ES2641896T3

ES2641896T3 - Polipéptido de unión a la región Fc de la inmunoglobulina G

Info

Publication number: ES2641896T3
Application number: ES15181524.8T
Authority: ES
Inventors: Lars Abrahmsen
Original assignee: GE Healthcare Bioprocess R&D AB
Current assignee: Cytiva Bioprocess R&D AB
Priority date: 2010-03-08
Filing date: 2011-03-07
Publication date: 2017-11-14
Anticipated expiration: 2031-03-07
Also published as: DK2977088T3; EP2977088A1; EP2544785A1; EP2977088B1; CN102811782A; EP2544785B1; JP2013528567A; CN107686513A; CA2789738C; DK2544785T3; JP5951509B2; CA2789738A1; US20130203962A1; US9175067B2; WO2011110515A1

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptido de unión a la región Fc de la inmunoglobulina G

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un polipéptido de unión a la región Fc de la inmunoglobulina G (IgG Fc) y a métodos para su producción. El polipéptido tiene aplicación industrial, por ejemplo, en la separación y/o purificación para la pro-5 ducción de anticuerpos y/o proteínas de fusión con Fc, por ejemplo en cromatografía.

Antecedentes

En la producción industrial de anticuerpos monoclonales y proteínas de fusión con Fc, la purificación se realiza fre-cuentemente usando cromatografía. La proteína A de Staphylococcus aureus se ha utilizado durante mucho tiempo como ligando de afinidad en dichas aplicaciones, debido a la afinidad natural de la proteína A por la porción Fc de 10 IgG. La proteína A en su totalidad, así como sus cinco dominios individuales de unión a Fc, han servido posterior-mente como puntos de partida para el diseño racional de ligandos de afinidad modificados con propiedades mejora-das.

Por ejemplo, el dominio B de la proteína A sirvió como punto de partida para la creación de la proteína Z de un solo dominio, unida a IgG Fc, modificada (Nilsson B et al., Protein Eng 1 (2):107-13, 1987). Con el fin de mejorar la esta-15 bilidad de esta proteína en condiciones alcalinas, tales como las empleadas en los procedimientos de limpieza in situ durante procesos cromatográficos industriales, Linhult et al. (Proteins 55(2):407-16, 2004) propusieron una variante de proteína Z que comprende residuos de asparagina mutados. Esta variante fue desarrollada posteriormente por GE Healthcare, Uppsala, Suecia, en el producto comercial MAbSelect™ SuRe. En el documento WO2009/146755 se describen variantes de Z adicionales con afinidad por IgG Fc. 20

Las proteínas de unión mutadas basadas en la proteína Z, en las que ha sido modificada la unión a IgG Fc natural, están descritas en los documentos WO2009/080811 y US 5.143.844A. Los polipéptidos de unión a la región Fc de IgG que se pueden producir por escisión de multímeros están descritos en SAITO A et al., (Protein Engineering 2(6):481-488, 1989).

Se ha demostrado que la proteína A natural, con sus cinco dominios individuales de unión a IgG Fc, se une a sólo 2 25 moléculas de IgG, o a 3 moléculas del fragmento Fc recombinante, a pesar de que cada uno de los cinco dominios tiene la capacidad de unirse a una IgG (Birger Jansson, PhD Thesis, Estocolmo, Suecia, 1996, ISBN 91-7170-656-9).

A pesar del éxito comparable de los ligandos de afinidad por IgG Fc utilizados actualmente, existe una necesidad continuada de mejora, especialmente con respecto a los requisitos combinados de mejorar la estequiometría y al 30 mismo tiempo mantener, e idealmente mejorar, la estabilidad en condiciones ácidas y alcalinas. La provisión conti-nuada de agentes con afinidad por IgG Fc sigue siendo un asunto de interés sustancial.

Sumario de la invención

De acuerdo con uno de sus primeros aspectos, la invención proporciona un polipéptido de unión a la región Fc de la inmunoglobulina G (IgG Fc), que comprende la secuencia de aminoácidos: 35

i) X1-([espaciador1]-KFDKEQQN AFYEILX17LPX20 LTEEQRNAFI

QKLKDX36PSQS AELLAEAKQL X51EAQA-[espaciador2])n-CCTERM-1XCTERM

en donde, independientemente uno de otro,

X1 es P;

[espaciador1] es una secuencia de aminoácidos que consiste en 1-3 residuos de aminoácidos; 40

X17 es cualquier residuo de aminoácidos;

X20 es cualquier residuo de aminoácidos;

X36 es E o A;

X51 es cualquier residuo de aminoácidos;

[espaciador2] es una secuencia de aminoácidos que consiste en 0-20 residuos de aminoácidos; 45

XCTERM es D; y

n es 1-4.

En una realización de este aspecto de la invención, el polipéptido de unión a la región Fc de inmunoglobulina G (IgG Fc) consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de i) como se ha definido anteriormente.

La secuencia de aminoácidos del polipéptido de acuerdo con la invención ha sido concebida por el presente inventor con el fin de proporcionar una molécula optimizada de unión a IgG Fc, tomando como punto de partida los diversos 5 dominios de la proteína A de Staphylococcus, así como la proteína Z derivada del dominio B de la proteína A. Al igual que la estructura del dominio modular de la proteína A natural o sus variantes modificadas previamente conoci-das, el polipéptido de la presente invención proporciona uno o más dominios distintos que poseen capacidad de unión a IgG Fc. En particular, se predice que la secuencia de aminoácidos entre las dos secuencias espaciadoras se pliega en un solo dominio en haz de tres hélices con capacidad de unión a IgG Fc. Como se ha descrito anteriormen-10 te, el número n puede estar entre 1 y 4, lo que significa que un polipéptido de acuerdo con la invención puede tener de uno a cuatro dominios distintos de unión a IgG Fc separados por las secuencias espaciadoras, formando un mo-nómero, dímero, trímero o tetrámero de dichos dominios.

En la proteína Z, la posición del aminoácido correspondiente a la posición 17 en la secuencia de aminoácidos i) ante-rior está ocupada por un residuo de histidina. En el polipéptido de la invención, X17 puede ser H, pero también puede 15 estar sustituido por cualquier otro residuo de aminoácido. La sustitución en esta posición puede estar motivada por la necesidad general de evitar aminoácidos químicamente reactivos.

