ES2777939T3 - Moduladores del sistema inmunitario - Google Patents

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Abstract

Péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos FFVKLS (SEQ ID NO: 62) que comprende no más de 30 aminoácidos, en el que, si el péptido aislado se pone en contacto con un segundo péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos VFDEFKPLVEEPQNLIK (SEQ ID NO: 185), el péptido aislado se une específicamente al segundo péptido.

Description

DESCRIPCIÓN
Moduladores del sistema inmunitario
Campo de la invención
Los aspectos de la presente invención se refieren generalmente a composiciones que interaccionan con moléculas que suprimen el sistema inmunitario. Más específicamente, las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al descubrimiento, la fabricación y el uso de composiciones que modulan el sistema inmunitario.
Antecedentes de la invención
El sistema inmunitario está finamente ajustado para detectar y erradicar moléculas foráneas y, al mismo tiempo, evitar una sobrerreactividad, que podría dar como resultado la destrucción de tejidos normales dando como resultado enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias crónicas. La iniciación de una respuesta inmunitaria específica es una cadena bien orquestada de acontecimientos que culminan en la activación de funciones efectoras, tales como la liberación de citocinas, la producción de anticuerpos específicos y/o actividad citotóxica celular.
El papel del sistema inmunitario en cáncer humano ha sido objeto de debate durante varios años. Ha sido desconcertante, por ejemplo, que no se observa un aumento de la incidencia de tumores malignos en animales inmunocomprometidos, tales como ratones desnudos. Estos animales no están tan profundamente inmunocomprometidos como se esperaría, ya que son capaces de montar una reactividad inmunitaria antitumoral significativa. Cuando se estudiaron ratones transgénicos gravemente inmunocomprometidos de los genotipos Stat 1 -/-, IFNyR -/- o RAG2 -/-, la incidencia de tumores y la inmunogenicidad de los cánceres que crecían en estos animales apoyó fuertemente la existencia de una reactividad anticancerígena mediada inmunitariamente con la capacidad de controlar el desarrollo del cáncer. Basándose en estos resultados, se desarrolló el modelo de inmunoedición (Dunn y Schreiber, Immunity, 21:137-148 (2004)).
De manera similar, el modesto aumento en la incidencia de cáncer en pacientes con trasplantes de órganos alogénicos, inmunosuprimidos terapéuticamente parece explicarse por la aparición temprana de inmunosupresión en cánceres epiteliales (Schüle J, et al., Breast Cancer Res Treat. 2002; 74:33-40; Wolfram RM, et al., Int J Cancer.
2000; 88:239-44., Petersen RP, et al., Cancer. 2006; 107:2866-72). La aparición de regresión tumoral espontánea mediada inmunitariamente, la correlación entre linfocitos infiltrantes de tumores y el pronóstico, la aparición de linfocitos T citotóxicos específicos de tumor y anticuerpos y la eficacia del tratamiento inmunoestimulador apoyan todos un papel significativo del sistema inmunitario en el control o la regulación de la progresión del cáncer.
Estas observaciones son también consecuentes con los resultados de Clinchy et al. (Clinchy B, et al., Cancer. 2007; 109:1742-9), que muestran que la desregulación del sistema inmunitario en cáncer, con una capacidad potenciada de producir IL-6, se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes con cáncer colorrectal sometidos a resección radical. Ni siquiera en el grupo de pacientes de alto riesgo con tumores localmente avanzados, T3N1-2, murieron los pacientes por su cáncer si sus células inmunitarias presentaban una producción normal de IL-6. De manera similar, Galon et al. (Galon J, et al., Science. 2006; 313:1960-4, Mlecnik B, et al., J Clin Oncol. 2011, 29:610-8) han mostrado que los parámetros inmunitarios de células T se correlacionan fuertemente con el pronóstico en estos pacientes.
La mayoría de los cánceres humanos de diferente origen inducen reactividad antitumoral mediada inmunitariamente, pero los mecanismos inmunosupresores que aparecen a menudo en un estadio temprano comprometen al sistema inmunitario. La existencia de inmunosupresión regional en ausencia de supresión sistémica (inmunidad concomitante), indica un gradiente regional, sistémico de inmunosupresión (Gorelik E., et al., Adv Cancer Res. 1983; 39:71-120). Por ejemplo, la función de células inmunitarias puede verse más alterada cerca del tumor que en la sangre periférica (Vose BM, et al., Int J Cancer 197720:895-902). Varios factores pueden mediar en esta supresión (Ménétrier-Caux C, et al., Br J Cancer 1999 79: 119-130., Heimdal JH, et al., Scand J Immunol 2000 51: 271-278., Heimdal JH, et al., Scand J Immunol 2001 53: 162-170), pero no se ha identificado ningún mecanismo fundamental (Kim R, et al., Cancer Res. 1 de junio de 2006; 66(11):5527-36, Mocellin S, et al., J Immunother 2001 24:392-407). El impacto del medio intratumoral hostil se ha descrito por varios grupos (Perdrizet GA, et al., J Exp Med.
1990;171:1205-20, Yu P, et al., J Exp Med. 2005 201:779-91). La reactividad inmunitaria contra el cáncer puede suprimirse a varios niveles, por ejemplo, iniciación, reclutamiento de células efectoras al tumor y migración de estas células dentro del tumor y su actividad citotóxica. Los mecanismos efectores presentes en el sitio tumoral también pueden proporcionar control del cáncer mediado inmunitariamente.
Aunque los datos indican que el sistema inmunitario es de gran importancia para el control del cáncer (Dunn GP, et al., Immunity. 200421:137-48., Galon J, et al., Science. 2006313:1960-4., Koebel CM, et al., Nature. 2007450:903-7, Clinchy B, et al., Cancer. 2007 109:1742-9, Teng MW, et al., J Leukoc Biol. 2008 84:988-93), los tumores malignos siguen creciendo y la eficacia de la inmunoterapia es bastante escasa con una tasa de remisión objetiva del 10-20%. Puede haber varios motivos para esta aparente paradoja, por ejemplo, los tumores evitan el reconocimiento por el sistema inmunitario debido a que los antígenos tumorales son autoantígenos débiles, escasa presentación de antígenos debido a la regulación por disminución de TAP y MHC I y II) o inducción de tolerancia o inmunosupresión relacionada con el cáncer. El impacto de un medio intratumoral hostil se demuestra mediante los resultados a partir de experimentos con animales (Perdrizet GA, et al., J Exp Med. 1990; 171:1205-20, Yu P, et al., J Exp Med. 2005201:779-91) y tumores humanos (Gajewski TF, et al., J Immunother. 200629:233-40, Whiteside TL, Oncogene. 200827:5904-12).
Diferentes tipos de células inmunosupresoras, células T reguladoras, células dendríticas inmaduras (iDC), macrófagos asociados a tumores (TAM) y células supresoras derivadas de tejido mieloide (MDSC) pueden funcionar sustancialmente en la inmunosupresión relacionada con el cáncer. El equilibrio inmunitario se desvía generalmente a una dominancia de Th2 caracterizada por citocinas, tales como IL-4, IL-10 y PGE2. Adicionalmente, otros mecanismos inmunosupresores, tales como factores bloqueantes séricos, complejos inmunitarios circulantes, producción de IL-1Ra potenciada y actividad proteolítica intratumoral potenciada pueden funcionar en la inmunosupresión relacionada con el cáncer.
Mientras se investigaban mecanismos para la inducción de interleucina-6 (IL-6) en pacientes con cáncer, se encontraron secuencias de péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina sérica (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 7.960.126; 8.110.347; y 8.110.347; así como la publicación estadounidense n.° 2010/0323370. La interleucina-2 (IL-2) desempeña un papel importante en la iniciación y activación de la respuesta inmunitaria y su capacidad para inducir células citolíticas activadas por linfocinas (células LAK), proliferación de célula T y citotoxicidad. Varios informes han mostrado que células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con cáncer tienen una capacidad disminuida tanto de sintetizar (Wanebo HJ, et al., Cancer. 198657:656-62, Mantovani, G., et al., Diagn. Clin. Immunol. 1987 5: 104-111, Lauerova L, et al., Neoplasma 199946: 141-149) como responder a IL-2 (Tsubono M, et al., J Clin Lab Immunol 199033:107-115, Pellegrini P, et al., Cancer Immunol Immunother 1996 42:1-8). Productos solubles a partir de explantes tumorales o suero de pacientes con cáncer pueden inhibir la producción de citocinas, inhibir la expresión de receptores de IL-2 (Botti C, et al., Intl J Biol Markers 1998 13:51-69, Lauerova L, et al., Neoplasma 199946:141-149) y/o reducir la capacidad proliferativa en linfocitos T normales (Botti C, et al., Intl J Biol Markers 1998 13:51-69).
Las integrinas son una superfamilia de glicoproteínas transmembrana, que se encuentran predominantemente en leucocitos que median en interacciones célula-célula y célula-sustrato. Las integrinas desempeñan un papel importante en la regulación inmunitaria, también, en particular aLp2 (molécula asociada a función leucocitaria-1, LFA-1) es de importancia fundamental para la iniciación y regulación de una respuesta inmunitaria, el reclutamiento en el tejido y la migración de células inflamatorias y la actividad citotóxica de linfocitos (Hogg N, et al., J Cell Sci.
2003 116:4695-705, Giblin PA, et al., Curr Pharm Des. 2006 12:2771-95, Evans R, et al., Cell Sci. 2009122:215-25). Además, LFA-1 está implicada en la respuesta proliferativa a interleucina-2 (Vyth-Dreese FA, Eur J Immunol. 1993 12:3292-9) y algunos fragmentos de albúmina se unen a LFA-1 y/o al receptor de IL-2 modulando de ese modo las propiedades funcionales mediadas a través de estos receptores incluyendo la proliferación de células inmunitarias (véase la publicación estadounidense n.° 2011/0262470). El documento US 2004/031072 da a conocer un polipéptido que consiste en 76 aminoácidos y que comprende una secuencia de motivo FFVKLS. A pesar de estos avances, es manifiesta la necesidad de más composiciones para modular el sistema inmunitario, especialmente en individuos que tienen un sistema inmunitario comprometido y/o cáncer.
Breve sumario de la invención
Se han descubierto varias moléculas que regulan el sistema inmunitario. Tal como se describe en el presente documento, muchos péptidos (por ejemplo, péptidos obtenidos a partir de albúmina desnaturalizada o escindida enzimáticamente y/o fragmentos de albúmina) se unen a receptores (por ejemplo, receptores de IL-2 y/o LFA-1) en células inmunitarias humanas y de ese modo inhiben varias propiedades o funciones de células inmunitarias (por ejemplo, proliferación de linfocitos, diseminación/migración de leucocitos, citotoxicidad de células citolíticas naturales (células Nk )), que son centrales para mantener un sistema inmunitario sano. De manera interesante, se encontró que se producía una degradación significativamente potenciada de la albúmina cuando se desarrollaba resistencia al tratamiento en un modelo de ratón (Culp WD, et al., J ProteomeRes. 2006; 5:1332-43). Por consiguiente, se dan a conocer en el presente documento moléculas que son o que se asemejan o imitan estructuralmente a estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina (por ejemplo, análogos o miméticos derivados de manera sintética, o peptidomiméticos), que se unen a y/o interaccionan con receptores en células inmunitarias humanas e inhiben o suprimen el sistema inmunitario (por ejemplo, reduciendo la proliferación de linfocitos, diseminación/migración de leucocitos y/o citotoxicidad de células NK). Adicionalmente, se desarrollaron varias moléculas que se unen a y/o interaccionan con estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina inhibiendo la interacción de las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina con receptores en células inmunitarias humanas. Por ejemplo, se prepararon anticuerpos y péptidos que se unen a las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina y se encontró que estos inhibidores de estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina interfieren con la capacidad de las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina para inhibir o suprimir la función de células inmunitarias.
Un aspecto de la presente invención proporciona un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos FFVKLS (SEQ ID NO: 62) que comprende no más de 30 aminoácidos, en el que, si el péptido aislado se pone en contacto con un segundo péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos VFDEFKPLVEEPQNLIK (SEQ ID NO: 185), el péptido aislado se une específicamente al segundo péptido. Se identificaron inhibidores preferidos de estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tales como P28R (SEQ ID NO: 2) o núcleo P28 (SEQ ID NO: 62), usando los métodos y enfoques descritos en el presente documento. Se encontró que los inhibidores P28R y núcleo P28, por ejemplo, desbloquean (por ejemplo, desplazan las estructuras de 3028 o péptidos inmunorreguladores unidos de un receptor de células inmunitarias, tal como LFA-1), eliminan o desplazan las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina que se unieron a o se asociaron con receptores de células inmunitarias (por ejemplo, LFA-1) y de ese modo restauran la función normal de células inmunitarias (por ejemplo, proliferación de células inmunitarias en respuesta a un inductor, tal como IL-2, activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas). Como tal, se contempla en el presente documento que, según algunas realizaciones en el presente documento, P28R y núcleo P28 pueden inducir citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas. Se encontró también que P28R estimula directamente células inmunitarias e induce citotoxicidad en células tumorales. Se contempla que varios otros inhibidores de estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina puedan desarrollarse usando las enseñanzas descritas en el presente documento. Por consiguiente, se dan a conocer en el presente documento péptidos, péptidos modificados, peptidomiméticos, aptámeros, anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se unen a estructuras inmunorreguladoras, tales como estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, así como métodos de fabricación y métodos de uso de los mismos, en particular, métodos para reducir la inmunosupresión en un sujeto que lo necesita (por ejemplo, inmunosupresión que resulta de cáncer o infecciones patógenas, virales o bacterianas, duraderas o crónicas, por ejemplo debido a resistencia a antibióticos).
Se dan a conocer en el presente documento composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende la fórmula VII, en la que la fórmula VII es:
X700KX701X702X703X704X705X706KX707X708X709X710X711EX712 (SEQ ID NO: 394)
en la que X700 es K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente;
en la que X701 es L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente;
en la que X702 es D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente;
en la que X703 es T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente;
en la que X704 es F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente;
en la que X705 es F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente;
en la que X706 es V, F, G, L, P o R, o está ausente;
en la que X707 es L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente;
en la que X708 es S, H, M, N, Q o T, o está ausente;
en la que X709 es L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente;
en la que X710 es F, A, C, G, H, I, L, M, NP, Q, R, S, T, V o W, o está ausente;
en la que X711 es T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente; y
en la que X712 es R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente.
Dicha fórmula VII puede ser una de SEQ ID NO: 1-101, 167-172, 174-177, 179-393, 396-581 o 582.
Se dan a conocer composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende la fórmula VIII, en la que la fórmula VIII es:
X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395)
en la que X800 es K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente;
en la queX801 es LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFW, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente;
en la queX802 es LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente; y
en la que X803 es R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente.
Dicha fórmula VIII puede ser una de SEQ ID NO: 1-34, 64-68, 70-72, 74-77, 80, 83, 86, 89, 92-96, 99-100, 264, 268­ 269, 270-386, 388-393, 396-401, 403, 404, 406, 408-411, 413-416, 419-420, 422-438, 442-444, 446-449, 451-453, 455-458, 460, 462-466, 470, 472-477, 479-480, 482-484, 486, 487, 489, 491-493, 495-498, 500-508, 512-517, 519­ 522, 528-530, 532, 533, 535-538, 540, 542-551, 553, 557-559, 567, 570, 572-581 o 582.
Se dan a conocer además composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende la fórmula I, en la que la fórmula I es:
XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166)
en la que X es KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T, Q, o está ausente;
en la que X1 es FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, W, VT o VL, o está ausente;
en la que X2 es LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH, o está ausente;
en la que X3 es LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR; y
en la que X4 es ER, E, o está ausente.
Dicha fórmula I puede ser una de SEQ ID NO: 2-40, 46-52, 58-65, 67-71, 74-77, 80-83, 8 6 -8 8 , 92-96, 99-101, 166, 173, 178, 182, 268-325, 332-392-393, 396-415, 417-444, 446-468, 470-487, 489-494, 497-508, 510, 512, 514-517, 520-522, 524-525, 528-533, 535-536, 538-539, 542-544, 546, 548, 551, 553, 556-559, 561, 563-568, 571-573, 575­ 581 o 582, de manera que dicha fórmula I puede ser una de SEQ ID NO: 2 a 33.
Se dan a conocer composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende la fórmula II, en la que la fórmula II es XTFFVKLSX1X2 (SEQ ID NO: 173),
en la que X es KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD, D, o está ausente
en la que Xi es LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente; y
en la que X2 es ER o E, o está ausente, de manera que dicha fórmula II puede ser una de SEQ ID NO: 2-5, 19-38, 46-49, 58-61, 64, 68-70, 75, 81, 87, 93, 94, 100, 101, 173, 268-303, 350-393, 396, 398, 399, 400, 402, 403, 405, 406-408, 412-414, 417, 418, 421-423, 426-428, 430, 431, 435, 436, 438, 439, 440-442, 448-455, 458, 459, 461, 465, 467, 468, 471, 475, 476, 478-481, 483, 485, 487, 489-491, 493, 494, 497-499, 503, 507, 510, 512, 514-517, 520, 521, 524, 525, 528, 529, 531, 533, 538, 539, 542-, 544, 546, 551, 556-559, 561, 563-568, 571-573, 575-577, 579, 580 o 581. Otros ejemplos incluyen un péptido aislado, en el que X es KKLD (SEQ ID NO: 174) o en el que X2 es ER o en el que dicha fórmula es TFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 49) o TFFVKLSLFTE (SEQ ID NO: 250) o en el que dicha fórmula es KKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 2) o KKLDTFFVKLSLFTE (SEQ ID NO: 34).
Se dan a conocer composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende la fórmula III, en la que la fórmula III es:
XX1VKLX2LX3TEX4 (SEQ ID NO: 178)
en la que X es KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente;
en la que X1 es F, M, S, V, T o L, o está ausente;
en la que X2 es S, Q, M, T o H, o está ausente;
en la que X3 es F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R, o está ausente; y
en la que X4 es R o está ausente.
Dicha fórmula III puede ser una de SEQ ID NO: 2-13, 15-18, 22-30,34, 46-52, 58, 64, 65, 70, 71, 76, 77, 82, 83, 88, 93-96, 99, 100, 178, 268-325. Los ejemplos incluyen en la que X es KKLDTF (SEQ ID NO: 178) o en la que X4 es R o en la que dicha fórmula es VKLSLFTER (SEQ ID NO: 52) o VKLSLFTE (SEQ ID NO: 251) o en la que dicha fórmula es KKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 2) o KKLDTFFVKLSLFTE (SEQ ID NO: 34).
Otros ejemplos incluyen péptidos aislados que comprenden al menos una de SEQ ID NO: 1-101, 167-172, 174-177, 179-393, 396-581 y 582 o al menos una de SEQ ID NO: 1-32, 34, 64-66, 68, 76, 94-96, 98 y 264-393 o al menos una de las secuencias de la tabla 5.1.
Los péptidos aislados mencionados anteriormente pueden tener al menos un aminoácido que es un D aminoácido, aminoácido artificial o aminoácido modificado químicamente y/o comprenden un grupo acetilo N-terminal y/o comprenden un grupo amida C-terminal y/o están glicosilados o nitrosilados.
Los péptidos aislados mencionados anteriormente pueden unirse a al menos uno de polietilenglicol, un ácido graso o un modificador farmacocinético y/o comprenden un péptido cíclico.
Los péptidos aislados mencionados anteriormente pueden comprender al menos una modificación, por ejemplo, al menos uno de un D aminoácido y/o un grupo acetilo N-terminal y/o un grupo amida C-terminal y/o glicosilación y/o nitrosilación y/o carbonilación y/u oxidación y/o un modificador farmacocinético unido y/o un polietilenglicol unido o cualquier combinación de los mismos.
Los péptidos aislados mencionados anteriormente pueden tener menos de o igual a 1100 aminoácidos de longitud, tal como entre 7 aminoácidos y 20 aminoácidos de longitud.
Los péptidos aislados mencionados anteriormente pueden unirse a al menos uno de un soporte, un portador y/o una proteína de fusión.
Los péptidos aislados mencionados anteriormente pueden estar multimerizados.
Los péptidos mencionados anteriormente pueden comprender un marcador detectable unido al mismo, tal como un marcador biotinilado, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente o un marcador de oro coloidal y/o comprender un agente citotóxico unido al mismo, tal como uno radioquímico, o una toxina.
Los péptidos definidos anteriormente pueden tener menos de o igual a 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34 , 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos de longitud o cualquier longitud entre cualquiera de estos números.
Se da a conocer un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica para cualquiera de los péptidos dados a conocer anteriormente, tal como SEQ ID NO: 2, 62, 102-165, 583-586 o 589. La invención también se refiere a un vector que comprende los polinucleótidos aislados. Los péptidos codificados por el polinucleótido aislado que puede estar presente en un vector tienen menos de o igual a 1100 aminoácidos de longitud, tal como entre 7 aminoácidos y 20 aminoácidos de longitud.
Se da a conocer un complejo proteico que comprende cualquiera de los péptidos aislados mencionados anteriormente unidos a al menos uno de albúmina, un fragmento de albúmina, un soporte, un portador o una proteína de fusión. La invención también se refiere a un método de preparación del complejo proteico que comprende:
poner en contacto cualquiera de los péptidos definidos anteriormente con una muestra biológica obtenida de un sujeto humano, en la que dicha muestra biológica comprende albúmina o un fragmento de la misma; y detectar la presencia de dicho complejo proteico.
Dichos péptidos pueden estar por ejemplo unidos a un soporte.
Se da a conocer un método de detección de la presencia de una albúmina o un fragmento de albúmina en una muestra biológica que comprende:
poner en contacto cualquiera de los péptidos definidos anteriormente con una muestra biológica que comprende albúmina o un fragmento de la misma y detectar la unión de dicho péptido a dicha albúmina o dicho fragmento de albúmina.
Se da a conocer además un medio de unión específico para los péptidos definidos anteriormente, en el que el medio de unión es un anticuerpo, policlonal o monoclonal o fragmento de unión del mismo, tal como fragmentos funcionales tales como un anticuerpo de un solo dominio de manera que el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal y el fragmento de unión puede ser un fragmento de unión de anticuerpo monoclonal.
Se da a conocer un aptámero que es específico para un péptido que comprende al menos una de las secuencias de las tablas 1-4 (SEQ ID NO: 183-184, y 188-246), de manera que el aptámero es específico para el péptido de la secuencia VFDEFKPLVEEPQNLIK (SEQ ID NO: 185). El aptámero puede ser por ejemplo un aptámero peptídico o de ADN.
Se da a conocer un método de inhibición de la inmunosupresión en un paciente que lo necesita, comprendiendo dicho método:
identificar un paciente que tiene un estado asociado con inmunosupresión;
administrar al paciente cualquiera de los péptidos definidos anteriormente y
detectar un aumento en la diseminación de leucocitos en el paciente. El péptido puede tener menos de o igual a 50, 49,48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37 ,36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos de longitud o cualquier longitud entre cualquiera de estos números y el péptido puede ser sintético. La administración de dicho péptido puede comprender administrar una composición que consiste en al menos el 0,1% del péptido en peso, por ejemplo, al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 20% o el 30% del péptido en peso, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. Dicho paciente puede padecer cáncer, una infección viral o una infección bacteriana, de manera que dicho cáncer puede ser cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, de pulmón o de células hematopoyéticas. El método puede comprender además detectar un aumento en la migración de linfocitos.
Se da a conocer un método de inhibición de la unión de un fragmento de albúmina a un receptor, comprendiendo el método:
identificar un ser humano que padece inmunosupresión;
poner en contacto una célula inmunitaria con cualquiera de los péptidos definidos anteriormente; y
detectar un aumento en la proliferación de la célula inmunitaria tras el contacto con dicho péptido. La célula inmunitaria pude ser por ejemplo un linfocito o PBMC. El ser humano puede padecer cáncer, una infección viral o una infección bacteriana, de manera que dicho cáncer puede ser cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, de pulmón o de células hematopoyéticas. Se da a conocer un método de aumento de la citotoxicidad de células NK que comprende:
identificar un ser humano que padece inmunosupresión;
poner en contacto células NK con cualquiera de los péptidos definidos anteriormente; y
detectar un aumento en la citotoxicidad de dichas células NKtras el contacto con dicho péptido en comparación con una muestra de control, tal como la citotoxicidad de células NK en ausencia de dicho péptido o la citotoxicidad de células NK y un péptido no relacionado. El ser humano puede padecer cáncer, una infección viral o una infección bacteriana, de manera que dicho cáncer puede ser cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, de pulmón o de células hematopoyéticas.
Se da a conocer un método de aumento de la migración de linfocitos humanos que comprende:
identificar un ser humano que padece inmunosupresión;
poner en contacto linfocitos humanos con cualquiera de los péptidos definidos anteriormente; y
detectar un aumento en la migración de dichos linfocitos humanos tras el contacto con dicho péptido en comparación con una muestra de control, tal como la migración de linfocitos humanos en ausencia de dicho péptido o la migración de linfocitos humanos y un péptido no relacionado. El ser humano puede padecer cáncer, una infección viral o una infección bacteriana, de manera que dicho cáncer puede ser cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, de pulmón o de células hematopoyéticas. Se da a conocer un método de inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos que comprende:
poner en contacto linfocitos humanos con cualquiera de los péptidos definidos anteriormente en presencia de albúmina humana o un fragmento de albúmina humana; y
detectar una inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos en comparación con una muestra de control, tal como la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos en ausencia de dicho péptido o la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos en presencia de un péptido no relacionado. El fragmento de albúmina humana comprende una secuencia con al menos el 95% de identidad con SEQ ID NO: 185, de manera que el fragmento de albúmina humana comprende la secuencia de SEQ ID NO: 185.
Se da a conocer un método de inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos que comprende:
proporcionar linfocitos humanos, en el que al menos uno del receptor de LFA-1 y receptor de IL-2 se une a una albúmina humana de fragmento de albúmina;
unir específicamente una molécula a la albúmina humana o fragmento de albúmina; y
detectar una disminución de la inhibición de la estimulación de los linfocitos humanos por medio del receptor de LFA-1, receptor de IL-2. El fragmento de albúmina humana comprende una secuencia con al menos el 95% de identidad con SEQ ID NO: 185, de manera que el fragmento de albúmina humana comprende la secuencia de SEQ ID NO: 185.
Se da a conocer un método de unión de células cancerosas con un péptido que comprende:
poner en contacto células cancerosas con cualquiera de los péptidos definidos anteriormente; y
detectar la unión de dicho péptido a dichas células cancerosas. Dicho cáncer puede ser células de cáncer colorrectal, células de cáncer renal, células de cáncer de mama, células de cáncer de piel, células de cáncer de ovario, células de cáncer de próstata, células de cáncer pancreático, células de cáncer de pulmón, células de cáncer renal, células de melanoma maligno o células de cáncer hematopoyético. Dicho péptido puede comprender un marcador detectable unido al mismo, tal como un marcador biotinilado, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente o un marcador de oro coloidal y/o comprender un agente citotóxico unido al mismo, tal como un agente radioquímico o una toxina y/o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo o fragmento funcional del mismo.
Se da a conocer un método de inhibición de la proliferación de células cancerosas humanas que comprende: identificar un paciente con cáncer humano;
poner en contacto células inmunitarias del paciente con cáncer humano con cualquiera de los péptidos definidos anteriormente; y
detectar una inhibición de la proliferación de células cancerosas del paciente o una inducción de muerte celular de células cancerosas del paciente. Puede detectarse, por ejemplo, una inhibición de la proliferación de células cancerosas del paciente y/o puede detectarse, por ejemplo, una inducción de muerte celular de células cancerosas del paciente. El cáncer puede ser por ejemplo células de cáncer colorrectal, células de cáncer renal, células de cáncer de mama, células de cáncer de piel, células de cáncer de ovario, células de cáncer de próstata, células de cáncer pancreático, células de cáncer de pulmón, células de cáncer renal, células de melanoma maligno o células de cáncer hematopoyético. Por ejemplo, puede detectarse un aumento en la proliferación de células inmunitarias del ser humano. Las células inmunitarias pueden ser linfocitos o PBMC. El péptido usado en el método puede ser sintético.
Se da a conocer un método de eliminación de un ligando unido al receptor de LFA-1 de linfocitos humanos que comprende:
poner en contacto linfocitos humanos con cualquiera de los péptidos definidos anteriormente; y
detectar una unión reducida de un ligando para el receptor de LFA-1. Dichos linfocitos humanos pueden ser de un paciente con cáncer, una infección bacteriana o una infección viral tal como un paciente que padece cáncer de mama, carcinoma de células renales, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, de pulmón o de células hematopoyéticas.
Se da a conocer un método de eliminación de un ligando unido al receptor de IL-2 de linfocitos humanos que comprende:
poner en contacto linfocitos humanos con cualquiera de los péptidos definidos anteriormente; y
detectar una unión reducida de un ligando para el receptor de IL-2. Dichos linfocitos humanos pueden ser de un paciente con cáncer, una infección bacteriana o una infección viral tal como un paciente que padece cáncer de mama, carcinoma de células renales, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, de pulmón o de células hematopoyéticas.
Se da a conocer un método de reducción de la inmunosupresión en un ser humano que está inmunosuprimido que comprende:
proporcionar a un ser humano un péptido tal como se definió anteriormente; y
detectar una reducción de la inmunosupresión en dicho ser humano tal como detectando una activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia mediante un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia mediante la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia mediante la liberación de granzima B o perforina, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas. Dicho ser humano puede tener cáncer, una infección bacteriana o una infección viral, de manera que dicho cáncer es cáncer de mama, carcinoma de células renales, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, de pulmón o de células hematopoyéticas. Dicho péptido puede administrarse a dicho ser humano como una composición que consiste en al menos el 0,1% del péptido en peso, por ejemplo, al menos el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 20% o el 30% del péptido en peso, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas realizaciones, la detección en la inmunosupresión comprende detectar una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se da a conocer un método de inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos que comprende:
proporcionar a un ser humano el polinucleótido o vector tal como se definió anteriormente; y
detectar una inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos.
Se da a conocer un método de inhibición de la proliferación de células cancerosas humanas que comprende: proporcionar el polinucleótido o vector tal como se definió anteriormente a un humano que tiene células cancerosas; y
detectar una inhibición de la proliferación de dichas células cancerosas.
Se da a conocer un método de eliminación de un ligando unido al receptor de LFA-1 o receptor de IL-2 o ambos de linfocitos humanos que comprende:
poner en contacto linfocitos humanos con el polinucleótido o vector tal como se definió anteriormente; y detectar una unión reducida de un ligando para el receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos.
Se da a conocer un método de reducción de la inmunosupresión en un ser humano que está inmunosuprimido que comprende:
proporcionar el polinucleótido o vector tal como se definió anteriormente a dicho ser humano; y
detectar una reducción de la inmunosupresión en dicho ser humano tal como detectando una activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina. En algunos ejemplos, la detección de una reducción de la inmunosupresión comprende detectar una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende:
cualquiera de los péptidos definidos anteriormente; y
un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. El péptido comprende al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 62, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 583-586 o 589.
