进一步测定多个检测指标。例如可以同时通过荧光仪来测定荧光与荧光共振能量转移。

本发明的融合蛋白也可以用于细胞内的抗原(例如蛋白质或多肽等)的动态观察。在一例中，能够通过使针对作为动态观察对象的抗原的抗原结合性肽制成本发明的融合蛋白在细胞内表达，检测抗原与融合蛋白的反应，从而进行抗原的动态观察。抗原的动态观察包括在某一时间或经时地观察抗原的表达、抗原的定位等。

抗原与融合蛋白反应的检测例如可以利用融合蛋白所含的检测用肽所引起的荧光、发光、显色等来进行。

＜4.使抗原结合性肽在细胞内表达的方法＞

本发明又提供一种使抗原结合性肽在细胞内表达的方法。该表达方法包括使上述多核苷酸(即编码本发明的融合蛋白的多核苷酸)在细胞内表达的步骤。

表达可以是恒定的，也可以是瞬时的。另外，也可以是诱导性的。在恒定地表达的情况下，只要使用在融合蛋白的基因上游连结有进行恒定表达的启动子的多核苷酸即可。在瞬时地表达的情况下，例如只要将RNA而不是DNA导入至细胞内表达即可。在通过诱导进行表达的情况下，只要使用在融合蛋白的基因上游连结有诱导性启动子的多核苷酸即可。而且，在使抗原结合性肽表达时，只要将诱导因子(例如IPTG等)引入至细胞即可。

作为对象细胞，可列举＜3.利用方法＞中列举的细胞。

在本发明的表达方法中，使抗原结合性肽在与细胞内稳定化肽融合的状态下(即制成融合蛋白)表达。本发明的融合蛋白通过包含细胞内稳定化肽，从而等电点比抗原结合性肽单独存在的情况降低。因此，在细胞内，与使抗原结合性肽单独表达的情况相比，抑制聚集，能够稳定地作为细胞内抗体发挥功能。

在一个实施方式中，本发明的表达方法还包括将上述多核苷酸导入至细胞的步骤。上述多核苷酸可以用载体的形态导入。具体的导入方法可列举＜3.利用方法＞中记载的方法。因此，本发明进而提供一种制造在细胞内表达抗原结合性肽的细胞的方法。该制造方法包括将上述多核苷酸(即编码本发明的融合蛋白的多核苷酸)或上述表达载体导入至细胞的步骤。另外，本发明还进而提供一种表达本发明的融合蛋白的细胞。

＜5.试剂盒＞

本发明又提供一种试剂盒，其用于制作编码上述包含细胞内稳定化肽与抗原结合性肽的融合蛋白的多核苷酸，包含编码该细胞内稳定化肽的多核苷酸。

本发明的试剂盒可以是能够对所需抗原结合性肽容易地制作编码融合蛋白的多核苷酸的通用试剂盒。

编码本发明的细胞内稳定化肽的多核苷酸可以引入至如上所述的载体。另外，该多核苷酸可以包含蛋白质表达所必需的因子(例如启动子、核糖体结合位点、及终止子等)、选择标记、或限制酶识别位点等。

进而，本发明的试剂盒也可以进一步包含缓冲液、限制酶、其它必要的试剂、器具、及使用说明书等中的至少一个。

以下示出实施例，对本发明的实施方式进一步详细地进行说明。当然，不用说本发明不限于以下实施例，细节可以是各种方式。进而，本发明不限于上述实施方式，能够在权利要求所示的范围内进行各种变更，适当组合各公开的技术手段而获得的实施方式也包括在本发明的技术范围内。另外，本说明书中所记载的文献全部作为参考加以引用。

实施例

[实验动物]

所有实验程序均依据理化学研究所动物实验委员会的指南进行。将使用小鼠置于以12小时为单位的明暗周期，暗周期是从20：00至8：00发生。

[抗体]

将该研究中使用的抗体记载于表S1。

[抗体反应性噬菌体的分离]

使用重组噬菌体抗体系统(RPAS)(GE Healthcare)分离scFv基因。scFv-A36的DNA序列以登录编号AB472376登录在日本DNA数据库(DDBJ)。

[表达载体的构建]

下文记载基于使用特定引物的PCR所构建的表达载体。

[重组病毒载体的制作]

使用AAV1血清型制作了ScFv-GFPA36及scFv-GFPM4；使用AAV9血清型制作了s3Flag-scFv-A36-HA及s3Flag-scFv-M4-HA。AAV载体质粒及其制作详情记载于下文。

[AAV载体的定位注入]

使用麻醉器(MK-A110；Muromachi)利用异氟醚(Escain；Mylan)麻醉雄性野生型B6小鼠、或雄性DAT-cre(+/-)小鼠(8周龄)，配置于定位框架(Stereotaxic Just for Mouse，Muromachi)。将AAV载体注入右半球的黑质(相对于前囟以毫米单位表示的坐标为AP：-3.08，LR：-1.25，DV：-4.5)。

[重组scFv抗体的纯化]

使重组抗体scFv-GFPA36在大肠杆菌(E.coli)系统BL21中表达，在变性或非变性条件下，使用Ni-NTA琼脂糖色谱进行纯化。从为了提高外源蛋白质在可溶状态下的表达(Yasukawa et al.,1995)而利用表达硫氧还蛋白(Trx)的pT-Trx载体进行了共转化的大肠杆菌系统BL21，在非变性的条件下使用抗-Flag(M2)抗体结合亲和珠(Sigma)纯化重组抗体s3Flag-scFv-A36-HA。

[免疫荧光染色]

用标准方法进行免疫染色。免疫荧光信号是通过经Alexa Fluor 488或AlexaFluor 594标记的二级抗体(Invitrogen)可视化。经荧光标记的试样是通过FluoviewFV1000共聚焦显微镜(Olympus)或BZ-9000荧光显微镜(Keyence)显示为图像。

[利用ELISA进行的抗体的亲和性测量]

如下所述通过ELISA来测量GST-Syt I-C2A的抗体结合亲和性。

[行动测试]

改良了以前报告的转棒试验(Shiotsuki et al.,2010)，实施改良转棒试验。在本研究中，配备在小鼠用转棒(MK-610A，Muromachi)上覆盖了防滑胶带(Nitoflon胶带，No.903UL，0.13mm厚，Nitto denko)所得的大棒(直径9cm)。

[与scFv-A36比对的ScFv蛋白]

将与scFv-A36比对的scFv蛋白的登录编号及氨基酸残基记载于表S2。

[实验动物]

从Jackson laboratory购买Dat+/IRES-cre小鼠(Backman et al.,2006)。将表达scFv基因的AAV病毒载体与DAT-Cre小鼠系统一起用于使抗体基因在黑质的多巴胺神经中选择性地表达。微透析及行动测试中使用的具有病毒载体的所有小鼠都是由一对杂合子生出的雄性同窝仔。将从Charles Liver Japan购买的Balb/c、Balb/c-nu及野生型C57B6/J小鼠用于抗体产生、或使用慢病毒载体及AAV载体的实验、以及原代多巴胺神经培养。

[抗体反应性噬菌体的分离]

在scFv中，上述抗体的轻链及重链的可变部利用被一个基因编码的甘氨酸接头融合。通过RPAS(GE Healthcare)，能够将scFv的多种多样的组库(Repertoire)展示在M13噬菌体的表面上。从通过GST-Syt II-C2A获得了免疫性的小鼠(Balb/c)脾脏分离总RNA(Fukuda et al.,1994；Fukuda et al.,1999)。对上述轻链及重链的可变部(分别为VH及VL)使用简并引物(GE Healthcare)通过2个独立的反应进行扩增。将结果获得的PCR产物与柔性的编码(Gly4-Ser)3的15个氨基酸链的接头结合。将VH-甘氨酸接头-VL复合体(scFv)亚克隆至pCANTAB 5E载体(GE Healthcare)的Sfi I及Not I位点。通过利用包含scFv cDNA的质粒载体及M13-KO7辅助噬菌体的感染转化大肠杆菌TG-1细胞，从而产生重组噬菌体抗体。抗体反应性噬菌体的分离是依据制造商的使用说明书通过生物淘选进行的。使抗体反应性噬菌体感染对数期TG-1细胞。通过使用与微量滴定孔结合的重组GST-Syt II-C2A进行ELISA，从噬菌体库筛选出展示各个抗体的噬菌体。使用辣根过氧化物酶(HRP)结合抗M13抗体使抗体反应性噬菌体可视化。使用自动DNA测序仪确定抗体反应性scFv克隆(命名为scFv-A36)的序列。

[表达载体的构建]

基于scFv-A36的cDNA序列，配合PCR扩增来设计2个接头引物，由此，将科扎克序列、T7肽、及BamHI限制酶识别位点导入至A36的5'侧翼区，将MunI位点、六组氨酸残基、及Not I位点导入至A36的3'侧翼区(表1)。

[表1]

接下来，将PCR产物直接连结至pGEM-T-easy克隆载体(Promega，Tokyo，Japan)(命名为pGEM-scFv-A36；图8的A)。从pEGFP-C1载体(Clontech)通过使用下述引物进行PCR获得了高灵敏度绿色荧光蛋白(EGFP)片段(表2)。

[表2]