En la proteína Z, la posición del aminoácido correspondiente a la posición 36 en la secuencia de aminoácidos i) ante-rior está ocupada por un residuo de ácido aspártico. En la secuencia de aminoácidos i), sin embargo, esta posición está sustituida, por ejemplo, por un residuo de ácido glutámico o un residuo de alanina. Sin pretender estar vinculado 20 a ninguna teoría, actualmente se cree que esta diferencia sirve para los dos fines separados de a) aumentar la esta-bilidad en ácidos del polipéptido y b) eliminar un dipéptido DP dentro del dominio del haz de tres hélices, que de otro modo sería susceptible de escisión catalizada por ácido. Un aspecto de la invención, descrito con más detalle a con-tinuación, utiliza la susceptibilidad del resto de dipéptido DP en otra parte de la molécula y la presencia de un dipép-tido DP en las posiciones 36-37 disminuiría la viabilidad de este aspecto de la invención. 25

En la proteína Z, la posición del aminoácido correspondiente a la posición 49 en la secuencia de aminoácidos i) ante-rior está ocupada por un residuo de lisina. En la secuencia de aminoácidos i), sin embargo, esta posición está ocu-pada por un residuo de glutamina.

Como apreciarán los expertos en la técnica, la función de cualquier polipéptido, tal como la capacidad de unión a IgG Fc de los polipéptidos de acuerdo con la invención, depende de la estructura terciaria del polipéptido. Es posible 30 hacer cambios en la secuencia de aminoácidos en un polipéptido α-helicoidal sin afectar su función (Taverna and Goldstein, J. Mol Biol 315(3):479-84, 2002; He et al., Proc Natl Acad Sci USA 105(38):14412-17, 2008). Por tanto, la descripción abarca variantes modificadas de i), que son tales que la secuencia resultante sea al menos 95% idéntica a una secuencia perteneciente a la clase definida por i). Por ejemplo, es posible que un residuo de aminoácido per-teneciente a un cierto grupo funcional de residuos de aminoácidos (por ejemplo, hidrófobo, hidrófilo, polar, etc.) pue-35 da ser intercambiado por otro residuo de aminoácido del mismo grupo funcional.

Cuando en la presente memoria se hace referencia al grado de identidad entre las secuencias de aminoácidos de diferentes polipéptidos, se considera el límite inferior del 95% de identidad con una secuencia descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, el polipéptido de la invención puede tener una secuencia que sea al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idéntica a la secuencia descrita en la presente memoria. El tér-40 mino “% de identidad”, como se utiliza en toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, puede cal-cularse, por ejemplo, como sigue. La secuencia buscada se alinea con la secuencia diana usando el algoritmo CLUSTAL W (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Se realiza una comparación sobre la ventana correspondiente a la secuencia más corta de las alineadas. La secuencia más corta de las alineadas puede en algunos casos ser la secuencia diana, tal como el resto de unión HER3 de 29 45 residuos de aminoácidos. En otros casos, la secuencia buscada puede constituir la secuencia más corta de las ali-neadas. La secuencia buscada puede consistir, por ejemplo, en al menos 10 residuos de aminoácidos, tales como al menos 20 residuos de aminoácidos. Se comparan los residuos de aminoácidos en cada posición y el porcentaje de posiciones en la secuencia buscada que tienen correspondencias idénticas con la secuencia diana se expresa en % de identidad. 50

En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, [espaciador1] se selecciona entre A, AE y AEA. [es-paciador1] puede ser por ejemplo A.

En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X17 es H.

En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X20 es cualquier residuo de aminoácido excepto N. X20 puede ser por ejemplo T. 55

En una realización alternativa, X20 es N.

En el polipéptido de acuerdo con la invención, X36 se selecciona entre E y A. X36 puede ser, por ejemplo, E.

En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, X51 es cualquier residuo de aminoácido excepto N. X51 puede ser por ejemplo D.

En una realización alternativa, X51 es N.

En una realización del polipéptido de acuerdo con la invención, todos los residuos de aminoácidos del [espaciador2] 5 se seleccionan independientemente de A, E, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, T y V, en particular de A, E, G, K, P, Q, R, S y T, tal como de G, Q y S. En una realización aún más específica, el [espaciador2] es G.

Como se ha expuesto anteriormente, n es un número entre 1 y 4, es decir, puede ser 1, 2, 3 ó 4.

En los polipéptidos de acuerdo con la invención en donde n > 1, los múltiples casos del [espaciador1] pueden con-sistir cada uno individualmente en la misma secuencia de aminoácidos o ser diferentes secuencias de aminoácidos. 10 Igualmente, en polipéptidos de acuerdo con la invención en donde n > 1, los múltiples casos del [espaciador2] pue-den consistir cada uno individualmente en la misma secuencia de aminoácidos o ser diferentes secuencias de ami-noácidos.

Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con cualquier aspecto de la invención puede unirse a IgG Fc de tal manera que el valor de KD de la interacción sea como máximo 1 x 10-6 M, por ejemplo como máximo 1 x 10-7 M, tal 15 como máximo 5 x 10-8 M.

El polipéptido es ventajoso porque se une bien a una IgG Fc. En particular, el polipéptido puede ser capaz de unirse a la porción Fc de una molécula de IgG humana. En algunas realizaciones de la invención, el polipéptido es capaz de unirse a las clases 1, 2 y 4 de IgG humana, pero no a la clase 3. En algunas realizaciones, el polipéptido es ca-paz de unirse a la interfaz entre los dominios CH2 y CH3 de la IgG Fc. 20

En una realización del polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con la invención, X1 es P.

En una realización del polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con la invención, XCTERM es D.

En una realización particular del polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con la invención, X1 es P y XCTERM es D.

En una realización del polipéptido de acuerdo con la descripción, la secuencia de aminoácidos i) se selecciona de SEQ ID NO:1-6 de la Figura 1 adjunta. Puede ser, por ejemplo, la SEQ ID NO:1. Como es fácilmente evidente, n = 1 25 para las secuencias SEQ ID NO:1-2 y n = 2 para las secuencias SEQ ID NO:3-6. También es evidente a partir de las secuencias propiamente dichas que las SEQ ID NO:1-4 son ejemplos de la realización en donde X1 es P y XCTERM es D, mientras que las SEQ ID NO:5-6 son ejemplos de otra realización.