Un aspecto de la presente invención proporciona una composición que comprende: un péptido aislado tal como se define mediante las reivindicaciones, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Se da a conocer un método para identificar a un paciente que necesita tratamiento con un inhibidor de estructuras o péptidos inmunorreguladores, comprendiendo el método:
poner en contacto células inmunitarias del paciente in vitro con cualquiera de los péptidos definidos anteriormente; detectar una inhibición de la proliferación de dichas células inmunitarias;
clasificar al paciente como que es probable que responda al tratamiento con el inhibidor de estructuras o péptidos inmunorreguladores si dicho péptido inhibe la proliferación de dichas células inmunitarias. El método puede comprender además, por ejemplo, reducir la inmunosupresión en el paciente que lo necesita, en el que la reducción de la inmunosupresión comprende proporcionar al paciente que lo necesita un péptido tal como se definió anteriormente y/o comprende además detectar una reducción de la inmunosupresión en dicho ser humano y/o que comprende además reducir la inmunosupresión en el paciente que lo necesita, en el que la reducción de la inmunosupresión comprende proporcionar al paciente que lo necesita un vector o polinucleótido tal como se definió anteriormente y/o que comprende además detectar una reducción de la inmunosupresión en dicho ser humano. Se da a conocer un péptido aislado, en el que dicho péptido comprende un residuo de aminoácido homólogo al residuo de aminoácido K2 de SEQ ID NO: 2 y/o, en el que dicho péptido comprende un residuo de aminoácido homólogo al residuo de aminoácido K9 de SEQ ID NO: 2 y/o, en el que dicho péptido comprende un residuo de aminoácido homólogo al residuo de aminoácido E15 de SEQ ID NO: 2.
Los péptidos definidos anteriormente pueden comprender al menos una modificación, por ejemplo, al menos un aminoácido que no se produce de manera natural y/o comprender al menos un D aminoácido, un grupo acetilo N-terminal, un grupo amida C-terminal, glicosilación, nitrosilación, un modificador farmacocinético unido o un polietilenglicol unido. Cualquiera de los péptidos definidos anteriormente puede tener una longitud que es menor de o igual a 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37 ,36, 35, 34 , 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 aminoácidos de longitud o una longitud entre dos cualesquiera de estos números, tal como entre 6 aminoácidos y 20 aminoácidos de longitud, entre 7 aminoácidos y 20 aminoácidos de longitud preferiblemente entre 8-16 aminoácidos de longitud y lo más preferiblemente entre 9 y 15 aminoácidos de longitud. Cualquiera de los péptidos definidos anteriormente puede estar unido a un soporte, así como multimerizado.
Se da a conocer un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que codifica para cualquiera de los péptidos definidos anteriormente, así como vectores que comprenden el polinucleótido aislado, así como un complejo proteico que comprende albúmina o un fragmento de albúmina unido a cualquiera de los péptidos definidos anteriormente. El complejo proteico puede estar unido a un soporte.
Se da a conocer un péptido aislado que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166). En algunos ejemplos, este péptido aislado tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T, Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, W, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 puede ser uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 puede ser uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER, E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF, y X2 es LS. En algunos ejemplos, el péptido comprende una de SEQ ID NO: 2-33.
Se dan a conocer composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173). En algunos ejemplos, este péptido aislado tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113,114, 115, 116,117, 118, 119,120, 121,122, 123, 124,125, 126, 127,128, 129, 130,131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250,260, 270, 280,290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD, D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR, MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER, E, o está ausente.
Se dan a conocer composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, este péptido aislado tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102,103, 104, 105,106, 107, 108,109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250,260, 270, 280,290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SeQ ID NO: 181), DTF, TF, F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T, L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R, o está ausente.
Se dan a conocer composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394). En algunos ejemplos, este péptido aislado tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124,125, 126, 127,128, 129, 130,131, 132,133, 134, 135,136, 137, 138,139, 140, 150,160, 170, 180, 190, 200,210, 220, 230,240, 250,260, 270, 280,290, 300, 320, 340, 360, 380,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P, R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente.
Se dan a conocer composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ Id NO: 395). En algunos ejemplos, este péptido aislado tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFW, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente.
Se dan a conocer composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1. En algunos ejemplos, este péptido aislado tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a
4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 3 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 60, 61, 6 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 91, 92, 9 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116,
122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139,
190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450,
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750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Se dan a conocer composiciones que comprenden un polinucleótido aislado que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en polinucleótidos aislados que codifican para un inhibidor de péptido (por ejemplo, uno cualquiera o más de los péptidos descritos anteriormente) de una estructura o péptido inmunorregulador derivado de albúmina, tal como se describe en el presente documento. Algunos ejemplos incluyen vectores que incluyen tales polinucleótidos aislados. Algunos ejemplos incluyen también complejos proteicos, que comprenden una albúmina o fragmento de albúmina unido a un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento.
En las composiciones de la invención se comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en: Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPbS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazol-láctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.
Se dan a conocer métodos de preparación de los complejos proteicos tal como se describe en el presente documento. Los métodos pueden incluir poner en contacto un péptido tal como se describe en el presente documento con una muestra biológica de un ser humano. En algunos ejemplos, la muestra biológica incluye una albúmina o un fragmento de albúmina. Los métodos pueden incluir detectar la presencia del complejo proteico.
Se dan a conocer métodos de detección de la presencia de una albúmina o un fragmento de albúmina en una muestra biológica. Los métodos pueden incluir poner en contacto un inhibidor de péptido (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento) con una muestra biológica que incluye una albúmina o un fragmento de albúmina. Los métodos pueden incluir detectar la unión de la albúmina o fragmento de albúmina al inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento.
Algunos ejemplos incluyen anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos que son específicos para una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento.
Algunos ejemplos dados a conocer en el presente documento incluyen aptámeros que son específicos para y se unen a un péptido que tiene la secuencia VFDEFKPLVEEPQNLIK (SEQ ID NO: 185) o un fragmento de la misma.
Algunos ejemplos dados a conocer en el presente documento incluyen aptámeros que son específicos para y se unen a cualquiera de los péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera de los péptidos descritos en las tablas proporcionadas en el presente documento). En algunos ejemplos, los aptámeros son aptámeros oligonucleotídicos. En algunos ejemplos, los aptámeros son aptámeros peptídicos.
Se dan a conocer en el presente documento métodos para abordar a un paciente que padece inmunosupresión, tal como inmunosupresión resultante de cáncer, o infección por infecciones patógenas, virales o bacterianas, duraderas o crónicas, por ejemplo, debido a resistencia a antibióticos. Tales enfoques incluyen métodos de tratamiento de la inmunosupresión o de inhibición de un aspecto de o marcador para la inmunosupresión, tal como una proliferación de células inmunitarias reducida, citotoxicidad de células NK reducida o migración de leucocitos reducida o métodos de tratamiento de una enfermedad viral o bacteriana (por ejemplo, métodos de tratamiento o de inhibición de una infección viral crónica tal como hepatitis o una infección bacteriana tal como la provocada por Staphilococcus, Streptococcus, Psuedomonas, u otras bacterias patógenas. Los métodos pueden incluir identificar a un paciente que tiene un estado asociado con inmunosupresión tal como cáncer o una infección bacteriana o viral o una infección bacteriana o viral duradera o crónica. Los métodos pueden incluir administrar al paciente identificado uno o más de los inhibidores de péptidos (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina), tal como se describe en el presente documento y, opcionalmente, detectar la activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas. Los métodos pueden incluir también detectar un aumento en la diseminación de leucocitos en el paciente. Algunos de estos métodos pueden incluir, por ejemplo, composiciones que comprenden un péptido aislado que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1 o 5.4, o un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 2, 62, 584 o 589. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1 o 5.4 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210,220, 230, 240,250, 260,270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400,450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Se dan a conocer métodos de inhibición de la unión de un fragmento de albúmina a un receptor. Los métodos pueden incluir identificar a un ser humano que tiene inmunosupresión. Los métodos pueden incluir poner en contacto una célula inmunitaria con un péptido (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina), tal como se describe en el presente documento. Puede estar presente suero del ser humano cuando se pone en contacto la célula inmunitaria con el inhibidor. Los métodos pueden incluir detectar un aumento en la proliferación de la célula inmunitaria o activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina tras el contacto con el inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, los métodos comprenden detectar una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se dan a conocer métodos de aumento de la citotoxicidad de linfocitos o células NK en presencia de suero humano autólogo. Los métodos pueden incluir identificar un ser humano que tiene inmunosupresión. Los métodos pueden incluir poner en contacto células NK con un péptido tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina) en presencia de suero del ser humano. Los métodos pueden incluir detectar un aumento en la citotoxicidad de dichas células NK tras el contacto con el inhibidor, en comparación con una muestra de control. Las muestras de control pueden incluir la citotoxicidad de células NK en presencia de suero humano autólogo en ausencia de dicho inhibidor o la citotoxicidad de células NK en presencia de suero humano autólogo y un péptido no relacionado.
Se dan a conocer métodos de aumento de las funciones de linfocitos humanos, tales como migración en presencia de suero humano autólogo o activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas. Los métodos pueden incluir identificar un ser humano que padece inmunosupresión. Los métodos pueden incluir poner en contacto linfocitos humanos con un péptido tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina) en presencia de suero del ser humano. Los métodos pueden incluir detectar un aumento en la migración de dichos linfocitos humanos o activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas tras el contacto con el inhibidor, en comparación con una muestra de control. Las muestras de control pueden incluir la migración de linfocitos humanos en presencia de suero humano autólogo en ausencia del inhibidor o la migración de linfocitos humanos en presencia de suero humano autólogo y un péptido no relacionado. En algunos ejemplos, los métodos comprenden detectar potenciación de la citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular.
Se dan a conocer métodos de inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana a receptores celulares, tales como el receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos, en linfocitos humanos. Los métodos pueden incluir poner en contacto linfocitos humanos con un péptido tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina) en presencia de albúmina humana o un fragmento de albúmina humana. Los métodos pueden incluir detectar una inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos, en comparación con una muestra de control. Las muestras de control pueden incluir la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos en ausencia de dicho inhibidor o la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos en presencia de un péptido no relacionado.
Se dan a conocer métodos de inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos. Los métodos pueden incluir proporcionar linfocitos humanos. En algunos ejemplos, al menos uno del receptor de LFA-1 o receptor de IL-2 se une a una albúmina humana o fragmento de albúmina. Los métodos pueden incluir unir específicamente un inhibidor (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento) a la albúmina humana o fragmento de albúmina. Los métodos pueden incluir detectar una disminución de la inhibición de la estimulación de los linfocitos humanos por medio del receptor de LFA-1, receptor de IL-2 o activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina. En algunos ejemplos, los métodos detectan citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se dan a conocer métodos de unión de células cancerosas con una molécula que interacciona específicamente con dichas células cancerosas (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento). Los métodos pueden incluir poner en contacto células cancerosas con uno o más de los inhibidores, tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, el método comprende un método ex vivo o in vitro. En algunos ejemplos, el método comprende un método in vivo. En algunos ejemplos, el inhibidor se administra por vía peritumoral, o cerca de un tumor de un paciente, por ejemplo, dentro de 10 cm, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 cm del tumor. En algunos ejemplos, el inhibidor se administra por vía sistémica. En algunos ejemplos, el inhibidor se administra conjuntamente con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, un agente terapéutico seleccionado para estimular una célula inmunitaria después de que se haya desbloqueado un receptor de LFA-1 de la célula inmunitaria, o un agente terapéutico seleccionado para estimular una célula inmunitaria después de que se haya desbloqueado un receptor de IL-2 de la célula inmunitaria. Los métodos pueden incluir detectar la unión de dicho inhibidor a dichas células cancerosas.
Se dan a conocer métodos de inhibición de la proliferación de células cancerosas humanas. Los métodos pueden incluir identificar a un paciente con cáncer humano. Los métodos pueden incluir poner en contacto células inmunitarias del paciente con cáncer humano con un inhibidor (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento). En algunos ejemplos, el inhibidor se administra por vía peritumoral, o cerca de un tumor del paciente, por ejemplo, dentro de 10 cm, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 cm del tumor. En algunos ejemplos, el inhibidor se administra por vía sistémica. En algunos ejemplos, el inhibidor se administra conjuntamente con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, un agente terapéutico seleccionado para estimular una célula inmunitaria después de haberse desbloqueado un receptor de LFA-1 de la célula inmunitaria. Los métodos pueden incluir detectar una inhibición de la proliferación de células cancerosas del paciente o una inducción de la apoptosis o muerte celular de células cancerosas del paciente. Opcionalmente, el método puede incluir coadministrar al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente terapéutico que estimula la activación de células inmunitarias (por ejemplo, expresión potenciada de CD69 y/o CD71, secreción de IL-12 de IFNy, o secreción de perforina o granzima B, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas) directa o indirectamente a través del receptor de LFA-1. En algunos ejemplos, el agente terapéutico adicional estimula una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se dan a conocer métodos de eliminación de un ligando unido al receptor de LFA-1 de linfocitos humanos. Los métodos pueden incluir poner en contacto linfocitos humanos con un inhibidor (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento). Los métodos pueden incluir detectar una unión reducida de un ligando para el receptor de LFA-1.
Se dan a conocer métodos de eliminación de un ligando unido al receptor de IL-2 de linfocitos humanos. Los métodos pueden incluir poner en contacto linfocitos humanos con un inhibidor (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento). Los métodos pueden incluir detectar una unión reducida de un ligando para el receptor de IL-2 o detectar la activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina. En algunos ejemplos, los métodos comprenden detectar una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se dan a conocer métodos de reducción de la inmunosupresión en un ser humano que está inmunosuprimido. Los métodos pueden incluir proporcionar a un ser humano un inhibidor, tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un inhibidor de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina). Los métodos pueden incluir detectar una reducción de la inmunosupresión en el ser humano o detectar la activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina. En algunos ejemplos, los métodos comprenden detectar una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se dan a conocer métodos de inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos en linfocitos humanos. Los métodos pueden incluir proporcionar a un ser humano uno o más de los polinucleótidos y/o vectores tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un polinucleótido o vector que tiene una secuencia que codifica para uno o más de los inhibidores de las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina). Los métodos pueden incluir detectar una inhibición de la unión de una albúmina humana o un fragmento de albúmina humana al receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos o detectar la activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina. Opcionalmente, el método puede incluir detectar uno o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas. Opcionalmente, el método puede incluir coadministrar al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente terapéutico que estimula la activación de células inmunitarias (por ejemplo, expresión de CD69 y/o CD71 potenciada, secreción de IL-12 de IFNy, secreción de perforina o granzima B, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas) directa o indirectamente a través del receptor de LFA-1. El agente terapéutico adicional puede administrarse simultáneamente con, o después del inhibidor. En algunos ejemplos, el segundo agente terapéutico estimula una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se dan a conocer métodos de inhibición de la proliferación de células cancerosas humanas. Los métodos pueden incluir proporcionar a un ser humano que tiene cáncer uno o más de los polinucleótidos o vectores tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un polinucleótido o vector que tiene una secuencia que codifica para uno o más de los inhibidores de las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina). En algunos ejemplos, el inhibidor se administra por vía peritumoral, o cerca de un tumor del paciente, por ejemplo, dentro de 10 cm, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 cm del tumor. En algunos ejemplos, el inhibidor se administra por vía sistémica. En algunos ejemplos, el inhibidor se administra conjuntamente con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, un agente terapéutico seleccionado para estimular una célula inmunitaria después de haberse desbloqueado un receptor de LFA-1 de la célula inmunitaria. Los métodos pueden incluir detectar una inhibición de la proliferación de dichas células cancerosas o detectar la activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina, citotoxicidad potenciada, producción de citocinas, migración celular o proliferación celular. En algunos ejemplos, los métodos comprenden detectar una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se dan a conocer métodos de inducción de la infiltración de un cáncer por células inmunitarias. Los métodos pueden incluir administrar un inhibidor de péptido tal como se describe en el presente documento por vía peritumoral, o cerca de un tumor de un paciente, por ejemplo, dentro de 10 cm, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 cm del tumor. Los métodos pueden incluir detectar una infiltración del cáncer por las células inmunitarias.
Se dan a conocer métodos de eliminación de un ligando unido al receptor de LFA-1 o receptor de IL-2 o ambos de linfocitos humanos. Los métodos pueden incluir proporcionar a un ser humano uno o más de los polinucleótidos o vectores tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un polinucleótido o vector que tiene una secuencia que codifica para uno o más de los inhibidores de las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina). Los métodos pueden incluir detectar una unión reducida de un ligando para el receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 o ambos.
Se dan a conocer métodos de reducción de la inmunosupresión en un ser humano que está inmunosuprimido. Los métodos pueden incluir proporcionar a un ser humano uno o más de los polinucleótidos o vectores tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un polinucleótido o vector que tiene una secuencia que codifica para uno o más de los inhibidores de las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina). Los métodos pueden incluir detectar una reducción de la inmunosupresión en el ser humano tal como detectar la activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas. En algunos ejemplos, los métodos comprenden detectar una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
Se dan a conocer composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir uno o más de los polinucleótidos o vectores tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un polinucleótido o vector que tiene una secuencia que codifica para uno o más de los inhibidores de las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina) y/o uno o más de los inhibidores descritos en el presente documento (por ejemplo, un inhibidor de péptido de una o más estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, tal como se describe en el presente documento). Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Un aspecto de la presente invención proporciona una composición que comprende: un péptido aislado tal como se define mediante las reivindicaciones, y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en: Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPs O, MOBS, Tris, Hepes, h Ep BS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, a MpD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazol-láctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.
Se dan a conocer métodos para identificar a un paciente que necesita la inhibición de péptidos inmunorreguladores. El paciente puede tener estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina unidos a sus células inmunitarias, y/o puede ser probable que responda al tratamiento con un inhibidor de las estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina. El método de diagnóstico puede incluir poner en contacto células inmunitarias del paciente in vitro con al menos un inhibidor de estructuras o péptidos inmunorreguladores. El método de diagnóstico puede incluir clasificar al paciente como que tiene estructuras o péptidos inmunorreguladores, y/o como que es probable que responda al tratamiento con un inhibidor de estructuras o péptidos inmunorreguladores cuando el bloqueo de las estructuras o péptidos inmunorreguladores aumenta la restauración de parámetros inmunitarios o mejora la respuesta inmunitaria, por ejemplo, proliferación o respuesta por las PBMC de dicho sujeto. El método puede incluir determinar qué inhibidor o inhibidores de péptidos inmunorreguladores tienen actividad inmunomoduladora en el paciente.
Un aspecto de la presente invención proporciona un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos FFVKLS (SEQ ID NO: 62) que comprende no más de 30 aminoácidos, en la que, si el péptido aislado se pone en contacto con un segundo péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos VFDEFKPLVEEPQNLIK (SEQ ID NO: 185), el péptido aislado se une específicamente al segundo péptido. En algunas realizaciones, el péptido aislado comprende no más de 29 residuos de aminoácido, por ejemplo, no más de 28 residuos de aminoácidos, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6 residuos de aminoácido o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos números. En algunas realizaciones, el péptido aislado comprende no más de 16 residuos de aminoácido. En algunas realizaciones, el péptido aislado comprende no más de 8 residuos de aminoácido. En algunas realizaciones, el péptido aislado consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos FFVKLS (SEQ ID NO: 62).
En algunas realizaciones de la invención, el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos KKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, el péptido aislado comprende no más de 100 residuos de aminoácido, por ejemplo, no más de 20 residuos de aminoácido. En algunas realizaciones, el péptido aislado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
Algunas realizaciones de la invención incluyen un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos RKLDTFFVKLSLFTERRR (SEQ ID NO: 586). En algunas realizaciones, el péptido aislado comprende no más de 20 residuos de aminoácido En algunas realizaciones, el péptido aislado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 586.
Se da a conocer un péptido aislado que comprende la fórmula X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17; en la que X1 es cualquier aminoácido o está ausente; X2 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X3 es cualquier aminoácido; X4 es cualquier aminoácido; X5 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X6 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X7 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; Xa es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X9 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X10 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X11 es un aminoácido polar no cargado o H; X12 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X13 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X14 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X15 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X16 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X17 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente X1 comprende un aminoácido cargado positivamente. En algunos ejemplos, X1 es R o K. En algunos ejemplos, X17 es RR. En algunos ejemplos, X1 es R y X17 es RR. En algunos ejemplos, X1 comprende R, y X17 comprende RR. En algunos ejemplos, el péptido es soluble en una disolución acuosa. En algunos ejemplos, el péptido es soluble en una disolución acuosa. En algunos ejemplos, al menos uno de: X1 es K; X2 es K; X3 es L; X4 es D; X5 es T; X6 es F; X7 es F; X8 es V; X9 es K; X10 es L; X11 es S; X12 es L; X13 es F; X14 es T; X15 es E; o X16 es R. En algunas realizaciones, el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos KKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 2) o el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos RKLDTFFVKLSLFTERRR (SEQ ID NO: 586), en la que el péptido aislado tiene una longitud de 30 residuos de aminoácido o menos, por ejemplo no más de aproximadamente 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6 residuos de aminoácido o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos números. En algunos ejemplos, el péptido aislado consiste en la fórmula X0X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17. En algunas realizaciones, el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos KKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos RKLDTFFVKLSLFTERRR (SEQ ID NO: 586).
En algunas realizaciones, los péptidos aislados de la invención comprenden un péptido sintético.
En algunas realizaciones, los péptidos aislados de la invención comprenden al menos una modificación, por ejemplo, al menos uno de un D aminoácido, un grupo acetilo N-terminal, un grupo amida C-terminal, glicosilación, nitrosilación, carbonilación, oxidación, un modificador farmacocinético unido y un polietilenglicol unido o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, el péptido aislado de la invención activa una célula inmunitaria. A modo de ejemplo, la activación de una célula inmunitaria puede incluir la proliferación de la célula inmunitaria, el aumento de la expresión de CD69 o CD71, la secreción de una sustancia señal tal como IFNy de IL-12, la secreción de una molécula citolítica tal como perforina o granzima B, citotoxicidad, producción de citocinas y/o migración celular potenciadas.
En algunas realizaciones, el péptido aislado de la invención activa una célula inmunitaria, si una disolución que comprende la célula inmunitaria comprende un segundo péptido que tiene la secuencia VFDEFKPLVEEPQNLIK (SEQ ID NO: 185), o si un receptor de LFA-1 de la célula inmunitaria se une al segundo péptido.
Si cualquiera de los péptidos aislados de la presente invención se pone en contacto con un segundo péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos VFDEFKPLVEEPQNLIK (SEQ ID NO: 185), el péptido aislado se une específicamente al segundo péptido.
En algunas realizaciones, si cualquiera de los péptidos aislados anteriores se pone en contacto con una célula inmunitaria que comprende un receptor de LFA-1 y un segundo péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos VFDEFKPLVEEPQNLIK (SEQ ID NO: 185), el péptido aislado inhibe la unión del segundo péptido al receptor de LFA-1.
Algunas realizaciones de la invención incluyen una composición que comprende el péptido aislado de la presente invención y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el portador o diluyente farmacéuticamente aceptable comprende una partícula degradable. En algunas realizaciones, la composición comprende una cantidad del péptido que es de al menos aproximadamente 1 ng del péptido, por ejemplo al menos aproximadamente 1 ng, 2 ng, 3 ng, 4 ng, 5 ng, 10 ng, 20 ng, 50 ng, 60 ng, 70 ng, 80 ng, 90 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng, aproximadamente 1 |ig, 2 |ig, 3 |ig, 4 |ig, 5 |ig, 6 |ig, 7 |ig, 8 |ig, 9 |ig, 10 |ig, 20 |ig, 30 |ig, 40 |ig, 50 |ig, 60 |ig, 70 |ig, 80 |ig, 90 |ig, 100 |ig o 200 |ig o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos números. En algunas realizaciones, la composición comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en: Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazol-láctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES. En algunas realizaciones, si se pone en contacto con una célula cancerosa, la composición induce citotoxicidad de la célula cancerosa. En algunas realizaciones, la célula cancerosa comprende una célula de cáncer de próstata. En algunas realizaciones, la composición comprende un gel. En algunas realizaciones, la composición permanecerá en un formato de gel durante al menos 72 horas en condiciones fisiológicas.
Se da a conocer un método que comprende administrar a un individuo que tiene un cáncer, y que necesita tratamiento para el mismo, una cantidad eficaz de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente, induciendo de ese modo al menos una de las siguientes: (a) activación de una célula inmunitaria (por ejemplo expresión potenciada de CD69 y/o CD71, secreción de IL-12 de IFNy, o secreción de perforina o granzima B, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas); (b) inhibición de la unión de una albúmina dañada, un agregado de albúminas, un fragmento de albúmina o un segundo péptido a un receptor de LFA-1 o receptor de IL-2, en el que el segundo péptido o fragmento de albúmina, si está presente, comprende al menos una de SEQ ID NO: 183-246; o (c) citotoxicidad para la célula tumoral. En algunos ejemplos, se inducen (a) y (b). En algunos ejemplos, se inducen (a), (b) y (c). En algunos ejemplos, el receptor comprende un receptor de LFA-1. En algunos ejemplos, el receptor comprende un receptor de IL-2. En algunos ejemplos, el fragmento de albúmina o segundo péptido comprende no más de 100 residuos de aminoácido. En algunos ejemplos, el fragmento de albúmina o segundo péptido comprende SEQ ID NO: 185. En algunos ejemplos, el fragmento de albúmina o segundo péptido consiste en SEQ ID NO: 185. En algunos ejemplos, el receptor de LFA-1 está disponible para su estimulación tras la inhibición de la unión de la albúmina, fragmento de albúmina o segundo péptido. En algunos ejemplos, la célula inmunitaria se estimula tras la inhibición de la unión de la albúmina, fragmento de albúmina o segundo péptido. En algunos ejemplos, la célula inmunitaria se estimula mediante un segundo agente terapéutico. En algunos ejemplos, el segundo agente terapéutico se administra simultáneamente con la composición. En algunos ejemplos, la composición comprende el segundo agente terapéutico. En algunos ejemplos, el segundo agente terapéutico se administra antes de administrar la composición. En algunos ejemplos, el segundo agente terapéutico se administra posteriormente a administrar la composición. En algunos ejemplos, el péptido de la composición se administra al individuo a una dosis de al menos aproximadamente 0,1 mg/kg, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,9 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, de 10 mg/kg o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos valores. En algunos ejemplos, el péptido de la composición se administra en al menos una primera administración y una segunda administración al menos cinco días después de la primera administración. En algunos ejemplos, el péptido se administra a un tejido dentro de aproximadamente 10 cm de un tumor del cáncer. En algunos ejemplos, el péptido se administra por vía peritumoral a un tumor del cáncer. En algunos ejemplos, el cáncer comprende al menos uno de cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, melanoma maligno, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (adenocarcinoma), carcinoma de células escamosas, cáncer de vejiga, osteosarcoma, cáncer bronquial o cáncer de células hematopoyéticas. En algunos ejemplos, el individuo comprende suero que comprende una albúmina dañada, un agregado de albúminas, un fragmento de albúmina o un segundo péptido, en el que el fragmento de albúmina o segundo péptido comprende al menos una de SEQ ID NO: 183-246. En algunos ejemplos, el segundo péptido o fragmento de albúmina comprende la secuencia de aminoácidos VFDEFKPLVEEPQNLIK (SEQ ID NO: 185). En algunos ejemplos, el segundo péptido o fragmento de albúmina comprende no más de 100 residuos de aminoácido.
Se da a conocer un método de activación de una célula inmunitaria (por ejemplo expresión potenciada de CD69 y/o CD71, secreción de IL-12 de IFNy o secreción de perforina o granzima B, citotoxicidad, producción de citocinas y/o migración celular potenciadas) en un paciente con cáncer, comprendiendo el método poner en contacto la célula inmunitaria con un péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos FFVKLS (SEQ ID NO: 62), en el que el péptido consiste en de aproximadamente seis a treinta aminoácidos. En algunos ejemplos, poner en contacto la célula inmunitaria con el péptido aislado inhibe la unión de una albúmina dañada, un agregado de albúminas, un fragmento de albúmina o un segundo péptido a un receptor de LFA-1, en el que el fragmento de albúmina o segundo péptido comprende al menos una de SEQ ID NO: 183-246. En algunos ejemplos, el fragmento de albúmina o segundo péptido comprende no más de 100 aminoácidos. En algunos ejemplos, el fragmento de albúmina o segundo péptido comprende SEQ ID NO: 185. En algunos ejemplos, el fragmento de albúmina o segundo péptido consiste en SEQ ID NO: 185. En algunos ejemplos, el receptor de LFA-1 está disponible para su estimulación tras la inhibición de la unión de la albúmina, fragmento de albúmina o segundo péptido. En algunos ejemplos, la célula inmunitaria se estimula tras la inhibición de la unión de la albúmina, fragmento de albúmina o segundo péptido. En algunos ejemplos, la célula inmunitaria se estimula mediante un segundo agente terapéutico. En algunos ejemplos, el segundo agente terapéutico se administra simultáneamente con la composición. En algunos ejemplos, la composición comprende el segundo agente terapéutico. En algunos ejemplos, el segundo agente terapéutico se administra antes de la administración de la composición. En algunos ejemplos, el segundo agente terapéutico se administra posteriormente a la administración de la composición.
Se da a conocer un método de unión de células cancerosas con un péptido. El método puede comprender poner en contacto una célula cancerosa con cualquiera de los péptidos descritos anteriormente, y detectar la unión de dicho péptido a dicha célula cancerosa. En algunas realizaciones, el péptido comprende un resto detectable. En algunos ejemplos, el resto detectable comprende un marcador biotinilado, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, una enzima o un marcador de oro coloidal. En algunos ejemplos, la célula cancerosa es una célula de cáncer colorrectal, una célula de cáncer renal, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de piel, una célula de cáncer de ovario, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer pancreático, una célula de cáncer de pulmón, una célula de melanoma maligno, una célula de cáncer de pulmón de células pequeñas, una célula de cáncer de pulmón de células no pequeñas (adenocarcinoma), una célula de carcinoma de células escamosas, una célula de cáncer de vejiga, una célula de osteosarcoma, una célula de cáncer bronquial o una célula de cáncer de células hematopoyéticas. En algunos ejemplos, dicho péptido comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
Se da a conocer un método de mejora de la inmunosupresión en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 29-36, induciendo de ese modo al menos una de las siguientes: (a)
activación de una célula inmunitaria (por ejemplo expresión potenciada de CD69 y/o CD71, secreción de IL-12 de IFNy o secreción de perforina o granzima B, citotoxicidad, producción de citocinas y/o migración celular potenciadas); o (b) inhibición de la unión de una albúmina dañada, un agregado de albúminas, un fragmento de albúmina o un segundo péptido a un receptor de LFA-1, en el que el segundo péptido o fragmento de albúmina, si está presente, comprende al menos una de SEQ ID NO: 183-246. En algunos ejemplos, el fragmento de albúmina o segundo péptido comprende no más de 100 residuos de aminoácido. En algunos ejemplos, el fragmento de albúmina o segundo péptido comprende SEQ ID NO: 185. En algunos ejemplos, el fragmento de albúmina o segundo péptido consiste en SEQ ID NO: 185. En algunos ejemplos, el receptor de LFA-1 está disponible para su estimulación tras la inhibición de la unión de la albúmina, fragmento de albúmina o segundo péptido.
Se da a conocer un kit que comprende el péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15; y un marcador detectable. En algunos ejemplos, el marcador comprende un marcador biotinilado, un marcador radiactivo, un marcador fluorescente, una enzima o un marcador de oro coloidal.
Se da a conocer un ácido nucleico aislado que codifica para cualquiera de los péptidos aislados descritos anteriormente. Algunos ejemplos incluyen un vector aislado que comprende este ácido nucleico.
Se da a conocer el uso de cualquiera de los péptidos aislados descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.
Se da a conocer el uso de cualquiera de los péptidos aislados descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para estimular una célula inmunitaria en un paciente con cáncer.
Un aspecto de la invención proporciona el péptido aislado tal como se define mediante las reivindicaciones, o la composición tal como se define mediante las reivindicaciones para su uso como medicamento. Algunas realizaciones de la invención incluyen la composición de la invención para su uso en el tratamiento de cáncer.
Se dan a conocer adicionalmente las composiciones descritas anteriormente para la preparación de un medicamento para estimular una célula inmunitaria en un paciente con cáncer.