接下来，将消化EGFP片段连结至pGEM-scFv-A36的BamHI位点，制作pGEM-scFv-GFPA36载体。为了构建pET-scFv-GFP A36，将pGEM-scFv-GFPA36的BamHI-NotI消化片段连结至变更的pET3a(M.Fukuda，未发表数据)大肠杆菌表达载体(Novagen)的BamHI及NotI位点。为了在哺乳类细胞中，通过巨细胞病毒(CMV)启动子进行驱动使scFv-GFPA36瞬时表达，而将pGEM-scFv-GFPA36的NotI片段连结至pIRES载体(Invitrogen)，制作载体pIRES-scFv-GFPA36。为了构建scFv-A36变异体，将包含A36的重链的CDR1及CDR3区的DNA片段通过使用下述2个简并引物进行PCR而扩增(表3)。此外，N为A、C、G、或T(等摩尔)。

[表3]

接下来，使用HindIII及BstEII来消化CDR1及CDR3变异体片段，连结到原先的A36的HindIII及Bst EII位点。从这些DNA片段利用上述方法产生展示变异体scFv的噬菌体库。scFvs的氨基酸序列的多重比对是使用CLUSTALW(version.2.1：http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php？lang＝ja)(Thompson et al.,1994)进行的。合成融合了3×Flag标签(MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(序列编号1))及HA标签(YPYDVPDYA(序列编号14))的scFv构建物(s3Flag-scFv-HA)，并且为了在小鼠中表达而使密码子最优化。为了在哺乳类细胞中瞬时表达，将s3Flag-scFv-HA片段克隆至pEF-BOS载体(Mizushima andNagata，1990)。为了在大肠杆菌BL21细胞中表达s3Flag-scFv-HA蛋白及纯化，将s3Flag-scFv-HA片段克隆至pET3a载体。

[细胞培养及转染]

从胚胎日13～14天的雄性及雌性小鼠胚胎的腹侧中脑准备原代多巴胺神经培养。简而言之，通过胰蛋白酶处理解离腹侧中脑(0.25％20分钟、37℃)，在包含DNase I的添加有10％FBS的neurobasal培养基中，用经火抛光的巴斯德吸管粉碎。将解离的细胞(6×10⁴)在24孔盘(Iwaki)中，铺在涂布了聚-L-赖氨酸(1μg/mL)的盖玻片(Fisherbrand，直径：12mm)上，然后在添加了B27(Invitrogen)的neurobasal培养基500μL中培养。用AAV载体(滴度：1×10¹¹mg/mL)5μL感染各孔内第7天的体外(in vitro)的细胞(DIV)，使附带GFP标签的scFv蛋白表达，在感染起7天后，进行免疫细胞化学或多巴胺释放分析。将从RIKENBioResource Center Cell Bank(Tsukuba，Japan)获取的293T及COS-7细胞在添加了10％FBS的DMEM中培养。使用Lipofectamine2000依据制造商的使用说明书(Invitrogen)利用表达载体转染这些细胞，在转染起1天后，用于免疫化学分析。

[重组scFv抗体的纯化]

将大肠杆菌系统BL21(DE3)(Novagen)用于scFv-GFPA36的表达。利用1mM的异丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)在30℃下诱导scFv-GFPA36的表达3小时。用缓冲液(8M尿素、0.1M NaH₂PO₄、10mM Tris-HCl[pH值8.0])溶解ScFv-GFPA36蛋白，利用Ni-NTA琼脂糖色谱(Qiagen)依据制造商的建议进行纯化。在变性条件下，用4mL的缓冲液(8M尿素、0.1MNaH₂PO₄、10mM Tris-HCl[pH值6.3])清洗管柱。其后，用1mL的缓冲液(8M尿素、0.1MNaH₂PO₄、0.01M Tris-HCl[pH值4.5])从管柱洗脱ScFv-GFPA36。将洗脱的scFv-GFPA36蛋白利用缓冲液(10mM HEPES-KOH；pH值7.2)进行透析。为了在非变性条件下纯化scFv-GFPA36，将表达scFv-GFPA36的细胞重悬于包含蛋白酶抑制剂混合物的PBS缓冲液中，在冰上进行超声处理，添加Triton X-100(1％)在4℃下溶解1小时。进行离心分离后，将上清液进行Ni-NTA(镍-次氮基三乙酸，GE Healthcare)色谱。使用包含5mM组氨酸的缓冲液(10mM HEPES-KOH；pH值7.2)从管柱洗脱表达的scFv-GFPA36，其后用缓冲液(10mM HEPES-KOH；pH值7.2，150mM NaCl)透析。

为了在非变性条件下纯化s3Flag-scFv-A36-HA，利用表达s3Flag-scFv-A36-HA的pET3a载体(Novagen)及表达硫氧还蛋白(Trx)的pT-Trx载体共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(Novagen)，提高了外源蛋白质在可溶状态下的表达(Yasukawa et al.,1995)。添加1mM IPTG诱导对数期的已转化的细胞。在诱导起3小时后，通过离心分离回收细胞。将细胞重悬于包含蛋白酶抑制剂混合物的PBS缓冲液。对悬浮的细胞在冰上进行超声处理，添加Triton X-100(1％)在4℃下溶解1小时。进行离心分离，使用0.45μm孔过滤器进行过滤后，将上清液进行使用抗Flag(M2)抗体结合亲和珠(Sigma)的纯化色谱。依据制造商的建议纯化表达的s3Flag-scFv-A36-HA。使用包含3×Flag肽(1mg/mL)的缓冲液(50mM Tris-HCl，pH值7.4，150mM NaCl)从管柱洗脱s3Flag-scFv-A36-HA，用缓冲液(20mM Hepes-KOH，pH值7.2，50mM NaCl)进行透析。

[由ELISA进行的抗体亲和性测量]

将缓冲液中的纯化的GST-Syt I-C2A(0.25pmol)在室温下涂布于96孔盘16小时。将各孔用包含5％脱脂奶的PBS缓冲液在室温下封闭2小时，与0.22～36nM纯化的s3Flag-scFv-A36-HA一起孵育。通过与小鼠的抗体Flag(M2)一级抗体、及HRP结合抗小鼠二级抗体一起孵育来对结合进行定量。通过减去s3Flag-scFv-A36-HA对经0.25pmol的GST涂布的孔的结合来计算特异性结合。通过希尔-朗缪尔的式子进行了s3Flag-scFv-A36-HA结合数据的非线性回归。

[数1]

上式中，B表示与GST-Syt I-C2A结合的s3Flag-scFv-A36-HA的浓度，B_max表示所有结合位点的浓度，[s3Flag-scFv-A36-HA]表示游离s3Flag-scFv-A36-HA浓度，Kd表示解离常数。

[免疫荧光染色]

利用下述标准方法实施免疫细胞化学及免疫组织化学。将细胞用4％PFA在室温下固定2分钟，用包含0.3％Triton X-100的PBS在室温下进行2分钟通透处理。对细胞立即用封闭溶液(包含1％BSA及0.1％Triton X-100的PBS)清洗3次，与封闭溶液一起在室温下孵育1小时，其后在室温下与一级抗体一起孵育2小时。通过与经Alexa Fluor 488或AlexaFluor 594标记的二级抗体(Invitrogen)一起孵育而将免疫荧光信号可视化。将与AlexaFluor染料结合的一级抗体及二级抗体记载于表S1。在对具有由细胞内抗体形成的聚集体的细胞的比率进行定量的实验中，在各实验中对1个皿内的至少100个细胞进行计数以定量具有聚集体的细胞的比率。由3次独立实验获得数据。在免疫组织化学中，小鼠用4％多聚甲醛固定。对小鼠脑的低温切片(16μm厚)在包含0.3％Triton X-100的PBS中在室温下进行2小时通透处理，与包含一级抗体的封闭溶液(1％BSA、0.1％Triton X-100)一起在4℃下孵育16小时。使用经Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594标记的二级抗体(Invitrogen)将免疫荧光信号可视化。使经荧光标记的试样利用Fluoview FV1000共聚焦显微镜(Olympus)或BZ-9000荧光显微镜(Keyence)成像。

[免疫印迹分析]

像以前记载的那样制备附带Flag标签的全长小鼠Syt I-XI(Fukuda et al.,1999)。对在COS-7细胞中瞬时表达的附带Flag标签的Syt I-XI的全匀浆物进行10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将纯化的scFv-GFPA36(1.6μg/mL)用作一级抗体。将经HRP标记的抗T7单克隆抗体(1/5000稀释，Merck Millipore)用作二级抗体。使用高灵敏度化学发光(ECL)检测系统(GE Healthcare)将有免疫反应性的条带可视化。为了确保加载了等量的附带Flag标签的Syts，对印迹用抗Flag抗体进行再探测。为了调查纯化的s3Flag-A36-HA是否在脑中识别小鼠Syt I/II，分离出小鼠脑组织，用匀浆缓冲液(20mM HEPES-KOH，pH值7.2、150mM NaCl、0.5％TrintonX-100、Complete蛋白酶抑制剂混合物；Roche)进行匀浆，并在4℃下搅动1小时。将纯化的s3Flag-A36-HA用作一级抗体，对全匀浆物的2.5μg蛋白质进行西方印迹。通过使用抗Flag抗体(二级抗体)及HRP标记抗小鼠抗体的ECL将有免疫反应性的条带可视化。在使用注入了AAV载体的小鼠脑的实验中，分离出小鼠脑组织，在缓冲液(PBS、0.5％NP40、1mM 2ME、2mMEDTA、及Complete蛋白酶抑制剂混合物)内进行匀浆，利用27G针头注射器切断，在4℃下搅动1小时。将抗TH、抗微管蛋白、抗Syt I抗体用作一级抗体对全匀浆物进行西方印迹。