En un aspecto relacionado, la descripción proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleóti-dos que codifica cualquier polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención. 30

Como se ha explicado anteriormente, en el polipéptido de acuerdo con el primer aspecto de la invención, X1 es P y XCTERM es D en su secuencia de aminoácidos. Este diseño de los residuos de aminoácidos N- y C-terminales permite un método conveniente para la producción del polipéptido de unión a IgG Fc por tecnología de DNA recombinante, produciendo en primer lugar un multímero que tiene copias del polipéptido de la invención como subunidades, es-tando separada cada subunidad de las otras por medio del dipéptido DP. La secuencia de aminoácidos DP es sus-35 ceptible de hidrólisis catalizada por ácido, de modo que el sitio del dipéptido entre las subunidades se puede usar como un sitio de escisión para la separación unas de otras de las subunidades en el multímero. Como ejemplos no limitativos, el multímero puede comprender 2-6 subunidades, tales como 4 subunidades o 6 subunidades. A este respecto, se señala que las subunidades que forman el multímero pueden comprender ellas mismas de 1 a 4 domi-nios distintos de unión a IgG Fc, como se ha descrito anteriormente respecto al número n en la secuencia de i). Las 40 subunidades separadas por secuencias DP y los dominios individuales de unión a IgG Fc pueden constituir los mis-mos elementos estructurales en el multímero (es decir, si n = 1), pero también pueden constituir elementos estructu-rales diferentes de los elementos de la construcción (si n = 2-4).

Por tanto, en un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido multímero que compren-de: 45

- al menos dos subunidades, siendo cada subunidad un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto, en donde X1 es P y XCTERM es D; y

- un péptido guía N-terminal que comprende un residuo D como el último de sus residuos.

Por tanto, con el fin de proporcionar un dipéptido DP adecuado para la escisión, el péptido guía N-terminal tiene que comprender un residuo D como el último de sus residuos. En el polipéptido multímero, este residuo D forma un di-50 péptido DP junto con el residuo P1 de la primera subunidad. La secuencia exacta del resto del péptido guía N-

terminal no es crítica para la invención, siempre y cuando cualquier residuo de aminoácido que preceda al residuo D no interfiera con la escisión del dipéptido DP. El principio del péptido guía dependerá del sistema de expresión utili-zado para la producción. Por ejemplo, se puede usar la expresión intracelular para producir un péptido guía de MD a partir del cual se separa luego el M in vivo, a partir de una proteína soluble. Si la expresión se dirige hacia la forma-ción de cuerpos de inclusión, se puede usar un péptido guía de MXGD, en el que X puede ser cualquier aminoácido 5 o G o estar excluido.

La descripción proporciona también un polinucleótido, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido multímero, como se ha descrito inmediatamente antes.

La presente descripción proporciona, incluso en un aspecto relacionado, un método para producir un polipéptido multímero como se ha descrito anteriormente, comprendiendo dicho método: 10

- proporcionar una célula hospedante que aloja un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un multímero, como se ha descrito anterior-mente,

- cultivar la célula hospedante en condiciones que permitan la expresión de dicho polinucleótido en un po-lipéptido multímero, y 15

- aislar el polipéptido multímero resultante.

Una vez que ha sido aislado el polipéptido multímero resultante, puede ser utilizado como material de partida para la producción de los polipéptidos de unión a IgG Fc del primer aspecto de la invención, puesto que estos polipéptidos están presentes como las subunidades del multímero. De este modo, la descripción proporciona también un método para producir un polipéptido de acuerdo con el primer aspecto, comprendiendo dicho método: 20

- producir un polipéptido multímero usando el método descrito inmediatamente antes,

- escindir el polipéptido multímero en sitios que comprendan la secuencia DP usando hidrólisis catalizada por ácidos, produciendo polipéptidos de unión a IgG Fc de acuerdo con el primer aspecto de la inven-ción y el péptido guía N-terminal, y

- aislar dichos polipéptidos de unión a IgG Fc. 25

Tanto si comprenden como si no secuencias DP y tanto si se preparan o no de acuerdo con el procedimiento conve-niente descrito en el apartado anterior, cualquier polipéptido de acuerdo con la descripción comprende un residuo de cisteína en la penúltima posición CCTERM-1 (que es de hecho la última posición si XCTERM no está presente). La incor-poración de este residuo de cisteína a la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención permite un aco-plamiento químico altamente versátil del polipéptido a otros compuestos. El uso de este residuo de cisteína para 30 acoplar el polipéptido, directa o indirectamente, a una matriz, permite la producción de un medio de separación útil para la separación a escala industrial de moléculas que contienen IgG Fc, por ejemplo en un procedimiento para la producción de anticuerpos monoclonales. El ligando de afinidad en el medio de separación o medio de cromatografía es el polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con el primer aspecto de la invención. La matriz puede estar hecha de un material orgánico o inorgánico. En una realización, la matriz se prepara a partir de un polímero natural, tal co-35 mo material de carbohidrato reticulado, por ejemplo agarosa, agar-agar, celulosa, dextrano, quitosano, konjac, ca-rragenano, goma gellan, alginato, etc. Las matrices de polímero naturales se preparan fácilmente y opcionalmente se reticulan de acuerdo con métodos estándares, tales como gelificación en suspensión inversa (S Hjertén (1964), Biochim Biophys Acta 79(2):393-398). En una realización alternativa, la matriz se prepara a partir de un polímero o copolímero sintético, tal como polímeros sintéticos reticulados, por ejemplo estireno o derivados de estireno, divinil-40 benceno, acrilamidas, ésteres de acrilato, ésteres de metacrilato, ésteres de vinilo, vinil-amidas, etc. Dichas matrices de polímeros sintéticos se preparan fácilmente y se reticulan opcionalmente según métodos estándares. Como ejemplos no limitativos de acoplamiento directo a una matriz, el polipéptido de unión a IgG Fc se puede unir por me-dio de CCTERM-1 a una maleimida-agarosa, yodoacetil-sefarosa o agarosa, por ejemplo SulfoLink® de Pierce. Como ejemplo no limitativo de acoplamiento indirecto, el polipéptido de unión a IgG Fc se puede unir por medio de CCTERM-1 45 a un polímero enlazador, formando una composición intermedia de unión a IgG Fc. Esta composición intermedia se puede unir a su vez a una matriz por medio de grupos reactivos, bien al polipéptido de unión a IgG Fc o al polímero enlazador.