Una realización de la invención proporciona el péptido aislado tal como se define mediante las reivindicaciones, o la composición tal como se define mediante las reivindicaciones para su uso en el tratamiento de cáncer. En una realización adicional, el cáncer comprende al menos uno de cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, melanoma maligno, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (adenocarcinoma), carcinoma de células escamosas, cáncer de vejiga, osteosarcoma, cáncer bronquial o cáncer de células hematopoyéticas.
Se da a conocer en el presente documento el uso de cualquiera de los péptidos aislados descritos anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de inmunosupresión.
Una realización de la invención proporciona el péptido aislado tal como se define mediante las reivindicaciones, o la composición tal como se define mediante las reivindicaciones para su uso en la mejora de la inmunosupresión. Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra la tinción inmunohistoquímica de una metástasis de melanoma maligno usando anticuerpos de conejo purificados por afinidad dirigidos al epítopo P3028.
La figura 2 ilustra la inmunotransferencia de tipo Western realizada sobre extractos tumorales usando anticuerpos dirigidos contra la estructura de 3028.
La figura 3 ilustra el ELISA de tipo sándwich que detecta albúmina que expone el epítopo P3028 en suero; competición con el péptido P3028.
La figura 4 ilustra la proliferación inducida por IL-2 de PBMC de muestras de control sanas y células inmunitarias humanas (PBMC) de pacientes con carcinoma de células renales (RCC) cultivadas en sueros autólogos al 10%. La figura 5 ilustra un análisis de Kaplan Meyer de pacientes con carcinoma de células renales según la respuesta proliferativa a IL-2.
La figura 6 ilustra el análisis del efecto de cuatro péptidos diferentes sobre la proliferación inducida por IL-2 de PBMC de muestras de control sanas.
La figura 7 ilustra la inhibición de la respuesta proliferativa a IL-2 por P3028 en el modelo ex vivo humano usando PBMC de pacientes con cáncer.
La figura 8 ilustra el efecto de P3028 sobre la proliferación de linfocitos estimulada por TCR de PBMC de cuatro personas sanas.
Las figuras 9A-9B ilustran el efecto de péptidos de albúmina sobre la citotoxicidad de células NK. La figura 9A representa los efectos de K5 y K6. La figura 9B representa los efectos de K12 y K13.
La figura 10 ilustra el efecto de P3028 sobre la diseminación en leucocitos de sangre periférica.
La figura 11 ilustra el efecto de P3028 sobre la migración de PBMC estudiada usando la técnica de cámara de Boyden.
La figura 12 ilustra el efecto de las partes C-(3218) y N-terminal (3325) de P3028 sobre la proliferación inducida por IL-2 en comparación con el efecto del P3028 de longitud completa.
La figura 13 ilustra que el efecto inhibidor de P3028 sobre la proliferación inducida por IL-2 no se neutraliza mediante las partes C-(3218) y N-terminal (3325) de P3028 solo o en combinación.
La figura 14 ilustra la inhibición de la unión del anticuerpo anti-LFA-1 a CD11a mediante incubación de PBMC normales con sueros de pacientes.
La figura 15 ilustra la inhibición de la unión de un AcM anti-LFA-1 a células sanguíneas mononucleares mediante P3028.
La figura 16 ilustra la tinción de LFA-1 sobre PBMC de una muestra de control sana (A) y un paciente con cáncer antes (B) y después (C) del tratamiento con un anticuerpo dirigido contra el P3028 inhibidor.
La figura 17 ilustra que la tinción de células sanguíneas mononucleares mediante un anticuerpo anti-LFA-1 (A) se bloquea mediante P3028 (B) o suero de pacientes con cáncer (C).
Las figuras 18A y 18B ilustran un análisis de ELISA que muestra la unión de IL-2 biotinilada a rhuIL-2R. La figura 18B es una imagen de contraste potenciado de la figura 18A, para representar los datos de unión de IL-2 no biotinilada (triángulos).
La figura 19 ilustra la cadena a del receptor de IL-2 (CD25) que se une a P3028 (A) en el sitio de unión de IL-2 (B). La figura 20 ilustra que antisueros de conejos inmunizados con P3028 se unen a P3028.
La figura 21 ilustra la inhibición de la unión del suero de conejo anti-3028 L a pocillos recubiertos con el P3028 en un ELISA mediante péptidos de albúmina
La figura 22 ilustra el efecto de anticuerpos purificados por afinidad dirigidos contra P3028 sobre la respuesta proliferativa a IL-2 de PBMC de pacientes con cáncer inmunosuprimidos y muestras de control normales.
La figura 23 ilustra la identificación de inhibidores de P3028 en disolución. Basándose en análisis previos, se sintetizaron posibles agentes de unión de P3028 sobre un chip. La figura 23A ilustra los resultados para los ensayos 1-14. La figura 23B ilustra los resultados para los ensayos 15-28. Las figuras 23A y 23B representan los lados izquierdo y derecho, respectivamente, de un único gráfico que se amplió para mostrar el texto más claramente. El eje Y se ha reproducido en la figura 23B para referencia.
La figura 24 ilustra la actividad estimuladora de P28R sobre la respuesta proliferativa suprimida a IL-2. Las figuras 24A, 24B, 24C y 24D ilustran respectivamente la actividad estimuladora para cuatro pacientes con cáncer diferentes. La figura 25 ilustra la unión de P28R biotinilado a un tumor de cáncer de mama recién congelado.
La figura 26 ilustra tejido de cáncer de mama incubado con tampón (figura 26A) o P28R (figura 26B) teñido mediante un anticuerpo dirigido contra LFA-1.
La figura 27 ilustra puntuaciones de rampo para la unión de P3028 a péptidos que tienen sustituciones de un solo aminoácido de cada posición de P28R.
La figura 28 ilustra sustituciones de un solo aminoácido del péptido P28R que tienen puntuaciones de rampo mayores de 500.
La figura 29 ilustra puntuaciones de rampo para la unión de P3028 a P28R y truncamientos N-terminales y/o C-terminales del péptido P28R.
La figura 30 ilustra puntuaciones de rampo para la unión de P3028 a mutantes de deleción internos y mutantes de sustitución de un solo aminoácido del péptido P28R. Las figuras 30A y 30B representan los lados izquierdo y derecho, respectivamente, de un único gráfico que se amplió para mostrar el texto más claramente. Para referencia, el eje Y se ha reproducido en la figura 30B.
La figura 31 ilustra interacciones electrostáticas e interacciones hidrófobas favorables entre el péptido 3028 y el péptido KKL15.
La figura 32 ilustra alineaciones de péptidos cíclicos que se identifica que se unen a P3028 en experimentos de barrido posicional (SEQ ID NO: 265-267) y péptidos lineales que se identifica que se unen a P3028 (SEQ ID NO: 2 y 268-293).
Las figuras 33A y 33B ilustran los efectos de diversas concentraciones del péptido P28R sobre la biorreducción de MTS en (figura 33A) PBMC de muestras de control sanas y (figura 33B) PBMC de pacientes con cáncer.
La figura 34 ilustra el efecto de P28R (también conocido como “SCF 28R”) (N=9) y P27 (también conocido como “SCF 27”) (N=8) sobre PBMC de pacientes con cáncer, mediciones de MTS, día 7.
La figura 35 ilustra la respuesta a IL-2 en células de pacientes con cáncer, medida mediante la incorporación de BrdU.
La figura 36 ilustra el efecto de P28R (también conocido como “P28”) sobre la proliferación inducida por IL-2 en células de (figura 36A) pacientes con alta respuesta y (figura 36B) pacientes con baja respuesta.
La figura 37 ilustra el efecto de P28R (también conocido como “SCF 28R”) y P27 (también conocido como “SCF 27”) sobre la estimulación por IL-2 de PBMC de pacientes con cáncer, basándose en la incorporación de BrdU.
La figura 38 ilustra el efecto de P28R (también conocido como “SCF 28R”) y P27 (también conocido como “SCF 27”) sobre la proliferación inducida por IL-2 basándose en la incorporación de BrdU (figuras 38A, 38C) e incorporación de MTS (figuras 38B, 38D). Se muestran células de dos pacientes diferentes (figuras 38A, 38B) y (figuras 38C, 38D) respectivamente.
La figura 39 ilustra ensayos de puntos de inmunoabsorción ligados a enzimas de células con (fila inferior) y sin (fila superior) péptido P3028.
La figura 40 ilustra datos de ensayos de puntos de inmunoabsorción ligados a enzimas de células con y sin péptido P3028.
La figura 41 es una serie de gráficos que ilustran los efectos de péptidos modificados sobre la activación de PBMC de una persona de control sana. Se incubaron PBMC con los péptidos (40 |ig/ml) durante 24 horas en RPMI más suero AB humano al 10%. La activación se determina como el porcentaje de células con marcador potenciado CD69 usando citometría de flujo. La figura 41A ilustra los resultados de dos experimentos (410 y 412) realizados para cada péptido. La figura 41B ilustra los resultados de dos experimentos (414 y 416) realizados para cada péptido.
La figura 42 es una serie de gráficos que ilustran los efectos del péptido de longitud completa P28R y la secuencia central de 6 aminoácidos (32230, FFVKLS, SEQ ID NO: 62) en medio de cultivo que contiene suero AB humano normal. La activación se determina como el porcentaje de células con marcador potenciado CD69 o CD71 usando citometría de flujo. Se incubaron PBMC con los péptidos (40 |ig/ml) durante 24 horas en RPMI más suero AB humano al 10%. La figura 42A ilustra los resultados de dos experimentos (420 y 422) realizados para cada péptido. La figura 42B ilustra los resultados de dos experimentos (424 y 426) realizados para cada péptido.
La figura 43 es un gráfico que ilustra una comparación del péptido de longitud completa P28R y la secuencia central de 6 aminoácidos (32230, FFVKLS, SEQ ID NO: 62) en medio de cultivo que contiene sueros de dos pacientes con cáncer diferentes (“suero ca humano 1” 430 y “suero ca humano 2” 432).
La figura 44 es una serie de imágenes de microscopio que ilustran el tratamiento con P28R de cáncer de próstata humano, PC3, en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos. Se inyectó en el tumor por vía intratumoral P28R (figura 44A) y solo el disolvente del fármaco (figura 44B). Se representan la tinción para caspasa 3 440 (que demuestra la inducción de la apoptosis) y una usencia de tinción 442.
La figura 45 es una serie de imágenes de microscopio que ilustran el tratamiento intratumoral de melanoma B16 con P28R. Se demostró el infiltrado inflamatorio después de 3 días de tratamiento usando un anticuerpo policlonal de conejo dirigido contra CD45 (figura 45A), y se incubaron secciones de control con IgG de conejo a la misma concentración (figura 45B). Se representan la tinción 450 y una ausencia de tinción 452.
La figura 46 es una serie de gráficos que ilustran el efecto de los péptidos modificados sobre la activación de PBMC de personas de control sanas. La activación se determina como el porcentaje de células con marcador potenciado CD69 (figura 46A, que muestra resultados de dos experimentos, exp. 1460 y exp. 2462) o CD71 (figura 46B, que muestra resultados de dos experimentos, exp. 1464 y exp. 2466) usando citometría de flujo. Se incubaron PBMc con los péptidos (40 |ig/ml) durante 48 horas en RPMI más suero AB humano al 10%.
La figura 47 es una serie de imágenes de microscopio que ilustran la aparición de la estructura de 3028 inmunoinhibidora en dos áreas (figura 47A y figura 47B, respectivamente) de un cáncer de mama humano. Se representa la tinción inmunohistoquímica (470) usando P28R biotinilado. Se observa una ausencia de tinción 472 en la figura 47A.
Descripción detallada de la invención
Se han desarrollado varios inhibidores de péptidos inmunorreguladores, que interaccionan con péptidos inmunorreguladores que provocan inmunosupresión en un ser humano (por ejemplo, un ser humano que tiene cáncer, enfermedad inflamatoria o infecciosa duradera o crónica). Los inhibidores de péptidos inmunorreguladores preferidos se unen a proteínas o péptidos que comprenden la estructura de P3028 y/o la secuencia de P3028 (SEQ ID NO: 185). Con referencia a algunos ejemplos y la descripción en el presente documento, la estructura de P3028 se refiere a polipéptidos, tales como péptidos, proteínas, y similares que incluyen la secuencia de P3028 (SEQ ID NO: 185). La estructura de P3028 puede incluir macromoléculas tales como péptidos, proteínas, y similares que se reconocen por anticuerpos que se unen específicamente a estructuras de P3028 (véanse también el ejemplo 1 y la figura 2). Por ejemplo, los agregados de albúmina, la albúmina desnaturalizada y otras albúminas dañadas pueden incluir la estructura de P3028. En algunos contextos en la presente divulgación, la estructura de P3028, secuencia de P3028 y P3028 son términos usados de manera intercambiable. Las moléculas que tienen la estructura de P3028 interaccionan con receptores sobre células inmunitarias, tales como el receptor de IL-2 y el receptor de LFA-1, provocando inmunosupresión. Como tal, se contempla en el presente documento que péptidos, proteínas, fragmentos de albúmina, albúmina dañada (por ejemplo, albúmina desnaturalizada) y agregados de albúmina puedan incluir la estructura de P3028, y puedan interaccionar con receptores de células inmunitarias tales como el receptor de IL-2 y receptor de LFA-1. La inmunosupresión puede caracterizarse por una proliferación, diseminación y migración de células inmunitarias reducidas, así como, citotoxicidad de células NK. En presencia de un inhibidor de péptidos inmunorreguladores, tal como se describe en el presente documento; sin embargo, la inmunosupresión mediada por la estructura de P3028 puede alterarse (por ejemplo, reducirse, mejorarse, eliminarse o eliminarse completamente). En algunos experimentos, por ejemplo, se encontró que un inhibidor de péptidos inmunorreguladores puede eliminar una molécula que incluye una estructura de P3028 del receptor de LFA-1 alterando de ese modo la inmunosupresión mediada por la estructura de P3028. Por consiguiente, la descripción que sigue proporciona detalles sobre muchas clases diferentes de inhibidores de péptidos inmunorreguladores incluyendo, pero sin limitarse a, inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en péptidos, inhibidores de péptidos inmunorreguladores de peptidomiméticos, inhibidores de péptidos inmunorreguladores modificados (por ejemplo, que contienen un D aminoácido, grupo acetilo N-terminal o grupo amida C-terminal), inhibidores de péptidos cíclicos e inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en aptámeros. Se proporcionan métodos de uso de composiciones (tal como se describe en el presente documento) para reducir la inmunosupresión o un aspecto de la misma (por ejemplo, reducción de la inhibición mediada por P3029 de la proliferación, diseminación, migración de células inmunitarias o citotoxicidad de células NK), así como enfoques para inhibir, reducir o alterar la progresión del cáncer o la enfermedad inflamatoria. La composición puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores tal como se describe en el presente documento. Por consiguiente, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores tal como se describe en el presente documento pueden ser útiles para mejorar, reducir los síntomas de, reducir la gravedad de y/o tratar la inmunosupresión.
Los inhibidores de péptidos inmunorreguladores tal como se describe en el presente documento interaccionan con o se unen a proteínas o péptidos que comprenden al menos una de las secuencias SEQ ID NO: 183-185 o 188-246. Tales péptidos pueden tener propiedades inmunorreguladoras similares a secuencias y estructuras de P3028 (véanse los ejemplos 17 a 26).
Con referencia a algunos ejemplos en la siguiente divulgación, puede hacerse referencia a aminoácidos, o residuos de aminoácido mediante o bien un código de tres letras o bien de una letra. Los veinte aminoácidos están codificados normalmente por el código genético, y puede hacérseles referencia usando los siguientes códigos o abreviaturas en el presente documento: arginina (“Arg” o “R”), histidina (“His” o “H”), lisina (“Lys” o “K”), ácido aspártico (“Asp” o “D”), ácido glutámico (“Glu” o “E”), serina (“Ser” o “S”), treonina (“Thr” o “T”), asparagina (“Asp” o “N”), glutamina (“Gln” o “Q”), cisteína (“Cys” o “C”), glicina (“Gly” o “G”), prolina (“Pro” o “P”), alanina (“Ala” o “A”), valina (“Val” o “V”), isoleucina (“ Ile” o “I”), leucina (“Leu” o “L”), metionina (“Met” o “M”), fenilalanina (“Phe” o “F”), tirosina (“Tyr” o “Y”), triptófano (“Trp” o “W”).
Con referencia a algunos ejemplos en la siguiente divulgación, por “péptido” quiere decirse una proteína y/o un fragmento de una proteína, que puede tener varias longitudes diferentes (por ejemplo, al menos o igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 240, 260, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 o 1000 aminoácidos o un intervalo definido por cualquier número entre estos números).
Con referencia a algunos ejemplos en la siguiente descripción, los aminoácidos (y sus residuos) pueden clasificarse según diversas características de las cadenas laterales del carbono alfa del aminoácido. Se observa que los veinte aminoácidos que se producen de manera natural codificados por el código genético, y también aminoácidos sintéticos, se contemplan en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “aminoácido hidrófobo” (incluyendo las pluralizaciones y variaciones de este término raíz) se refiere a aminoácidos que se producen de manera natural o sintéticos que tienen una cadena lateral hidrófoba, por ejemplo, A, V, I, L, M, F, Y o W. Tal como se usa en el presente documento, “aminoácido cargado positivamente” (incluyendo las pluralizaciones y variaciones de este término raíz) se refiere a aminoácidos que se producen de manera natural o sintéticos que tienen una cadena lateral cargada positivamente, por ejemplo, R, H o K. Tal como se usa en el presente documento, “aminoácido cargado negativamente” (incluyendo las pluralizaciones y variaciones de este término raíz) se refiere a aminoácidos que se producen de manera natural o sintéticos que tienen una cadena lateral cargada negativamente, por ejemplo, D o E. Tal como se usa en el presente documento, “aminoácido de cadena de carbono no aromático hidrófobo” (incluyendo las pluralizaciones y variaciones de este término raíz) se refiere a aminoácidos que se producen de manera natural o sintéticos que tienen una cadena lateral de carbono hidrófoba no aromática, por ejemplo, A, V, I o L. Tal como se usa en el presente documento, “amino polar no cargado” (incluyendo las pluralizaciones y variaciones de este término raíz) se refiere a aminoácidos que se producen de manera natural o sintéticos que tienen una cadena lateral polar no cargada, por ejemplo, S, T, N o Q.
Con referencia a algunos ejemplos y la descripción en el presente documento, puede hacerse referencia a las bases de ácidos nucleicos, tales como a Dn , ARN y similares, ya sea por el nombre de la base o por un código de una letra. Un experto en la técnica apreciará que el código genético está degenerado, ya que, para algunos residuos de aminoácidos, dos o más codones de tres bases pueden codificar para el mismo aminoácido. Por tanto, algunos códigos de una letra, y descritos en el presente documento, pueden representar una de dos o más bases, por ejemplo, para describir dos o más posibles ácidos nucleicos que pueden codificar para un solo aminoácido. Los códigos de una letra utilizados en el presente documento incluyen: “A” (adenina), “G” (guanina), “C” (citosina), “T” (timina), “R” (una de adenina o guanina), “Y” (una de citosina o timina), “M” (una de adenina o citosina), “K” (una de guanina o timina), “S” (una de citosina o guanina), “W” (una de adenina o timina ), “H” (una de adenina, citosina o timina), “B” (una de citosina, guanina o timina), “V” (una de adenina, citosina o guanina), “D” (una de adenina, guanina o timina) y “N” (una de adenina, guanina, citosina o timina).
Los términos “desbloqueo” y “no bloqueo” tal como se usan en el presente documento (incluyendo la pluralización y las variaciones de este término raíz) se refieren al desplazamiento de un péptido inmunorregulador unido o estructura de P3028 de un receptor. Como tal, el desbloqueo o no bloqueo de un receptor desplaza el equilibrio entre el péptido inmunorregulador unido al receptor y no unido al receptor hacia la categoría “no unido al receptor”. Por ejemplo, un receptor de LFA-1 o un receptor de IL-2 puede desbloquearse según realizaciones en el presente documento desplazando un péptido P3028 unido del receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2. Por ejemplo, un receptor de LFA-1 o receptor de IL-2 puede desbloquearse según realizaciones en el presente documento mediante el desplazamiento de cualquier péptido inmunorregulador que comprenda una o más secuencias para las tablas 1-4 del receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2.
El término “activación de células inmunitarias” tal como se usa en el presente documento, y las pluralizaciones y variaciones de este término raíz (incluyendo, por ejemplo, “activación de una célula inmunitaria”), se refiere a la proliferación de células inmunitarias, activación o potenciación de la expresión de CD69 y/o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal (por ejemplo, IFNy o IL-12), inducción de la secreción de una molécula citolítica (por ejemplo, perforina o granzima B), citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular, proliferación celular potenciadas, o dos o más de estos elementos enumerados. A modo de ejemplo, la activación de células inmunitarias según algunas realizaciones en el presente documento puede producirse si una célula inmunitaria prolifera, o si una célula inmunitaria comienza a expresar CD69 detectable, o si una célula inmunitaria aumenta su expresión de CD71, o si una célula inmunitaria secreta IFNy, IL-12 o IFNy e IL-12.
Los datos disponibles respaldan un papel importante del sistema inmunitario en la muestra de control de cáncer. Sin embargo, los tumores malignos pueden aprovechar un gran número de mecanismos inmunorreguladores para suprimir la reactividad antitumoral mediada inmunitariamente. Basándose en la observación de que un aumento de la concentración sérica de interleucina-6 (IL-6) a menudo se correlaciona con un mal pronóstico en pacientes con cáncer de diversos diagnósticos, se exploró el origen y la inducción de esta citocina. Se encontró que la fragmentación proteolítica o la desnaturalización de la albúmina sérica normal generaba neoestructuras, que presentan actividad inmunorreguladora al unirse a células inmunitarias. En consecuencia, se descubrió una nueva clase de sustancias inmunorreguladoras.
La existencia de secuencias de albúmina que tienen neoestructuras que se unen a células inmunitarias se identificó usando un modelo ex vivo humano basado en cromatografía de afinidad sobre una “columna de superficie celular artificial” (ACS). Se analizó el efecto de los diferentes fragmentos de albúmina sobre la proliferación inducida por IL-2 de células inmunitarias humanas (PBMC) en el sistema de ACS (véase el ejemplo 9). Brevemente, se cultivaron PBMC durante siete días en presencia de IL-2 y los diversos fragmentos de albúmina preparados de manera sintética. La proliferación se midió como la incorporación de 3H-timidina durante las 18 horas finales. Uno de los péptidos, P3028 (también denominado “péptido 3028” y que tiene la secuencia de aminoácidos VFDEFKPLVEEPQNLIK - SEQ ID NO: 185) inhibió regularmente la proliferación inducida por IL-2, pero ninguno de los otros péptidos identificados por su unión a la superficie celular artificial mostró tanta actividad inhibitoria como la secuencia/estructura de P3028 (véase la figura 6). Por consiguiente, la respuesta proliferativa de las células inmunitarias inducida por LFA-1 o IL-2 podría inhibirse por P3028, lo que indica que la secuencia/estructura de P3028 puede estar actuando a través de al menos del receptor de LFA-1 o IL-2.
La incorporación potenciada de 3HTdR puede ser el resultado de una actividad específica potenciada de las reservas de timidina intracelulares y, por tanto, una actividad específica potenciada del ADN, por tanto, sin reflejar necesariamente un aumento en el número de células. Por tanto, se consideró de importancia explorar un modo diferente de estimulación de la proliferación de linfocitos y medir la respuesta usando un método diferente, la técnica de MTS (véase el ejemplo 3). Por consiguiente, se estimularon células T en cultivos sobre placas recubiertas previamente con un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD3 y se determinó el número de células metabólicamente activas usando tinción de MTS después de 3 a 7 días de cultivo (véase la figura 8). Tal como se muestra, la secuencia/estructura de P3028 tuvo un efecto inhibidor. Puede argumentarse que la tinción de MTS reducida provocada por la secuencia/estructura de P3028 podría deberse a un metabolismo celular reducido; sin embargo, tomados en conjunto los resultados de ambos modelos de proliferación de linfocitos, un metabolismo reducido debe reducir razonablemente las reservas de timidina endógenas y, por tanto, dar como resultado una captación potenciada de timidina exógena/actividad específica de las reservas de timidina, que luego deben registrarse erróneamente como una proliferación potenciada. La 3H-TdR se redujo realmente en estos experimentos, lo que indica la inhibición de la proliferación. En consecuencia, se confirmó que los péptidos que comprenden la secuencia de 3028 inhibían eficazmente la proliferación de células inmunitarias mediada por IL-2.
Luego se sintetizaron fragmentos de péptidos que abarcaban las partes C y N-terminales de P3028 y se analizó la capacidad de estos péptidos (por separado y en combinación) para inhibir la proliferación de células inmunitarias inducidas por IL-2 (véase el ejemplo 6). Se sintetizaron un fragmento N-terminal de P3028 (es decir, P3325 que tiene la secuencia de aminoácidos VFDEFKPLVE (SEQ ID NO: 186)) y un fragmento C-terminal de P3028 (es decir, P3218 que tiene la secuencia de aminoácidos EPQNLIK) (SEQ ID NO: 187)). Se determinó que la actividad inhibidora de estos dos fragmentos de P3028 solos o en combinación era más débil que P3028 (véase la figura 12) y los fragmentos peptídicos de 3028 no inhiben el efecto de P3028 sobre la proliferación inducida por IL-2 (véase la figura 13).
Luego se determinó que los péptidos que comprenden la secuencia de secuencia/estructura de P3028 no solo interaccionaban con el receptor de IL-2 sino que también interaccionaban con el receptor de LFA-1. En un primer conjunto de experimentos, se encontró que el péptido P3028 tiene la capacidad de modular la unión de un anticuerpo monoclonal específico de LFA-1 al receptor de LFA-1 en células inmunitarias humanas (véase el ejemplo 7). Este anticuerpo monoclonal específico de LFA-1 es un potente inhibidor de la proliferación de células inmunitarias inducida por IL-2 (véase Vyth-Dreese et al., Eur. J. Immunol. 12: 3292-3299 (1993)). Se empleó un procedimiento de tinción inmunohistoquímica convencional en presencia y ausencia del péptido P3028. Brevemente, se compararon las células inmunitarias (PBMC) de individuos sanos y pacientes con cáncer. Las células se fijaron utilizando acetona, se bloquearon con suero AB humano al 10% con o sin P3028, y se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-LFA-1 y un anticuerpo secundario seguido por desarrollo de color usando Fast Red. Tal como se muestra en la figura 16A, se encontró una tinción clara de membrana 3 en las PBMC de muestras de control sanas en contraste con las PBMC de un paciente con cáncer avanzado, que mostró una tinción débil 5. Sin embargo, cuando las PBMC de este paciente con cáncer se incubaron con un anticuerpo específico para la estructura de 3028 durante 24 horas, apareció la tinción de membrana 3, lo que indica que el anticuerpo se unió a la estructura de 3028 y, por tanto, desbloqueó LFA-1 (véase la figura 16C) y la discusión a continuación.
Dado que la secuencia/estructura de P3028 inhibió significativamente la respuesta proliferativa de las células inmunitarias a IL-2, se estudió el efecto de la secuencia/estructura de P3028 sobre la unión de IL-2 a CD25. La proteína de fusión de CD25 y la parte Fc de IgG se unió a microplacas/placas ELISA recubiertas con proteína G y las placas se incubaron con IL-2 biotinilada con o sin la presencia de P3028. Sorprendentemente, la unión de IL-2 a CD25 se potenció mediante la presencia de P3028, proporcionando evidencias de una interacción de tres partes entre IL-2, CD25 y P3028 (véanse las figuras 18A-B). Incluso si se potencia la unión de IL-2 a CD25, el ensamblaje apropiado del receptor de alta afinidad y/o la transducción de señales se bloquea ya que la secuencia/estructura de P3028 es un potente inhibidor de la proliferación inducida por IL-2. Usando modelos moleculares asistidos por ordenador, se determinó que la secuencia/estructura de P3028 se une a CD25 en el sitio de unión de IL-2 (véase la figura 19). Estos resultados proporcionan una mayor evidencia de que la secuencia/estructura de P3028 tiene al menos una capacidad inmunorreguladora doble ya que se une tanto al receptor de LFA-1 como al receptor de IL-2.
También se evaluó la capacidad de fragmentos específicos de albúmina para afectar a la citotoxicidad de células NK. En estos experimentos, se prepararon péptidos sintéticos correspondientes a fragmentos de albúmina (P3028, P3026 y P3027) (SEQ ID NO: 185, 183 y 184, respectivamente) y se evaluó la cantidad de lisis de células diana K562 (véase el ejemplo 4). No se observó inhibición en presencia del péptido de la muestra de control P3027, pero P3028 y, en menor grado, P3026 provocaron una reducción en la citotoxicidad de células NK (véanse las figuras 9A-B). Por consiguiente, los péptidos que tienen la secuencia de P3028 inhiben eficazmente la citotoxicidad de células NK.
También se analizó la capacidad de fragmentos de albúmina específicos para inhibir la diseminación de leucocitos y la migración de células inmunitarias. Brevemente, se prepararon células de la capa leucocitaria a partir de sangre heparinizada mediante sedimentación asistida por dextrano. Estas células se lavaron entonces dos veces en PBS y se transfirieron a portaobjetos limpios. Las células se adhirieron fuertemente a la superficie de vidrio y se extendieron; sin embargo, el pretratamiento de estas células con P3028 a una concentración de 10 |ig/ml durante 15 minutos inhibió eficazmente la propagación de las células inmunitarias (véase el ejemplo 5). De manera similar, se estudió el impacto de P3028 sobre la migración de PBMC usando la técnica de cámara de Boyden (véase el ejemplo 5). Tal como se muestra en la figura 11, P3028 es un potente inhibidor de la migración de células inmunitarias (p <0,002).
Se prepararon anticuerpos específicos para proteínas que tienen la secuencia/estructura de P3028, se purificaron y se caracterizaron (véase el ejemplo 9). Se generaron anticuerpos policlonales específicos para P3028 en conejos o cabras. Brevemente, se inmunizaron conejos con P3028 y se purificaron por afinidad anticuerpos específicos usando P3028. Se encontró que estos anticuerpos se unen a P3325 (el fragmento N-terminal SEQ ID NO: 186) pero no a P3218 (el fragmento C-terminal (SEQ ID NO: 187) de P3028.
En la siguiente serie de experimentos, se identificó la expresión de P3028 en tumores malignos (por ejemplo, melanoma maligno, carcinoma de células renales y cáncer colorrectal) mediante tinción inmunohistoquímica usando anticuerpos de conejo anti-3028 purificados por afinidad (véase el ejemplo 9). La tinción inmunohistoquímica de cortes de tejido con melanoma maligno, carcinoma de células renales y cáncer colorrectal mostró que las moléculas que contienen la secuencia de P3028 se expresan y/o localizan ampliamente en células cancerosas. Estos resultados fueron respaldados además por la demostración de estructuras de 3028 en extractos tumorales preparados a partir de metástasis de melanoma maligno usando una técnica de tipo Western (véase el ejemplo 1). Se identificaron estructuras de 3028 apreciables (aproximadamente, ligeramente más grandes de 66 kD) mediante la inmunotransferencia de tipo Western, pero la secuencia de 3028 también se detectó en albúmina de tamaño completo y moléculas más grandes (véase la figura 2). Estos resultados proporcionan evidencias de que las moléculas que comprenden la estructura de 3028 se generan no solo por fragmentación proteolítica sino también por desnaturalización. Por consiguiente, se determinó que la secuencia de P3028 y/o las moléculas que comprenden esta secuencia están presentes y/o localizadas en el tejido tumoral.