[免疫沉淀]

用pIRES-scFv-GFPA36或pIRES-scFv-GFPM4、及pEF-BOS-Flag-Syt I或对照载体(pEF-BOS)共转染COS-7细胞。利用LipofectAMINE(Invitrogen)依据制造商的建议进行质粒DNA的转染。转染2天后，使细胞分散，在缓冲液(10mM HEPES-KOH[pH值7.2]、100mM NaCl、1mMβ-巯基乙醇)中进行匀浆。使匀浆物以1,200×g在4℃下离心分离5分钟，将上清液利用溶解缓冲液(10mM HEPES-KOH[pH值7.2]、0.1％Triton X-100、100mM NaCl、1mMβ-巯基乙醇)在4℃下溶解1小时。以20,400×g在4℃下离心分离15分钟后，将上清液移到新试管中，利用抗Flag抗体(Sigma)及Protein A Sepharose(GE Healthcare)使Flag-Syt I或II免疫沉淀。用溶解缓冲液清洗珠粒后，将珠粒在1×SDS样品缓冲液(62.5mM Tris-HCl[pH值6.8]、2％SDS、2％β-巯基乙醇、0.001％溴酚蓝[BPB]、10％甘油)中煮沸。以13,000×g离心分离5分钟后，将上清液用于西方印迹分析。首先，利用HRP标记抗T7抗体检测共免疫沉淀的scFv-GFPA36。为了确保Flag-Syt I沉淀，利用抗Syt I抗体(Stressgen)对印迹进行再探测。为了调查Syt I与细胞内s3Flag-scFv-A36-HA的相互作用，使用Lipofectamine2000利用pEF-BOS-Syt I及pEF-BOS-s3Flag-scFv-A36-HA或pEF-BOS-s3Flag-scFv-M4-HA载体共转染293T细胞。转染的28小时后，使细胞分散，在缓冲液(20mM HEPES-NaOH[pH值7.4]、150mM NaCl、0.5％Triton X-100、蛋白酶抑制剂(无EGTA，Roche))中溶解1小时，其后，用27G针头注射器切断。将匀浆物以1,5000rpm在4℃下离心分离10分钟，将上清液移至包含CaCl₂(500μM)的新试管中，通过抗HA琼脂糖(Sigma)进行免疫沉淀。利用包含500μM CaCl₂的溶解缓冲液清洗珠粒后，将珠粒在1×SDS样品缓冲液中煮沸3分钟。以12,000rpm进行5分钟离心分离后，将上清液用于西方印迹分析。用一级抗Syt I(Stressgen)抗体及二级HRP标记抗小鼠IgG轻链特异性抗体检测共免疫沉淀的Syt I。为了确保scFv蛋白沉淀，用抗Flag(M2)一级抗体(Sigma)及抗HRP标记抗小鼠IgG轻链特异性二级抗体对印迹进行探测。

[AAV载体的制作]

AAV9/3载体质粒包含人突触蛋白I启动子(hSynIp)，在其后在源自pAAV-DIO-eNpHR-YFP载体(addgene：#26966)的双loxP序列(loxP-lox2722)之间包含目标反向cDNA，在AAV3基因组的反向末端重复之间包含源自大鼠的tau 3'-UTR(Brun et al.,2003)的含有核苷酸2519-2760的241bp片段(FrgH)、土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)、及猿猴病毒40多腺苷酸信号序列(SV40pA)。用以前记载的方法(Petrs-Silva et al.,2011)合成具有变异的AAV9 vp cDNA(T466F)(Gao et al.,2004)。通过使用载体质粒、AAV3 rep及AAV9 vp表达质粒、以及腺病毒辅助质粒pHelper(Agilent Technologies)瞬时转染HEK293细胞，利用以前所记述的方法制作重组AAV9/3载体(Li et al.,2006)，获得载体AAV9/3-hSynIp-DIO-s3Flag-scFv-A36或-M4-HA。通过利用2种一系列连续的CsCl梯度分离重组病毒而加以纯化，利用qRT-PCR确定病毒滴度。

AAV1载体质粒包含hSynIp，在其后在AAV1基因组的反向末端序列之间包含目标cDNA、FrgH、WPRE、及SV40pA。如上所述制作重组AAV1载体，获得载体AAV1-hSynIp-scFvGFPA36或M4。

[AAV载体的定位注入]

用异氟醚(Escain；Mylan)麻醉雄性野生型小鼠或雌性DAT-cre(+/-)小鼠(8周龄)。用钻头(型号1474Stereotaxic drill，Muromachi)切开注入部位的头盖骨。使用由注射泵(Legato 130，Muromachi)控制的33G针头及5μL注射器(型号75RN SYR，Hamilton)，以速度0.2μL/min将AAV载体注入右半球的黑质(相对于前囟的毫米坐标为AP：-3.08，LR：-1.25，DV：-4.5)2μL。针头在注入后留在该位置10分钟。将注入至少33天后的小鼠用于微透析、行动测试、或免疫化学分析。

[使用原代培养多巴胺神经的多巴胺释放测定]

将AAV载体注入7天后的原代多巴胺神经用500μL经预热的PSS-LK缓冲液(20mMHEPES-NaOH，pH值7.4、140mM NaCl、4.7mM KCl、2.5mM CaCl₂、1.2mM MgSO₄、1.2mM KH₂PO₄、11mM葡萄糖)清洗2次，将细胞在200μL的PSS-LK缓冲液中在37℃下孵育5分钟。回收PSS-LK缓冲液后，对细胞在200μL的PSS-HK缓冲液(20mM HEPES-NaOH，pH值7.4、85mM NaCl、60mMKCl、2.5mM CaCl₂、1.2mM MgSO₄、1.2mM KH₂PO₄、11mM葡萄糖)中在37℃下刺激5分钟。将回收的上清液立即与包含50μM EDTA-2Na的10μL的0.1M过氯酸(PCA)混合，进行30秒超声处理，其后以20,000G在0℃下进行15分钟离心分离。将上清液(190μL)移至新的试管中，与1.7μL的5M CH₃COONa混合以将pH值调整为约3.0。回收PSS-HK缓冲液后，将细胞溶解于包含2.5μMEDTA-2Na的200μL的5mM PCA。对样品(200μL)进行超声处理，与2.4μL的5M CH₃COONa混合。将所有样品利用0.45μm聚偏二氟乙烯(PVDF)微孔过滤器(Millipore)进行过滤，对过滤物利用与电化学检测系统(ECD300，Eicom)相连的高效液相色谱(HPLC)依据以前的报告(Kabayama et al.,2013)进行分析。将从暴露于高浓度KCl的原代培养多巴胺神经释放的多巴胺的量用细胞所含的总多巴胺的比率进行表示。

[自由行动小鼠的体内微透析]

使用小动物麻醉器(MK-A110；Muromachi)利用异氟醚(Escain；Mylan)来麻醉小鼠，配置于定位框架(Stereotaxic Just for Mouse，Muromachi)。为了移植钢制导引套管(AG-4；Eicom)，在右半球的纹状体上(相对于前囟的坐标为AP：+0.6mm，LR：-2.0mm，DV：-2.0mm)开孔，再开一个孔以便牢固地固定用来固定的螺钉。用牙科水泥(Unifast3；GC)来固定导引套管及用来固定的螺钉。牙科水泥完全干燥后，将微透析探针(A-I-4-02；Eicom)沿导引套管插入纹状体。微透析探针的移植在小鼠的麻醉开始后，在3.5小时至4.5小时之间结束。将插入了微透析探针的小鼠放置在具备水与饲料的透明微透析笼(20cm长×20cm宽×21cm高)内的纸巾(Kim Towel，Nippon Paper Crecia)上。在移植手术的第二天，将小鼠放置在不具备水与饲料的透明微透析笼内的新纸巾(Comfort200，Nippon Paper Crecia)上。为了测定基础多巴胺释放，在探针移植手术的第二天的10：00至11：00之间回收透析液。使用注射泵(ESP-32，Eicom)以1μL/min的速度连续地对微透析探针灌注包含147mM NaCl、4.02mM KCl、2.25mM CaCl₂的林格溶液。使用冷藏的馏分收集器(Refrigerated collector820，Univentor)在4℃下以10分钟为间隔将透析液自动地回收到预先添加有5μL的0.1MCH₃COOH/250μM EDTA-2Na的塑料微管中。在微透析探针的移植后16.5小时至17.5小时后进行透析液的回收。将所有透析液样品在4℃下保存，第二天利用HPLC进行分析。

[脑切片的活体组织检查]

在骨头切除后立刻回收脑，制备50μm厚的冷冻冠状切片。使用直径1.5mm的一次性活检针(Biopsy Punch；Kai Medical)从12片黑质切片、及8片纹状体切片(4片前部切片由以下坐标获得，AP：+0.6mm，且4片后部切片由以下坐标获得，AP：+0.6mm)回收圆形的组织打孔器。将样品在包含0.1mM EDTA的0.1M过氯酸内匀浆，以20,000×g在4℃下进行15分钟离心分离。将上清液通入0.22μm聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器(GV Durapore，Millipore)进行过滤，对过滤后的样品利用HPLC进行分析。