Los polímeros enlazadores preferidos son estables, tanto frente a la hidrólisis catalizada por ácido como por base, así como frente a la degradación proteolítica. Son hidrófilos y de origen no ácido nucleico y no peptídico. Desde un 50 punto de vista regulador, los polímeros preferidos son los que se han utilizado previamente in vivo, pero la invención no está limitada a ellos. Un polímero enlazador particularmente preferido es poli(etilenglicol), PEG. La longitud del polímero enlazador entre los polipéptidos de unión a IgG Fc acoplados debería ser suficiente para permitir una este-quiometría 1:1 de la interacción entre moléculas que contienen IgG Fc y cada dominio de unión a Fc.

En la composición de unión a IgG Fc de la invención, la estabilidad frente a la hidrólisis catalizada por ácido o base se asegura uniendo los dominios plegados usando un polímero enlazador químicamente estable.

Por tanto, en otro de sus aspectos, la invención proporciona una composición de unión a IgG Fc, que comprende al menos un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con el primer aspecto, acoplado covalentemente a un polímero enlazador no ácido nucleico y no péptido por medio del residuo de cisteína CCTERM-1. 5

En un aspecto relacionado, la descripción proporciona un método para producir dicha composición de unión a IgG Fc. El método comprende:

- proporcionar al menos un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con el primer aspecto, y

- acoplar dicho polipéptido a un polímero enlazador no ácido nucleico y no péptido por medio del residuo de cisteína CCTERM-1 presente en dicho polipéptido. 10

El número de polipéptidos de unión a IgG Fc acoplados a cada molécula del enlazador polimérico se puede determi-nar por diseño, por ejemplo utilizando una mezcla predeterminada de moléculas de polímero adaptadas para la con-jugación con diferentes números de polipéptidos de unión a IgG Fc. Por ejemplo, se puede usar un polímero que tenga 1-4 sitios de conjugación para los polipéptidos de unión a IgG Fc en la preparación de una composición homo-génea de unión a IgG Fc, o se puede usar una mezcla de polímeros que tengan 1-4 sitios de conjugación para pre-15 parar la correspondiente composición de unión a Fc.

En el caso en el que el polipéptido de unión a IgG Fc comprenda los residuos de aminoácidos P1 y DCTERM, la prime-ra etapa de este método de producción se puede realizar de acuerdo con la descripción anterior de un método para producir dichos polipéptidos como subunidades en un multímero, cuyas subunidades están separadas por secuen-cias DP susceptibles de escisión por hidrólisis catalizada por ácido. En otras palabras, en esta realización de la in-20 vención, se puede preparar una composición para uso como ligando de afinidad en un medio de cromatografía por: i) expresando un multímero que comprende los polipéptidos individuales de unión a IgG Fc (tanto mono-, di-, tri- o te-tra-méricos) como subunidades, ii) escindiendo el multímero en sus subunidades constituyentes por hidrólisis catali-zada por ácido, y iii) acoplando las subunidades resultantes (es decir, los polipéptidos de unión a IgG Fc de acuerdo con la invención) al polímero enlazador por medio del residuo CCTERM-1. 25

En algunas realizaciones de la composición de la invención y de los métodos para producirla descritas anteriormen-te, el polímero enlazador es poli(etilenglicol).

La composición de acuerdo con la invención puede ser conectable adecuadamente a una matriz o medio de croma-tografía por medio del polímero enlazador. La naturaleza química del grupo utilizado para la unión de la composición a la matriz es preferiblemente diferente de la del grupo utilizado para la conjugación de los polipéptidos de unión a 30 IgG Fc con el polímero enlazador. Gracias a la estabilidad de los polipéptidos de unión a IgG Fc de acuerdo con la invención respecto a las condiciones tanto ácidas como básicas, la activación de un grupo de reacción puede ser realizada bien por una base o por un ácido. La longitud del polímero entre la matriz y el polipéptido de unión a IgG Fc más próximo no debe interferir con las propiedades de unión a IgG de este dominio. La elección entre los compues-tos químicos de acoplamiento disponibles y su adaptación a la presente invención está dentro de las capacidades 35 del experto en la técnica.

Los términos “de unión a IgG Fc” y “afinidad de unión a IgG Fc” como se utiliza en esta memoria descriptiva se refie-ren a una propiedad de un polipéptido que se puede analizar, por ejemplo, por el uso de tecnología de resonancia de plasmones superficiales, tal como en un instrumento Biacore (GE Healthcare). Por ejemplo, como se describe en los ejemplos siguientes, la afinidad de unión a IgG Fc se puede analizar en un experimento en el que se inmoviliza IgG 40 Fc, o un fragmento de IgG Fc, sobre un chip sensor del instrumento y la muestra que contiene el polipéptido que se va a analizar se pasa sobre el chip. Alternativamente, el polipéptido que se va a analizar se inmoviliza en un chip sensor del instrumento, y una muestra que contiene IgG Fc, o uno de sus fragmentos, se pasa sobre el chip. El ex-perto en la técnica puede interpretar entonces los resultados obtenidos en dichos experimentos para establecer al menos una medida cualitativa de la afinidad de unión del polipéptido a IgG Fc. Si se desea una medida cuantitativa, 45 por ejemplo para determinar un valor de KD para la interacción, también se pueden usar métodos de resonancia de plasmones superficiales. Los valores de unión se pueden definir, por ejemplo, en un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare). IgG Fc se inmoviliza sobre un chip sensor del instrumento y se preparan muestras del polipéptido cuya afinidad se ha de determinar por dilución en serie y se inyectan en orden aleatorio. Los valores de KD se pueden calcular entonces a partir de los resultados usando, por ejemplo, el modelo de unión Langmuir 1:1 del programa in-50 formático BIAevaluation 4.1 proporcionado por el fabricante del instrumento.