Luego se usó una técnica de ELISA para confirmar que las proteínas y péptidos que comprenden la secuencia de 3028 estaban presentes en el suero humano. Brevemente, se empleó un ensayo de tipo sándwich, en el que micropocillos de ELISA de alta unión a proteínas se recubrieron con anticuerpos anti-3028 purificados por afinidad (anticuerpo de captura), y luego se añadió una disolución al 1% de suero inactivado por calor, con adiciones conocidas con concentraciones crecientes de P3028. Después de lavar, se añadió un anticuerpo monoclonal de ratón biotinilado anti-albúmina humana y se detectó la cantidad de anticuerpo unido con estreptavidina conjugada con HRP y sustrato de cromógeno TMB (véase el ejemplo 1). Se encontró que la concentración sérica estaba en el intervalo de 1,2-1,6 |ig/ml de equivalentes de P3028 en una reserva de suero de 5 muestras de control sanas, 1 suero de muestra de control sana y 2 sueros obtenidos de pacientes con cáncer. La cantidad de moléculas que contienen 3028 se determinó como la cantidad de P3028 que inhibe el 50% de la unión de las estructuras de 3028 en el suero al anticuerpo de captura (dirigido contra el epítopo de 3028) en el ELISA de tipo sándwich (véase la figura 3). La cantidad de estas sustancias 3028 en el suero puede ser considerablemente mayor ya que el peso molecular de la albúmina es aproximadamente 35 veces mayor que el de P3028, pero su reactividad específica de epítopo se determina con precisión utilizando el método descrito anteriormente.
Entonces se realizaron experimentos usando una primera clase de inhibidores que son específicos para la secuencia/estructura de P3028. Se analizó la respuesta proliferativa de células inmunitarias humanas de individuos sanos y pacientes con cáncer después de la inducción con IL-2 en presencia y ausencia de anticuerpos específicos para la secuencia/estructura de P3028 (véase el ejemplo 9). Es decir, la respuesta proliferativa de las PBMc de un paciente que tiene carcinoma de células renales y un paciente que tiene melanoma maligno se comparó con la respuesta proliferativa de PBMC obtenidas de un individuo sano en presencia y ausencia de anticuerpos específicos para la secuencia/estructura de P3028. Se determinó que, en presencia de los anticuerpos que son específicos para la secuencia/estructura de P3028, se observó una proliferación potenciada de las PBMC después de la inducción con IL-2. Es decir, el inhibidor de anticuerpo para la secuencia/estructura de P3028 fue capaz de eliminar el bloqueo en la proliferación inducida por IL-2 de las células inmunitarias mediada por la secuencia/estructura de P3028. Estos resultados demuestran que una pareja de unión para la secuencia/estructura de P3028 (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo específico para P3028), puede reducir la supresión inmunitaria mediada por la secuencia/estructura de P3028.
La secuencia/estructura de P3028 es un potente inhibidor fisiológico del sistema inmunitario, y es una posible diana para composiciones terapéuticas que pueden modular la actividad inmunitaria. Los anticuerpos dirigidos contra la secuencia/estructura de P3028 revirtieron la inmunosupresión relacionada con el cáncer, que se modeló como una respuesta proliferativa reducida de PBMC a IL-2 en un modelo ex vivo humano (véase el ejemplo 9). Además, el resultado en este modelo se correlacionó con la supervivencia global de los pacientes con cáncer (véase el ejemplo 2). Por tanto, se contempló que parejas de unión adicionales para la secuencia/estructura de P3028 (por ejemplo, péptidos, péptidos cíclicos, peptidomiméticos, anticuerpos y porciones de los mismos) pueden ser útiles para inhibir la supresión inmunitaria mediada por la secuencia/estructura de P3028.
Inicialmente se desarrollaron tres parejas de unión basadas en péptidos para la secuencia/estructura de P3028 y se sometió a prueba la capacidad de unión de estos inhibidores con P3028 en disolución, tal como se muestra en la figura 23 (véase el ejemplo 10). Solo una molécula, SCF28, tenía una solubilidad suficiente para permitir pruebas en modelos ex vivo humanos biológicos. Basándose en esta estructura, se desarrolló un primer candidato a fármaco, P28R (SEQ ID NO: 2).
Puesto que P28R se unía fuertemente a P3028, se sometió a prueba la capacidad de P28R para inhibir la función de la secuencia/estructura de P3028. Tal como se describió anteriormente, las integrinas p2 desempeñan un papel importante en la función normal del sistema inmunitario. Sin embargo, la unión de la secuencia/estructura de P3028 a la integrina p2 LFA-1 tiene un efecto inmunosupresor sustancial. Tal como se demostró anteriormente (véase el ejemplo 7), en los ensayos de tinción para LFA-1, la tinción de la membrana de PBMC de pacientes con cáncer disminuye notablemente en comparación con muestras de control normales. Sin embargo, la exposición de LFA-1 podía potenciarse incubando PBMC de pacientes con cáncer con un anticuerpo dirigido contra la secuencia/estructura de P3028 inhibidora (véase el ejemplo 7 y la figura 16C). De manera similar, la incubación de secciones tumorales recién congeladas con el péptido P28R (SEQ ID NO: 2) desbloquea LFA-1 de linfocitos infiltrantes de tumores (es decir, desplaza los péptidos inmunorreguladores unidos o las estructuras de P3028 de los receptores de LFA-1), dando como resultado una unión potenciada del anticuerpo anti-CD11a (figura 26). Estos resultados mostraron que el receptor de LFA-1 se desbloqueó mediante la eliminación de la estructura de P3028 por el anticuerpo. Para someter a prueba la capacidad de P28R para inhibir la estructura de P3028, se incubaron secciones tumorales recién congeladas sin fijación durante 4-20 horas en presencia del candidato a fármaco, P28R, antes de la tinción para LFA-1 (véase el ejemplo 15). Para comparación, se incubaron secciones tumorales solo con solución salina tamponada con fosfato. Tal como se muestra en la figura 26, P28R desbloqueó eficazmente el receptor de LFA-1 (por ejemplo, desplazó péptidos inmunorreguladores o estructuras de 3028 unidos del receptor de LFA-1) y, por tanto, potenció notablemente la expresión funcional de LFA-1 permitiendo la migración y actividad citotóxica de estas células. Por consiguiente, P28R disminuye la unión de P3028 a LFA-1 e inhibe eficazmente la supresión inmunitaria mediada por P3028. Se contempla que la incubación con el núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) según algunas realizaciones en el presente documento también desbloquea LFA-1 (por ejemplo, desplaza péptidos inmunorreguladores o estructuras de 3028 unidos del receptor de LFA-1).
Como tales, los receptores de P3028 incluyen LFA-1 y la cadena alfa del receptor de IL-2 (CD25). La unión de un anticuerpo monoclonal a CD11a (la cadena alfa de LFA-1) se usó para estudiar la posible aparición de un bloqueante fisiológico de LFA-1 y la actividad de desbloqueo de P28R y anticuerpos dirigidos a P3028. Por consiguiente, se contempla además que, similar al receptor de LFA-1, el receptor de IL-2 puede desbloquearse mediante inhibidores de péptidos inmunorreguladores tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, los péptidos inmunorreguladores o las estructuras de 3028 unidos pueden desplazarse del receptor de IL-2). Como tal, en algunas realizaciones, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores tal como se describe en el presente documento desbloquea un receptor de IL-2, por ejemplo, un receptor de IL-2 que se ha bloqueado por uno o más de los péptidos enumerados en las tablas 1-4 (por ejemplo, un péptido que comprende SEQ ID NO: 185).
La incubación de PBMC de controles sanos con P3028 (figuras 15 y 17) o sueros de pacientes con cáncer (figura 17) bloquea la unión del anticuerpo anti-CD11a a LFA-1. Además, la incubación de PBMC de pacientes con cáncer avanzado con un anticuerpo dirigido contra P3028 restituye la unión del anticuerpo anti-CD11a a LFA-1 (figura 16). P3028 puede unirse a PBMC (véase la figura 15a que representa ningún péptido añadido, y la figura 15B, que representa la preincubación con péptido 3028; el AcM anti-LFA-1 HI111 se inhibió mediante la preincubación con el péptido 3028, lo que indica la unión a células sanguíneas mononucleares por el péptido 3028).
Puesto que P28R desbloquea los receptores de LFA-1 que se suprimen por la secuencia/estructura de P3028 (por ejemplo, desplaza péptidos inmunorreguladores o estructuras de 3028 unidos del receptor de LFA-1), se sometió a prueba la capacidad de P28R para potenciar la estimulación inmunitaria se probó en modelos ex vivo humanos. Se midió la actividad estimuladora de P28R en PBMC usando las técnicas de MTS o CFSE en 7 muestras de control sanas y 7 pacientes con cáncer de diversos diagnósticos (véase el ejemplo 13). Incluso en ausencia de otros tipos de estimulación, P28R tiene una actividad estimuladora significativa en 6 de 7 pacientes con cáncer; mientras que las PBMC de las muestras de control mostraron solo una estimulación débil o nula (véase el ejemplo 13). Similar a los estudios sobre la eficacia de anticuerpos dirigidos contra P3028 para revertir la inmunosupresión relacionada con el cáncer anteriormente (véase el ejemplo 9; véase la figura 22), se investigó la capacidad del inhibidor de P28R para desbloquear el receptor de IL-2 y, de ese modo, inducir la proliferación de células inmunitarias. Los cultivos de PBMC de cuatro pacientes sin tratamiento previo diferentes se trataron cada uno con P28R, y se midió la proliferación de PBMC. Mientras que las PBMC que tenían una alta actividad proliferativa antes del tratamiento con P28R no se vieron afectadas en gran medida por el fármaco (véase la figura 24c y la figura 24D), las PBMC con una baja proliferación inicial se estimularon notablemente (véase la figura 24a y la figura 23B; véase el ejemplo 13). Por tanto, el inhibidor de P28R induce eficazmente la proliferación de células inmunitarias cuando las células inmunitarias se unen y están suprimidas por la secuencia/estructura de P3028, incluso en ausencia de estimulación adicional.
Puesto que se ha demostrado que las células cancerosas están enriquecidas en estructuras de P3028 (véase el ejemplo 1 y las figuras 1-2), se investigó la capacidad de P28R para unirse específicamente a células cancerosas. Se estudió la unión de P28R biotinilado a tumores. Se analizaron tres cánceres de mama, dos carcinomas de células renales y cuatro melanomas malignos. En particular, todos los diferentes tipos de tumores analizados en los experimentos se unieron a P28R. La sección de cáncer de mama teñida, mostrada en la figura 25, por ejemplo, presenta una señal positiva fuerte, que indica la presencia de la estructura de P3028 inhibidora en este tumor, y la capacidad de P28R para unirse a este tumor (véase el ejemplo 14).
Puesto que la estructura de P3028 inhibe la migración de linfocitos, así como la actividad citotóxica (véanse los ejemplos 4 y 5), se espera que un ataque mediado por el sistema inmunitario contra áreas tumorales que se tiñen positivamente se suprima eficazmente siempre que la estructura que contiene P3028 esté presente y no se secuestre por una pareja de unión para la secuencia/estructura de P3028 (por ejemplo, un anticuerpo, fragmento de unión del mismo y/o un péptido inhibidor, tal como P28R, o un peptidomimético correspondiente a la estructura de P28R). Consecuente con la observación de que P3028 se une fuertemente al receptor de LFA-1, no se tiñeron linfocitos por este procedimiento ya que la estructura de P3028 se bloqueó al unirse a LFA-1 en estas células.
Basándose en la capacidad de P28R para unirse a la secuencia/estructura de P3028, desbloquear el receptor de LFA-1 y mejorar la inmunosupresión dependiente de la secuencia/estructura de P3028, se usó P28R como compuesto molde para identificar compuestos adicionales que se unen a y secuestran P3028. Se sintetizaron variantes de la estructura de P28R y se sometieron a prueba para determinar la capacidad de unirse a P3028 usando la tecnología PEPSCAN (véase el ejemplo 12). Se sintetizó una biblioteca de péptidos que incluyen cada sustitución de aminoácido codificado genéticamente en cada posición de aminoácido de P28R (es decir, 19 sustituciones para cada posición). Cada péptido se fijó a una clavija de soporte, y la biblioteca de péptidos se incubó con P3028. La unión de los inhibidores candidatos a P3028 se detectó mediante un ELISA de tipo sándwich, donde se empleó un anticuerpo secundario de conejo anti-peroxidasa de ratón (rampo) (véase el ejemplo 12). A la unión de cada péptido se le asignó entonces una puntuación de rampo (véase la figura 27). El péptido P28R tenía valores de rampo que oscilaban entre aproximadamente 262 y 460 con un valor medio de 370. En algunas realizaciones, el péptido aislado de la presente invención se selecciona para una puntuación de rampo de unión a P3028 deseada. En algunas realizaciones, la puntuación de rampo de unión a P3028 deseada es mayor que o igual a la puntuación de rampo de P28R. También se contempla que algunos péptidos que se unen a P3028 con menos afinidad que P28R tengan aplicación terapéutica. Algunos péptidos con afinidades de unión que son menores que P28R, por ejemplo, pueden modular eventos de transducción de señales de manera diferente a P28R en virtud del hecho de que la afinidad a P3028 es menor. Por consiguiente, las realizaciones también incluyen péptidos aislados de la presente invención que se unen a P3028, en donde dichos péptidos tienen una puntuación de rampo que es menor que la presentada por P28R. Por consiguiente, las realizaciones contempladas incluyen péptidos aislados de la presente invención que se unen con cualquier afinidad a P3028 (por ejemplo, uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, preferiblemente péptidos que modulan el sistema inmunitario (por ejemplo, modulan, regulan por incremento o regulan por disminución un marcador del sistema inmunitario o inmunosupresión, tal como la reducción de una inhibición mediada por P3028 de la proliferación, diseminación, migración de células inmunitarias o citotoxicidad de células NK mediada por P3028).
Un total de 31 sustituciones del péptido P28R (SEQ ID NO: 3-33) tenían valores de rampo mayores de 500 (véase la figura 28), lo que indica que estos 31 péptidos (parejas de unión fuerte para P3028) pueden usarse para unir y secuestrar P3028 eficazmente y, de ese modo, reducir la inmunosupresión mediada por P3028. La tabla 6.1 enumera estos 31 péptidos que se evaluaron en ensayos y se demostró que tienen una unión apreciable a P3028. Adicionalmente, la fuerza de unión de los péptidos sustituidos en cada posición (basándose en la puntuación de rampo) se comparó con la fuerza de unión de una muestra de control de P28R (SEQ ID NO: 2) para la misma posición (véase el ejemplo 12). Se identificaron péptidos que se unían con una puntuación de rampo sustancialmente igual a o mayor que la de la muestra de control de P28R (es decir, en péptidos que se unían a P3028 con al menos el 98% de la puntuación de rampo de la muestra de control de P28R) (SEQ ID NO: 268-393). La tabla 6.2 enumera estos 126 péptidos que demostró que tenían una unión apreciable a P3028. Se observa que estos 126 péptidos incluyen los 31 péptidos de la tabla 6.1. Por consiguiente, se identificaron 126 parejas de unión diferentes para P3028 mediante este examen inicial y estas moléculas o variantes de las mismas (por ejemplo, variantes que tienen D aminoácidos, amidas N-terminales y/o grupos acetilo C-terminales o peptidomiméticos o aptámeros correspondientes a estas parejas de unión) puede usarse para inhibir la unión de la secuencia/estructura de P3028 a una célula inmunitaria y, de ese modo, aliviar o reducir la inmunosupresión dependiente de P3028. Una variante de P28R, el péptido KKL15 (SEQ ID NO: 1), que carece solo de una arginina C-terminal, se cree que se une a la secuencia/estructura de P3028 a través de tanto interacciones cargadas como hidrófobas. Tal como se muestra en la figura 31, los aminoácidos cargados positivamente de KKL15 interaccionan con los aminoácidos cargados negativamente en P3028 y los aminoácidos hidrófobos generan contactos hidrófobos que potencian la interacción.
Para mapear adicionalmente el dominio de unión a P3028 de P28R, se sintetizaron deleciones y truncamientos de P28R, y se sometió a prueba su unión a P3028 usando el ensayo PEPSCAN. Este enfoque condujo al desarrollo de muchas más parejas de unión para P3028. Mientras que la deleción de los residuos 6-9 (“FFVK” - SEQ ID NO: 182) y los aminoácidos C-terminales tendían a reducir la unión de péptidos a P3028 basándose en la puntuación de rampo (véase el ejemplo 12 y la figura 30), varias deleciones y truncamientos del péptido P28R tienen una puntuación rampo comparable a o mayor que el péptido P28R (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 34, 64-66, 68 y 76). Adicionalmente, los péptidos con deleción de hasta al menos 8 aminoácidos del extremo N-terminal de P28R (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 46-53) conservaron una alta afinidad por P3028, tal como se mide mediante la puntuación de rampo, proporcionando evidencias de que inhibidores que son más pequeños que P28R pueden ser útiles para unirse a y secuestrar P3028, evitando la interacción de P3028 con receptores de células inmunitarias, tales como los receptores de IL-2 o LFA-1, reduciendo de ese modo la inmunosupresión inducida por P3028.
Debido a que se demostró que P28R tiene un efecto modulador sobre la estimulación por IL-2 de la proliferación de células inmunitarias (véase el ejemplo 2), se investigó además si P28R tendría un efecto modulador sobre otros aspectos de la estimulación por IL-2 de células inmunitarias. Se cultivaron PBMC de ocho muestras de control sanas y nueve pacientes con cáncer con diversos diagnósticos en una versión modificada del modelo ex vivo del ejemplo 2 durante siete días en presencia de diversas dosis de P28R (o bien muestras de control “sin P28R”, o bien 5 |ig/ml, 10 |ig/ml o 20 |ig/ml de P28R). Se observó una estimulación dependiente de la dosis del metabolismo mitocondrial medida como conversión de MTS en 5/8 (véase la figura 33A) muestras de control y 9/9 pacientes con cáncer (véase la figura 33B). Se obtuvieron resultados similares cuando las PBMC se cultivaron durante solo tres días (véase el ejemplo 28).
Para identificar la eficacia de otros inhibidores de péptidos inmunomoduladores, se comparó el efecto de P28R (SEQ ID NO: 2) sobre el metabolismo mitocondrial basándose en la conversión de MTS con el efecto de un péptido estrechamente relacionado, P27. P27 tiene la secuencia KKLDTFFKKLSLFTER (SEQ ID NO: 264), y es una variante de P28R que difiere en que V8 de P28R se sustituye por K8 en P27. P28R se une a P3028 más eficazmente que P27 (P27 se une a P3028 con una puntuación de rampo de 253, mientras que una muestra de control de P28R se une a P3028 con una puntuación rampo de 308; véase el ejemplo 12). Las concentraciones fueron o bien muestras de control sin tratar, 5 |ig/ml (“SCF28-R5” y “SCF275”), 10 |ig/ml (“SCF28-R10” y “SCF2710”), 20 |ig/ml (“SCF28-R20” y “SCF2720”) o 40 |ig/ml (“SCF28-R40” y “SCF2740”). Los resultados se muestran en la figura 34. Mientras que P28R estimuló las células de pacientes con cáncer de una manera dependiente de la dosis, P27 no tuvo efecto (véase el ejemplo 29).
El efecto de P28R (SEQ ID NO: 2) sobre la proliferación inducida por IL-2 también se midió en un ensayo de incorporación de BrdU. Se recogieron PBMC de seis muestras de control sanas y diez de cáncer en una versión modificada del modelo ex vivo. Cuatro de seis muestras de control tenían una alta respuesta proliferativa a IL-2 en comparación con cuatro de diez muestras de pacientes con cáncer (véase la figura 35). Estas diferencias en la respuesta proliferativa a IL-2 en PBMC demostraron la existencia de diferencias de pacientes con respuesta alta y baja a la estimulación por IL-2 (véase el ejemplo 30).
Se comparó la respuesta de pacientes con respuesta alta y pacientes con respuesta baja a diversas dosis de P28R. Las células de o bien pacientes con respuesta alta o bien pacientes con respuesta baja se cultivaron con diversas dosis de P28R (véanse las figuras 36A y 36B). La proliferación inducida por IL-2 se midió como la incorporación de BrdU. Mientras que P28R no tuvo efecto estimulador en células de pacientes con una alta respuesta a IL-2 (N = 4) (véase la figura 36A), P28R tuvo un efecto estimulador sobre células de pacientes con baja respuesta a IL-2 (N = 6) (véase la figura 36B). Por consiguiente, se demostraron los efectos de P28R sobre la unión y el bloqueo de la actividad inmunoinhibidora de P3028 en el modelo ex vivo, ya que la adición de P28R a los cultivos no tuvo efecto sobre la proliferación cuando se añadió a PBMC de controles sanos y pacientes con cáncer con una tasa de proliferación normal, pero la proliferación de PBMC de pacientes con cáncer inmunosuprimidos se estimuló significativamente por P28R. Sin querer limitarse a la teoría, en algunas realizaciones, P28R (SEQ ID NO: 2) se une a un bloqueante de la proliferación de células inmunitarias e induce la proliferación de células inmunitarias.
Entonces se comparó el efecto de P27 (SEQ ID NO: 264) con el efecto de P28R (SEQ ID NO: 2) sobre la proliferación inducida por IL-2 tal como de mide mediante la incorporación de BrdU. Las PBMC de pacientes con cáncer con respuesta baja tenían diversas concentraciones de P28R o P27, que oscilaban desde ausencia de péptido (“células no tratadas”), hasta 5 |ig/ml, 10 |ig/ml o 20 |ig/ml. Tal como se muestra en la figura 37, tanto P28R como P27 potenciaron la tasa de proliferación de PBMC inducida por IL-2 tal como se mide mediante la incorporación de BrdU. Cuando se comparan los resultados mostrados en la figura 37 con los de la figura 34, se observó que P27 potenciaba la estimulación por IL-2 de la proliferación celular tal como se mide mediante la incorporación de BrdU, pero no el metabolismo mitocondrial tal como se mide mediante la conversión de MTS. Por otro lado, se observó que P28R potencia tanto la conversión de MTS como la incorporación de BrdU en respuesta a la estimulación por IL-2 (véase el ejemplo 31).
Se investigaron además los diferentes efectos de diferentes inhibidores de péptidos inmunorreguladores sobre la incorporación de BrdU y la conversión de MTS. Los efectos de P28R sobre la estimulación por IL-2 de la proliferación de células inmunitarias diferían significativamente, dependiendo del ensayo usado (véase la figura 38). El péptido P28R tenía una actividad estimuladora de la conversión de MTS en cultivos de PBMC de siete días en el 100% de los pacientes con cáncer examinados (N = 9) y en el 63% de las muestras de control sanas examinadas (N = 8). En cambio, P28R estimuló la incorporación de BrdU en cultivos de PBMC de siete días de solo el 17% (N = 6) y el 20% (N = 10) de los pacientes. P28R estimuló la proliferación inducida por IL-2, medida como incorporación de BrdU, en cultivos de PBMC de pacientes con cáncer con una baja respuesta proliferativa a IL-2. Por otro lado, las PBMC del 67% de las muestras de control sanas examinadas (N = 3) y el 50% de los pacientes con cáncer (N = 4) no se estimularon por IL-2 cuando el efecto se midió como conversión de MTS (véase el ejemplo 32 y la figura 38). Sin embargo, las PBMC de todas estas personas (“pacientes que no responden”) que no respondieron cuando se midieron con MTS se estimularon significativamente por IL-2 cuando el efecto se midió como la incorporación de BrdU (véase la figura 38). En dos pacientes, la respuesta a IL-2, medida como incorporación de BrdU, se potenció por P28R (véanse las figuras 38A y 38C), pero este efecto de P28R solo se observó en uno de estos pacientes cuando se usó la conversión de MTS (véase la figura 38B). Por tanto, mientras que en un paciente (véanse las figuras 38A y 38B) la actividad estimuladora de IL-2 se registró usando BrdU y MTS, en el otro paciente la actividad estimuladora de IL-2 se registró usando BrDU solo (véase la figura 38C) (véase el ejemplo 32). Basándose en estas observaciones, se contempló que los efectos sobre la actividad metabólica medida como conversión de MTS no siempre se correlacionan con la síntesis de ADN medida como incorporación de BrdU, y diferentes poblaciones de pacientes pueden responder de manera diferente a los inhibidores de péptidos inmunorreguladores.
Se contempló que podrían identificarse otras moléculas que se unen a P3028. Estas moléculas de unión adicionales también podrían bloquear posiblemente P3028. Se sintetizaron péptidos de 6 meros en bucle y se identificaron 6 meros que demostraron una unión apreciable a P3028 (véase la tabla 12, SEQ ID NO: 265-267) (véase el ejemplo 19). Se observó que dos de los 6 meres con la unión más fuerte a P3028 basándose en la puntuación de rampo poseían homología con péptidos lineales que se unen a 3028 (véase la figura 32).
Además de P3028, se encontró que varios otros fragmentos de albúmina y péptidos sintéticos se unían a las células inmunitarias. Algunos de estos fragmentos pueden tener una actividad inmunomoduladora similar a P3028, pueden unirse a células inmunitarias similares a P3028 y/o pueden unirse a anticuerpos inmunomoduladores que reconocen P3028. En un primer conjunto de experimentos, se generaron fragmentos de albúmina por digestión con tripsina y se encontró que los fragmentos trípticos se unían a células inmunitarias en el sistema de ACS descrito en el presente documento (véase el ejemplo 17). La tabla 1 proporciona una lista de fragmentos de albúmina generados por tripsina, que se unen a células inmunitarias en el sistema de ACS, tal como se detecta mediante análisis de MALDI-TOF.
Tabla 1: Fragmentos de albúmina generados por tripsina que se unen a ACS
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En un segundo conjunto de experimentos, se degradó albúmina sérica humana desnaturalizada mediante asparaginasa (ASN-N), y se evaluó la capacidad de estos fragmentos proteolíticos para unirse con células inmunitarias en el sistema de ACS. De nuevo, se identificaron los péptidos que se unen a células inmunitarias comparando disoluciones de péptidos adsorbidos y no adsorbidos usando la técnica de MALDI TOF. Estos péptidos se muestran en la tabla 2.
Tabla 2: Fragmentos de albúmina generados por Asp-N que se unen a ACS
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Adicionalmente, se sintetizaron varios péptidos sintéticos, tal como se muestra en la tabla 3, y se evaluó la unión de estas moléculas a células inmunitarias usando el sistema de ACS.
Tabla 3: Péptidos de albúmina sintéticos
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Adicionalmente, varios péptidos de fragmentos de albúmina se unen específicamente a un anticuerpo específico de dHSA con efectos inmunomoduladores (AcM A) (véase el ejemplo 18). Estos péptidos se muestran en la tabla 4. Tabla 4: Péptidos de albúmina que se unen al anticuerpo monoclonal AcM A
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Se contempla que puedan generarse inhibidores para uno cualquiera o más de los péptidos enumerados en las tablas 1-4 del mismo modo que se generaron inhibidores para P3028. En resumen, anticuerpos monoclonales y policlonales que son específicos para uno cualquiera o más de los péptidos en las tablas 1-4 pueden generarse fácilmente usando técnicas convencionales en inmunología. También pueden prepararse y aislarse fragmentos de unión de anticuerpos usando técnicas convencionales en inmunología. Estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser humanos o humanizados, tal como se describe en el presente documento. Usando un enfoque similar al descrito anteriormente y en los ejemplos 9 y 10, estos inhibidores de péptidos pueden evaluarse en un ensayo basado en chip y ensayos bioquímicos, tales como proliferación de células inmunitarias en presencia y ausencia de los inhibidores de péptidos. La sección a continuación proporciona más información sobre el desarrollo de inhibidores de péptidos inmunorreguladores, preferiblemente inhibidores de P3028.
Se contempla que los inhibidores de uno cualquiera o más de los péptidos enumerados en las tablas 1-4 puedan comprender modificaciones de la secuencia de P28R (SEQ ID NO: 2) o núcleo P28 (SEQ ID NO: 62), y además pueden ser útiles para reducir la inhibición del receptor de LFA-1, o para estimular células inmunitarias. Para identificar una modificación en péptidos inhibidores según algunas realizaciones en el presente documento, se usaron datos de barrido posicional para estudiar la influencia de la sustitución de diferentes tipos de aminoácidos en cada posición de P28R (SEQ ID NO: 2) sobre la unión de P3028 (SEQ ID NO: 185). Cada aminoácido en la secuencia de péptido P28R (SEQ ID NO: 2) se intercambió con todos los aminoácidos que se producen de manera natural, y se evaluó la unión de P3028 (SEQ ID NO: 185) a cada péptido sobre un chip de fase sólida (véase, por ejemplo, el ejemplo 36). Varias modificaciones opcionales en P28R según ejemplos en el presente documento se resumen en las tablas 5.3, 5.4, 5.5, 5.6 y 13. Opcionalmente, un péptido inhibidor según algunos ejemplos en el presente documento puede comprender una o más de las modificaciones de la tabla 5.3 o la tabla 13. Opcionalmente, un péptido inhibidor comprende un núcleo central de posiciones 2, 5-11 y 15 tal como se proporciona en la tabla 5.3, y las posiciones restantes se omiten o se sustituyen con sustancialmente cualquier aminoácido. Opcionalmente, un péptido inhibidor comprende un núcleo central de posiciones K2, T5-S11 y E15 de SEQ ID NO: 2, y las posiciones restantes se omiten o se sustituyen con sustancialmente cualquier aminoácido.
A partir de los datos de barrido posicional, se observa también que puede identificare un “péptido núcleo”, FFVKLS (SEQ ID NO: 62) (denominado en el presente documento “núcleo P28”). En algunas realizaciones, se proporciona un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en el núcleo P28 (SEQ ID NO: 62). El péptido puede comprender no más de aproximadamente 30 residuos de aminoácido, por ejemplo, no más de aproximadamente 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6 residuos de aminoácido. En algunas realizaciones, el péptido núcleo desbloquea un receptor de LFA-1 (por ejemplo, desplaza péptidos inmunorreguladores o estructuras de 3028 unidos del receptor de LFA-1) al que se han unido uno o más péptidos inmunorreguladores de las tablas 1-4.
Basándose en los datos de barrido posicional, se contempla que sustituciones de SEQ ID NO: 2 puedan ser útiles según algunas realizaciones en el presente documento para la unión a P3028, el desbloqueo del receptor de LFA-1 de la inhibición mediada por P3028 (por ejemplo, desplazando el péptido P3028 y las moléculas que contienen estructura de P3028 unidos del receptor de LFA-1) y/o la estimulación de células inmunitarias. La actividad del péptido P28R (SEQ ID NO: 2) y las modificaciones de P28R se estudiaron en un modelo ex vivo humano usando PBMC de un ser humano de control sano en cultivos a corto plazo, y con la activación de PBMC medida como un porcentaje de células con CD69 potenciada (véase el ejemplo 37). Se observó que P28R (SEQ ID NO: 2) y el péptido 31135 (KKLDTFFVILSLFTER)(SEQ iD NO: 589) estimulan directamente PBMC sanas en este modelo ex vivo, pero los péptidos 30677 (KKLDTFFVKLSLMTER)(SEQ ID NO: 583), 30678 (KKLDTFFVKLQLFTER) (SEQ ID NO: 584), 30680 (KKLDTVMVKLQLMTER) (SEQ ID NO: 585), 30864 (KSLDTFFVKLSLFTER) (SEQ ID NO: 587); 30685 (KKLDTFFVKLSLFTFR)(SEQ ID NO: 588); y 31136 (KKLDTFFVNLSLFTER)(SEQ ID NO: 590) y 31138 (KKLDTFFVDLSLFTER)(SEQ ID NO: 591) no estimulaban las PBMC sanas en este modelo ex vivo (véanse las figuras 41A y 41B). Como tal, en algunas realizaciones, una composición que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en P28R (SEQ ID NO: 2), péptido 31135 (SEQ ID NO: 589), o una combinación de P28R y péptido 31135 se proporciona para estimular directamente células inmunitarias. Como tal, en algunas realizaciones, se proporciona una composición que comprende, que consiste esencialmente en un péptido de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 62, o cualquiera de SEQ ID NO: 583-586 o 587-595, o una combinación de estos péptidos.