[HPLC]

对源自原代培养神经的样品及脑切片的活体组织切片利用HPLC(ECD300，Eicom)依据以前报告的操作流程(Kabayama et al.,2013)进行分析。对微透析样品依据制造商的文件利用HPLC(ECD500，Eicom)进行分析。

[行动测试]

使用棒(直径3cm)的转棒试验通常用于小鼠的运动技能学习。在以前的研究中的小鼠的改良转棒试验中，证实了在组合大转筒及缓慢的旋转(直径9cm及10rpm)的转棒试验中，获得陡峭的学习曲线(Shiotsuki et al.,2010)。在本研究中，配备了在小鼠用转棒(MK-610A，Muromachi)上覆盖防滑胶带(Nitoflon胶带，No.903UL，0.13mm厚，Nitto denko)所得的大棒(直径9cm)。在训练期间之前，在第1天通过使小鼠停留在定位转筒上3分钟而进行驯化。在训练期间之前每天重复1分钟驯化。将旋转设定为缓慢的速度(5rpm，表面速度2.8m/min)。在每个期间，将小鼠在掉落后至多5次立即送回转筒上。测试1天进行1个期间，反复进行5天。手动记录掉落的等待时间，利用两因素重复测定ANOVA来分析训练的(第1天)之前、及(第5天)之后在棒上的合计等待时间。

[蛋白质序列分析]

根据包含肽标签的各细胞内抗体的氨基酸序列，使用由Chris Putnam ant theScrips Research Institute(http://protcalc.sourceforge.net/)开发的Proteincalculator v3.4来计算等电点及细胞内pH值(7.4、7.03、6.60)下的净电荷。

[统计分析]

所有数据都是至少3次独立实验的代表值。结果由平均±标准误差表示。数据使用GraphPad Prism 4.0program(GraphPad Software)，在双侧独立t-检验、双侧非重复ANOVA之后进行Newman-Keuls事后多重比较检验，或在双因素重复测定ANOVA之后进行Bonferroni事后多重比较检验来进行分析。将P＜0.05视作统计学上有意义。

＜实施例1：针对Syt I/II的C2A结构域的抗体特异性结合的分离＞

首先，使用噬菌体展示系统，将编码针对Syt I/II的C2A结构域(Syt I/II-C2A)的特异性抗体的ScFv基因分离。为了调查分离的展示ScFv的噬菌体的特异性，将Syt I/II的C2B结构域(Syt I/II-C2B)用作阴性对照。通过酶联免疫吸附分析(ELISA)，分离的ScFv展示噬菌体中之一(称为scFv-A36)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)-Syt II-C2A结合，未与GST-Syt II-C2B或GST结合(图1的A)。根据cDNA序列，明确了重链及轻链相互经甘氨酸接头融合的包含723个核苷酸的开放阅读框(361个氨基酸；登录编号AB472376)(图1的B、上栏)。为了使表达的scFv-A36可视化及纯化，将T7、EGFP、及His标签融合在A36的氨基末端、或羧基末端(称为scFv-GFPA36；图1的B、下栏)。在大肠杆菌中表达ScFv-GFPA36，通入Ni-NTA管柱进行纯化。利用西方印迹分析，确认纯化的ScFv-GFPA36蛋白仅识别全长Syt I/II，不识别COS-7细胞中外源地表达的其它9个同工型(图1的C)。根据这些结果，表示cFv-GFPA36是针对Syt I/II-C2A结构域的特异性抗体。scFv-A36的轻链的可变区的3个CDR的氨基酸序列与编码CRA5的scFv的这些氨基酸序列相同，由于CRA5是针对免疫球蛋白E(IgE)受体(登录编号BAB82458、数据未显示)的抗体，因此提示scFv-A36的轻链的CDR在决定与Syt I/II的结合特异性中不具有重要的作用。另一方面，已知重链CDR3是抗体中最高变的区域，在人中有产生约10¹⁴种多样性的可能性(Sanz，1991)，由此有助于抗体的相互作用(Chothia andLesk，1987)。发现实际上scFv-A36的重链CDR3的氨基酸序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI)DNA数据库中储存的其它4个scFv的重链CDR3的氨基酸序列(图2)之间有较大多样性，提示scFv-A36的重链CDR3对结合特异性而言是重要的。接下来，通过使用PCR诱发突变，尝试由scFv-GFPA36构建阴性对照的抗体。A36的重链CDR1(8个氨基酸)及CDR3(8个氨基酸)的计16个氨基酸利用简并引物变异。在ELISA中，确认分离的变异型ScFv噬菌体克隆(称为scFv-M4)未与GST-Syt II-C2A蛋白结合(图1的D)，确定了scFv-M4的CDR1及CDR3的核苷酸序列(图2)。根据以上，在scFv-GFPA36的进一步的功能分析中，将M4基因用作阴性对照(称为scFv-GFPM4)。接下来，调查是否能使scFv-GFPA36在哺乳类细胞的细胞内表达、且是否能与细胞内抗体结合。ScFv-GFPA36仅当scFv-GFPA36与Flag-Syt I双方在COS-7细胞内共表达时，才与抗Flag抗体一起共免疫沉淀，但scFv-M4未与抗Flag抗体一起共免疫沉淀(图1的E)，因此表示在细胞内表达的scFv-GFPA36能够与表达的Syt I结合。

＜实施例2：细胞内scFv-A36在体外及体内的表征＞

由于Syt I/II起针对脑中神经递质迅速释放的主要Ca²⁺感受器的作用，所以接下来调查scFv-A36在多巴胺释放中的阻碍效果。为了表达scFv-GFPA36及scFv-GFPM4而构建了AAV载体(分别称为AAV-scFv-GFPA36及AAV-scFv-GFPM4)。使AAV载体感染由小鼠胚胎的黑质制备的DIV7中的原代培养多巴胺神经。在经AAV感染起7天后固定细胞进行分析。scFv-GFPA36及scFv-GFPM4双方在神经的细胞内聚集或分散地表达(图3，A～C：scFv-GFPA36，D～F：scFv-GFPM4)。又通过西方印迹分析确认了ScFv表达(图3的G，上：GFP，中：Syt I，下：肌动蛋白)。接下来比较由去极化诱导的多巴胺释放。在原代培养细胞中，由去极化诱导的多巴胺释放依赖于细胞外Ca²⁺(图3的H、右列)。该Ca²⁺依赖性与以前的报告(Rouge-Pont etal.,1999)不矛盾。表达scFv-GFPA36的细胞中，由去极化诱导的多巴胺释放与表达scFv-GFPM4的细胞、或未感染的对照细胞相比有意义地减少(图3的H)。这些结果显示，细胞内抗体能够在原代培养神经的细胞内表达，scFv-GFPA36阻碍Syt I/II的C2A结构域的功能。接下来，调查这些细胞内抗体是否在小鼠脑神经的细胞内稳定地表达。对成年小鼠(P56)的黑质仅在单侧注入AAV-scFv-GFPA36(1.6×10⁸vg/小鼠)。注入的4周后，几乎在所有多巴胺神经中均观察到了scFv-GFPA36在细胞内表达。然而，在黑质致密部(SNc)的一些神经中，观察到严重的聚集(图4的A～C，箭头)。这些荧光信号在未注入AAV的左半球的SNc中未被观察到(图4的D～F)。这些结果显示，在体外的培养细胞的细胞内稳定地表达的细胞内抗体不一定会在体内始终稳定地表达。