Cuando se introducen sustituciones de aminoácidos, éstas no deben afectar a la estructura básica del polipéptido. Por ejemplo, el plegamiento global de la cadena principal de Cα del polipéptido puede ser esencialmente el mismo que el de un dominio de la proteína A, es decir, que tenga los mismos elementos de estructura secundaria en el mismo orden. De este modo, los polipéptidos que tengan esta estructura básica tendrán espectros de CD que serán 55 similares a los de un dominio de la proteína A de tipo natural. El destinatario experto es consciente de otros paráme-tros que pueden ser relevantes. El requisito para la conservación de la estructura básica impone restricciones en las

que las posiciones de la secuencia de aminoácidos pueden ser sometidas a sustitución. Por ejemplo, se prefiere que los residuos de aminoácidos situados en la superficie del polipéptido estén sustituidos, mientras que los residuos de aminoácidos enterrados dentro del núcleo del polipéptido en “haz de tres hélices” deben mantenerse constantes para preservar las propiedades estructurales de la molécula. El mismo razonamiento se aplica a fragmentos de poli-péptidos de la invención. 5

Por tanto, la invención también abarca polipéptidos y composiciones en las que el polipéptido de unión a IgG Fc descrito anteriormente está presente como un dominio de unión a IgG Fc al que se han añadido en cualquiera de los extremos residuos de aminoácidos adicionales. Estos residuos de aminoácidos adicionales pueden desempeñar un papel en la unión de IgG Fc por el polipéptido, pero pueden servir igualmente para otros fines, relacionados por ejemplo con uno o más de la producción, purificación, estabilización in vivo y/o in vitro, acoplamiento o detección del 10 polipéptido. Dichos residuos de aminoácidos adicionales pueden comprender uno o más residuos de aminoácidos añadidos con el fin de acoplamiento químico. Dichos residuos de aminoácidos adicionales pueden proporcionar una “etiqueta” para la purificación o detección del polipéptido, tal como una etiqueta His6 o una etiqueta “myc” (c-myc) o una etiqueta “FLAG” para la interacción con anticuerpos específicos para la etiqueta.

La presente invención también abarca polipéptidos de unión a IgG Fc en los que está presente un polipéptido de 15 unión a IgG Fc como se ha descrito anteriormente como un dominio de unión a IgG Fc al que se acoplan péptidos o proteínas adicionales u otros grupos funcionales N- o C-terminales o a cualquier otro residuo (específicamente o no específicamente) por medio de conjugación química (utilizando métodos conocidos de química orgánica).

Un polipéptido de acuerdo con la invención puede ser útil en cualquier método que se base en la afinidad por IgG Fc de un reactivo. Por tanto, el polipéptido se puede usar en dichos métodos como un reactivo de detección, un reactivo 20 de captura o un reactivo de separación. En particular, como ya se ha indicado anteriormente, el polipéptido presenta diversas características que lo hacen útil como reactivo de afinidad en cromatografía, en donde el objetivo es sepa-rar, purificar y/o producir anticuerpos o proteínas de fusión con Fc a partir de una mezcla heterogénea. El polipéptido se puede unir a una matriz y por ejemplo utilizar para la purificación de compuestos terapéuticos que contienen IgG Fc en la producción industrial. Debido a propiedades tales como una alta afinidad por la diana, una alta estabilidad 25 tanto en ambientes ácidos como básicos y selectividad para el fragmento IgG Fc mayor que para el fragmento IgG Fab, se cree que el polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con la invención presenta una afinidad muy atractiva.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención es un método para aislar moléculas que comprenden IgG Fc a partir de un líquido, comprendiendo dicho método las etapas:

(i) proporcionar un líquido que contiene moléculas que comprenden IgG Fc; 30

(ii) poner en contacto el líquido con un polipéptido o composición de unión a IgG Fc como se describe en la presente invención, con lo que dichas moléculas que comprenden IgG Fc se unen al polipéptido o composición; y

(iii) aislar las moléculas unidas que comprenden IgG Fc del líquido.

En el método de aislamiento de la invención, el líquido puede proceder de un cultivo de células procariotas o euca-riotas, tales como de mamíferos o plantas, que expresan moléculas que comprenden IgG Fc, o de la expresión de 35 dichas moléculas en un sistema de expresión alternativo, por ejemplo un sistema vesicular. Alternativamente, el lí-quido puede proceder de la expresión transgénica en un hospedante, tal como un hospedante vegetal o mamíferos.

En el contexto de la presente invención, los términos “muestra” y “líquido” se pueden usar indistintamente. Ninguno de los dos términos implica limitaciones, por ejemplo respecto al volumen de líquido implicado u otras característi-cas. El líquido puede ser de un volumen pequeño, tal como una parte alícuota de un volumen mayor, por ejemplo 40 con fines analíticos; o alternativamente, la alimentación o el líquido usado en un proceso de purificación a gran esca-la.

En algunas realizaciones, dichas moléculas que comprenden IgG Fc son moléculas de IgG o sus fragmentos. Por ejemplo, pueden ser moléculas de IgG humana o sus fragmentos. En algunas realizaciones, dichas moléculas que comprenden IgG Fc son anticuerpos IgG monoclonales. En particular, dichos anticuerpos IgG monoclonales pueden 45 ser anticuerpos IgG monoclonales humanos. Por ejemplo, son anticuerpos IgG monoclonales humanos de la clase 1, 2 y/o 4.

En otras realizaciones, dichas moléculas que comprenden IgG Fc son proteínas de fusión Fc. El dominio Fc en dicha proteína de fusión puede así, ventajosamente, ser utilizado como un “asa de afinidad” en el aislamiento de la proteí-na de fusión. Se ha creado una gran variedad de proteínas de fusión con Fc. Por ejemplo, las proteínas de fusión 50 con Fc que tienen aplicaciones terapéuticas incluyen etanercept, que es una fusión entre el receptor TNF-α soluble y Fc y VEGF Trap, que es una fusión entre los dominios del receptor VEGF y Fc (Holash et al., Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99 (17):11393-11398). Aunque estos dos ejemplos son ilustrativos de gran interés, su enumeración no es limitativa y en principio es posible fusionar un dominio Fc con cualquier proteína deseada con el fin de modificar sus propiedades y facilitar su purificación por afinidad utilizando como ligando de afinidad el polipéptido o composi-55 ción de unión a IgG Fc de la invención descrito en la presente memoria.