Se observa que el péptido 31135 comprende una Y en la posición correspondiente a la posición 9 de SEQ ID NO: 2 y la posición 4 de SEQ ID NO: 62 (véanse las tablas 5.3 y 5.5). En algunos ejemplos, se da a conocer una composición que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en un péptido modificado que comprende una modificación de P28R que comprende una Y en la posición 9 de SEQ ID NO: 2. Opcionalmente, las células inmunitarias pueden comprender células inmunitarias sanas. Opcionalmente, las células inmunitarias pueden comprender células inmunitarias en suero de pacientes con cáncer, por ejemplo, células inmunitarias de pacientes con cáncer. En algunos ejemplos, se da a conocer una composición que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en un péptido modificado que comprende una modificación del núcleo P28 que comprende una Y en la posición 4 de SEQ iD NO: 62. Opcionalmente, las células inmunitarias pueden comprender células inmunitarias sanas. Opcionalmente, las células inmunitarias pueden comprender células inmunitarias en suero de pacientes con cáncer, por ejemplo, células inmunitarias de pacientes con cáncer.
Puesto que P28R (SEQ ID NO: 2) puede unirse a P3028 y estimular PBMC de controles sanos en cultivos a corto plazo, por ejemplo cuando está en un medio de cultivo que comprende RPMI más suero AB humano normal al 10% (véase el ejemplo 37), se contempla que truncamientos de P28R según algunos ejemplos en el presente documento puedan ser útiles para la unión a inhibidores de uno cualquiera o más de los péptidos enumerados en las tablas 1-4. Se evaluaron truncamientos de P28R para determinar su capacidad para activar PBMC (véase el ejemplo 38). Se incubaron PBMC con los péptidos (40 |ig/ml) durante 24 horas en RPMI más suero AB humano al 10%. Se midió la activación de PBMC como el porcentaje de células con expresión potenciada de o bien CD69 (figura 42A) o bien CD71 (figura 42B) usando citometría de flujo. Tal como se muestra en las figuras 42A y 42B, el péptido P28R (SEQ ID NO: 2) activó eficazmente PBMC sanas en este modelo ex vivo, pero el péptido 32251 (SeQ ID NO: 592) y péptido 32230 (“núcleo P28”) (FFVKLS)(SEQ ID NO: 62) no lo hicieron. Sin embargo, también se incubaron Pb MC con los péptidos en sueros con cáncer de perros, o en sueros con cáncer de pacientes con cáncer humanos (véase la figura 43). Se observó que el péptido de longitud completa P28R (SEQ ID NO: 2) y el péptido de núcleo P28 (péptido 32230) (SEQ ID NO: 62) activaban PBMC en presencia de suero con cáncer. Como tal, se contempla que, según algunas realizaciones en el presente documento, P28R, núcleo P28, o combinaciones de estos péptidos sean útiles para estimular células inmunitarias en el suero de un sujeto que tiene cáncer.
En algunas realizaciones, se proporciona un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en el núcleo P28 (SEQ ID NO: 62), en el que el péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en el núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) puede unirse al péptido P3028 y en el que el péptido comprende no más de 30 aminoácidos. Se observó que el péptido de núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) puede unirse al péptido 3028 tan eficientemente como el péptido de longitud completa P28R, y puede inducir activación (por ejemplo proliferación, expresión potenciada de CD69 y/o CD71, secreción de IL-12 de IFNy, o secreción de perforina o granzima B, citotoxicidad, migración celular o producción de citocinas potenciadas) de PBMC en suero con cáncer (véase el ejemplo 38 y la figura 43), pero que en un modelo ex vivo que comprende cultivos a corto plazo de PBMC, el péptido de núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) no estimula la activación de PBMC (CD69 y CD71) como lo hace el péptido P2 8 R (véanse las figuras 42A y 42B). Por consiguiente, en algunas realizaciones, el péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en el núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) se une al péptido P3028 de manera tan eficaz o sustancialmente de manera tan eficaz como P28R (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, se proporciona P28R (SEQ ID NO: 2) para unirse a P3028 y desbloquear receptores celulares (por ejemplo, desplaza péptidos inmunorreguladores o estructuras de 3028 unidos de los receptores celulares). Opcionalmente P28R puede tener además una actividad estimuladora directa sobre células inmunitarias. En algunas realizaciones, el núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) se proporciona para unirse a P3028 y desbloquear receptores celulares (por ejemplo, desplaza péptidos P3028 o estructuras de 3028 unidos de los receptores celulares).
Se ha observado también que P28R biotinilado se une directamente a PBMC tal como se demuestra mediante inmunohistoquímica o formación de rosetas de perlas recubiertas con P28R (unión de perlas a las células). Por consiguiente, en algunas realizaciones, se proporciona P28R para unirse directamente a PBMC. En algunas realizaciones, se proporciona P28R que comprende un resto detectable para unirse a PBMC. En algunas realizaciones, se proporciona P28R que comprende una toxina para unirse a PBMC. En algunas realizaciones, se proporciona el péptido 31135 que comprende una toxina o un resto detectable.
El efecto de P28R (SEQ ID NO:2) sobre células cancerosas se estudió adicionalmente en modelos in vivo en ratones desnudos e inmunocompetentes. Se inyectó P28R por vía intratumoral en cáncer de páncreas humano en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos, y se indujo la apoptosis de células tumorales después de un día (véase el ejemplo 39). P28R indujo caspasa 3, un marcador de apoptosis en curso, mientras que el tratamiento de tumores con el disolvente del fármaco no indujo caspasa 3 (véanse las figuras 44A y 44B). En algunas realizaciones, P28R (SEQ ID NO: 2) tiene una acción citotóxica directa sobre células tumorales, por ejemplo, células de cáncer de próstata. Se da a conocer que un péptido de la tabla 5.3, o un péptido P28R modificado que comprende al menos una modificación de la tabla 5.2, tiene una acción citotóxica directa sobre células tumorales, por ejemplo, células de cáncer de próstata.
Puesto que se observa que P28R tiene un efecto inmunoestimulador (véase, por ejemplo, el ejemplo 37), también se evaluó la capacidad de P28R (SEQ ID NO: 2) para activar el sistema inmunitario. Se inyectó P28R, 40 microgramos en 100 microlitros, por vía intratumoral en melanoma B16 en ratones inmunocompetentes inoculados con melanoma B16, C57B1 (véase el ejemplo 40). Se extirparon los tumores después de 3 días, y se tiñeron secciones inmunohistoquímicamente usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-CD45. Las células dominantes en los tumores después del tratamiento con P28R eran células inflamatorias, tal como se indica mediante la inmunotinción de CD45450 (véase la figura 45A). La tinción no se observó 452 en una sección de tumor de control incubada con IgG de conejo a la misma concentración (figura 45B). Se contempla que en algunos ejemplos P28R (SEQ ID NO: 2), núcleo P28 (SEQ ID NO: 62), un péptido de SEQ ID NO: 586 o 589 o un péptido P28R modificado que comprende al menos una modificación de la tabla 5.2 puedan activar el sistema inmunitario, por ejemplo, para dirigir una respuesta inmunitaria contra células tumorales. En algunos ejemplos, uno o más de los péptidos enumerados se administra en o cerca de un tumor. En algunos ejemplos, uno o más de los péptidos enumerados se administra por vía peritumoral. En algunos ejemplos, uno o más de los péptidos enumerados se administra por vía sistémica.
Puesto que se contempla que las modificaciones de P28R puedan ser útiles para la estimulación de células inmunitarias, se estudió además la influencia de diversas sustituciones y adiciones de aminoácidos a P28R sobre el efecto inmunoestimulador. Se evaluaron los efectos de péptidos modificados sobre la activación de PBMC de una persona de control sana (véase el ejemplo 41). Se incubaron PBMC con los péptidos (40 |ig/ml) durante 48 horas en RPMI más suero AB humano al 10%, y se determinó la activación de PBMC mediante citometría de flujo basándose en el porcentaje de células con marcador CD69 o CD71 potenciado. Se sometieron a prueba péptidos P28R (SEQ ID NO: 2), núcleo P28 (péptido 32230) (SEQ ID NO: 62), 32251 (KKLDTFFPKLSLFTER) (SEQ ID NO: 592), 32814 (RKLDTFFVKLSLFTERRR) (SEQ ID NO: 586), 32815 (KKLDQFFVKLSQHNER) (SEQ ID NO: 595), 32665 (KKLDTFMVKLSQHTER) (SEQ ID NO: 593) y 32819 (KKLDTFFVKLSLFTER(C(PEG24))) (SEQ ID NO: 594). Tal como se muestra en la figura 46, el péptido 32814 (SEQ ID NO: 586) tenía un efecto estimulador en cultivos a corto plazo similar al de P28R (SEQ ID No : 2) (lote CS8040) para tanto la potenciación de CD69 (véase la figura 46A) como la potenciación de CD71 (véase la figura 46B). Por consiguiente, se contempla en el presente documento que
Además de aplicaciones terapéuticas, también se contemplaron aplicaciones de diagnóstico de P28R y truncamientos y modificaciones del mismo. Por ejemplo, puede obtenerse información sobre el estado inmunitario local (intratumoral) y sistémico de los pacientes usando reactivos que comprenden P28R, o un truncamiento o modificación del mismo.
Se contempla que la aparición de estructuras de 3 02 8 inmunoinhibidoras pueda identificarse mediante tinción inmunohistoquímica usando o bien un anticuerpo dirigido contra P3028 o bien usando P28R (SEQ ID NO: 2) o núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) marcados, por ejemplo, P28R o núcleo P28 biotinilados. La figura 47 muestra dos zonas de un cáncer de mama humano teñido usando P28R biotinilado. Se observa tinción 470 en la figura 47B. No se observa tinción en la figura 47A. Se indica una ausencia de tinción 472.
Como tales, pueden identificarse zonas de tumores que comprenden estructuras de P3028 (así como zonas que no comprenden estas estructuras) usando péptidos marcados según ejemplos en el presente documento. En algunas realizaciones, se proporciona un péptido de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 62, y comprende además un resto detectable. El péptido que comprende el resto detectable puede unirse a uno o más péptidos inmunorreguladores de las tablas 1-4, por ejemplo, P3028 (SEQ ID NO: 185).
Mejora de la inmunosupresión
Puesto que los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento pueden ser útiles para eliminar la inmunosupresión, algunos ejemplos dados a conocer el presente documento comprenden métodos de mejora, reducción de los síntomas de, reducción o tratamiento de la inmunosupresión. En algunos ejemplos, se identifica un sujeto que padece inmunosupresión. El sujeto puede comprender un ser humano, o un mamífero no humano. Al paciente puede administrársele una composición que comprende al menos uno de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento. La composición puede comprender al menos un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en una cualquiera de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 62, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 265-393, 583-586, 587-595, o un péptido P28R o de núcleo P28 modificado que comprende una o más de las modificaciones de la tabla 5.3 o tabla 13. El péptido puede tener una longitud menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos o una longitud definida por un intervalo entre dos cualesquiera de estos números. Opcionalmente, la composición puede comprender además un tampón tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazol-láctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO o TES. Opcionalmente, la composición puede comprender además una partícula degradable tal como se describe en el presente documento. La composición puede administrarse al sujeto por medio de una variedad de vías, por ejemplo, por vía sistémica, en el sitio de inmunosupresión (por ejemplo, si hay inmunosupresión local por un tumor), 0 cerca del sitio de inmunosupresión, por ejemplo, dentro de 10 cm, 9 cm, 8 cm, 7 cm, 6 cm, 5 cm, 4 cm, 3 cm, 2 cm, 1 cm o 0,5 cm del sitio de inmunosupresión. Opcionalmente, puede administrarse un segundo agente terapéutico además de la composición, por ejemplo, antes de, simultáneamente con o posterior a la administración de la composición. Por ejemplo, el segundo agente terapéutico puede comprender un agente inmunoestimulador.
Opcionalmente, puede detectarse activación de células inmunitarias (por ejemplo, expresión potenciada de CD69 y/o CD71, secreción de IL-12 de IFNy o secreción de perforina o granzima B, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas) del sujeto. Por ejemplo, puede detectarse la activación de células inmunitarias como expresión potenciada de uno o más marcadores de células inmunitarias, por ejemplo, CD69, CD71, y similares. La activación de células inmunitarias (por ejemplo expresión potenciada de CD69 y/o CD71, secreción de IL-12 de IFNy o secreción de perforina o granzima B, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas) puede detectarse mediante varias técnicas conocidas por el experto en la técnica, por ejemplo citometría de flujo, inmunohistoquímica, ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, inmunotransferencia, pCr cuantitativa, detección de la incorporación de BUdR para medir la proliferación, y similares. Sin querer restringirse a la teoría, diferentes tipos de células inmunosupresoras, células T reguladoras, células dendríticas inmaduras (iDC), macrófagos asociados a tumores (TAM) y células supresoras derivadas de tejido mieloide (MDSC) pueden funcionar en la inmunosupresión, y además, otros mecanismos inmunosupresores, tales como factores bloqueantes séricos, complejos inmunitarios circulantes, producción de IL-1Ra potenciada y actividad proteolítica intratumoral potenciada pueden funcionar en la inmunosupresión relacionada con el cáncer.
Como tal, en algunos ejemplos, el tratamiento, la mejora, la reducción o la reducción de los síntomas de la inmunosupresión pueden determinarse mediante un cambio en la actividad, el fenotipo o la proliferación de una célula inmunosupresora, o un cambio en el nivel de expresión o localización de un factor inmunosupresor.
Inhibidores de péptidos inmunorreguladores
Algunos ejemplos incluyen inhibidores de péptidos inmunorreguladores tales como P3028 y/o uno o más de los péptidos inmunorreguladores enumerados en las tablas 1-4 (SEQ ID NO: 183-184 y 188-246), también denominados bloqueantes de péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, parejas de unión para péptidos inmunorreguladores o inhibidores de péptidos inmunorreguladores. Los inhibidores de péptidos inmunorreguladores pueden incluir, pero sin limitarse a: péptidos, péptidos cíclicos, peptidomiméticos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos; fragmentos de anticuerpos, aptámeros de ácido nucleico; aptámeros peptídicos; y moléculas pequeñas.
La siguiente sección proporciona más detalles sobre inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
Inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
Se dan a conocer inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.
También se dan a conocer métodos que usan estos inhibidores de péptidos inmunorreguladores para inhibir la inmunosupresión en un sujeto (por ejemplo, un sujeto que tiene cáncer o una infección patógena tal como una infección bacteriana o viral). La unidad estructural de anticuerpo núcleo se sabe que comprende un tetrámero. Cada tetrámero se compone de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Un isotipo adicional, IgY, se encuentra en huéspedes aviares. Las cadenas presentan todas la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par se alinean mediante las regiones marco, permitiendo la unión a un epítopo específico. Desde la parte N-terminal a la C-terminal, tanto las cadenas ligera como pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, f R2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es según las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol.
196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).
Por consiguiente, se da a conocer una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un dominio, que se une a una o más regiones de un péptido inmunorregulador, tal como P3028 o uno o más de los péptidos inmunorreguladores proporcionados en las tablas 1-4 (SEQ ID NO: 183-184 y 188-246). En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es de un huésped de ratón, conejo, rata, hámster, cobaya, cabra, asno, bovino, caballo, camello, vaca, pollo o humano. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento es de isotipo IgG, IgM, IgA, IgD, IgE o IgY. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento es parte de una colección de anticuerpos policlonales. En algunos ejemplos, el anticuerpo es monoclonal. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento es quimérico. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento incluye al menos una región de un huésped humano, que puede ser al menos una de las siguientes: Fc; Fab; región variable de cadena ligera; CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena ligera; región variable de cadena pesada; CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada; región marco de cadena ligera; FR1, FR2, FR3 o FR4 de cadena ligera; región marco de cadena pesada; FR1, FR2, FR3 o FR4 de cadena pesada. En algunos ejemplos, el anticuerpo incluye al menos una CDR o FR de un huésped no humano. En algunos ejemplos, las regiones del anticuerpo son según la definición de Kabat. En algunos ejemplos, las regiones del anticuerpo son según la definición de Chothia. En algunos ejemplos, las regiones del anticuerpo son según una combinación de la definición de Kabat y Chothia. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo imita a uno o más de los péptidos descritos en la tabla 5.1, tabla 5.4, tabla 5.5 o tabla 5.6.
Pueden producirse fácilmente anticuerpos usando técnicas convencionales en inmunología, por ejemplo técnicas descritas en las patentes estadounidenses n.os (8.142.784 y 7.628.986). Los anticuerpos generados en huéspedes no humanos pueden humanizarse, por ejemplo, sustituyendo al menos una región variable del anticuerpo del huésped no humano en un anticuerpo humano. Además, pueden generarse anticuerpos humanos, por ejemplo, en un animal huésped transgénico. Pueden modificarse por ingeniería genética animales transgénicos (por ejemplo, ratón, tal como XENOMOUSE), tras la inmunización, para producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulinas endógenas (Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551; Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Bruggermann et al. (1993) Year in Immuno. 7:33; y la patente estadounidense n.° 5.591.669; patente estadounidense n.° 5.589.369; patente estadounidense n.° 5.545.807). Además, puede usarse tecnología de presentación en fagos (McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553) para producir anticuerpos y fragmentos de anticuerpos humanos in vitro, a partir de repertorios de genes de dominios variables (V) de inmunoglobulinas de donantes no inmunizados (Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. (1993) Current Opinion in Structural Biology 3:564-571). Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y pueden aislarse esencialmente anticuerpos frente a una serie diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) (Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597; Griffith et al. (1993) EMBO J. 12:725-734; patente estadounidense n.° 5.565.332; patente estadounidense n.° 5.573.905). Se conocen muchas bibliotecas de presentación en fagos, o pueden generarse, por ejemplo, las de la (patente estadounidense n.° 7.985.840). También pueden generarse anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitro (patente estadounidense n.° 5.567.610; patente estadounidense n.° 5.229.275). Por tanto, algunos ejemplos incluyen generar anticuerpos que se unen a P3028 (SEQ ID NO: 185) y/o los péptidos de las tablas 1-4 (SEQ ID NO: 183-184 y 188-246). En algunos ejemplos, los anticuerpos son anticuerpos humanizados que incluyen al menos una región variable de un anticuerpo de huésped no humano. En algunos ejemplos, los anticuerpos son anticuerpos humanos generados en un huésped no humano, por ejemplo, un animal transgénico. En algunos ejemplos, el animal transgénico es un ratón transgénico. En algunos ejemplos, los anticuerpos se generan in vitro. En algunos ejemplos, los anticuerpos se generan usando tecnología de presentación en fagos. En algunos ejemplos, los anticuerpos se generan en células B activadas in vitro.
Pueden configurarse anticuerpos y fragmentos de anticuerpos para suministrar compuestos citotóxicos a un sitio diana. Por tanto, algunos ejemplos incluyen anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpos unidos a compuestos citotóxicos tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se unen a los compuestos citotóxicos por medio de un ligador escindible tal como se describe en el presente documento.
Se da a conocer una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende anticuerpos o un fragmento de unión de los mismos, que se une específicamente a P3028 (SEQ ID NO: 185). Algunos ejemplos incluyen anticuerpos o fragmentos de los mismos, que se unen específicamente a un fragmento de P3028 (SEQ ID NO: 186 y 187). En el ejemplo 9 se describen anticuerpos a modo de ejemplo que se unen a P3028.
En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento del mismo descrito anteriormente puede usarse para inhibir o secuestrar P3028. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento del mismo específico para P3028 puede administrarse a un paciente que tiene al menos una célula inmunitaria unida a P3028 para desbloquear al menos uno de los receptores de LFA-1 o de IL-2 del paciente. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede administrarse a un paciente que necesita tratamiento de la inmunosupresión, tal como se describe en el presente documento, estimulando o potenciando de ese modo una respuesta inmunitaria de dicho paciente. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo puede proporcionarse a un paciente que necesita una inhibición de la inmunosupresión (por ejemplo, un sujeto que tiene cáncer o una infección patógena tal como una infección bacteriana o viral). Tras proporcionar el anticuerpo o fragmento del mismo, el paciente puede evaluarse para detectar una inhibición de la inmunosupresión, que puede lograrse determinando la infiltración de células inmunitarias de un tumor o una reducción en una infección bacteriana o viral, por ejemplo, o una respuesta inmunitaria mejorada por las PBMC de dicho sujeto.
En otros ejemplos, el anticuerpo o fragmento del mismo puede usarse para detectar la presencia de P3028, por ejemplo, en una muestra biológica. El anticuerpo o fragmento del mismo puede usarse para detectar la formación de un complejo, por ejemplo, cuando un inhibidor de péptidos inmunorreguladores (por ejemplo, un péptido de SEQ ID
NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98 o 264-393) está unido a un soporte, y el anticuerpo se usa como anticuerpo primario o fragmento del mismo para detectar la presencia de P3028 unido al inhibidor.
Se da a conocer un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de P3028 (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que imita o tiene al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 98% de identidad con uno o más de los péptidos de la tabla 5.1). El anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse específicamente a un péptido que incluye al menos una de SEQ ID
NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98 o 264-393. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento del mismo específico para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de P3028 puede usarse para detectar la presencia de un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de P3028 en una muestra biológica. El anticuerpo o fragmento del mismo específico para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de P3028 también puede usarse para detectar la formación de un complejo, por ejemplo, si P3028 está unido a un soporte, y el anticuerpo o fragmento del mismo se usa como anticuerpo primario para detectar la presencia de un inhibidor de péptidos inmunorreguladores unido a P3028.
En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento del mismo específico para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de P3028 puede usarse para aislar o identificar la presencia de un inhibidor de P3028. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo puede usarse para purificar un inhibidor que va a usarse para estimular una célula inmunitaria de un ser humano, y/o para unirse a la célula cancerosa de un ser humano.
En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento del mismo específico para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de P3028 puede usarse para detectar la presencia de P3028. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento del mismo específico para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de P3028 puede usarse para la tinción inmunohistoquímica de una muestra biológica para detectar la presencia de una célula cancerosa que se ha puesto en contacto con un inhibidor de péptidos inmunorreguladores. Por ejemplo, el anticuerpo específico para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de P3028 puede usarse en citometría de flujo para detectar y/o aislar células cancerosas o inmunitarias que están unidas a un inhibidor de péptidos inmunorreguladores. La siguiente sección proporciona más detalles sobre inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en péptidos.
Inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en péptidos
Se da a conocer un péptido aislado que comprende un dominio, que se une a una o más regiones de un péptido inmunorregulador, tal como P3028. El término “aislado” requiere que el material se retire de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si se produce de manera natural). Por ejemplo, un polinucleótido que se produce de manera natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido, separado de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. También es ventajoso que las secuencias estén en forma purificada. El término “purificado” no requiere pureza absoluta; más bien, está previsto como una definición relativa. Las proteínas aisladas se han purificado convencionalmente hasta la homogeneidad electroforética mediante tinción de Coomassie, por ejemplo. Se contempla expresamente la purificación de material de partida o material natural hasta al menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes, y más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud. Un péptido aislado puede existir, por ejemplo, sustancialmente en una forma de sal, forma de cristal, forma liofilizada, en disolución (por ejemplo, disolución acuosa que puede incluir tampón), y/o en un portador o diluyente farmacéutico. Un péptido aislado puede existir en una forma sustancialmente pura, por ejemplo una composición que incluye al menos o igual a aproximadamente el 1% del péptido en peso, por ejemplo al menos o igual a aproximadamente el 1%, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 4 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 7 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98,5, 99, 99,5, 99,9, 99,99 o 99,999% de péptido en peso.
En algunos ejemplos, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores aislados descritos en el presente documento
(por ejemplo, un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en uno cualquiera de SEQ
ID NO: 1-33, 34, 46-53, 62, 64-66, 68, 76, 94-96 ,98, 265-393, 583-586, 587-595, o un péptido P28R o de núcleo
P28 modificado que comprende una o más de las modificaciones de la tabla 5.3 o la tabla 13 tienen longitudes que son menores de o iguales a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menores de o iguales a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 4 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 7 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,
105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. Por ejemplo, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que consiste en la secuencia (FVKL) puede unirse a P3028 con una puntación de rampo comparable a inhibidores de péptidos inmunorreguladores, que comprenden FVKL, que tienen de 6 a 16 aminoácidos de longitud (véase la figura 29 y el ejemplo 12). Adicionalmente, secuencias de aminoácidos cerca de un bucle N-terminal, C-terminal o expuesto de un péptido es más probable que sean accesibles a posibles dianas de unión en vez de incorporarse en una estructura peptídica de orden superior, permitiendo por tanto que un péptido de 1100 aminoácidos o menos se una a P3028. Por tanto, algunos ejemplos de composiciones y métodos de uso de las mismas (por ejemplo, un método de unión a P3028 o un método de reducción de la inmunosupresión mediada por P3028), que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5 o 5.6). Deseablemente, estos péptidos (por ejemplo, uno cualquiera o más de los péptidos de la tabla 5.1, 5.4, 5.5 o 5.6) tienen longitudes que son menores de o iguales a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menores de o iguales a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,127, 128, 129,130, 131,132, 133, 134,135, 136, 137,138, 139, 140,150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,1000,1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Tabla 5.1: Secuencias y puntuaciones de Rampo correspondientes
Figure imgf000038_0002
Figure imgf000038_0001
KKLDTFFVKLSLFMER 501 KKLDTFFVKLSMFTER 499 KKLDTFFVKLSMFTER 499 KKLDTPFVKLSLFTER 497 KKLDTFFVKGSLFTER 495 KKLDTFFVKLSLTTER 494 KKLATFFVKLSLFTER 494 TKLDTFFVKLSLFTER 493 KKDDTFFVKLSLFTER 492 KKLDTFFVKLSRFTER 483 IKLDTFFVKLSLFTER 483 KKLDTTFVKLSLFTER 481 KKLDTFFVKLSSFTER 478 KKHDTFFVKLSLFTER
Figure imgf000039_0001
477 KKLDMFFVKLSLFTER 475 KKQDTFFVKLSLFTER 473 KKLDTFFVKQSLFTER 470 KKLDTFFVKLSLITER 468 KKLDTMFVKLSLFTER 467 KKLDTIFVKLSLFTER 466 AKLDTFFVKLSLFTER 466 KKLDTFFVKLSLFHER 463 KKLDTFFVKLSNFTER 462 KKLDTFFVKLSAFTER 462 KKLDTFFVKLSLFTER 460 KKLDTFFVKLSHFTER 460 KKLDTFFVKMSLFTER 460 KKMDTFFVKLSLFTER 460 KKLDSFFVKLSLFTER 458 MKLDTFFVKLSLFTER 457 KKLDTFFVKLSIFTER
Figure imgf000039_0003
456 KKLDTFFPKLSLFTER 456 QKLDTFFVKLSLFTER 455 KKIDTFFVKLSLFTER 454 KKLDTFFVKLNLFTER 451 KKTDTFFVKLSLFTER 451 KKLDCFFVKLSLFTER 449 LKLDTFFVKLSLFTER 449 KKLDTFFVKLSLLTER 448 KKLDTFIVKLSLFTER 446 KKLDTFFVKLSLVTER 446 KKLDTNFVKLSLFTER 446 KKLDTFFVKLSLFTER 445 NKLDTFFVKLSLFTER 445 KKLWTFFVKLSLFTER 443 KKLDTFFVKLSLFTER 442 VKLDTFFVKLSLFTER 442
Figure imgf000039_0005
Figure imgf000039_0002
KKLDTFFVKRSLFTER
Figure imgf000039_0004
439
Figure imgf000040_0001
KKLDTFDVKLSLFTER 301 KKLDTFFVKLSLFQER 301 KYLDTFFVKLSLFTER 301 KKLDTFFAKLSLFTER 299 KKLDTFFTKLSLFTER 298 KKLDTFFVKLSPFTER 297 KKLDTFFVKLSLFTEF 297 KKLNTFFVKLSLFTER 296 KCLDTFFVKLSLFTER 295 KKLDDFFVKLSLFTER 295 KKLDIFFVKLSLFTER 293 KKLDTFFVKHSLFTER 293 KKLDTFFVKLSLFTET 292 KKLDTFFVKLSLYTER 291 KKLDTFFVKLSLFTEK 291 KKLDFFFVKLSLFTER 290 KKLDTFFVKLILFTER 289 KKLDTFFVKLGLFTER 288 KKLDTFFVKKSLFTER 285 WKLDTFFVKLSLFTER 284 KKLDTFFVKCSLFTER 283 KKLDTFFVMLSLFTER 283 KSLDTFFVKLSLFTER 281 KKLDTFFVSLSLFTER
Figure imgf000041_0001
274 KKLKTFFVKLSLFTER 274 KKLDTFFQKLSLFTER 271 KKLDTFFVKLSLFYER 270 KKLGTFFVKLSLFTER 264 KKLDTFFVKLSLFRER 264 KKLDTFFVKLSLFTER 260 KKLDTFFVKLSLFKER 259 KKLDTFFVNLSLFTER 256 KKLDTFFCKLSLFTER 254 KKLDTFFVKLSLFCER 254 KKLDTFFVKLSLFTEV 254 KKLDTFFKKLSLFTER 253 KKLDTFFVKLFLFTER 250 KKLDTFFWLSLFTER 248 KKLDTFFVKLSLFTMR 247 KKLDTFFVKLSLFTLR 246 KKLDTFFVWLSLFTER 245 KKLDTFFVELSLFTER 240 KKLDTFFVKLSLFTEH 239 KKLDTFFVKLSLFTEM 238 KKLDKFFVKLSLFTER 237 KKLDTFFVKLSLFTRR 237 KKLDTFFVKLELFTER 234
Figure imgf000041_0003
KKLDTFFVKLSLFTEP
Figure imgf000041_0002
234
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Figure imgf000042_0002
Tal como se muestra en el ejemplo 12, al menos 31 sustituciones de un solo aminoácido de P28R mostradas en la tabla 6.1 (SEQ ID NO: 3-34) se unen a P3028 con una puntuación de rampo mayor que P28R. Adicionalmente, al menos 4 sustituciones individuales de residuos de glicina por residuos de p28R (SEQ ID NO: 94-96 y 98) se unen a P3028 con puntuaciones de rampo al menos comparables P28R, por ejemplo una puntuación de rampo mayor de aproximadamente 500. Adicionalmente, al menos 129 sustituciones de un solo aminoácido se unen a P3028 con una puntuación de rampo al menos sustancialmente igual a (es decir, al menos el 98% de) P28R, tal como se muestra en la tabla 6.2 (SEQ ID NO: 268-393). Adicionalmente, truncamientos de al menos la arginina N-terminal de P28R (SEQ ID NO: 34) y hasta los primeros 8 aminoácidos C-terminales de P28R (SEQ ID NO: 46-53) proporcionan péptidos con puntuaciones de rampo al menos comparables a P28R. Adicionalmente, al menos algunas deleciones de residuos de aminoácidos internos de P28 (SEQ ID NO: 64-66, 6 8 , 76) proporcionan péptidos con puntuaciones de rampo al menos comparables a P28R. Por tanto, se dan a conocer en el presente documento péptidos que incluyen sustituciones de P28R que incluyen combinaciones de dos o más de las sustituciones de SEQ ID NO: 3-34. Además, se dan a conocer en el presente documento péptidos que incluyen al menos una deleción de P28R como en SEQ ID NO: 34, 46-53, 64-66, 6 8 y/o 74, y al menos una sustitución (de un residuo no delecionado) de P28R como en SEQ ID NO: 3-34, 94-96, 98 y/o 268-393.
Por consiguiente, algunos ejemplos se refieren a composiciones que comprenden, consiste en o consisten esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende, consiste en o consiste esencialmente en la fórmula (I):
Fórmula (I):
XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166)
en la que X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente.
X1 puede ser uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL.
X2 puede ser uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH.
X3 puede ser uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR.
X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente.
En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS.