＜实施例3：通过附加具有强负电荷的3×Flag肽标签、及具有中等负电荷的HA肽标签来提高细胞内抗体的稳定性＞

细胞质内pH值7.4下的细胞内抗体的净负电荷与哺乳类细胞的细胞质内的细胞内抗体的稳定性之间存在正相关(Kvam et al.,2010)。例如，在pH值7.4下具有高净负电荷(-5.0)的V_HH-H7细胞内抗体在哺乳类的细胞质内不怎么聚集，良好地表达(Kvam et al.,2010)。这提示如果pH值7.4下的净负电荷值小于-5.0，那么能够预测细胞内抗体在细胞内稳定表达。实施上，在pH值7.4下具有相同净负电荷(-5.0)的scFv-GFPA36及scFv-GFPM4在原代培养多巴胺神经的细胞内稳定表达了7天(图3)。然而，scFv-GFPA36及scFv-GFPM4在小鼠脑的多巴胺神经形成细胞内聚集物(图4)。根据这些情况，进行计算机分析以设计在体内稳定的细胞内抗体。报告称海马神经非兴奋时的细胞内pH值为～7.03-7.35(Ruffin etal.,2014)，根据以内体为目标的使用pH值敏感性荧光蛋白pHluorin的先前研究，可知内体的局部细胞质侧表面pH值为6.73±0.08(Mitsui et al.,2011)。因此，将细胞质内pH值6.60、7.03、及7.40各自下的scFv-A36及scFv-M4的pI及净电荷与其它肽标签进行了比较(图5的A)。通过向scFv-A36或scFv-M4融合T7标签、EGFP标签、及His标签，pH值7.4下的净负电荷增加。然而，scFv-GFPA36及scFvGFPM4净负电荷在更低的pH值7.03及pH值6.6下大幅减少。这提示在细胞质内pH值7.03及6.6下，scFv-GFPA36及sFv-GFPM4的稳定性减少。为了使细胞内抗体的净电荷在更低pH值下也提高，验证了2个短肽标签、3×Flag标签(MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK(序列编号1)；称为s3Flag)及HA标签。这些标签本身分别具有强的净负电荷(s3Flag：-7.0)及中等的净负电荷(HA：-2.2)。计算机分析的结果证实了，通过向scFv-A36/M4蛋白融合s3Flag标签及HA标签(称为s3Flag-scFv-HA)，其净负电荷在pH值6.6下也大幅增加(图5的A)。接下来，通过使用scFv-A36蛋白序列进行NCBI blast搜索而获得其它94种scFv蛋白序列(表S2)，使用它们对附加s3Flag及HA肽标签所产生的低pH值环境下细胞内抗体的净负电荷的增加效果的普遍性进行调查(图6)。对与不同的肽标签融合的94种scFv蛋白在pH值7.4(图6的A，上栏)、及pH值6.6(图6的A，下栏)下的净电荷进行了比较。与T7标签、EGFP标签、及His标签融合的scFv蛋白的净负电荷的平均与不具有肽标签的scFv蛋白相比，在pH值7.4下统计学上地增加(上栏)，但在pH值6.6下未增加(下栏)。相反地，在pH值7.4与pH值6.6双方下，与s3Flag及HA标签融合的scFv蛋白的净负电荷的平均与附加了其它肽标签或未附加肽标签的scFv蛋白的净负电荷的平均相比，统计学上地增加。蛋白质在比其pI低的pH值下具有正净电荷，在比其pI高的pH值下具有负净电荷。与s3Flag标签及HA标签融合的scFv蛋白的推定pI的平均有意义地低于融合了T7标签、EGFP标签、及His标签的scFv蛋白、或未附加标签的scFv蛋白的推定pI的平均(图5的A、图6的B)。这些情况提示，附加s3Flag标签及HA标签所产生的使pH值6.6下的scFv蛋白的净负电荷增加的效果是由减少scFv蛋白的pI带来的。另外，调查了scFv蛋白与scFv-A36的氨基酸一致性和融合了s3Flag标签及HA标签的scFv蛋白在pH值7.4下的净电荷之间的相关(图6的C)，明确了它们之间没有统计学上的相关。这表示scFv蛋白相对于scFv-A36的结构上的一致性本身不影响与s3Flag标签及HA标签融合所产生的增加其它scFv蛋白的净负电荷的效果。根据以上，这些结果显示，通过对scFv蛋白融合s3Flag肽标签或HA肽标签，从而因这些标签的强负电荷、及因scFv蛋白的pI降低，细胞质内pH值6.6～7.4下的scFv蛋白的净负电荷普遍增加。

接下来，调查与这些肽标签融合的scFv-A36及scFv-M4细胞内抗体在哺乳类细胞内的稳定性。通过免疫细胞化学分析明确，在HeLa细胞的细胞内，s3Flag-scFv-A36-HA及s3Flag-scFv-M4-HA几乎未聚集而是分散地表达(图5的B，下栏)，另一方面，细胞内scFv-GFPA36及scFv-GFPM4在HeLa细胞的细胞内形成聚集体(图5的B，上栏)。表达s3Flag-scFv-A36-HA或s3Flag-scFv-M4-HA的具有聚集体的细胞的平均与表达scFv-GFPA36或scFv-GFPM4的具有聚集体的细胞的平均相比有意义地减少(图5的C)。这些结果显示，s3Flag标签及HA标签在培养细胞的细胞内改善细胞内抗体的稳定性。

＜实施例4：s3Flag-scFv-A36-HA与Syt I-C2A结构域相互作用，抑制Syt I与突触融合蛋白1-SNARE结构域之间的Ca²⁺依赖性相互作用＞

接下来，调查s3Flag-scFvA-36-HA构建物的生物化学性质。测量纯化的s3Flag-scFv-A36-HA的与GST-Syt I-C2A的结合亲和性。使用抗Flag抗体结合亲和珠从大肠杆菌纯化s3Flag-scFv-A36-HA。通过ELISA实验明确，纯化的s3Flag-scFv-A36-HA与Syt I-C2A相互作用，但不与Syt I-C2B相互作用(图7的A)。该s3Flag-scFv-A36-HA的特异性不与图1所示的scFv-GFPA36的结果矛盾。通过使用不同浓度的s3Flag-scFv-A36-HA的ELISA实验，明确了s3Flag-scFv-A36-HA相对于SytI-C2A的Kd值为约11.97nM(图7的B)。此外，通过西方印迹分析，明确了s3Flag-scFv-A36-HA特异性地识别小鼠脑的Syt I/II(图7的C)。这些结果显示，s3Flag-scFv-A36-HA是具有高亲和性的高度特异性的细胞内抗体。接下来，使用293T细胞调查细胞内s3Flag-scFv-A36-HA是否能在细胞内与Syt I结合。Syt I与s3Flag-scFv-A36-HA共免疫沉淀，但未与s3Flag-scFv-M4-HA共免疫沉淀(图7的D)。这表示在哺乳类细胞的细胞内，细胞内s3Flag-scFv-A36-HA能与Syt I结合。根据这些情况，想到s3Flag-scFv-A36-HA阻碍其相互作用的可能性。为了对此进行调查，使用图7的D所示的细胞溶解物进行GST下拉分析。使用纯化的GST-突触融合蛋白1-SNARE在500μM Ca²⁺的存在下进行沉淀，对沉淀物利用西方印迹进行分析。表达s3Flag-scFv-A36-HA的细胞内的Syt I及GST-突触融合蛋白1-SNARE的共沉淀与表达s3Flag-scFv-M4-HA的细胞相比，减少了约46.5％(图7的E、F)。这表示细胞内s3Flag-scFv-A36-HA通过与Syt I的C2A结构域的相互作用，对细胞内的Syt I与突触融合蛋白I之间的相互作用产生干扰。

＜实施例5：s3Flag-scFv-HA在体内的稳定的细胞内表达＞

接下来，调查s3Flag-scFv-HA是否在小鼠脑神经的细胞内稳定地表达。将AAV9/3-hSynIp-DIO-s3Flag-scFv-A36(或M4)-HA注入DAT-cre小鼠的右半球的黑质。通过免疫组织化学分析明确，在AAV9/3载体注入起33天后，右半球的SNc及VTA的多巴胺神经的细胞内，s3Flag-scFv-A36-HA及s3Flag-scFv-M4-HA稳定地表达(图8的A～L，箭头)。在黑质区的几乎所有广范围(～768μm)内观察到它们的表达模式(图9的A～J)。另外，使用西方印迹分析确认了s3Flag-scFv-A36-HA及s3Flag-scFv-M4-HA双方在SN中的表达(图9的K，上栏)。在纹状体神经元从中脑多巴胺神经接收长向心输入的纹状体中，s3Flag-scFv-A36-HA的表达水平高于s3Flag-scFv-M4-HA的表达水平(图9的K，上栏)。这提示了s3Flag-scFv-A36-HA与内源性Syt I结合，在纹状体中与Syt I一起被从细胞体向轴突末端运送。此外，在AAV9/3注入的6个月后，观察到s3Flag-scFv-A36-HA及s3Flag-scFv-M4-HA双方均不损伤多巴胺神经地稳定表达(图10)。在SN的多巴胺神经中，为了确认在体内s3Flag-scFv-A36-HA对Syt I具有功能活性，利用微透析测定AAV9/3注入起33天后清醒时的小鼠的纹状体中的基础多巴胺释放。在表达s3Flag-scFv-A36-HA的小鼠、表达s3Flag-scFv-M4-HA的小鼠、及未注入AAV的小鼠这3组间比较纹状体中的多巴胺释放。可知从表达s3Flag-scFv-A36-HA的小鼠的纹状体释放的多巴胺与表达s3Flag-scFv-M4-HA的小鼠相比为55.3％、且与未注入AAV9/3的小鼠相比为52.7％，有意义地减少(图11的B、C)。然而，纹状体及黑质中的多巴胺的总量在所有3个组间没有统计学上变化(图11的D)。根据以上，这些结果显示，s3Flag-scFv-A36-HA阻碍依赖于神经活性与来自多巴胺神经的轴突末端的细胞外Ca²⁺的多巴胺释放。

＜实施例6：s3Flag-scFv-A36-HA在多巴胺神经中的细胞内表达所导致的运动学习的阻碍＞

帕金森氏病(PD)是神经退化性疾病，伴随包含震颤、僵硬、动作迟缓、及姿势不稳定在内的运动障碍。患者最特征性的方面主要是SNc中的多巴胺神经丧失及纹状体中的多巴胺浓度减少。因此，为了研究纹状体的多巴胺释放在运动行动中的直接作用，进行了旷场测试及改良转棒试验。将AAV9/3-hSynIp-DIO-s3Flag-scFv-A36(或M4)-HA注入DAT-cre小鼠的黑质的两侧。AAV注入4周后，将小鼠用于旷场测试，5或6天后，用于改良转棒试验。在表达s3Flag-scFv-A36-HA的小鼠与表达s3Flag-scFv-M4-HA的小鼠之间，总移动距离、动作速度、中央时间(center of time)、及站立的总数没有不同(图12的A～D)。接下来，改良以前报告的转棒试验(Shiotsuki et al.,2010)，调查运动学习(参照实验程序一栏)。训练的5天后，表达s3Flag-scFv-M4-HA的小鼠与表达s3Flag-scFv-A36-HA的小鼠相比，能够更长地停留在棒上(图12的E，P＝0.0132)。运动行动测试后，通过免疫组织化学来分析小鼠脑。确认了黑质的DA神经中3Flag-scFv-M4-HA及s3Flag-scFv-A36-HA蛋白在两侧表达(图12的F，箭头)。