Incluso otro aspecto de la presente descripción se refiere a un método para producir moléculas que comprenden IgG Fc, comprendiendo dicho método las etapas:

(i) expresar las moléculas deseadas que comprenden IgG Fc;

(ii) obtener un líquido que contenga moléculas que comprenden IgG Fc a partir de dicha expresión;

(iii) poner en contacto el líquido con un polipéptido o composición de unión a IgG Fc como se describe en la 5 presente memoria, con lo que las moléculas que comprenden IgG Fc se unen al polipéptido o composición;

(iv) aislar las moléculas unidas que comprenden IgG Fc del líquido, y

(v) recuperar las moléculas unidas que comprenden IgG Fc por su elución a partir del polipéptido o compo-sición de unión a IgG Fc.

La etapa de expresión (i) se puede realizar utilizando cualquier sistema de expresión conocido, por ejemplo expre-10 sión recombinante en células procariotas o eucariotas, tales como de mamíferos o vegetales, o en un sistema vesi-cular. El líquido también puede proceder de la expresión transgénica en un hospedante, tal como un hospedante mamífero o vegetal.

En algunas realizaciones, dichas moléculas que comprenden IgG Fc son moléculas de IgG o sus fragmentos. Por ejemplo, pueden ser moléculas de IgG humana o sus fragmentos. En algunas realizaciones, dichas moléculas que 15 comprenden IgG Fc son anticuerpos IgG monoclonales. En particular, dichos anticuerpos IgG monoclonales pueden ser anticuerpos IgG monoclonales humanos. Por ejemplo, son anticuerpos IgG monoclonales humanos de la clase 1, 2 y/o 4.

En otras realizaciones, dichas moléculas que comprenden IgG Fc son proteínas de fusión con Fc.

En algunas realizaciones de los métodos de aislamiento y producción de la invención, el polipéptido o composición 20 de unión a IgG Fc se inmoviliza sobre una matriz. En una realización, el presente polipéptido o composición ha sido acoplado a una matriz en forma de un portador insoluble. Dicho portador puede ser una o más partículas, tales como perlas, por ejemplo una resina para cromatografía; o formas irregulares; membranas; filtros; capilares; monolitos; y cualquier otro formato comúnmente utilizado en la separación y/o purificación de proteínas. Por tanto, en general, los métodos que emplean los polipéptidos y/o las composiciones de acuerdo con la invención in vitro se pueden realizar 25 en diferentes formatos, tales como sobre filtros o membranas, placas de microtitulación, en matrices proteínicas, sobre superficies de biosensores, sobre perlas, en citometría de flujo, en cortes de tejidos, etc. En un aspecto espe-cífico, la invención proporciona un medio de cromatografía, que tiene un polipéptido o composición de unión a IgG Fc como se describe en la presente invención inmovilizado sobre sí mismo. Dicho medio puede estar basado en cualquier material para cromatografía conocido, como una matriz, y el acoplamiento del polipéptido o composición a 30 la matriz se puede realizar usando uno cualquiera de los diversos procedimientos conocidos.

La numeración de los residuos de aminoácidos y cualquier uso del término “posición” en la secuencia del polipéptido de acuerdo con la invención es relativa. En un polipéptido de acuerdo con la invención que tenga tantos residuos de aminoácidos como un polipéptido descrito específicamente, es decir, los descritos anteriormente, las posiciones de aminoácidos en el polipéptido corresponden exactamente a las de los polipéptidos descritos. En una situación en la 35 que haya, por ejemplo, una extensión N-terminal en comparación con los polipéptidos descritos, los residuos de aminoácidos en el péptido extendido que corresponden a los del péptido no extendido tendrán los mismos números de posición. Por ejemplo, si hay una extensión de seis aminoácidos en el polipéptido extendido, entonces el aminoá-cido número siete de ese polipéptido modificado, contando desde el extremo N, corresponde al aminoácido en la posición número uno del polipéptido descrito. 40

La invención es ilustrada además por los siguientes ejemplos no limitativos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es una tabla que muestra información sobre la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos descritos en la presente memoria. Las SEQ ID NO:1-6 son ejemplos no limitativos de polipéptidos de acuerdo con la inven-ción, mientras que las SEQ ID NO:7-9 se describen con fines ilustrativos y/o comparativos. 45

La Figura 2 es un cromatograma del análisis por HPLC/MSD de una muestra de His6-Z05494 después de tratamien-to con ácido fosfórico 5 M. El pico señalado con I corresponde a la molécula His6-Z05494 escindida (7052 Da), no escindida (9179 Da) y modificada (7268 Da).

La Figura 3 es un cromatograma del análisis por HPLC/MSD de una muestra de His6-Z05494 después de tratamien-to con ácido clorhídrico 2 M durante 1 hora a 50ºC. El pico señalado con I corresponde a la molécula His6-Z05494 50 escindida (7052 Da), no escindida (9179 Da) y modificada (7268 Da). El pico señalado con II corresponde a la eti-queta de hexahistidilo (2145 Da).

La Figura 4 es un cromatograma del análisis por HPLC/MSD de una muestra de His6-Z05494 después de tratamien-to con ácido fosfórico 6 M durante 1 hora a 50ºC. El pico señalado con I corresponde a la molécula His6-Z05494 es-cindida (7052 Da) y no escindida (9179 Da).

Ejemplo 1

Escisión de una secuencia de dipéptido DP 5

La molécula Z05494 de Affibody® de unión a HER2 (SEQ ID NO:8 en la Figura 1) se construyó a partir de Z02891 (SEQ ID NO:7 en la Figura 1) reemplazando el ácido aspártico en la posición 37 de Z02891 por un ácido glutámico. A continuación se usó la molécula Z05494 en el experimento descrito en la presente memoria con fines ilustrativos. El gen mutado se insertó en un vector de expresión que contenía el promotor T7 y que codificaba una cola de he-xahistidina (His6) seguido por una secuencia de dipéptidos DP que permitía la escisión por ácido. La proteína expre-10 sada, que tenía la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:9 (Figura 1) y se denominó His6-Z05494, se recolectó co-mo un producto soluble con la metionina de partida eliminada.