En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (I) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Algunos ejemplos se refieren a composiciones que comprenden, consisten en o consisten esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende, consiste en o consiste esencialmente en la fórmula (II): Fórmula (II):
X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173)
en la que X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD, o D o está ausente.
X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente.
X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente.
En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (II) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Algunos ejemplos se refieren a composiciones que comprenden, consisten en o consisten esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende, consiste en o consiste esencialmente en la fórmula (III): Fórmula (III):
X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178)
en la que X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente.
X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F.
X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S.
X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F.
X34 es una secuencia opcional, y puede ser R, o está ausente.
En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (III) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400,450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Algunos ejemplos se refieren a composiciones que comprenden, consisten en o consisten esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende, consiste en o consiste esencialmente en la fórmula (VII): Fórmula (VII):
X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394),
en la que X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente.
X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente.
X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente.
X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente.
X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente.
X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente.
X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente.
X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente.
X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente.
X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente.
X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente.
X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente.
En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Algunos ejemplos se refieren a composiciones que comprenden, consisten en o consisten esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende, consiste en o consiste esencialmente en la fórmula (VIII): Fórmula (VIII):
X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395)
en la que X800 es K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente.
X801 es LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente;
en la que X802 es LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente; y
en la que X803 es R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente.
En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Algunos ejemplos se refieren a composiciones que comprenden, consisten en o consisten esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1 usado en estas composiciones tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150,160, 170, 180,190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunos ejemplos, el péptido comprende una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96 o 98. De nuevo, este péptido aislado puede tener una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Las realizaciones de la invención también incluyen un péptido aislado tal como se define mediante las reivindicaciones que tiene una afinidad específica por secuencias o estructuras de P3028. En algunas realizaciones, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores tienen afinidad específica por secuencias o estructuras de P3028 tal como se mide mediante un ensayo de rampo en el que los inhibidores de péptidos inmunorreguladores se fijan a una fase sólida, se añade P3028 y se mide la actividad enzimática de un anticuerpo secundario de rampo para detectar la unión (véase el ejemplo 12). En algunas realizaciones, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores se unen a estructuras o secuencias de P3028 con una puntuación de rampo que es al menos sustancialmente igual a la puntuación de rampo de P28R (véase el ejemplo 12, tabla 6.2). Preferiblemente, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores tienen una afinidad específica por P3028 mediante este ensayo de rampo de al menos o igual a aproximadamente 300 unidades de rampo, por ejemplo, al menos o igual a aproximadamente 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450,460, 470, 480,490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 820, 840, 860, 880, 900, 920, 940, 960, 980, 1000, 1020 o 1040 unidades de rampo, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunas realizaciones, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores se unen a estructuras o secuencias de P3028 con una puntuación de rampo de al menos 500 (véase el ejemplo 12, tabla 6.1). En el ejemplo 12 se proporcionan péptidos a modo de ejemplo con afinidad por P3028 (véanse las tablas 6.1,6.2, y las figuras 29-30).
Se dan a conocer inhibidores de péptidos inmunorreguladores aislados que tienen una afinidad por uno cualquiera o más de los péptidos inmunorreguladores enumerados en las tablas 1-4 (SEQ ID NO: 183-184 y 188-246). En algunos ejemplos, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores tienen afinidad específica por uno cualquiera o más de los péptidos inmunorreguladores enumerados en las tablas 1-4 (SEQ ID NO: 183-184 y 188-246), tal como se mide mediante un ensayo de rampo en el que los inhibidores de péptidos inmunorreguladores se fijan a una fase sólida, se añade uno cualquiera o más de los péptidos inmunorreguladores enumerados en las tablas 1-4 (SEQ ID NO: 183-184 y 188-246) y se mide la actividad enzimática de un anticuerpo secundario de rampo para detectar la unión. Por ejemplo, cualquier péptido proporcionado en la tabla 5.1 y cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede ponerse en práctica usando uno o más de los péptidos descritos en la tabla 5.1. Preferiblemente, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores tienen una afinidad específica por uno cualquiera o más de los péptidos inmunorreguladores enumerados en las tablas 1-4 (SEQ ID NO: 183-184 y 188-246) mediante este ensayo de rampo de al menos o igual a aproximadamente 300 unidades de rampo, por ejemplo, al menos o igual a aproximadamente 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470,480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 820, 840, 860, 880, 900, 920, 940, 960, 980, 1000, 1020 o 1040 unidades de rampo, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Variaciones de secuencias peptídicas
Se ha mostrado que varias variaciones de secuencia para el inhibidor de péptidos inmunorreguladores P28R (KKLDTFFVKLSLFTER; SEQ ID NO: 2) tienen actividad inmunoestimuladora y/o citotoxicidad para células tumorales (véanse los ejemplos 37-40). Sin querer restringirse a la teoría, SEQ ID NO: 2 y variaciones de SEQ ID NO: 2 tal como se describe en la tabla 5.3 por ejemplo, uno o más de los péptidos de la tabla 5.4 pueden ser útiles para la unión al péptido 3028 (SEQ ID NO: 185), unión a un péptido o fragmento de albúmina que comprende SEQ ID NO: 185, unión a uno cualquiera o más de los péptidos enumerados en las tablas 1-4, estimulando directamente células inmunitarias y/o destruyendo células tumorales según algunos ejemplos en el presente documento (véanse los ejemplos 36-40). Como tal, en algunos ejemplos, un péptido inhibidor de péptidos inmunorreguladores comprende, consiste en o consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos con una o más de las modificaciones en SEQ ID NO: 2 tal como se muestra en la tabla 5.3, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 modificaciones, por ejemplo, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 7-8, 7-9, 7-10, 8-9, 8-10 o 9-10 variaciones. El péptido inhibidor puede comprender además una variación adicional en una o más de las posiciones 1, 3-4, 12-14 o 16 en SEQ ID NO: 2, en la que la variación adicional comprende cualquier aminoácido o la ausencia de un aminoácido, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 variaciones adicionales:
Tabla 5.3
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En algunos ejemplos, el péptido variado no comprende una M en la posición 8. En algunos ejemplos, el péptido variado no comprende una M en la posición 9. En algunos ejemplos, el péptido variado no comprende una M en la posición 15. En algunos ejemplos, el péptido modificado no comprende una M en cualquiera de las posiciones 8, 9 o 15.
Por consiguiente, en algunos ejemplos, el péptido inhibidor que comprende una variación de P28R comprende, consiste esencialmente en o consiste en un péptido de fórmula (IX):
Fórmula (IX)
X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917,
en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente,
X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N,
X903 es cualquier aminoácido,
X904 es cualquier aminoácido,
X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W,
X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo,
X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo,
X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F,
X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y,
X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente,
X911 es un aminoácido polar no cargado o H,
X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente,
X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente,
X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente,
X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q,
Xgi6 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente, y
Xgi7 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente.
Opcionalmente, Xgoi comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente, Xgoi es una R o K. Opcional, Xgi7 comprende o consiste en RR.
Se ha mostrado que varios inhibidores de péptidos basados en la variación de péptidos descritos en el presente documento estimulan células inmunitarias (véase el ejemplo 36). Se muestran péptidos variados a modo de ejemplo en la tabla 5.4. Por consiguiente, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptido comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido de la tabla 5.4. En las tablas 5.5 y 5.6 se muestran péptidos variados a modo de ejemplo adicionales que tienen baja unión a P3028 (véase el ejemplo 36) o baja estimulación de PBMC sanas en suero sano (véase el ejemplo 37). En algunos ejemplos, se da a conocer un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en un péptido de la tabla 5.4, 5.5 o 5.6. En una realización, el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos Rk LDTFFVKLSLFTERRR (SEQ ID NO: 586).
Tabla 5.4: Péptidos con “alta” unión a P3028 basándose en barridos posicionales
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Tabla 5.5: Péptidos con “baja” unión a P3028 basándose en barridos posicionales
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Tabla 5.6: Modificación adicional de P28R
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Se dan a conocer péptidos y proteínas con identidad con un inhibidor de péptidos inmunorreguladores aislado descrito en el presente documento. El término “identidad” pretende incluir homología de secuencia de ácido nucleico o proteína u homología tridimensional. Existen varias técnicas para determinar la homología de secuencia de ácido nucleico o péptido y/u homología tridimensional con péptidos. Estos métodos se emplean de manera rutinaria para descubrir el grado de identidad que una secuencia, dominio o modelo tiene con una secuencia, dominio o modelo diana. Una gran gama de inhibidores de péptidos inmunorreguladores funcionales (por ejemplo, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores para secuencias o estructuras de P3028) pueden incorporar características de inhibidores de péptidos dados a conocer en el presente documento, proporcionando por tanto un gran grado de identidad con los inhibidores de péptidos inmunorreguladores de SEQ ID No : i -33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, g4-g6, g8, 264-3g3, 583-586 o 58g. Por ejemplo, una proteína de fusión que tiene una región pequeña de un inhibidor puede presentar un bajo grado de identidad global con un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de SEQ ID NO: i -33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, g4-g6, g8, 264-3g3, 583-586 o 58g, conservando aún la capacidad de funcionar como inhibidor (por ejemplo, un inhibidor de P3028, tal como una molécula que se une a P3028), o de potenciar la estimulación de células inmunitarias por medio del receptor de LFA-1 y/o de IL-2 (por ejemplo, modular, regular por incremento o regular por disminución un marcador del sistema inmunitario o la inmunosupresión, tal como reduciendo una inhibición mediada por P3028 de la proliferación, diseminación, migración de células inmunitarias, o citotoxicidad de células NK), o de potenciar la estimulación de células inmunitarias. Por tanto, los ejemplos dados a conocer en el presente documento pueden tener desde el 1% de identidad hasta el 100% de identidad con las secuencias de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 62, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589. Es decir, los ejemplos pueden tener al menos o igual a aproximadamente el 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46­ 53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589. Preferiblemente, estos péptidos o péptidos modificados pueden conservar también la capacidad de modular el sistema inmunitario (por ejemplo, modular, regular por incremento o regular por disminución un marcador del sistema inmunitario o la inmunosupresión, tal como reduciendo una inhibición mediada por P3028 de la proliferación, diseminación, migración de células inmunitarias, o citotoxicidad de células NK).
Las realizaciones también incluyen composiciones que comprenden multímeros del péptido aislado (inhibidores y/o inhibidores de péptidos inmunorreguladores aislados) de la presente invención unidos a un soporte. Algunas realizaciones incluyen composiciones que comprenden los multímeros de péptidos que incluyen múltiples copias de un único péptido aislado de la invención tal como se define mediante las reivindicaciones. Algunas realizaciones incluyen composiciones que comprenden multímeros que incluyen dos o más inhibidores de péptidos inmunorreguladores diferentes. Algunos multímeros incluyen al menos o igual a dos inhibidores de péptidos inmunorreguladores, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100 o 101 inhibidores de péptidos inmunorreguladores. En algunas realizaciones, los multímeros son del mismo péptido aislado de la invención tal como se define mediante las reivindicaciones y en otras realizaciones, los multímeros son de diferentes péptidos aislados de la invención tal como se define mediante las reivindicaciones. Por consiguiente, algunas realizaciones se refieren a composiciones que comprenden uno o más inhibidores de péptidos inmunorreguladores y en algunas realizaciones, el uno o más inhibidores de péptidos inmunorreguladores son multímeros de la misma molécula.
Métodos de preparación de inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en péptidos
En la técnica se conocen muchos métodos de preparación de péptidos. Pueden encontrarse ejemplos de métodos de preparación de péptidos en la patente estadounidense n.°: 6.495.674. En algunos ejemplos, los inhibidores de péptidos se sintetizan químicamente. Se conoce bien la síntesis química de péptidos también. Por ejemplo, puede usarse síntesis química en fase sólida para producir péptidos de hasta al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud. Por consiguiente, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores es un péptido sintético.
En otras realizaciones, el péptido aislado de la presente invención se prepara mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Tales métodos pueden usarse para construir vectores de expresión que contienen secuencias de nucleótidos que codifican para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores, por ejemplo, y señales de control de la transcripción y traducción apropiadas. Estos métodos pueden incluir, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Alternativamente, puede sintetizarse químicamente ARN capaz de codificar para un inhibidor de péptido usando, por ejemplo, sintetizadores. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M. J. ed., IRL Press, Oxford. Alternativamente, puede proporcionarse un ADN o ARN que codifica para un péptido o proteína sustancialmente más largo que el inhibidor de péptido, en el que el inhibidor de péptido está flanqueado por sitios diana de proteasas, produciendo por tanto el inhibidor de péptido a partir de un péptido o proteína más grande. Las proteasas a modo de ejemplo incluyen trombina, tripsina, quimotripsina, LysC, GluC y AspN. Alternativamente, puede proporcionarse un ADN o ARN que codifica para dos o más copias del inhibidor de péptido, en el que los inhibidores de péptido están flanqueados por sitios diana de proteasas, produciendo por tanto el inhibidor de péptido a partir de un péptido o proteína más grande. Por tanto, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptido de P3028 se produce mediante un ribosoma.
En varios ejemplos, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores se expresan en una línea celular. Por ejemplo, se proporciona a algunas células un ácido nucleico que codifica para uno o más inhibidores de péptidos inmunorreguladores, se hace que dichas células expresen los péptidos de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1 y los inhibidores de péptidos inmunorreguladores se aíslan y/o se purifican. Se enumeran ácidos nucleicos a modo de ejemplo en la tabla 5.2, SEQ ID NO: 102-165.
Puede utilizarse una variedad de sistemas de huésped-vector de expresión para expresar péptidos inhibidores de algunas realizaciones de la invención. Cuando el inhibidor de péptidos inmunorreguladores es un péptido soluble, puede recuperarse del cultivo, es decir, de la célula huésped en casos en los que el péptido o polipéptido no se secreta, y de los medios de cultivo en casos en los que el péptido o polipéptido se secreta por las células. Sin embargo, los sistemas de expresión también abarcan células huésped modificadas por ingeniería genética que expresan el péptido o equivalentes funcionales in situ, es decir, anclados en la membrana celular. La purificación o el enriquecimiento del péptido a partir de tales sistemas de expresión puede lograrse usando micelas lipídicas y detergentes apropiados y métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Sin embargo, tales células huésped modificadas por ingeniería genética pueden usarse por sí mismas en situaciones en las que es importante no sólo conservar las características estructurales y funcionales del péptido, sino también evaluar la actividad biológica, por ejemplo, en ensayos de examen de fármacos.
Los sistemas de expresión que pueden usarse para los fines de la invención incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli o B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias de nucleótidos que codifican para péptidos inhibidores; levadura (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformada con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen las secuencias de nucleótidos que codifican para péptidos inhibidores; sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen secuencias que codifican para péptidos inhibidores; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias de nucleótidos que codifican para péptidos inhibidores; sistemas de células de mamífero (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el virus promotor de 7,5 K de virus vaccinia); o sistemas de expresión libres de células, que pueden incluir lisados celulares o fracciones de los mismos, y ácidos nucleicos que codifican para los péptidos inhibidores.
En sistemas bacterianos, varios vectores de expresión pueden seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso previsto para el péptido que está produciéndose. Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de un péptido de este tipo, para la generación de composiciones farmacéuticas o para generar anticuerpos frente al péptido, por ejemplo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J., 2:1791 (1983), en el que la secuencia codificante del péptido inhibidor puede ligarse individualmente en el vector en marco con la región codificante de lacZ de modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res., 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem., 264:5503-5509 (1989)); y similares. También pueden usarse vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse a partir de células lisadas mediante adsorción a perlas de glutatión-agarosa seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores PGEX están diseñados para incluir sitios de escisión de proteasas de trombina o factor Xa de modo que el producto génico diana clonado pueda liberarse del resto de GST.
En un sistema de insectos, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de péptido puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y colocarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina). La inserción satisfactoria de la secuencia codificante de péptido dará como resultado la inactivación del gen de polihedrina y la producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que carece de la cubierta proteínica codificada por el gen de polihedrina). Estos virus recombinantes se usan entonces para infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se expresa el gen insertado. (Véanse, por ejemplo, Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983); y Smith, patente estadounidense n.° 4.215.051).
En células huésped de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus. En casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia de nucleótidos de interés puede ligarse a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico puede insertarse entonces en el genoma de adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el péptido en huéspedes infectados (véase, por ejemplo, Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659 (1984)). También pueden requerirse señales de iniciación específicas para la traducción eficaz de secuencias de nucleótidos insertadas que codifican para péptidos. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes.
En sistemas libres de células, se proporcionan extractos celulares, o fracciones de los mismos para la traducción de ácidos nucleicos en polipéptidos in vitro. Los sistemas libres de células pueden incluir, por ejemplo, extractos de E. coli, extractos de levaduras. Los extractos pueden ser lisados. Los extractos pueden purificarse, por ejemplo, para enriquecer ribosomas y/o para eliminar materiales no deseados tales como residuos o ADN genómico del huésped.
Los ácidos nucleicos que codifican para inhibidores de péptidos inmunorreguladores en sistemas libres de células pueden incluir ADN de plásmido, ADN lineal o ARN.
En algunos ejemplos, se aíslan o se purifican inhibidores de péptidos inmunorreguladores tras su expresión. El aislamiento o la purificación puede incluir purificación por afinidad. En algunas realizaciones, el producto peptídico del sistema de expresión incluye una etiqueta de afinidad, por ejemplo, GST separada por un ligador escindible, por ejemplo, un sitio de escisión de proteasas de trombina o factor Xa. Tras la purificación por afinidad, la etiqueta de afinidad puede escindirse, produciendo un péptido sustancialmente puro que no tiene una etiqueta de afinidad o sitio de escisión. En algunos ejemplos, la purificación da como resultado una composición que es al menos o igual a aproximadamente el 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 5 60, 61, 62, 63, 64,
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65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 8 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98,5, 99, 99,5, 99,9, 99,99 o 99,999% de péptido en peso. La sección a continuación proporciona más información sobre portadores y diluyentes farmacéuticamente aceptables que pueden usarse con los ejemplos descritos en el presente documento.
D aminoácidos y aminoácidos no naturales
Algunos ejemplos incluyen composiciones que comprenden, consisten o consisten esencialmente en uno o más inhibidores de péptidos inmunorreguladores que incluyen al menos un D aminoácido. Con la excepción de glicina, el carbono quiral de un aminoácido puede existir como el isómero D o el L. Normalmente, los aminoácidos sintetizados por ribosomas están en la configuración L. Sin embargo, los péptidos que incluyen D aminoácidos, o una combinación de D y L aminoácidos, pueden tener actividad, por ejemplo, como ligandos o inhibidores. Por ejemplo, un péptido que incluye al menos un D aminoácido puede unirse a la secuencia/estructura de P3028 e inhibir la capacidad de la secuencia/estructura de P3028 de unirse al receptor de LFA-1 y/o el receptor de IL-2.
Por consiguiente, algunos ejemplos incluyen inhibidores de péptidos inmunorreguladores que comprenden al menos un aminoácido no natural. Los aminoácidos no naturales incluyen aminoácidos que tienen grupos R distintos del grupo R de los 20 aminoácidos codificados por el código genético convencional. Los aminoácidos no naturales pueden existir en la configuración L o D. Por tanto, algunas realizaciones incluyen péptidos que tienen aminoácidos no naturales en la configuración D y/o la configuración L. Se describen aminoácidos no naturales a modo de ejemplo en las patentes estadounidenses n.os: 8.153.758, 7.888.533, 6.344.483. Algunos ejemplos se refieren a una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento (por ejemplo, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de la secuencia/estructura de P3028, tal como uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, en la que dicho inhibidor de péptidos inmunorreguladores comprende al menos un D aminoácido. De manera similar, algunos ejemplos se refieren a una composición que comprende un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de la secuencia/estructura de P3028, en la que dichos inhibidores de péptidos inmunorreguladores (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96,
98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6 o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y
13 comprende al menos un aminoácido no natural. Los ejemplos adicionales incluyen una composición que comprende un inhibidor de péptidos inmunorreguladores (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393,
583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, en la que cada aminoácido distinto de glicina del inhibidor de péptidos inmunorreguladores es un D aminoácido.
La estructura cristalina del receptor de IL-2 (CD25) se ha resuelto, y se ha realizado el modelado por ordenador de la unión de P3028 al sitio de unión a IL-2 del receptor de IL-2 (véase la figura 19). Además, la estructura cristalina del dominio de unión a ligando de IL-2 se conoce (véase Qu, A y Leahy, DJ, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995, 92:
10277-10281). Además, interacciones favorables entre P3028 y al menos un inhibidor de péptidos inmunorreguladores pueden facilitar la selección de residuos de aminoácido, residuos de D aminoácido y/o residuos de aminoácidos no naturales adicionales para mantener interacciones favorables.
En algunos ejemplos, al menos algunos de estos inhibidores de péptidos inmunorreguladores incluyen posiciones de
D aminoácidos que se seleccionan usando diseño racional o inhibidores de la secuencia/estructura de P3028. Tal como se indica en la patente estadounidense n.° 7.957.912, el diseño racional de péptidos puede comenzar con una estructura principal de proteína y diseña la secuencia de aminoácidos para modificar las propiedades de la proteína, al tiempo que mantiene sus propiedades de plegamiento tridimensional. En algunos ejemplos, pueden manipularse grandes números de secuencias usando modelado por ordenador, permitiendo el diseño de estructuras proteicas (secuencias, subsecuencias, etc.). Se describen aspectos del diseño racional en varias publicaciones, incluyendo, por ejemplo, Malakauskas y Mayo (1998) “Design, Structure and Stability of a Hiperthermophilic Protein Variant” Nature Struc. Biol. 5:470; Dahiyat y Mayo (1997) “De Novo Protein Design: Fully Automated Sequence Selection” Science, 278, 82-87. DeGrado, (1997) “Proteins from Scratch” Science, 278:80-81; Dahiyat, Sarisky y Mayo (1997) “De Novo Protein Design: Towards Fully Automated Sequence Selection” J. Mol. Biol. 273:789-796; Dahiyat y Mayo (1997) “Probing the Role of Pachng Specificity in Protein Design” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:10172-10177; Hellinga (1997) “Rational Protein Design--Combining Theory and Experiment” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10015­ 10017; Su y Mayo (1997 j “Coupling Backbone Flexibility and Amino Acid Sequence Selection in Protein Design” Prot. Sci. 6:1701-1707; Dahiyat, Gordon y Mayo (1997) “Automated Design of the Surface Positions of Protein Helices” Prot. Sci., 6:1333-1337; Dahiyat y Mayo (1996) “Protein Design Automación” Prot. Sci., 5:895-903.
En algunos ejemplos, se examina una biblioteca de variantes de inhibidores de péptidos inmunorreguladores de la secuencia/estructura de P3028 que contienen uno más D aminoácidos y/o aminoácidos no naturales para detectar la unión a la secuencia/estructura de P3028. En algunos ejemplos, la biblioteca se examina para detectar la unión a P3028 (véanse los ejemplos 10 y 12). En algunos ejemplos, la biblioteca se examina para detectar la inhibición de la unión de la secuencia/estructura de P3028 al receptor de LFA-1 (véase el ejemplo 15).
En algunos ejemplos, se usa una molécula líder como molde para el diseño de fármacos dirigido. Un péptido líder, por ejemplo, puede incluir, pero no se limita a uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento, tal como en el ejemplo 12, (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de p28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13). El péptido líder puede sintetizarse para incluir al menos un D aminoácido y/o al menos un aminoácido no natural. En algunos ejemplos, se detecta entonces la actividad de unión del inhibidor de péptidos inmunorreguladores artificial de primera generación, por ejemplo, evaluando la afinidad de unión por la secuencia/estructura de P3028, tal como se describe en el presente documento. Adicionalmente, puede detectarse la actividad inmunoestimuladora del inhibidor de péptidos inmunorreguladores artificial de primera generación, por ejemplo, evaluando la estimulación de una respuesta dependiente de LFA-1 y/o IL-2 en una célula que tiene un receptor de LFA-1 o receptor de IL-2, que puede inhibirse mediante la secuencia/estructura de P3028. Una vez obtenida la unión y/o actividad inmunoestimuladora del inhibidor de péptidos inmunorreguladores artificial de primera generación, se hace al menos una modificación adicional en el péptido líder y se evalúa este inhibidor de péptidos inmunorreguladores de segunda generación para detectar la unión a la secuencia/estructura de P3028 y la actividad inmunoestimuladora. La modificación adicional puede incluir, pero no se limita a, la adición o sustitución de al menos un D aminoácido y/o un aminoácido no natural adicional. Realizando de manera iterativa este procedimiento de examen y modificación, pueden prepararse más inhibidores de péptidos inmunorreguladores.
Adicionalmente, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5,4, 5,5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 puede comprender un grupo acetilo N-terminal y/o un grupo amida C-terminal. Además, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento que comprende al menos un D aminoácido y/o al menos un aminoácido no natural (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 puede prepararse para comprender un grupo acetilo N-terminal y/o un grupo amida C-terminal).
Peptidomiméticos
Se dan a conocer en el presente documento composiciones que comprenden, consisten en o consisten esencialmente en inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en peptidomiméticos. Los peptidomiméticos pueden incluir, pero no se limitan a, compuestos de molécula pequeña que tienen al menos una interacción bioquímica que tiene también un péptido. Algunos peptidomiméticos pueden incluir una estructura principal de molécula pequeña. Algunos peptidomiméticos pueden incluir al menos un grupo R de un aminoácido que se produce de manera natural covalentemente unido a una estructura principal de molécula pequeña. Algunos peptidomiméticos están sustituidos en al menos una posición de una secuencia peptídica conocida. Por consiguiente, algunas realizaciones incluyen una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID nO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13), en la que dicho inhibidor de péptidos inmunorreguladores comprende al menos una sustitución de peptidomimético (por ejemplo, un enlace no peptídico, una estructura principal de molécula pequeña o una unión peptídica artificial).
Se da a conocer en el presente documento una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores aislados a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, en la que dichos inhibidores inmunorreguladores comprenden una sustitución de peptidomimético, que incluye dos o más monómeros, en el que cada monómero comprende una estructura principal de molécula pequeña covalentemente unida a al menos un grupo R. Más ejemplos incluyen una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporciona en las tablas 5.3 y 13, en la que dichos inhibidores inmunorreguladores comprenden al menos una estructura principal de molécula pequeña de peptidomimético, en la que cada molécula de estructura principal incluye uno de un grupo arilo, por ejemplo un benceno, pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, triazol, pirazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares; un cicloalcano o heterocicloalcano; un cicloalqueno o heterocicloalqueno; o una combinación de dos o más de las moléculas enumeradas. Cada grupo R puede ser el grupo R de un aminoácido que se produce de manera natural, u opcionalmente puede ser una molécula sintética. Cada grupo R puede ser diferente, pero dos o más grupos R pueden ser iguales. Algunos peptidomiméticos incluyen un primer monómero que se une a una primera posición de P3028, por ejemplo, y un segundo monómero que se une a una segunda posición de P3028, en los que los monómeros primero y segundo están unidos covalentemente (véase, por ejemplo, el enfoque de Chen et al., ACS Chemical Biology 2009; 4(9): 769-81). La estructura principal de peptidomimético que se incorpora en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionada en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 puede incluir un derivado de un compuesto cíclico de peptidomimético de giro p de fórmula (IV), tal como se enseña mediante la patente estadounidense n.° 6.881.719:
Fórmula (IV)
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En algunos ejemplos, R1 y R3 de la fórmula (IV) anterior incluyen grupos R de aminoácidos naturales y/o sintéticos. Algunos ejemplos incluyen una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 dados a conocer en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ iD NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13), en la que dichos inhibidores inmunorreguladores comprenden una sustitución de peptidomimético que incluye un polímero de dos o más derivados de fórmula (IV). En algunos ejemplos, se seleccionan monómeros o dímeros de peptidomiméticos individuales derivados de la fórmula (IV) por su capacidad para unirse a la secuencia/estructura de P3028, y luego se ensamblan para dar polímeros, produciendo por tanto un polímero de peptidomimético que se une específicamente a la secuencia/estructura de P3028.
Tal como se describe en la patente estadounidense n.° 7.816.324, pueden modificarse peptidomiméticos de o bien fórmula (V) o bien fórmula (VI) para imitar motivos de alfa-hélice que se unen a péptidos.
Fórmula (V)
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Fórmula (VI)
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Por consiguiente, se da a conocer en el presente documento una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13), en la que dichos inhibidores inmunorreguladores comprenden una sustitución de peptidomimético que incorpora el armazón de fórmula V o fórmula VI, que proporciona una estructura rígida y coloca y orienta los sustituyentes como lo hace una alfa-hélice. La sustitución en la tris-benzamida rígida, por ejemplo, puede permitir la colocación de tres grupos funcionales (R1-R3) correspondientes a las cadenas laterales de aminoácidos encontrados en las posiciones i, i+4 e i+7 posiciones de una alfa-hélice ideal, a la que se une el péptido. Tal como se muestra en la figura 19, se modela P3028 para unirse a regiones que contienen alfa-hélice del receptor de IL-2. Por tanto, algunos ejemplos incluyen una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID No : 1-33,34,46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13), en la que dichos inhibidores inmunorreguladores comprenden una sustitución de peptidomimético que incorpora un peptidomimético de fórmula V o fórmula VI, en la que R1 - R3 se seleccionan de las posiciones en una pareja de unión conocida de P3028, por ejemplo la subunidad alfa del receptor de IL-2 (CD25) (SEQ ID NO: 247), el receptor de LFA-1 (CD 11a - SEQ ID NO: 248 y CD18 - SEQ ID NO: 249), o un péptido de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13.
Los ejemplos también incluyen una biblioteca de peptidomiméticos. En algunos ejemplos, la biblioteca de peptidomiméticos se selecciona y/o se sintetiza usando un enfoque de diseño racional. Tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.° 7.816.324, puede desarrollarse una biblioteca de peptidomiméticos basándose en un conocimiento estructural de la superficie de contacto de complejos proteicos. Por tanto, en algunos ejemplos, los compuestos de peptidomiméticos se basan en la estructura de P3028, y sus interacciones con parejas de unión conocidas, por ejemplo, el receptor de IL-2 para el que se conoce la estructura cristalina (véase la figura 19), el receptor de LFA-1, para el que se conoce la estructura cristalina, el péptido KKL15 (véase el ejemplo 11), e inhibidores conocidos de la secuencia/estructura de P3028 (por ejemplo, SeQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98 o 264-393 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1). En algunos ejemplos, pueden usarse miméticos de alfa-hélice para modular la interacción proteína-proteína o proteína-péptido. Por tanto, se contemplan armazones sintéticos que imitan elementos clave encontrados en la superficie de contacto entre la secuencia/estructura de P3028 y sus parejas de unión para el desarrollo de inhibidores de proteínas inmunorreguladoras de molécula pequeña. En algunos ejemplos, las moléculas de la biblioteca de peptidomiméticos están unidas a un soporte, chip, superficie o sustrato, por ejemplo, una micromatriz, como en la patente estadounidense n.° 7.153.68. La sección a continuación proporciona más detalles sobre inhibidores de péptidos inmunorreguladores basados en aptámeros.
Péptidos cíclicos
Algunos ejemplos incluyen al menos un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de péptido cíclico. Los péptidos cíclicos, algunas veces denominados “péptidos en bucle” se conocen en la técnica, y pueden sintetizarse químicamente (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.589.170), o sintetizarse in vivo (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 7.252.952). Tal como se enseña en la patente estadounidense n.° 7.589.170, la ciclación puede lograrse, por ejemplo, mediante formación de enlaces disulfuro entre dos grupos funcionales de la cadena lateral, formación de enlaces amida o éster entre un grupo funcional de la cadena lateral y la función alfaamino o carboxilo de la estructura principal, formación de enlaces amida o éster entre dos grupos funcionales de la cadena lateral, formación de enlaces amida entre las funciones alfa-amino y carboxilo de la estructura principal, o por medio de un ligador que conecta dos o más posiciones del péptido.