＜实施例7：抗肿瘤活性的评估＞

接下来，对于抗Kras单克隆抗体(Y13-259；序列编号22)，与前述实施例同样地制作融合了s3Flag及HA所得的s3Flag-scFv-Y13-259-HA(STAND-Y13-259；序列编号23)，评估有无抗肿瘤活性。此外，Y13-259的DNA序列由于没有登录在数据库中，所以基于氨基酸序列设计了针对小鼠的密码子进行了最优化的序列。将STAND-Y13-259的DNA序列示于序列编号24。将myc-Y13-259的DNA序列示于序列编号25。DNA合成委托给Genescript公司。

(1)计算机分析

在设计STAND-Y13-259时进行了计算机分析，结果证实，通过融合s3Flag标签及HA标签，scFv-Y13-259的净负电荷在pH值6.6下也大幅地增加(图13的A)。

(2)STAND-Y13-259的结合能力的评估

接下来，如前述实施例所述通过ELISA测量了STAND-Y13-259与GST-Kras的结合亲和性。其结果，确认STAND-Y13-259也维持了与Kras的高结合活性(图13的B)。接着，使慢病毒中引入了STAND-Y13-259、myc-Y13-259(序列编号26)或仅scFv-Y13-259所得的载体感染MIA PaCa2细胞，进行免疫细胞染色。其结果，确认以往的myc-Y13-259不稳定而未表达，或即使表达也会在细胞内聚集，与此相对，STAND-Y13-259稳定地表达(图13的C)。进而，为了确认细胞内源性的Kras细胞内相互作用，使用抗HA抗体进行了共免疫沉淀，结果在源自感染了STAND-Y13-259的MIA PaCa2细胞的试样中，确认到内源性Kras与STAND-Y13-259结合(图13的D)。

(3)抗肿瘤活性的评估

接下来，对与前述同样地使用慢病毒载体感染的MIAPaCa2细胞的存活率在感染起4天后通过MTS分析进行了测定。其结果显示，通过STAND-Y13-259的表达，存活率明显降低(图13的E)。接着，在皮下移植了胰腺癌细胞的小鼠异种移植模型中，评估是否由STAND-Y13-259的细胞内表达抑制癌的生长。对在裸小鼠的皮下形成的肿瘤部分一周一次、在4周内施用前述表达STAND-Y13-259的慢病毒载体，结果显示强烈阻碍癌(图13的F、G)。在从最初感染起25天后摘除的肿瘤中也确认到了STAND-Y13-259表达(图13的H)。

＜实施例8：其它肽标签的评估＞

为了进行其它肽标签的性能评估，制作DE2.0标签及DE5.0标签并研究了其稳定化的效果。与实施例7同样地，作为使用DE2.0标签(DEQENDYDEPEVNDENQDYDE(序列编号13))的融合蛋白，制作了在源自抗Kras单克隆抗体的肽(Y13-259；序列编号22)的N末端侧融合了DE2.0标签所得的DE2.0-Y13-259(序列编号27)；在DE2.0-Y13-259的C末端侧进一步融合了HA肽所得的DE2.0-Y13-259-HA(序列编号28)；在DE2.0-Y13-259的C末端侧进一步融合了PA肽所得的DE2.0-Y13-259-PA(序列编号29)；以及在与聚集纤维化的人α-突触核蛋白特异性地结合的抗体(Barkhordarian et al.,2006:Protein Engineering,Design andSelection,Volume 19,Issue 11,1November 2006,Pages 497-502)的scFV序列(scFv-6E)的N、C两末端融合了DE2.0标签所得的蛋白质STAND-6E-LYS。对STAND-6E-LYS进一步将作为功能肽的热激关联蛋白70(Heat shock cognate protein 70，HSC70)结合肽(MARVKKDQAEPLHRKFERQPPG(序列编号31))(Bauer et al.,Nature Biotech(2010):NatureBiotechnology volume 28,pages 256-263(2010))融合在C末端侧的DE2.0标签的下游，进一步在HSC70结合肽的下游还附加HA肽。将制成的STAND-6E-LYS的氨基酸序列的全长示于序列编号32。

作为使用DE5.0标签(DDDEDEDDEDEDEDEDEDEDED(序列编号33))的融合蛋白，制作了在scFv-6E的N末端融合DE5.0标签并进一步在C末端融合T7标签(序列编号34：MASMTGGQQMG)所得的DE5.0-6E(氨基酸序列：序列编号35、碱基序列：序列编号36)。编码这些融合蛋白的DNA均针对人的密码子进行了最优化，由GenScript公司合成。

此外，将DE2.0-Y13-259-HA及STAND-6E-LYS的DNA序列分别示于序列编号30及序列编号37。

[表4]

[表5]

进行计算机分析，结果判明，即便仅融合DE2.0标签，scFv-Y13-259的净负电荷也大幅地增加(图13的A)。另外，判明如果也融合HA或PA，那么会进一步增加(图13的A)。对scFv-6E也同样地进行了计算机分析，结果证实，通过与DE2.0标签、DE2.0标签及HA标签融合、或与DE5.0标签融合，scFv-6E的净负电荷在pH值6.6下也大幅地增加(图15)。

使用慢病毒载体将编码DE2.0-Y13-259-HA的DNA导入MIAPaCa2细胞，结果确认，在细胞内，DE2.0-Y13-259-HA未聚集地表达，比STAND-Y13-259强地与内源性Kras在细胞内结合(图14的A)。使用在皮下移植了胰腺癌细胞的小鼠异种移植模型，对该表达DE2.0-Y13-259-HA的慢病毒载体的癌的生长抑制效果进行了评估，结果显示强力阻碍癌(图14的B)。这些结果表示本发明对开发使抗体在细胞内稳定地表达的肽标签极为有效。

将编码STAND-6E-LYS及DE5.0-6E的DNA克隆到哺乳类表达载体pEF-BOS载体而制作表达载体(STAND-6E-LYS表达载体：pEF-BOS-STAND-6E-LYS、DE5.0-6E表达载体：pEF-BOS-DE5.0-6E)。将STAND-6E-LYS表达载体及DE5.0-6E表达载体利用Lipofectamin2000导入HeLa细胞，培养18小时后用4％PFA固定。对STAND-6E-LYS利用HA抗体进行了染色，对DE5.0-6E利用T7抗体进行了染色。确认STAND-6E-LYS、DE5.0-6E均在细胞内不聚集地表达(图16)。

接下来，针对STAND-6E-LYS对α-突触核蛋白聚集的效果使用SHSY5Y细胞进行了验证。α-突触核蛋白的聚集分析是使用对从大肠杆菌纯化的人重组α-突触核蛋白通过超声波处理而纤维化、聚集化所得的α-突触核蛋白原纤维(Tarutani et al.,2018:ActaNeuropathol Commun.2018Apr 18；6(1):29.)。在本分析中，使用源自人的SHSY5Y细胞。引入STAND-6E-LYS的HSC70结合肽包含α-突触核蛋白的HSC70结合基序(VKKDQ(序列编号38))与HSC70结合共有基序(KFERQ(序列编号39))。在体外及体内显示，通过融合与突变亨廷顿蛋白(mutant huntingtin protein)结合的肽及HSC70结合肽，能够促进由分子伴侣介导的自噬(CMA，Chaperon-mediated autophagy)分解突变亨廷顿蛋白，如果有能够与靶蛋白分子特异性地结合的肽(也包括scFv)，那么能够依赖于CMA分解靶蛋白分子。构建表达将人α-突触核蛋白的全长与绿色荧光蛋白EGFP融合所得的蛋白质(EGFP-突触核蛋白)的pEGFP-α-突触核蛋白载体，与STAND-6E-LYS表达载体一起使用XtremGENE9(Sigma)向SHSY5Y细胞进行基因导入。6小时后使用MultiFectam(Promega)向细胞导入原纤维蛋白，培养3天后，用4％PFA固定。其后，利用抗HA抗体检测STAND-6E-LYS，利用抗磷酸化α-突触核蛋白抗体(小鼠、WAKO)进行染色。依据制造商的标准操作流程利用XtremeGENE9及MultiFectam进行基因导入、蛋白质导入。通过测定GFP-突触核蛋白点状地聚集的细胞数的出现率、磷酸化突触核蛋白阳性细胞的出现率，将由原纤维导致的聚集定量化。

在导入了对照载体的细胞中，由原纤维导致约14％的细胞的EGFP-突触核蛋白点状地局部变化。可知这些点状的突触核蛋白被检测帕金森患者脑的标记物α-突触核蛋白的氨基酸129位的磷酸化的抗PSer129-突触核蛋白抗体共染色(图17)。这显示从细胞外侵入的聚集突触核蛋白使在细胞内表达的曾为正常结构的EGFP-突触核蛋白聚集化。另一方面，表达STAND-6E-LYS的细胞中，聚集化被抑制在2％(图18)。