Después de la expresión, las células se lisaron por calentamiento y el producto His6-Z05494 soluble se purificó por IMAC seguido de cromatografía en fase inversa. La proteína se dividió en partes alícuotas en viales en porciones de 1 mg y 5 mg y se liofilizó. 15

Se preparó una serie de diluciones de 12 M, 10 M, 8 M, 6 M, 4 M, 2 M y 0,2 M de cada uno de los siete ácidos si-guientes: ácido fosfórico (H3PO4), ácido acético (CH3COOH), ácido fórmico (HCOOH), ácido sulfúrico (H2SO4), ácido clorhídrico (HCl), ácido nítrico (HNO2) y ácido trifluoroacético (CF3CO2H). La molécula His6-Z05494 liofilizada se di-luyó en agua desionizada hasta una concentración final de 4 mg/mL. Se prepararon siete tubos Eppendorf por ácido, conteniendo todos ellos 25 μL de His6-Z05494. Se añadieron a los tubos Eppendorf 25 μL de ácido y se dejaron in-20 cubar a 37ºC durante 17 horas 30 minutos (durante una noche).

La escisión catalizada por ácido se detuvo aumentando el pH hasta 7,5-8,5 por adición de diferentes concentracio-nes de NaOH y 125 μL de Tris-HCl 2 M, pH 8. Todas las muestras se analizaron con SDS-PAGE y se cargaron en un equipo de HPLC/MSD.

El análisis por HPLC/MSD mostró que los ácidos débiles, ácido acético y ácido fórmico, escindieron una cantidad 25 muy pequeña de proteína a una concentración de 5-6 M, y nada en absoluto a menores concentraciones. El ácido fosfórico 5 M fue una excepción a los resultados de los ácidos débiles en general, y escindió grandes cantidades de la molécula His6-Z05494. La Figura 2 es un diagrama del análisis por HPLC/MSD de la muestra tratada con ácido fosfórico 5 M, y se observa que el componente principal es la molécula escindida. Sin embargo, también se detecta-ron en la muestra pequeñas cantidades de moléculas no escindidas y de molécula escindida modificada. 30

El ácido nítrico era demasiado potente para el experimento de escisión, cortando la proteína de forma irregular. El ácido trifluoroacético no cortó la proteína en el sitio de escisión, lo que dio lugar a resultados que eran difíciles de interpretar. El ácido sulfúrico y el ácido clorhídrico mostraron resultados similares. A menores concentraciones, es decir, un ácido desde alrededor de 1 a 3 M, fue escindida la mayor parte de la proteína. Los resultados del análisis por HPLC/MSD confirman que la molécula His6-Z05494 fue escindida, pero el resultado estuvo muy lejos de ser per-35 fecto e indicaba que los experimentos de escisión no eran óptimos. En casi todos los casos, se detectó una cantidad significativa de molécula escindida con una masa extra de +216 Da.

Los resultados con ácido fosfórico y ácido clorhídrico fueron los más favorables, y se realizaron experimentos adicio-nales con estos dos ácidos. Se prepararon series de dilución para HCl con las concentraciones 7 M, 6 M y 4 M y para H3PO4 con las concentraciones 12 M, 10 M y 8 M. Se usó un tampón diferente (NaH2PO4 2 M, pH 7,4) para 40 determinar si el tampón Tris podría haber dado como resultado la modificación de la molécula His6-Z05494. La esci-sión se realizó a 100ºC, 80ºC y 50ºC y se detuvo después de 1 h, 2 h, 4 h, 6 h y 8 h aumentando el pH por adición de una concentración apropiada de NaOH y 125 μL de NaH2PO4 2 M, pH 7,4. Las muestras se analizaron en gel de SDS-PAGE y se cargaron en un equipo de HPLC/MSD.

La espectrometría de masas confirmó que las temperaturas de 100ºC y 80ºC eran claramente demasiado altas para 45 la escisión química y dieron como resultado una proteína totalmente fragmentada con ambos ácidos. La escisión realizada a 50ºC dio mejores resultados, pero confirmó que cuando se usaba una alta concentración de NaH2PO4 como tampón, el resultado de la espectroscopia de masas se veía afectado a medida que precipitaba el fosfato. La alta concentración de fosfato en las muestras condujo a un alto grado de modificaciones en la molécula His6-Z05494 escindida con una masa extra de +79 Da. También se detectó una molécula His6-Z05494 escindida con una masa 50 de 7269 Da, que es una masa extra de +216 Da. Los mejores resultados de escisión con ácido clorhídrico se consi-guieron con las concentraciones 2 M y 3 M durante 1-3 horas. Con ácido fosfórico, la mejor escisión se realizó utili-zando ácido 5-6 M durante 1-4 horas. Las Figuras 3 y 4 ilustran diagramas para obtener los mejores resultados con ácido clorhídrico y ácido fosfórico, respectivamente.

En resumen, los experimentos descritos anteriormente muestran que el dipéptido DP puede ser escindido satisfacto-55 riamente usando hidrólisis catalizada por ácido, cuando esta secuencia de dipéptidos está presente en un espacia-

dor que precede a un dominio de proteína en haz de tres hélices, tal como el dominio de unión a IgG Fc en haz de tres hélices presente en el polipéptido de acuerdo con la invención.

Ejemplo 2

Consideraciones sobre el diseño en la preparación de una composición de unión a IgG Fc de acuerdo con la inven-ción 5

Se realizó un experimento piloto con el fin de evaluar la longitud óptima de un enlazador polimérico en una composi-ción de unión a IgG Fc de acuerdo con la invención, con vistas a unir dos anticuerpos monoclonales (mAb) con dos polipéptidos de unión a IgG Fc en los que n = 1, es decir, dos dominios individuales, acoplados “cola con cola” por medio de sus respectivos residuos de CCTERM-1 sobre un enlazador de poli(etilenglicol) (PEG). El enlazador óptimo es suficientemente largo para permitir la unión de dos mAb sin interferencia estérica, pero no lo suficientemente largo 10 para permitir que ambos dominios de unión a IgG Fc se unan al mismo mAb. El PEG homobifuncional, reactivo con tiol (Bismaleimida-dPEG) se puede adquirir a Quanta Biodesign Ltd. El catálogo contiene variantes que tienen 3 u 11 unidades de etilenglicol, pero están disponibles otras alternativas si se solicitan. Se ha encontrado un enlazador de longitud adecuada cuando los dos dominios de unión a IgG Fc conectados por un PEG no tienen preferencia por la unión al mismo anticuerpo, sino que se unen a dos anticuerpos separados. De este modo, están disponibles retícu-15 los de anticuerpos y dominios de unión a IgG Fc conjugados con PEG.