Una porción de un péptido puede ciclarse, u opcionalmente, todo el péptido puede ciclarse, formando de ese modo un péptido cíclico. Por tanto, en algunos ejemplos, el extremo N-terminal del péptido se une al extremo C-terminal del péptido, ciclando de ese modo todo el péptido. En algunos ejemplos, el extremo N-terminal se une al extremo C-terminal por medio de una unión alfa-amida. En algunos ejemplos, el extremo N-terminal se une al extremo C-terminal por medio de una unión distinta de alfa-amida, por ejemplo, un enlace entre la cadena lateral de una Ser (S) o Thr(T) y el grupo carboxilo C-terminal, un enlace disulfuro entre dos residuos de Cys (C), o un tioéter entre un residuo de Trp (W) y Cys (C), o una molécula de ligador sintético. En algunos ejemplos, el extremo C-terminal se une a un aminoácido interno por medio de una unión distinta de alfa-amida, por ejemplo, un enlace entre la cadena lateral de una Ser (S) o Thr(T) y el grupo carboxilo C-terminal, o una molécula de ligador sintético. En algunos ejemplos, el extremo N-terminal o el extremo C-terminal se une a un aminoácido interno, o dos aminoácidos internos se unen entre sí por medio de una unión distinta de alfa-amida, por ejemplo, un enlace disulfuro entre dos residuos de Cys (C), o un tioéter entre un residuo de Trp (W) y Cys (C).
En algunos ejemplos, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de péptido cíclico incluye una única estructura de polipéptido cíclico. En algunos ejemplos, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores de péptido cíclico incluye dos o más estructuras de polipéptido cíclico, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 estructuras de polipéptido cíclico. Cada estructura de polipéptido cíclico puede incluir al menos dos residuos de aminoácido, por ejemplo, aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35 o 40 residuos de aminoácido o un intervalo que está definido por dos cualesquiera de estos números.
En algunos ejemplos, se examina una biblioteca de péptidos cíclicos para detectar péptidos cíclicos que se unen a péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, por ejemplo, los péptidos de las tablas 1-4 o 5.4 (SEQ ID NO: 183-184, 188-246). El examen de bibliotecas de péptidos cíclicos se describe en la publicación PCT WO 95/09344. En algunos ejemplos, se sintetiza una biblioteca de péptidos cíclicos. En algunos ejemplos, cada péptido en bucle en la biblioteca tiene la misma longitud, por ejemplo 5 meros, 6 meros, 7 meros, 8 meros, 9 meros, 10 meros, 11 meros, o 12 meros. En algunos ejemplos, la biblioteca incluye péptidos cíclicos de dos o más longitudes. Tal como se muestra en el ejemplo 12, se sintetizó una biblioteca de 6 meros y se examinó para detectar péptidos que se unen a P3038. Se realizaron barridos posicionales (es decir, sustituciones de un solo aminoácido en cada posición) de un péptido cíclico líder (SEQ ID NO: 265) que se identifica que presenta unión apreciable a P3028 para identificar 6 meros cíclicos adicionales que se unen a P3028. Se observó que los dos 6 meros que se unían a P3028 con la afinidad más alta (SEQ ID NO: 266-267) tenían homología con péptidos lineales que se unen a P3028 (véase la figura 32). Por tanto, se contempla en el presente documento que aspectos de péptidos lineales que se unen a péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina puedan incorporarse en péptidos cíclicos, produciendo por tanto péptidos cíclicos que se unen a péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina.
En algunos ejemplos, los inhibidores de estructuras o péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, o una porción de los mismos se ciclan. En algunos ejemplos, un péptido de cualquiera de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64­ 66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de p28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, o una porción de los mismos, se modifica para facilitar la ciclación. En algunos ejemplos, se añaden residuos de amino que contienen cadenas laterales que pueden formar estructuras cíclicas, por ejemplo cisteína, al extremo N-terminal, extremo C-terminal y/o posiciones internas de cualquiera del péptido de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13.
Aptámeros
Los aptámeros son moléculas pequeñas que se unen específicamente a una molécula diana. Los aptámeros pueden incluir aptámeros oligonucleotídicos, por ejemplo, ADN, ARN u oligonucleótidos sintéticos. En algunos ejemplos, los aptámeros oligonucleotídicos incluyen oligonucleótidos con una estructura principal sintética, por ejemplo, morfolinos. Los aptámeros pueden incluir también aptámeros peptídicos. Los aspectos de la invención incluyen una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un aptámero (por ejemplo, basado en ácido nucleico o basado en péptido), en la que dicho aptámero corresponde o imita a uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13). Algunos ejemplos incluyen aptámeros que se unen específicamente a la secuencia/estructura de P3028.
Algunos ejemplos incluyen una biblioteca de aptámeros oligonucleotídicos. Pueden desarrollarse fácilmente aptámeros oligonucleotídicos que se unen a la secuencia/estructura de P3028 dadas las enseñanzas descritas en el presente documento. Tal como se describe en la patente estadounidense n.°: 7.745.607, un aptámero que se une específicamente a una diana, por ejemplo la secuencia/estructura de P3028, puede identificarse mediante la interacción de un oligonucleótido antisentido con un oligonucleótido de la biblioteca que tiene un dominio de unión antisentido complementario para formar un dúplex bicatenario, teniendo además dicho oligonucleótido de la biblioteca un dominio de nucleótidos al azar; ii) la inmovilización de la estructura de dúplex sobre un soporte sólido; iii) la incubación de la estructura de dúplex en presencia de la secuencia/estructura de P3028; y iv) la recogida de oligonucleótidos de la biblioteca que se disocian de la estructura de dúplex y se unen a la secuencia/estructura de P3028. Alternativamente, puede proporcionarse una biblioteca de oligonucleótidos en la que el oligonucleótido de la biblioteca se hibrida con un oligonucleótido antisentido biotinilado para formar una molécula de dúplex. Las moléculas de dúplex se inmovilizan sobre una superficie, por ejemplo, perlas recubiertas de avidina. Se proporciona una diana, tal como P3028, y se pone en contacto con los oligonucleótidos. Se recogen y amplifican oligonucleótidos que se han unido a la diana. Pueden usarse enfoques de examen similares para identificar aptámeros basados en péptido que se unen a la secuencia/estructura de P3028. Los aptámeros basados en péptido que se unen a la secuencia/estructura de P3028 pueden imitar a los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de SEQ ID No : 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13), y variantes de los mismos. La sección a continuación comenta muchas de las modificaciones que pueden incorporarse en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores descrito en el presente documento.
Modificaciones
Los ejemplos descritos en el presente documento también incluyen una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores aislados a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por (SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13), en la que dichos inhibidores inmunorreguladors comprenden al menos una modificación (por ejemplo, glicosilación, nitrosilación, una citotoxina, un resto detectable o un radionúclido). La glicosilación puede incluir la adición de polietilenglicol (PEG). La adición de PEG puede aumentar la solubilidad de uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento en disolución acuosa, proteger la molécula del ataque por el sistema inmunitario de un huésped y/o aumentar la semivida de la molécula en el huésped.
En algunos ejemplos, los inhibidores de péptidos inmunorreguladores se unen directamente a una citotoxina. En algunos ejemplos, un péptido que consiste en, consiste esencialmente en o que comprende una de SEQ ID NO: 1­ 33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 se une covalentemente a una citotoxina. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores se une a la toxina por medio de un ligador. En algunos ejemplos, un péptido que consiste en, consiste esencialmente en o que comprende una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 se une a una citotoxina por medio de un ligador. Puede emplearse una amplia gama de tecnologías de ligador. Los ligadores pueden ser escindibles o no escindibles. Se sabe que, en muchos casos, el potencial citotóxico completo de un fármaco puede observarse cuando las moléculas citotóxicas se liberan de un conjugado, por ejemplo, un inhibidor de un péptido inmunorregulador, en forma no modificada en el sitio diana. Uno de los ligadores escindibles que se ha empleado para la preparación de conjugados de citotoxina es un ligador lábil a ácido basado en ácido cis-aconítico que se aprovecha del entorno ácido de diferentes compartimentos intracelulares tales como los endosomas encontrados durante la endocitosis mediada por receptor y los lisosomas. Shen y Ryser introdujeron este método para la preparación de conjugados de daunorubicina con portadores macromoleculares (Biochem. Biophys. Res. Commun. 102:1048-1054 (1981)). Yang y Reisfeld usadoron la misma técnica para conjugar daunorubicina con un anticuerpo anti-melanoma (J. Natl. Canc. Inst. 80:1154-1159 (1988)). Recientemente, Dillman et al. también usaron un ligador lábil a ácido de un modo similar para preparar conjugados de daunorubicina con un anticuerpo anti-célula T (Cancer Res. 48:6097-6102 (1988)). Un enfoque alternativo, explorado por Trouet et al. implicaba la unión de daunorubicina a una molécula de direccionamiento por medio de un brazo espaciador peptídico (Proc. Natl. Acad. Sci. 79:626-629 (1982)). Esto se realizó bajo la premisa de que el fármaco libre podría liberarse de un conjugado de este tipo mediante la acción de peptidasas lisosómicas. Un experto en la técnica apreciará que los enfoques de ligadores escindibles empleados para conjugar citotoxinas con anticuerpos también pueden emplearse para conjugar un péptido, por ejemplo uno de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 con una citotoxina.
Las citotoxinas a modo de ejemplo que pueden incorporarse en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID No : 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de p28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13) incluyen: radiotoxinas, monometilauristatina-E, monometilauristatina-F, aplidina, azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicina, bortezomib, briostatina-1, busulfano, caliqueamicina, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucilo, cisplatino, irinotecán (CPT-11), SN-38, carboplatino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, glucurónico de daunomicina, daunorubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorubicina, glucurónico de doxorubicina, glucurónido de epirubicina, etinilestradiol, estramustina, etopósido, glucurónido de etopósido, fosfato de etopósido, floxuridina (FUdR), 3',5'--O-dioleoil-FudR (FUdR-dO), fludarabina, flutamida, fluorouracilo, fluoximesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, L-asparaginasa, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroprogesterona, acetato de megestrol, melfalán, mercaptopurina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotano, butirato de fenilo, prednisona, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, PSI-341, saporina, estreptozocina de semustina, tamoxifeno, taxanos, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, tenipósido, topotecán, mostaza de uracilo, velcade, vinblastina, vinorelbina, vincristina, ricina, por ejemplo cadena A de ricina, abrina, ribonucleasa, onconasa, rapLR1, ADNasa I, enterotoxina-A estafilocócica, proteína antiviral de hierba carmín, gelonina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas.
Los ejemplos de restos detectables (que también pueden denominarse en el presente documento “marcadores detectables” que pueden incorporarse en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13) o a un anticuerpo que se une específicamente a P3028 incluyen: un radiomarcador, un fluoróforo, biotina, una proteína fluorescente, oro coloidal y/o una coenzima. Los radiomarcadores pueden incluir 3H y 14C. Los fluoróforos pueden incluir colorantes Alexa-Fluor, azul pacífico, naranja pacífico, azul cascada, amarillo cascada y R-ficoeritrina, fluoresceína (FITC), rodamina, rojo Texas, colorantes de la familia BODIPY, Cy2, Cy3, C5 y Cy7. Las proteínas fluorescentes pueden incluir proteínas fluorescentes azul, cian, verde, amarilla y roja. En algunos ejemplos, los marcadores fluorescentes incluyen un par de FRET. Por ejemplo, un único péptido puede unirse a un donador de FRET y un aceptor de FRET, que están configurados de modo que el aceptor de FRET está sustancialmente dentro de un radio de FRET del donador de FRET cuando el péptido está en una primera configuración (por ejemplo, unido a la diana), pero no cuando el péptido está en una segunda configuración (por ejemplo, no unido a la diana). Por ejemplo, un primer péptido puede unirse a un aceptor de FRET, y un segundo péptido puede unirse a un donador de FRET, de modo que el aceptor de FRET está sustancialmente dentro de un radio de FRET del donador de FRET cuando el primer péptido y el segundo péptido están cada uno unidos a una diana, por ejemplo, una célula diana, pero no cuando al menos un péptido no está unido a la diana. En algunos ejemplos, el marcador fluorescente incluye un fluoróforo y un extintor. El fluoróforo y el extintor pueden unirse al péptido para que el extintor absorba la radiación electromagnética emitida por el fluoróforo cuando el péptido está en una primera configuración (por ejemplo, unido a la diana), pero no cuando el péptido está en una segunda configuración (por ejemplo, no unido a la diana). Las coenzimas pueden incluir vitaminas tales como biotina.
Los radionúclidos a modo de ejemplo que pueden incorporarse en uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 13) o un anticuerpo que se une específicamente a P3028 incluye : 111I, 131I, 90Y, 67Cu, 186Re, 188Re, 212Bi o 211At. Los inhibidores de péptidos inmunorreguladores radiomarcados preferidos son capaces de administrar más de 6000 rads a un tumor, por ejemplo, y tienen suficiente afinidad para que la médula ósea del paciente no esté expuesta a más de 300 rads. La sección que sigue describe con mayor detalle algunos de los ejemplos, que abarcan complejos proteicos que comprenden un inhibidor de péptidos inmunorreguladores descrito en el presente documento.
Se da a conocer un kit de diagnóstico. El kit puede incluir uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ iD NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 o un anticuerpo que se une específicamente a cualquiera de los péptidos de s Eq ID NO: 183-185 o 188-246, por ejemplo P3028 (SEQ ID NO: 185). El kit también puede incluir un resto detectable tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptido o anticuerpo del kit está biotinilado.
Moléculas portadoras
Algunos ejemplos incluyen una molécula portadora. Las moléculas portadoras, por ejemplo, pueden aumentar la estabilidad o semivida, aumentar la solubilidad, aumentar la absorción, dirigir el péptido a una célula, órgano o tejido apropiado, y/o minimizar una respuesta inmunitaria contra una molécula terapéutica.
Las moléculas portadoras a modo de ejemplo incluyen albúmina sérica humana; un polímero que tiene una pluralidad de restos ácidos (véase la publicación PCT n.° WO 01/93911); copolímeros de bloque anfífilos que contienen grupos aniónicos que, cuando se usan como portador de fármaco para una molécula terapéutica catiónica, pueden mejorar la estabilidad de esa molécula (véase la publicación PCT n.° WO 03/00778); ciclodextrina y ácidos para mejorar las propiedades de moléculas terapéuticas básicas (patente europea n.° 0681 481); lípidos como portadores para moléculas terapéuticas hidrófobas (véase la publicación PCT n.° WO 04/064731); inmunoglobulinas; y fragmentos Fc como portadores para mejorar la semivida y minimizar la respuesta inmunitaria (véase la patente estadounidense n.° 7.736.653). En algunos ejemplos, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores (por ejemplo, un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13) incluye o se une a un portador. En algunos ejemplos, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores (por ejemplo un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13) incluye dos o más portadores.
En algunos ejemplos, se proporciona un inhibidor de péptidos inmunorreguladores con una partícula degradable. Sin querer restringirse a la teoría, se contempla que una partícula degradable pueda permitir que una partícula inmunorreguladora sea soluble y ejerza su actividad durante un periodo de tiempo controlado en la circulación sistémica. Por consiguiente, en algunos ejemplos, se proporciona una partícula degradable que comprende un inhibidor de péptidos inmunorreguladores (por ejemplo, un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13). En algunos ejemplos la partícula degradable que comprende el inhibidor de péptidos inmunorreguladores se administra a un sujeto que lo necesita. Opcionalmente, la partícula degradable puede administrarse por vía sistémica. Opcionalmente, la partícula degradable puede administrarse por vía local, por ejemplo, en o cerca de un sitio de inmunosupresión (por ejemplo, dentro de 10 cm, 9 cm, 8 cm 7 cm, 6 cm, 5 cm, 4 cm, 3 cm, 2 cm, 1 cm o 0,5 cm del sitio de inmunosupresión o un intervalo definido por dos cualesquiera de estos números). En algunos ejemplos, el sujeto padece bloqueo del receptor de LFA-1 por una secuencia de péptido inmunorregulador de cualquiera de las tablas 1-4. Opcionalmente, la partícula degradable puede coadministrarse con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, si el inhibidor de péptidos inmunorreguladores es útil para desbloquear un receptor de LFA-1 (por ejemplo, desplaza péptidos inmunorreguladores o estructuras de 3028 unidos del receptor de LFA-1), un agente terapéutico que estimula una respuesta inmunitaria, por ejemplo, por medio de un receptor de LFA-1 puede ser útil para coadministrar con el inhibidor de péptidos inmunorreguladores y la partícula degradable. En algunos ejemplos, el agente terapéutico adicional se administra al mismo tiempo que el inhibidor de péptidos inmunorreguladores, por ejemplo, como parte de la partícula degradable. En algunos ejemplos, el agente terapéutico adicional se administra después del inhibidor de péptidos inmunorreguladores, por ejemplo, al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas después, o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días después o un intervalo definido por dos cualesquiera de los tiempos mencionados anteriormente. Puede usarse una variedad de partículas degradables adecuadas según realizaciones en el presente documento. En algunos ejemplos, la partícula degradable comprende una esfera, por ejemplo, una microesfera. En algunos ejemplos, la partícula degradable comprende una nanopartícula. En algunos ejemplos, la partícula degradable comprende un almidón o azúcar. En algunos ejemplos, la partícula degradable comprende un polímero orgánico o una combinación de polímeros orgánicos, por ejemplo, poliésteres, poli(ésteres de fosfato), polifosfacenos, poliortoésteres, polianhídridos, policarbonatos, poliamidas, poli(ácido láctico), un poli(ácido glicólico), o una combinación de dos o más polímeros, por ejemplo, dos o más de los polímeros enumerados.
Complejos proteicos
Se da a conocer una composición que comprende un complejo proteico aislado que comprende un inhibidor de péptidos inmunorreguladores. El complejo proteico aislado puede incluir un péptido inmunorregulador, por ejemplo, P3028 (SEQ ID NO: 185) o uno cualquiera o más de los péptidos inmunorreguladores descritos en las tablas 1-4 (SEQ ID NO: 183-184 y 188-246) y al menos un inhibidor de péptidos inmunorreguladores (por ejemplo, uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1). En algunos ejemplos, el complejo proteico aislado incluye el péptido 3028 (s Eq ID No : 185) y un péptido inhibidor que incluye la secuencia de SeQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96 o 98 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1. En los ejemplos 10, 11 y 12 y la tabla 5.1 se proporcionan complejos proteicos a modo de ejemplo que incluyen cada uno de los péptidos de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 que se unen a la secuencia/estructura de P3028. El complejo proteico puede incluir al menos una interacción electrostática favorable entre un residuo de aminoácido de P3028 o una variante del mismo, y un aminoácido de un péptido inhibidor o peptidomimético. El complejo proteico puede incluir al menos una interacción hidrófoba favorable entre un residuo de aminoácido de P3028 o una variante del mismo, y un aminoácido de un péptido inhibidor o peptidomimético (véase el ejemplo 11). En algunos ejemplos, el complejo proteico incluye una variante de P3028 que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad con P3028, por ejemplo, mayor de o igual a aproximadamente el 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con P3028. El complejo proteico puede incluir además al menos una proteína unida a una célula cancerosa, por ejemplo, una proteína de superficie. Por tanto, en algunos ejemplos, el complejo proteico aislado puede localizarse en la superficie de una célula cancerosa.
Por consiguiente, se da a conocer un método de preparación de un complejo proteico que comprende uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento. Los métodos pueden ponerse en práctica, por ejemplo, uniendo un inhibidor de péptidos inmunorreguladores, tal como se describe en el presente documento, con P3028, o una variante o fragmento del mismo. El método puede incluir opcionalmente detectar la presencia del complejo, que puede lograrse mediante estudios de rampo, tal como se describe en el presente documento.
Algunos ejemplos incluyen métodos de unión de un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 a una molécula que comprende la secuencia/estructura de P3028 (SEQ ID NO: 185). Algunos ejemplos incluyen métodos de unión de un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 a una molécula que comprende una variante de la secuencia/estructura de P3028 (SEQ ID NO: 185). Algunos ejemplos incluyen métodos de unión de un péptido que incluye al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 7 6 , 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 a una proteína que comprende la secuencia/estructura de P3028 o un fragmento de P3028 (SEQ ID NO: 185), en el que el fragmento de P3028 tiene una longitud de al menos aproximadamente 10 aminoácidos, más preferiblemente 11 aminoácidos, más preferible 12 aminoácidos, más preferiblemente 13 aminoácidos, más preferiblemente 14 aminoácidos, más preferiblemente 15 aminoácidos, más preferiblemente 16 aminoácidos o más preferiblemente 17 aminoácidos. En algunos ejemplos, la unión incluye interacciones hidrófilas y/o electrostáticas favorables entre miembros del complejo proteico. En algunos ejemplos, la unión incluye enlaces covalentes entre miembros del complejo proteico, por ejemplo, a través de reticulación. La reticulación puede inducirse químicamente, y/o por medio de radiación electromagnética, por ejemplo, radiación electromagnética en el espectro ultravioleta.
En algunos ejemplos, el péptido comprende al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 583-586 o 5 8 9 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. Los soportes a modo de ejemplo incluyen una clavija, perla, superficie, matriz, superficie celular artificial o superficie celular. Por ejemplo, el péptido puede fijarse por medio de una etiqueta de afinidad a un soporte. En algunos ejemplos, P3028, o una variante o fragmento del mismo se fija a un soporte. En algunos ejemplos, el péptido que incluye al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 se fija a un soporte, y P3028 o una variante o fragmento del mismo se disuelve en un disolvente. En algunos ejemplos, el péptido que incluye al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 se disuelve en un disolvente, y P3028, o una variante o fragmento del mismo se fija a un soporte. En algunos ejemplos, el péptido que incluye al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 y P3028 se disuelven cada uno en un disolvente, por ejemplo, suero.
En algunos ejemplos, la unión se produce en un organismo, por ejemplo, en la matriz extracelular, y/o el suero o en una muestra biológica obtenida de un organismo, tal como un ser humano. Las muestras biológicas pueden incluir al menos una célula, tejido o composición extracelular de un organismo, incluyendo extractos, extractos purificados y/o fracciones de los mismos. Las muestras biológicas a modo de ejemplo incluyen sangre completa, suero, médula ósea, células inmunitarias aisladas y biopsias tumorales. Las células inmunitarias aisladas pueden incluir leucocitos y células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por ejemplo, linfocitos, monocitos o macrófagos. El método puede incluir administrar al menos un miembro del complejo, por ejemplo, un péptido que incluye al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 9 8 , 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, al organismo. En algunos ejemplos, la unión se produce in vitro, por ejemplo, en una disolución tampón o en una muestra biológica. El método puede incluir añadir al menos un miembro del complejo, por ejemplo un péptido que incluye al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 583-586, o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, a una disolución que contiene los miembros restantes del complejo. Alternativamente, el método puede incluir añadir dos o más miembros del complejo a una disolución, por ejemplo, un péptido que incluye al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 y P3028 o un fragmento o variante del mismo. En algunos ejemplos, un péptido que incluye al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 se añade a una muestra biológica.
Se da a conocer un método de detección de la presencia del complejo. Algunos ejemplos incluyen detectar la presencia de la secuencia/estructura de P3028 unida a un péptido que está fijado a un soporte (véase el ejemplo 12), por ejemplo, mediante ELISA. Algunos ejemplos incluyen detectar la presencia de un complejo mediante FRET. Por ejemplo, puede unirse un fluoróforo donador de FRET a un primer miembro del complejo, y puede unirse un fluoróforo aceptor de FRET a un segundo miembro del complejo, de modo que se produce transferencia de FRET solo cuando se forma el complejo. Algunos ejemplos incluyen detectar la presencia de un complejo mediante el cese de la extinción. Por ejemplo, puede unirse un miembro del complejo a un fluoróforo y un extintor para la radiación electromagnética emitida por el fluoróforo, de modo que cuando el miembro del complejo no está unido, el fluoróforo está sustancialmente dentro del radio del extintor, y el extintor absorbe la radiación electromagnética emitida por el fluoróforo (por ejemplo, puede unirse un extintor al extremo N-terminal y unirse un fluoróforo al extremo C-terminal, o puede unirse un extintor al extremo C-terminal y unirse un fluoróforo al extremo N-terminal). Tras la formación del complejo, el fluoróforo puede estar fuera del radio del extintor, permitiendo por tanto la detección de la radiación electromagnética emitida por el fluoróforo.
Algunos ejemplos incluyen detectar la presencia del complejo detectando la función del complejo. Por ejemplo, una célula inmunitaria en la que el péptido 3028 se une al receptor de LFA-1 y/o de IL-2 puede presentar una reducción de la proliferación inducida por IL-2, estimulación de receptores de células T, diseminación de leucocitos, migración de células inmunitarias y/o citotoxicidad de células NK (véanse los ejemplos 2-6). La detección directa o indirecta del aumento de la proliferación inducida por IL-2, estimulación de receptores de células T, diseminación de leucocitos, migración de células inmunitarias y/o citotoxicidad de células NK, por ejemplo, aumento en comparación con una muestra de control no tratada en la que al menos un miembro del complejo no se añadió, puede detectar la formación del complejo. Por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo 13, la formación de un complejo entre la secuencia/estructura de P3028 y un inhibidor de péptidos inmunorreguladores puede aumentar la estimulación de linfocitos. Por ejemplo, tal como se muestra en el ejemplo 1, la formación de un complejo puede desbloquear el receptor de LFA-1. Por tanto, algunos ejemplos incluyen detectar la formación del complejo indirectamente, por ejemplo, detectando un aumento de la estimulación de linfocito, detectando un receptor de LFA-1 desbloqueado y/o detectando la estimulación de células inmunitarias por medio de un desbloqueo del receptor de LFA-1 , en comparación con una muestra de control que se sabe que carece de formación del complejo.
Algunos ejemplos incluyen detectar la presencia del complejo detectando la localización de los miembros del complejo. En algunos ejemplos, detectar la presencia del complejo incluye detectar la presencia de un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que incluye al menos una de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, o un peptidomimético que se une específicamente a la secuencia/estructura de P3028 en células tumorales. Tal como se muestra en el ejemplo 1, la secuencia/estructura de P3028 puede unirse a células tumorales. Tal como se muestra en el ejemplo 14, un inhibidor de la secuencia/estructura de P3028 puede unirse a células tumorales, por ejemplo, uniéndose a la secuencia/estructura de P3028. Por tanto, en algunos ejemplos, la presencia de un inhibidor de la secuencia/estructura de P3028, por ejemplo, al menos una de SEQ ID n O: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94­ 96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 en una célula tumoral puede indicar la formación del complejo. Por tanto, la formación del complejo puede detectarse mediante la localización conjunta de un inhibidor con al menos un marcador de una célula tumoral. La localización conjunta puede detectarse por ejemplo mediante inmunohistoquímica o citometría de flujo. En algunos ejemplos, el inhibidor se marca, por ejemplo, con un fluoróforo o radiomarcador. En algunos ejemplos, el inhibidor se detecta, por ejemplo, con un anticuerpo primario que se une específicamente al inhibidor. La sección que sigue describe con mayor detalle algunos de los ejemplos de ácido nucleico, que codifican para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores.
Ácidos nucleicos que codifican para péptidos inhibidores
Se dan a conocer ácidos nucleicos aislados que codifican para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores. Un experto en la técnica apreciará que, para una secuencia peptídica dada, puede determinarse fácilmente una secuencia de ácido nucleico que codifica para esa secuencia peptídica, y debido a la degeneración del código genético, más de una secuencia de ácido nucleico puede codificar para un péptido cualquiera. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido puede incorporarse en un vector de expresión usando técnicas conocidas, también. Pueden usarse vectores de expresión para producir el péptido en un sistema de expresión, por ejemplo, una célula huésped, un organismo huésped, un sistema de expresión libre de células, y similares. También pueden usarse vectores de expresión para producir un péptido en un organismo, por ejemplo, un paciente que necesita el bloqueo de la inmunosupresión, tal como se describe en el presente documento. Los vectores de expresión a modo de ejemplo incluyen ADN de plásmido, tal como un constructo de pVAX, ADN de bacteriófago, a Dn de cósmido, cromosomas artificiales tales como BAC y YAC, sistemas de retrovirus, por ejemplo, lentivirus, sistemas de virus de ADN, por ejemplo, adenovirus o virus vaccinia (por ejemplo, MVA). Para péptidos que no tienen un aminoácido N-terminal que se corresponde con un codón de iniciación de la traducción (normalmente Met que corresponde a ATG), los vectores de expresión pueden incluir un codón de iniciación de la traducción en marco. Un aminoácido de este tipo puede estar separado del extremo N-terminal del péptido mediante un ligador escindible, por ejemplo, una secuencia peptídica que se escinde mediante una proteasa. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras de la transcripción, por ejemplo, promotores núcleo, potenciadores de la transcripción y/o secuencias aislantes. Tales secuencias pueden facilitar el ensamblaje de la maquinaria transcripcional (por ejemplo, ARN polimerasa III), y la posterior producción de un transcrito que codifica para el péptido (por ejemplo, facilitando un entorno heterocromático que es favorable a la transcripción).
En algunos ejemplos, un vector de expresión codifica para dos o más copias de un péptido, y/o dos o más péptidos únicos. En algunos ejemplos, un vector de expresión codifica para dos o más péptidos, y cada péptido está bajo el control de una unidad de transcripción única (por ejemplo, promotor, potenciadores de la transcripción y/o terminador de la transcripción). En algunos ejemplos, un ácido nucleico que codifica para dos o más péptidos está bajo el control de una única unidad de transcripción. En tales ejemplos, una secuencia que codifica para un péptido individual puede estar bajo el control de un sitio de inicio de la traducción individual, por ejemplo, un sitio de entrada interna al ribosoma (IREs ). En tales ejemplos, un único ácido nucleico puede codificar para una proteína o polipéptido que codifica para dos o más péptidos, que están separados por al menos un sitio diana de proteasa.
Un experto en la técnica apreciará que pueden construirse fácilmente polinucleótidos que codifican para péptidos, tales como inhibidores de péptidos, basándose en la secuencia del péptido. En la tabla 5.2 se proporcionan polinucleótidos a modo de ejemplo que codifican para las secuencias de péptidos inhibidores de péptidos inmunorreguladores de (SEQ ID NO: 2-33). Un experto en la técnica apreciará que, debido a la degeneración del código genético, un polipéptido dado puede estar codificado por más de un polinucleótido. Por tanto, se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, en la tabla 5.2, polinucleótidos de consenso que tienen en cuenta la degeneración típica del código genético, así como polinucleótidos a modo de ejemplo. Los polinucleótidos de la tabla 5.2 se proporcionan a modo de ejemplo, e incluyen SEQ ID NO: 102-165. Un experto en la técnica apreciará además que polinucleótidos adicionales pueden codificar para inhibidores de péptidos tales como los inhibidores de péptidos dados a conocer en el presente documento (por ejemplo, polinucleótidos que codifican para uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1 son ejemplos). Por ejemplo, pueden modificarse polinucleótidos de manera postranscripcional, por ejemplo, mediante corte y empalme alternativo, y/o mediante enzimas tales como adenosina desaminasa específica de ARN (ADAR) que pueden modificar las bases de polinucleótidos.
Tabla 5.2: Polinucleótidos que codifican para inhibidores de péptidos de la secuencia/estructura de P3028
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Por consiguiente, los ejemplos descritos en el presente documento también incluyen una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un ácido nucleico o polinucleótido aislado que codifica para uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo que se unen a la secuencia/estructura de P3028 proporcionados en el presente documento (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96 o 98 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1). También se dan a conocer en el presente documento vectores, constructos y plásmidos que comprenden los ácidos nucleicos o polinucleótidos mencionados anteriormente. La siguiente sección comenta componentes adicionales que pueden incluirse en una o más de las composiciones descritas en el presente documento.