以上结果显示，本发明对使抗原结合性肽在细胞内不聚集地保持功能进行表达极为有效。

[表6]

表S1

[表7]

表S2、与scFv-36比对的scFv蛋白：登陆编号：氨基酸残基数

[工业上的可利用性]

本发明例如能够用于各种研究用途、以及诊断及治疗等医学用途。

序列表

<110> 国立研究开发法人理化学研究所

<120> 融合蛋白

<130> RK18120PCT

<150> JP2017-124596

<151> 2017-06-26

<160> 39

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 3×Flag标签

<400> 1

Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp

1 5 10 15

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

20

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 2

Glu Glu Asp Gln Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gln Asp Asp

1 5 10

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 3

Asn Asp Glu Tyr Glu Asp Pro Asp Glu Gln Asp Asp Glu Asn Asp

1 5 10 15

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 4

Gln Asp Glu Val Asp Glu Pro Glu Asp Glu Glu Asp Asn Asp Asp

1 5 10 15

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 5

Gln Asp Glu Val Asp Glu Pro Glu Asp Glu Asp Glu Asn Asp Asp

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 6

Gln Asp Glu Val Asp Glu Pro Glu Asp Glu Asp Glu Asn Gln Asp

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 7

Gln Asp Asn Val Asp Glu Pro Glu Asp Asn Asp Glu Asn Gln Asp

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 8

Gln Asp Asn Tyr Asp Glu Pro Glu Asp Asn Asp Glu Asn Gln Asp

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 9

Glu Asp Asn Tyr Asp Glu Pro Glu Asp Asn Asp Glu Asn Gln Asp

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 10

Asp Asn Asn Tyr Asp Glu Gln Asp Glu Asn Glu Gln Pro Glu Asp

1 5 10 15

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 11

Gln Glu Asn Asp Tyr Asp Glu Pro Glu Val Asn Asp Glu Asn Gln Asp

1 5 10 15

<210> 12

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 12

Asp Glu Gln Glu Asn Asp Tyr Asp Glu Pro Glu Val Asn Asp Glu Asn

1 5 10 15

Gln Asp

<210> 13

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细胞内稳定化肽

<400> 13

Asp Glu Gln Glu Asn Asp Tyr Asp Glu Pro Glu Val Asn Asp Glu Asn

1 5 10 15

Gln Asp Tyr Asp Glu

20

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HA标签

<400> 14

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA标签

<400> 15

Gly Val Ala Met Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val

1 5 10

<210> 16

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头引物

<400> 16

gccgccacca tggctagcat gactggtgga cagcaaatgg gtggatccta tgcggcccag 60

ccggccaggg cc 72

<210> 17

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头引物

<400> 17

cggcggccgc tcaatgatga tgatgatgat gcaattgccg ttttatttcc aactttgtcc 60

c 61

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头引物

<400> 18

gcggatccat ggtgagcaag ggcgaggag 29

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头引物

<400> 19

cgagatcttc agaagaactc gtcaagaagg cg 32

<210> 20

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(41)

<223> n为a、c、g、或t

<400> 20

gcaaagcttc tggcttcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ntgggtgaag cagaggcctg 60

cacagg 66

<210> 21

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(54)

<223> n为a、c、g、或t

<400> 21

ggagacggtg accgtggtcc cttggcccca nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnagcaca 60

gtaatagacg gcagtgtcct cag 83

<210> 22

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Y13-259

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Leu Tyr Tyr Ala Glu Thr Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Glu Gly Thr Gly Thr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His

130 135 140

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala

145 150 155 160

Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

165 170 175

Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly

180 185 190

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu

195 200 205

Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln Ala Tyr Lys Tyr Pro Ser Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys

<210> 23

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> STAND-Y13-259

<400> 23

Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp

1 5 10 15

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val

35 40 45

Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln

50 55 60

Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser

65 70 75 80

Ser Tyr Leu Tyr Tyr Ala Glu Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg

100 105 110

Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Thr Gly

115 120 125

Thr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

165 170 175

Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr

180 185 190

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

195 200 205

Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro

225 230 235 240

Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Lys Tyr Pro Ser

245 250 255

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Tyr Pro Tyr Asp Val

260 265 270

Pro Asp Tyr Ala

275

<210> 24

<211> 831

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STAND-Y13-259

<400> 24

atggattaca aggaccacga cggcgattac aaagaccacg acattgacta caaggacgac 60

gacgacaaag gttcccaggt gcagctgcag cagtctggag gaggactcgt gcagcctggc 120

cgatccctga agctctcttg cgtggtcagt ggcttcactt tttccaacta cggaatgaat 180

tggatcagac agacccctgg taaaggcctg gaatgggtgg cttacattag ctccgggtct 240

agttatctgt actatgcaga gacagtcaag ggcaggttca ctatcagcag agacaacgca 300

aaaaataccc tgtacctcca gatgacatca ctgcggagcg aagataccgc cctctactat 360

tgcgctcgcc acgagggaac tgggaccgac ttctttgatt attggggtca gggcaccaca 420

gtgacagtct caagcggtgg aggagggagt ggtggaggag ggtcaggtgg cggagggagc 480

gacattcagc tgacacagtc cccccatagt ctgtcagcca gcctcggaga gaccgtgagc 540

atcgaatgtc tggcatcaga ggggattagc aactacctcg cctggtatca gcagaagccc 600

ggcaaaagtc ctcagctgct catctactat gcttcctctc tgcaggacgg agtgccttcc 660

aggttctccg gatctgggag tggtacccag ttttccctga agatttctaa tatgcagcca 720

gaggatgaag gcgtctacta ttgtcagcag gcttacaaat atcccagcac cttcggggct 780

gggacaaaac tggaaatcaa atacccttac gatgtgcctg actacgcatg a 831

<210> 25

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> myc-Y13-259

<400> 25

atggcatcaa tgcagaagct gatctcagag gaggacctgc aggtccaact gcagcagtct 60

ggaggaggct tagtgcagcc tggaaggtcc ctgaaactct cctgtgtagt ctctggattc 120

actttcagta actatggaat gaactggatt cgccagactc cagggaaggg actggagtgg 180

gttgcataca ttagtagtgg tagcagttac ctctactatg cagaaacggt gaagggccga 240

ttcaccatct ccagagacaa tgccaagaac accctgtacc tgcaaatgac cagtctgagg 300

tctgaagaca ctgccttgta ttactgtgca agacatgagg gtacgggtac cgacttcttt 360

gattactggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctcag gcggaggagg ctccggcggg 420

ggcggatctg ggggcggcgg atccgacatc cagctgaccc agtctccaca ttccctgtct 480

gcatctctgg gagaaactgt ctccatcgaa tgtctagcaa gtgagggcat ttccaattat 540

ttagcgtggt atcagcagaa gccagggaaa tctcctcagc tcctgatcta ttatgcaagt 600

agcttgcaag atggggtccc atcacggttc agtggcagtg gatctggcac acagttttct 660

ctcaagatca gcaacatgca acctgaagat gaaggggttt attactgtca acaggcttac 720

aagtatcctt ccacgtttgg agctgggacc aagctggaga tcaaatga 768

<210> 26

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> myc-Y13-259

<400> 26

Met Ala Ser Met Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gln Val Gln

1 5 10 15

Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys

20 25 30

Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Asn

35 40 45

Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile

50 55 60

Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Leu Tyr Tyr Ala Glu Thr Val Lys Gly Arg

65 70 75 80

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met

85 90 95

Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His

100 105 110

Glu Gly Thr Gly Thr Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

115 120 125

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser

145 150 155 160

Ala Ser Leu Gly Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly

165 170 175

Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro

180 185 190

Gln Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser

195 200 205

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser

210 215 220

Asn Met Gln Pro Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr

225 230 235 240

Lys Tyr Pro Ser Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

245 250 255

<210> 27

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DE2.0-Y13-259

<400> 27

Met Asp Glu Gln Glu Asn Asp Tyr Asp Glu Pro Glu Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Asn Gln Asp Tyr Asp Glu Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val

35 40 45

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Thr

50 55 60

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Tyr Tyr Ala Glu Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

85 90 95

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Thr Gly Thr

115 120 125

Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu

165 170 175

Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr Leu

180 185 190

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro Glu

225 230 235 240

Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Lys Tyr Pro Ser Thr

245 250 255

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

260 265

<210> 28

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DE2.0-Y13-259-HA

<400> 28

Met Asp Glu Gln Glu Asn Asp Tyr Asp Glu Pro Glu Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Asn Gln Asp Tyr Asp Glu Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val

35 40 45

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Thr

50 55 60

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Tyr Tyr Ala Glu Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

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Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Thr Gly Thr

115 120 125

Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu

165 170 175

Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr Leu

180 185 190

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro Glu

225 230 235 240

Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Lys Tyr Pro Ser Thr

245 250 255

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro

260 265 270

Asp Tyr Ala

275

<210> 29

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DE2.0-Y13-259-PA

<400> 29

Met Asp Glu Gln Glu Asn Asp Tyr Asp Glu Pro Glu Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Asn Gln Asp Tyr Asp Glu Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val

35 40 45

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Thr

50 55 60

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Leu Tyr Tyr Ala Glu Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