El experimento de optimización comienza preferiblemente con una evaluación de las dos longitudes enlazadoras comercialmente disponibles, y luego continúa con enlazadores de longitudes intermedias, o con una longitud de más de 11 unidades de etilenglicol. La orientación cola con cola de los dos polipéptidos de unión a IgG Fc permite la se-paración de los dominios por rotación alrededor del mismo “eje”, y por tanto proporciona una mayor distancia entre 20 las superficies de unión, en comparación con una situación en la que haya una orientación “cabeza con cola” usando un espaciador de las mismas longitudes. Una orientación “cabeza con cola” da típicamente como resultado la expre-sión recombinante de varios dominios de unión a IgG Fc en serie, como una proteína de fusión multimérica separada por espaciadores peptídicos.

Un experimento con el objetivo de evaluar qué retículos de polipéptidos de unión y mAb se obtienen se realiza usan-25 do un anticuerpo IgG1 humano (o una mezcla de anticuerpos IgG1 humanos). Después de incubación de la compo-sición de unión a IgG Fc con los mAb en condiciones adecuadas, se analizan los complejos formados usando cro-matografía de exclusión por tamaño molecular (SEC) y el resultado se confirma por análisis de espectrometría de masas de alto peso molecular. En el experimento SEC, los tamaños de los complejos formados se determinan por comparación con un patrón de tamaños de referencia. Partiendo de una longitud de enlazador que produce princi-30 palmente retículos y complejos mayores que 1:1 (con referencia a complejos de un dímero unido a PEG de dominios de unión a IgG y una molécula de IgG), se investiga la cantidad de complejos 1:1 formados con una longitud de en-lazador reducida sucesivamente. El PEG de longitud óptima contiene una o dos unidades de etilenglicol menos que la longitud que muestra un claro aumento en la cantidad de complejo 1:1 encontrado. Preferiblemente, se utiliza una molécula de PEG que tenga dos unidades menos, si esto no da lugar a un aumento en el contenido de complejo 1:1 35 en comparación con una molécula que tenga una unidad de etilenglicol menos. Por debajo de cierta longitud, el en-lazador será demasiado corto para permitir la formación de retículos.

Se realiza entonces un segundo experimento de optimización para evaluar la longitud óptima que permita que un trímero (es decir, tres dominios monoméricos de polipéptido de unión a IgG Fc acoplados equidistantemente en la misma cadena de PEG) se una a tres mAb separados. Lo mismo se hace entonces con un tetrámero, investigando 40 la unión de cuatro mAb.

Como se describe en el párrafo general anterior, la composición de acuerdo con la invención se puede conectar adecuadamente a una matriz o medio de cromatografía. Con el fin de encontrar la longitud óptima del enlazador po-limérico que conecta la composición a la matriz, el punto de partida es investigar un enlazador que sea al menos tan largo como el enlazador entre los dominios de unión a IgG Fc. Además, la naturaleza química del grupo utilizado 45 para la unión a la matriz es preferiblemente diferente de la maleimida usada para la conjugación de los dominios de unión a IgG Fc con el polímero enlazador. La activación de un grupo reactivo puede ser realizada ya sea por una base o un ácido, debido a la estabilidad del dominio polipeptídico frente a ambas condiciones. Como ejemplos no limitativos de productos químicos que pueden ser adecuados, Quanta Biodesign Ltd fabrica PEG que tiene un éster t-butílico así como derivados de tosilato que pueden ser activados y utilizados para productos químicos patentados, 50 y un azido-PEG que puede ser usado en reacciones de química clic. Alternativas adicionales son bien conocidas en la técnica.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido de unión a la región Fc de la inmunoglobulina G, que comprende la secuencia de aminoácidos:

i) X1-([espaciador1]-KFDKEQQN AFYEILX17LPX20 LTEEQRNAFI

QKLKDX36PSQS AELLAEAKQL X51EAQA-[espaciador2])n-CCTERM-1XCTERM

en donde, independientemente uno de otro, 5

X1 es P;

[espaciador1] es una secuencia de aminoácidos que consiste en 1-3 residuos de aminoácidos;

X17 es cualquier residuo de aminoácidos;

X20 es cualquier residuo de aminoácidos;

X36 es E o A; 10

X51 es cualquier residuo de aminoácidos;

[espaciador2] es una secuencia de aminoácidos que consiste en 0-20 residuos de aminoácidos;

XCTERM es D; y

n es 1-4.
2. Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el [espaciador1] se selecciona de 15 A, AE y AEA.
3. Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde X17 es H.
4. Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde X20 es N o T. 20
5. Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde [espa-ciador2] es G.
6. Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde X51 es N o D.
7. Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde todos 25 los residuos de aminoácidos del [espaciador2] se seleccionan independientemente de A, E, F, G, I, K, L, P, Q, R, S, T y V, en particular de A, E, G, K, P, Q, R, S y T, tal como de G, Q y S.
8. Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que se une a IgG Fc de tal manera que el valor de KD de la interacción es como máximo 1 x 10-6 M, tal como máximo 1 x 10-7 M o como máximo 5 x 10-8 M. 30
9. Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es capaz de unirse a la porción Fc de una molécula de IgG humana, tales como las clases 1, 2 y 4 de IgG humana.
10. Un polipéptido de unión a IgG Fc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde X1 es P y XCTERM es D y en donde la secuencia de aminoácidos i) se selecciona de SEQ ID NO:1-4.
11. Un polipéptido multímero que comprende al menos dos subunidades, siendo cada subunidad un polipéptido de 35 acuerdo con la reivindicación 1; y un péptido guía N-terminal que comprende un residuo D como su último residuo.
12. Una composición de unión a IgG Fc, que comprende al menos un polipéptido, tal como de uno a cuatro polipép-tidos, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, unido cada uno covalentemente a un polímero enlazador no ácido nucleico y no péptido por medio del residuo de cisteína CCTERM-1.
13. Un método para aislar moléculas que comprenden IgG Fc a partir de una muestra, comprendiendo dicho método 40 las etapas:

(i) proporcionar un líquido que contiene moléculas que comprenden IgG Fc;

(ii) poner en contacto el líquido con un polipéptido o composición de unión a IgG Fc de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y 12, por lo que dichas moléculas que comprenden IgG Fc se unen al poli-péptido o composición;

(iii) aislar las moléculas unidas que comprenden IgG Fc del líquido.
14. Un polipéptido o composición de unión a IgG Fc de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y 12 5 unido covalentemente a una matriz insoluble.