85 90 95

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg His Glu Gly Thr Gly Thr

115 120 125

Asp Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu

165 170 175

Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr Leu

180 185 190

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro Glu

225 230 235 240

Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Tyr Lys Tyr Pro Ser Thr

245 250 255

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gly Gly Val Ala Met

260 265 270

Pro Gly Ala Glu Asp Asp Val Val

275 280

<210> 30

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DE2.0-Y13-259-HA

<400> 30

atggatgaac aggagaacga ttatgatgag ccagaagtga acgacgagaa ccaggattat 60

gatgagggat cccaggtcca gctgcagcag tcaggaggag gcctggtgca gcctggccgg 120

tccctgaagc tgtcttgcgt ggtgagcggc ttcaccttta gcaactacgg catgaattgg 180

atcaggcaga caccaggcaa gggcctggag tgggtggcct acatcagctc cggctctagc 240

tatctgtact atgccgagac agtgaagggc cggttcacaa tctccagaga caacgccaag 300

aataccctgt acctgcagat gacatctctg aggagcgagg ataccgccct gtactattgc 360

gcaaggcacg agggaaccgg aacagacttc tttgattatt ggggccaggg caccacagtg 420

acagtgtcct ctggcggcgg cggctctgga ggaggaggaa gcggaggagg aggctccgac 480

atccagctga cccagtctcc acactctctg agcgcctccc tgggagagac agtgagcatc 540

gagtgtctgg cctccgaggg catctctaac tacctggcct ggtatcagca gaagcccggc 600

aagtcccctc agctgctgat ctactatgcc agctccctgc aggacggcgt gccttctcgg 660

ttctctggaa gcggctccgg aacccagttt agcctgaaga tctccaatat gcagccagag 720

gatgagggcg tgtactattg tcagcaggcc tacaagtatc ccagcacctt cggggctgga 780

actaaactgg aaatcaaata cccttacgat gtgcctgact acgcttga 828

<210> 31

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC70结合肽

<400> 31

Met Ala Arg Val Lys Lys Asp Gln Ala Glu Pro Leu His Arg Lys Phe

1 5 10 15

Glu Arg Gln Pro Pro Gly

20

<210> 32

<211> 320

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> STAND-6E-LYS

<400> 32

Met Asp Glu Gln Glu Asn Asp Tyr Asp Glu Pro Glu Val Asn Asp Glu

1 5 10 15

Asn Gln Asp Tyr Asp Glu Gly Ser Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala

35 40 45

Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln

50 55 60

Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ala Ser Gly Gly

65 70 75 80

Asp Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg

100 105 110

Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Ala Ser Ala Phe

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile Gln

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala

195 200 205

Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Asp Pro Tyr Thr Phe Gly

245 250 255

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Arg Ser Met Asp Glu Gln Glu

260 265 270

Asn Asp Tyr Asp Glu Pro Glu Val Asn Asp Glu Asn Gln Asp Tyr Asp

275 280 285

Glu Met Ala Arg Val Lys Lys Asp Gln Ala Glu Pro Leu His Arg Lys

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305 310 315 320

<210> 33

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DE5.0标签

<400> 33

Asp Asp Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp

1 5 10 15

Glu Asp Glu Asp Glu Asp

20

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T7标签

<400> 34

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly

1 5 10

<210> 35

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DE5.0-6E

<400> 35

Met Asp Asp Asp Glu Asp Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Glu

1 5 10 15

Asp Glu Asp Glu Asp Glu Asp Gly Ser Ala Glu Val Gln Leu Leu Glu

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

35 40 45

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg

50 55 60

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Tyr Ile Ala Ser Gly

65 70 75 80

Gly Asp Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

85 90 95

Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

100 105 110

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Ala Ser Ala

115 120 125

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Asp Ile

145 150 155 160

Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala

195 200 205

Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp

225 230 235 240

Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Asp Pro Tyr Thr Phe

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Arg Ser Met Ala Ser Met

260 265 270

Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly

275

<210> 36

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DE5.0-6E

<400> 36

atggatgacg acgaggacga agacgacgaa gatgaggatg aagatgaaga cgaggatgag 60

gacgaggacg gatctgccga agtccagctt ctcgagtctg gcggcgggtt ggtgcagcct 120

ggaggatccc tgagattatc ctgtgcagct agcgggttca ctttctcgtc ctatgccatg 180

tcatgggttc gccaagctcc cggcaaaggg ttggagtggg tgagctacat tgccagtgga 240

ggcgatacta ccaattacgc ggacagtgtg aagggtaggt ttaccattag ccgggataac 300

agcaagaaca ctctctacct gcagatgaac tctctgagag cggaggatac agccgtgtac 360

tattgcgcaa aaggcgcatc cgctttcgac tattggggtc aaggcactct cgtaaccgtg 420

tctagtggcg gaggtggttc agggggcggc ggatcaggag ggggaggcag tacagatatc 480

cagatgacac agagtccctc ctctctgtcc gcttctgtcg gcgatcgagt cacgattacg 540

tgtcgtgcta gtcagtctat cagctcatac ctcaattggt accagcagaa gcctggaaaa 600

gcccccaaac tgctgatcta tgccgcctcc tacctacaga gcggtgttcc aagccgcttt 660

tcaggcagcg ggtctgggac agatttcact ctgaccatat cctcgcttca gccagaggac 720

tttgcaacct actattgcca gcagtcctca aatgacccgt atacctttgg acaagggacc 780

aaggtggaaa tcaagcggag gagcatggcc agcatgacag gtgggcaaca aatgggctga 840

<210> 37

<211> 969

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> STAND-6E-LYS

<400> 37

gccaccatgg atgaacagga gaacgattat gatgagccag aagtgaacga cgagaaccag 60

gattatgatg agggatccgc cgaggtgcag ctgttggagt ctgggggagg cttggtacag 120

cctggggggt ccctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcacctttag cagctatgcc 180

atgagctggg tccgccaggc tccagggaag gggctggagt gggtctcata tattgctagt 240

ggtggtgata ctacaaatta cgcagactcc gtgaagggcc ggttcaccat ctccagagac 300

aattccaaga acacgctgta tctgcaaatg aacagcctga gagccgagga cacggccgta 360

tattactgtg cgaaaggtgc ttctgctttt gactactggg gccagggaac cctggtcacc 420

gtctcgagcg gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggcagcg gcggtggcgg gtcgacggac 480

atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggagacag agtcaccatc 540

acttgccggg caagtcagag cattagcagc tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg 600

aaagccccta agctcctgat ctatgctgca tcctatttgc aaagtggggt cccatcaagg 660

ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa 720

gattttgcaa cttactactg tcaacagagt tctaatgatc cttatacgtt cggccaaggg 780

accaaggtgg aaatcaaacg gagatctatg gatgaacagg agaacgatta tgatgagcca 840

gaagtgaacg acgagaacca ggattatgat gagatggcca gagtgaagaa ggaccaggct 900

gagcctctcc atagaaagtt tgagagacag ccaccagggt acccttacga tgtgcctgac 960

tacgcttga 969

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC70结合基序

<400> 38

Val Lys Lys Asp Gln

1 5

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HSC70结合共有基序

<400> 39

Lys Phe Glu Arg Gln

1 5

Claims (12)

1.一种融合蛋白，其包含细胞内稳定化肽及抗原结合性肽，

所述细胞内稳定化肽包含10～39个氨基酸，且该氨基酸的至少45％为酸性氨基酸，且

所述抗原结合性肽包含重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2、及轻链CDR3中的至少一个。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，

所述细胞内稳定化肽中所述氨基酸的28％以下为碱性氨基酸、或不含碱性氨基酸。

3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，

所述细胞内稳定化肽不含所述碱性氨基酸。

4.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中，

所述细胞内稳定化肽包含至少一个组氨酸作为所述碱性氨基酸。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中，

所述细胞内稳定化肽包含14～25个氨基酸，该氨基酸的至少50％为酸性氨基酸，且

在所述细胞内稳定化肽中，不存在8个以上所述酸性氨基酸相连的部分、及4个以上酸性氨基酸以外的氨基酸相连的部分。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，其中，

在所述细胞内稳定化肽中，不存在3个以上所述酸性氨基酸相连的部分、及3个以上酸性氨基酸以外的氨基酸相连的部分。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中，

所述细胞内稳定化肽在将所述酸性氨基酸设为X_A、将酸性氨基酸以外的氨基酸设为X_n时，

包含以下的氨基酸序列(1)或(2)：

-X_n-X_A-X_A-X_n-X_A-(X_A或X_n)-X_n-X_A-(X_A或X_n)-X_n-(X_A或X_n)-X_A-······(1)、

-X_n-X_A-X_n-X_A-X_n-X_A-X_A-X_n-X_A-X_n-X_n-X_A-X_A-X_n-X_n-X_A-······(2)。

8.根据权利要求7所述的融合蛋白，其中，

X_A为天冬氨酸或谷氨酸，X_n为从由天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸、酪氨酸及缬氨酸所组成的群中选择的任意氨基酸。

9.一种多核苷酸，其编码权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白。

10.一种表达载体，其包含权利要求9所述的多核苷酸。

11.一种制造在细胞内表达抗原结合性肽的细胞的方法，其包括

将权利要求9所述的多核苷酸或权利要求10所述的表达载体导入细胞的步骤。

12.一种细胞，其表达权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白。

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