Composiciones farmacéuticas
Se da a conocer una composición farmacéutica que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en un inhibidor de péptido (por ejemplo, uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1) y se proporciona. La composición farmacéutica puede incluir un inhibidor de péptido tal como se describe en el presente documento y un componente farmacéuticamente aceptable tal como se describe en el presente documento. Los componentes farmacéuticamente aceptables a modo de ejemplo incluyen diluyentes, portadores, excipientes y/o tampones. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptido comprende, consiste en o consiste esencialmente en un inhibidor de péptido tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, una composición puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en el péptido de fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 1 6 6 ). En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256)b, RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ,
T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, Xi es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM,
VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT,
QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT,
MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR,
QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR,
VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) tienen una longitud que es menor de o igual a
1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 4 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 8 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,
135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240,250, 260, 270,280, 290, 300, 320,
340, 360, 380, 400,450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, una composición puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido de fórmula (II) X20TFFVKLSX21X22,
(SEQ ID NO: 173). En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174),
RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT,
QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT,
MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP,
QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP,
VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR,
LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR,
VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59,
60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90,
91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115,
116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138,
139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400,
450, 500, 550, 600,650, 700, 750, 800, 850, 900, 950,1000,1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, una composición puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido de fórmula (III) X30X31VKLX32LX33TEX34
(SEQ ID NO: 178), o de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96 o 98. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R.
En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R, o está ausente. En algunos ejemplos,
X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180)b, LDTF (SEQ ID
NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72,
73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133,
Figure imgf000065_0001
134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, una composición puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido de fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280,290, 300, 320, 340, 360, 380,400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, una composición puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido de fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. Adicionalmente, una composición puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un péptido inhibidor que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1 usado en estas composiciones tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
La composición farmacéutica puede comprender uno o más de otros componentes farmacéuticos aceptables, tales como un diluyente, portador, excipiente y/o tampón farmacéuticamente aceptable. “Farmacéuticamente aceptable” significa un compuesto no tóxico que no disminuye la eficacia de la actividad biológica de los principios activos. Tales aditivos, diluyentes, tampones, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica (véanse Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000).
La composición farmacéutica puede incluir un tampón. El término “tampón” pretende referirse a una disolución acuosa que contiene una mezcla de ácido-base con el fin de estabilizar el pH. Ejemplos de agentes tamponantes son hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; disoluciones de pH tamponado; poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas. Otros ejemplos de tampones son Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMPD, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazol-láctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.
La composición farmacéutica puede incluir un diluyente. El término “diluyente” pretende referirse a una disolución acuosa o no acuosa con el fin de diluir los compuestos en la preparación farmacéutica. El diluyente puede ser uno o más de solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol o etanol.
La composición farmacéutica puede incluir un excipiente. El excipiente puede ser uno o más de hidratos de carbono, tensioactivos, polímeros, lípidos y minerales. Los ejemplos de hidratos de carbono incluyen lactosa, sacarosa, manitol y ciclodextrinas, que se añaden a la composición, por ejemplo, para facilitar la liofilización. Ejemplos de polímeros son almidón, éteres de celulosa, carboximetilcelulosa de celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenanos, ácido hialurónico y derivados del mismo, poli(ácido acrílico), polisulfonato, polietilenglicol/poli(óxido de etileno), copolímeros de poli(óxido de etileno)/poli(óxido de propileno), poli(alcohol vinílico)/poli(acetato de vinilo) de diferente grado de hidrólisis y polivinilpirrolidona, todos de diferente peso molecular, que se añaden a la composición, por ejemplo, para el control de la viscosidad, para lograr la bioadhesión o para proteger el lípido de la degradación química y proteolítica. Ejemplos de lípidos son ácidos grasos, fosfolípidos, mono, di y triglicéridos, ceramidas, esfingolípidos y glicolípidos, todos de diferente longitud y saturación de la cadena de acilo, lecitina de huevo, lecitina de soja, huevo hidrogenado y lecitina de soja, que se añaden a la composición por motivos similares a las de los polímeros. Ejemplos de minerales son talco, óxido de magnesio, óxido de zinc y óxido de titanio, que se añaden a la composición para obtener beneficios tales como reducción de la acumulación de líquido o propiedades ventajosas de pigmentos. La composición farmacéutica puede incluir un portador. En algunas realizaciones, el portador es un portador no acuoso. Los ejemplos de portadores acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la acción de los microorganismos sobre los compuestos objeto puede garantizarse mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol-sórbico, y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
La composición farmacéutica puede formularse para una liberación prolongada. En algunos ejemplos, la composición farmacéutica se formula como un gel o sustancia similar a un gel para liberación prolongada. El gel o sustancia similar un gel puede permanecer estable en condiciones fisiológicas durante aproximadamente 3 días, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días, 3-4 días, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, 3-11, 3-12, 3-13, 3-14, 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, 4-11, 4-12, 4-13, 4-14, 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, 5-11, 5-12, 5-13, 5-14, 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, 6-11, 6-12, 6-13, 6-14, 7-8, 7 -9, 7-10, 7-11, 7-12, 7-13, 7-14, 8-14, 9-14 o 10-14 días. En algunos ejemplos, el gel comprende un péptido inhibidor que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en cualquiera de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393 o 583-586, en el que el péptido inhibidor no es soluble en agua y se selecciona un tampón o adyuvante para formular un gel cuando se combina con el péptido inhibidor. Sin querer restringirse a la teoría, según algunos ejemplos en el presente documento, los geles pueden ser adecuados para la liberación lenta del péptido inhibidor.
La composición farmacéutica puede formularse para solubilidad en disolución acuosa. A modo de ejemplo, se ha mostrado que un péptido inhibidor que consiste o que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 589 es soluble en disolución acuosa. Como tal, en algunos ejemplos, una composición farmacéutica comprende un péptido inhibidor que consiste o consiste esencialmente en SEQ ID NO: 589 solubilizado o parcialmente solubilizado en una disolución acuosa. Opcionalmente, la disolución acuosa puede proporcionarse como un adyuvante.
Forma de administración
Las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse por vía local o sistémica. Las vías de administración incluyen tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular), oral, vaginal y rectal. La más utilizada es la administración oral.
En algunos ejemplos, por ejemplo, si se desea la invasión por células inmunitarias de un tumor, citotoxicidad de un tumor o desbloqueo de un receptor de células inmunitarias de un tumor, la formulación farmacéutica se administra en o cerca de un tumor. Por ejemplo, la formulación farmacéutica puede administrarse de manera peritumoral, o dentro de 10 cm del tumor, por ejemplo, dentro de 10 cm, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 cm del tumor o un intervalo definido por cualquiera de estas dos distancias.
Las composiciones farmacéuticas se administrarán a un paciente en una cantidad o dosis terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz incluye una dosis de composición farmacéutica suficiente para detener al menos parcialmente un síntoma de un trastorno que padece un paciente. La dosis exacta depende de la manera de administración, la naturaleza y la gravedad del trastorno. Dependiendo de la salud general, el sexo, la edad y el peso corporal del paciente, pueden necesitarse diferentes dosis. La dosis puede ser para administración única en forma de una unidad de dosis individual o también varias unidades de dosis más pequeñas y también para administración múltiple de dosis subdivididas a intervalos específicos, por ejemplo, intervalos diarios (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 días entre dosis, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados). La dosificación a modo de ejemplo puede comprender dosis en el intervalo de miligramos, microgramos o nanogramos, por ejemplo, miligramos, microgramos o nanogramos por kg de peso corporal del sujeto. Los compuestos o sustancias activos también pueden administrarse juntos o por separado dependiendo de la forma de administración. Los regímenes de dosificación a modo de ejemplo según algunos ejemplos en el presente documento incluyen enfoques de “sensibilización-refuerzo” en los que una primera dosis de compuesto o sustancia para administración en una primera administración, y una segunda dosis de compuesto o sustancia para administración en segunda administración. Opcionalmente, se realizan administraciones posteriores adicionales (por ejemplo, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena o décima). Opcionalmente, la primera dosis es mayor que una dosis posterior (por ejemplo, la segunda dosis, o si se realiza, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena o décima), por ejemplo, al menos 1,1x, 1,2x, 1,5 x, 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x, 100x, 200x, 500x, 1000x, 2000x, 5000x o 10000x de la dosis posterior. Opcionalmente, la dosis posterior (por ejemplo, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena o décima) es mayor que la primera dosis, por ejemplo, al menos 1,1x, 1,2x, 1,5x, 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x, 100x, 200x, 500x, 1000x, 2000x, 5000x o 10000x de la primera dosis. En algunos ejemplos, se administra una dosis posterior (por ejemplo, segunda dosis después de la primera dosis, tercera dosis después de la segunda dosis, si se realiza, cuarta dosis después de la quinta dosis, si se realiza) al menos un día después de la dosis anterior, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 60, 90 o 100 días después, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Formas de preparación adecuadas son, por ejemplo, gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro)cápsulas, polvos o gránulos efervescentes microgranulados, supositorios, solución inyectable en forma de ampolla y también preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos, en cuya preparación se usan habitualmente excipientes, diluyentes o portadores tal como se describió anteriormente. Otras preparaciones pueden ser aquellas que dan lugar a diferentes perfiles de liberación de los principios activos que conoce bien un experto en la técnica. Los ejemplos incluyen liberación sostenida, acción sostenida, liberación prolongada, liberación en el tiempo o liberación programada, liberación controlada, liberación modificada o liberación continua. Las ventajas de los comprimidos o cápsulas de liberación sostenida son que a menudo pueden tomarse con menos frecuencia que las formulaciones de liberación inmediata del mismo fármaco, y que mantienen niveles más constantes del fármaco en el torrente sanguíneo. Hoy en día, muchos medicamentos de liberación en el tiempo se formulan de manera que el principio activo se incrusta en una matriz de sustancia(s) insoluble(s) (por ejemplo, algunos materiales acrílicos o quitina) de modo que el fármaco en disolución debe encontrar su camino a través de los agujeros en la matriz. Algunos fármacos están encerrados en comprimidos basados en polímeros con un orificio perforado con láser en un lado y una membrana porosa en el otro lado. Los ácidos del estómago empujan a través de la membrana porosa, empujando así el medicamento a través del orificio perforado con láser. Con el tiempo, la dosis completa del fármaco se libera en el sistema mientras que el recipiente de polímero permanece intacto, excretándose más tarde a través de la digestión normal. En algunas formulaciones, el fármaco se disuelve en la matriz, y la matriz se hincha físicamente formando un gel, permitiendo que el fármaco salga a través de la superficie externa del gel. La microencapsulación también se considera una tecnología más completa para producir perfiles de disolución complejos. Al recubrir un principio farmacéutico activo alrededor de un núcleo inerte y al colocarlo en capas con sustancias insolubles para formar una microesfera, es posible obtener velocidades de disolución más constantes y replicables. En algunos ejemplos, la composición comprende al menos aproximadamente al menos el 0,1% en peso del inhibidor de péptidos inmunorreguladores, por ejemplo, al menos el 0,1%, 0,2%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20% o 30% del inhibidor de péptidos inmunorreguladores en peso, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. Todos ellos los conoce bien un experto en la técnica.
Métodos de detección de la presencia de una albúmina o fragmento de albúmina
Se dan a conocer métodos de detección de la presencia de una albúmina o fragmento de albúmina en una muestra biológica poniendo en contacto un inhibidor de péptidos inmunorreguladores con la muestra biológica permitiendo de ese modo la unión del inhibidor de péptidos inmunorreguladores a la albúmina o fragmento de albúmina y detectando la presencia del inhibidor de péptidos inmunorreguladores unido. En algunos ejemplos, un método de detección de la presencia de la secuencia/estructura de P3028 o un fragmento de la misma puede incluir poner en contacto una muestra biológica que comprende la secuencia/estructura de P3028 con un inhibidor de péptidos inmunorreguladores o anticuerpo que se une a la secuencia/estructura de P3028 y detectar la presencia del inhibidor de péptidos inmunorreguladores unido. Opcionalmente, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores o anticuerpo comprende un resto detectable tal como se describe en el presente documento.
El inhibidor de péptidos inmunorreguladores usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un péptido tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), Ke Dq (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173). En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, lNt , LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,
1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir
esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una
secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181),
DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o
está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos
ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una
secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender,
consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96 o 98, tal como se
describe en el presente documento. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III)
usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o
igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,
121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170,
180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650,
700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los
valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir
esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394),
tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser
K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y
puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una
secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia
opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia
opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y
puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V,
F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N,
P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N,
Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T,
V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N,
P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I,
L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N,
R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud
que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46,
47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105,
106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128,
129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250,
260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050
o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir
esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente
documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R,
T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV,
EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV,
LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV,
RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV,
LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV,
LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV,
LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV,
LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV,
YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV,
LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC,
LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE,
LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una
secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X 803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el péptido inhibidor comprende un péptido de fórmula (IX): X 901 X 902 X 903 X 904 X 905 X 906 X 907 X 908 X 909 X 910 X 911 X 912 X 913 X 914 X 915 X 916 X 917, en la que X 901 es cualquier aminoácido o está ausente; X 902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X 903 es cualquier aminoácido; X 904 es cualquier aminoácido; X 905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X 906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X 907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X 908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X 909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X 910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X 911 es un aminoácido polar no cargado o H; X 912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X 913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X 914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X 915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X 916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X 917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X 901 comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente, X 901 es una R o K. Opcionalmente, X 917 es RR. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4 3 , 4 4 , 4 5 , 4 6 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el péptido aislado de o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 usados en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 88 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Por consiguiente, una vez que el inhibidor de péptidos inmunorreguladores está unido a un fragmento de albúmina o albúmina que comprende la secuencia/estructura de P3028, se detecta la presencia del inhibidor, detectando por tanto la presencia de la secuencia/estructura de P3028.
En algunos métodos para detectar la presencia de albúmina o un fragmento de albúmina que comprende la secuencia/estructura de P3028, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores comprende un péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1 1 0 0 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173). En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD, D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, lNt , LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96 o 98 tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,
68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,
122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180,
190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,
750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el péptido inhibidor comprende un péptido de fórmula (IX): X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X911 es un aminoácido polar no cargado o H; X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente;
X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X901 comprende un aminoácido cargado positivamente.
Opcionalmente X901 es una R o K. Opcionalmente X917 es Rr . En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 9 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,
121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170,
180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650,
700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46,
47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105,
106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128,
129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250,
260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,
1050, o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un péptido inhibidor que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,
69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,
100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,
123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190,
200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,
800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores está unido a un soporte (véase el ejemplo 12).
Los soportes a modo de ejemplo incluyen superficies, una tira de prueba, una placa Petri, matrices, resina o perlas.
En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores está disuelto en disolución (véase el ejemplo 10).
En algunos ejemplos, una muestra biológica que contiene posiblemente la secuencia/estructura de P3028 se pone en contacto con el inhibidor en disolución (véanse los ejemplos 10 y 12). La muestra biológica puede incluir sangre, suero, células inmunitarias, lisados de células inmunitarias, células tumorales o lisados de células tumorales. Tras el contacto con el inhibidor de péptidos inmunorreguladores, el soporte que tiene el complejo proteico dispuesto sobre el mismo se lava opcionalmente para eliminar cualquier inhibidor de péptidos inmunorreguladores no unido o fijado
de manera suelta. Si la secuencia/estructura de P3028 estaba presente en la muestra, se detecta la presencia de la secuencia/estructura de P3028 unida al inhibidor unido al soporte, usando por ejemplo un ensayo de rampo. Si la secuencia/estructura de P3028 no estaba presente en la muestra, no se detecta proteína unida.
En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores está unido a un marcador detectable, tal como se describe en el presente documento. Los marcadores detectables a modo de ejemplo incluyen biotina, fluoróforos, radiomarcadores y enzimas. En algunos ejemplos, se proporciona una muestra biológica que posiblemente contiene la secuencia/estructura de P3028. La muestra puede incluir sangre, plasma, suero, células inmunitarias aisladas, células cancerosas aisladas, una biopsia tisular y/o una biopsia tumoral. El inhibidor de péptido 3028 (el inhibidor de péptidos inmunorreguladores) se pone en contacto con la muestra biológica. La muestra puede entonces lavarse opcionalmente. Si está presente la secuencia/estructura de P3028, el marcador detectable estará presente en la muestra biológica (véase el ejemplo 14). Si no estaba presente la secuencia/estructura de P3028, no se detecta marcador. Los métodos a modo de ejemplo de detección del marcador detectable incluyen microscopía, formación de secciones histológicas, inmunoensayos, inmunohistoquímica, citometría de flujo, inmunotransferencia, ELISA y ELISpot (véase la figura 39). Por ejemplo, puede examinarse una sección histológica para determinar células y/o tejidos que contienen la secuencia/estructura de P3028. Por ejemplo, una muestra de células tumorales y/o inmunitarias disociadas puede examinarse para detectar células unidas a la secuencia/estructura de P3028 usando técnicas de secciones congeladas o plásticas. La sección a continuación proporciona más detalle sobre enfoques para tratar, prevenir o inhibir la inmunosupresión en un sujeto que lo necesita (por ejemplo, un sujeto que tiene cáncer o una infección patógena, tal como una infección viral o una infección bacteriana).
Método de tratamiento, prevención o inhibición de la inmunosupresión
Muchos estados y enfermedades están asociados con la inmunosupresión, por ejemplo, muchos tipos de cáncer, infección y enfermedad inflamatoria están asociados con inmunosupresión. Por tanto, los estados a modo de ejemplo asociados con la inmunosupresión que pueden tratarse, prevenirse o inhibirse usando uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento incluyen muchos tipos de cáncer, tal como cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón o cáncer de células hematopoyéticas. Estos estados pueden también tratarse, prevenirse, mejorarse o inhibirse usando uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento. Los estados a modo de ejemplo asociados con la inmunosupresión que pueden tratarse, prevenirse o inhibirse usando uno o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento incluyen además desequilibrios hormonales, tales como actividad de cortisol aumentada y/o ectópica.
Por consiguiente, algunos ejemplos incluyen métodos de tratamiento, prevención o reducción de la inmunosupresión o una o más de las infecciones o enfermedades mencionadas anteriormente en un ser humano. En algunos ejemplos, el método incluye identificar a un paciente que tiene un estado asociado con la inmunosupresión (por ejemplo, cáncer). Una etapa de identificación de este tipo puede lograrse mediante evaluación clínica (por ejemplo, exploración por CT, MRI o PET) o ensayo de diagnóstico. El método incluye además administrar al paciente identificado o seleccionado una composición que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en una secuencia de inhibidor de péptidos inmunorreguladores, o un ácido nucleico que codifica para una molécula de este tipo tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, la composición que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores puede incluir una cualquiera de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 9 8 , 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, la composición se administra por vía peritumoral, o cerca de un tumor, por ejemplo dentro de 10, 9, 8 , 7, 6 , 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 cm de un tumor. En algunos ejemplos, la composición se administra por vía sistémica. En algunos ejemplos, la composición se administra conjuntamente con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, un agente terapéutico seleccionado para estimular una célula inmunitaria después de que un receptor de LFA-1 de la célula inmunitaria se haya desbloqueado (por ejemplo, los péptidos inmunorreguladores o estructuras de 3028 unidos se han desplazado del receptor de LFA-1). En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, la composición que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en el inhibidor de péptidos inmunorreguladores usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un péptido tal como se describe en el presente documento, o un ácido nucleico que codifica para una molécula de este tipo. Por ejemplo, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM,
VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,
4 3 , 4 4 , 4 5 , 4 6 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210,220, 230, 240, 250, 260,270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLd (SEQ
ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD, D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150,160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,
32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62,
63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93,
94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117,
118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula(IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptido comprende un péptido de fórmula (IX): X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; Xgo7 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; Xgo8 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; Xgog es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; Xgio es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; Xgii es un aminoácido polar no cargado o H; Xgi2 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; Xgi3 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; Xgi4 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; Xgi5 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; Xgi6 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y Xgi7 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, Xgoi comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente Xgoi es una R o K. Opcionalmente Xgi7 es RR. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a i io o aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, io, i i , i2, i3, i4, i5, i6, i7, i8, i 9, 2o, 2 i, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 3o, 3i, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 4o, 4 i, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 5o, 5 i, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6o, 6 i, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 7o, 7i, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 8o, 8i, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 9o, 9i, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ioo, io i, io2, io3, io4, io5, io6, io7, io8, io9, i io , i i i , i i2 , i i3 , i i4 , i i5 , i i6 , i i7 , i i8 , i i9 , i2o, i2 i, i22, i23, i24, i25, i26, i27, i28, i29, i3o, i3 i, i32, i33, i34, i35, i36, i37, i38, i39, i4o, i5o, i6o, i7o, i8o, i9o, 2oo, 2io, 22o, 23o, 24o, 25o, 26o, 27o, 28o, 29o, 3oo, 32o, 34o, 36o, 38o, 4oo, 45o, 5oo, 55o, 6oo, 65o, 7oo, 75o, 8oo, 85o, 9oo, 95o, iooo, io5o o i io o aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: i-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.i, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y i3. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a i io o aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, io, i i , i2, i3, i4, i5, i6, i7, i8, i9, 2o, 2 i, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 3o, 3 i, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 4o, 4 i, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 5o, 5i, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6o, 6 i, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 7o, 7 i, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 8o, 8i, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 9o, 9i, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ioo, io i, io2, io3, io4, io5, io6, io7, io8, io9, i io , i i i , i i2 , i i3 , i i4 , i i5 , i i6 , i i7 , i i8 , i i9 , i2o, i2 i, i22, i23, i24, i25, i26, i27, i28, i29, i3o, i3 i, i32, i33, i34, i35, i36, i37, i38, i39, i4o, i5o, i6o, i7o, i8o, 19o, 2oo, 2io, 22o, 23o, 24o, 25o, 26o, 27o, 28o, 29o, 3oo, 32o, 34o, 36o, 38o, 4oo, 45o, 5oo, 55o, 6oo, 65o, 7oo, 75o, 8oo, 85o, 9oo, 95o, iooo, io5o o i io o aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un péptido inhibidor que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en SEQ ID NO: i -33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el péptido aislado usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a iio o aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, io, i i , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2o, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 3o, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 4o, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 5o, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 6o, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 7o, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 8o, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 9o, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ioo, io i, io2, io3, io4, io5, io6, io7, io8, io9, i io , i i i , 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 12o, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 13o, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 14o, 15o, 16o, 17o, 18o, 19o, 2oo, 2io, 22o, 23o, 24o, 25o, 26o, 27o, 28o, 29o, 3oo, 32o, 34o, 36o, 38o, 4oo, 45o, 5oo, 55o, 6oo, 65o, 7oo, 75o, 8oo, 85o, 9oo, 95o, iooo, io5o o i io o aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Se da a conocer un ácido nucleico que codifica para un inhibidor de péptido de este tipo que puede proporcionarse, por ejemplo, un ácido nucleico de SEQ ID NO: io2-165. Preferiblemente, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores usado en los métodos mencionados anteriormente es P28R, un derivado del mismo o un ácido nucleico que codifica para una molécula de este tipo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores comprenden, consisten en o consisten esencialmente en un péptido tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser k KlDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 17o), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 26o), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, Xi es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173). En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF, F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T, o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, TV, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T, o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VIII), X800KX801KX802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula(IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptido comprende un péptido de fórmula (IX): X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X911 es un aminoácido polar no cargado o H; X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X901 comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente X901 es una R o K. Opcionalmente X917 es RR. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, los péptidos aislados tienen una longitud que es menor de o igual a 1 1 0 0 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1, 5.4, 5.5 o 5.6 o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1, 5.4, 5.5 o 5.6 o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4 3 , 4 4 , 4 5 , 4 6 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica para un inhibidor de péptido de este tipo puede proporcionarse por SEQ ID NO: 102-165.
Los inhibidores de péptidos inmunorreguladores usados en los métodos mencionados anteriormente pueden comprender al menos un D aminoácido, al menos un aminoácido no natural, un grupo acetilo N-terminal o un grupo amida C-terminal y dichos inhibidores de péptidos inmunorreguladores pueden estar glicosilados o unidos a PEG, una citotoxina o un radionúclido. El péptido puede administrarse a al menos una célula del paciente. La administración puede realizare in vivo, por ejemplo, terapéuticamente. La administración puede realizarse ex vivo, por ejemplo, como una herramienta de diagnóstico, o como una terapia ex vivo para estimular células inmunitarias del paciente antes de que las células inmunitarias se administren al paciente. La administración de un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en un inhibidor de péptido tal como se describe en el presente documento, o un ácido nucleico que codifica para una molécula de este tipo a células inmunitarias humanas, y la detección de la estimulación de células inmunitarias se describe en el ejemplo 13). Por ejemplo, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser k KlDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 4 3 , 4 4 , 4 5 , 4 6 , 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173). En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, lNt , LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102,103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W, Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W, Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Un ácido nucleico que codifica para un péptido inhibidor de este tipo puede proporcionar, por ejemplo, un ácido nucleico de SEQ ID NO: 102-165. Tras la administración del inhibidor de péptidos inmunorreguladores, puede detectarse la estimulación de células inmunitarias humanas del ser humano (por ejemplo, un aumento en proliferación de células inmunitarias, migración o citotoxicidad de células NK). Una vez que el inhibidor de péptidos inmunorreguladores se ha administrado, estos métodos, opcionalmente, pueden incluir medir u observar una reducción en la inmunosupresión en el paciente (por ejemplo, puede evaluarse un aumento en la proliferación, migración o diseminación de células inmunitarias o citotoxicidad de células NK o detectar la activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas).
Tal como se mencionó anteriormente, algunos ejemplos incluyen una etapa de identificar a un paciente que padece inmunosupresión. Este análisis puede incluir generalmente determinar la actividad de células inmunitarias del paciente, por ejemplo, determinar la cantidad de al menos un tipo de célula inmunitaria, por ejemplo, leucocitos, PBMC, linfocitos, monocitos, macrófagos en una muestra biológica del paciente. La presencia de la secuencia/estructura de P3028 en el suero de un paciente, y/o en una célula cancerosa de un paciente (una evaluación que puede lograrse usando un inhibidor de péptidos inmunorreguladores marcado) es también indicativa de la supresión del sistema inmunitario del paciente. Por consiguiente, algunos ejemplos incluyen detectar la presencia de la secuencia/estructura de P3028 en una muestra biológica de un paciente, por ejemplo, una muestra que incluye sangre, plasma, suero o una biopsia de células cancerosas. Pueden encontrarse ejemplos, métodos y composiciones para detectar la presencia de péptido 3028 en una muestra biológica de un paciente en las patentes estadounidenses n.os 7960126, 8133688, 8110347 y las publicaciones estadounidenses n.os 2010/0323370 y 2011/0262470. La secuencia/estructura de P3028 puede detectarse, por ejemplo, mediante inmunoensayos, una técnica de transferencia, ELISA, ELISpot, citometría de flujo, ensayo de perlas citométricas, proteómica y/o inmunohistoquímica de una muestra biológica, usando al menos un anticuerpo que se une a la secuencia/estructura de P3028. La secuencia/estructura de P3028 puede detectarse también, por ejemplo, mediante espectrometría de masas de una muestra biológica de un paciente o una fracción de la misma. La secuencia/estructura de P3028 puede detectarse además mediante detección directa de un inhibidor de péptido marcado de la secuencia/estructura de P3028 tal como se describe en el presente documento, por ejemplo, mediante tinción histológica, microscopía fluorescente, inmunohistoquímica o ensayos enzimáticos colorimétricos (véase el ejemplo 14). La secuencia/estructura de P3028 también puede detectarse, por ejemplo, funcionalmente, comparando una célula inmunitaria en contacto con el suero de un paciente con una célula inmunitaria en contacto con un suero de muestra de control que se sabe que no contiene la secuencia/estructura de P3028. En algunos ejemplos, el suero está desnaturalizado. Las células inmunitarias a modo de ejemplo incluyen PBMC. En algunos ejemplos, el suero no está desnaturalizado. Las células inmunitarias pueden estimularse opcionalmente, por ejemplo, mediante IL-2 o lipopolisacárido (LPS). En algunos ejemplos, las células inmunitarias se analizan para detectar la producción de IL-6.
En algunos ejemplos, puede identificarse un paciente que padece inmunosupresión diagnosticando al paciente con cáncer. En algunos ejemplos, pueden identificarse células cancerosas, y el paciente puede por tanto identificarse, detectando la unión de células del paciente a la secuencia/estructura de P3028 (véase el ejemplo 7) o un inhibidor de la secuencia/estructura de P3028 (véase el ejemplo 14). Los cánceres a modo de ejemplo que pueden identificarse, y que están asociados con la inmunosupresión incluyen cáncer de mama, carcinoma de células renales y melanoma maligno.
La administración del inhibidor de péptidos inmunorreguladores al paciente puede lograrse mediante una variedad de enfoques. En algunas realizaciones, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores para su administración directamente al paciente. El inhibidor de péptidos inmunorreguladores puede ser para administración por vía intravenosa, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía tópica, por vía transdérmica, por vía oral y/o por vía peritumoral. En algunas realizaciones, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores es para su administración en el sitio de un tumor, por ejemplo, por medio de inyección directa. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores es para su administración cerca de un tumor, por ejemplo, dentro de 10 cm, 9 cm, 8 cm, 7 cm, 6 cm, 5 cm, 4 cm, 3c m, 2 cm, 1 cm o 0,5 cm del tumor o un intervalo definido por dos cualesquiera de las distancias mencionadas anteriormente. En algunas realizaciones, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores para su administración con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable, tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores para su administración ex vivo. Pueden aislarse del paciente células inmunitarias del paciente, ponerse en contacto con el inhibidor, y devolverse al paciente, por ejemplo. Los ejemplos 13 y 14 describen la puesta en contacto de células inmunitarias de un paciente con un inhibidor de la secuencia/estructura de P3028.
Uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento puede emplearse con uno o más de los métodos mencionados anteriormente. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores comprende al menos una SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583­ 586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores incluye al menos un inhibidor de peptidomimético de la secuencia/estructura de P3028 correspondiente a una cualquiera o más de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores es un inhibidor de molécula pequeña del péptido 3028 correspondiente a una cualquiera o más de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores incluye un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente a la secuencia/estructura de P3028. En el ejemplo 9 se describen anticuerpos que inhiben la secuencia/estructura de P3028.
En algunos de los métodos mencionados anteriormente, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores de la secuencia/estructura de P3028 comprende un ácido nucleico que codifica para un inhibidor de péptidos inmunorreguladores, tal como un péptido descrito en el presente documento. Por ejemplo, el inhibidor de péptido codificado por el ácido nucleico puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) codificados por los ácidos nucleicos usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1 1 0 0 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido codificado por los ácidos nucleicos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173). En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, lNt , LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER, E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) codificados por los ácidos nucleicos usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1 1 0 0 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido codificado por los ácidos nucleicos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) codificados por los ácidos nucleicos usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido codificado por los ácidos nucleicos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido codificado por los ácidos nucleicos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,
68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,
122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180,
190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,
750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido codificado por el ácido nucleico usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptido comprende un péptido de fórmula (IX): X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X911 es un aminoácido polar no cargado o H; X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente;
X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X901 comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente X901 es una R o K. Opcionalmente X917 es RR. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a
1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,
112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido codificado por el ácido nucleico usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583­
586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados codificados por los ácidos nucleicos usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,
Figure imgf000087_0001
58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido codificado por el ácido nucleico usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un péptido inhibidor que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo
P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, que está codificado por el ácido nucleico usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,
39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,
70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,
100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Por ejemplo, puede proporcionarse un ácido nucleico que codifica para un inhibidor de péptido de este tipo, por ejemplo, un ácido nucleico de SEQ ID NO: 102-165. El ácido nucleico puede proporcionarse en un vector de expresión tal como se describe en el presente documento. El ácido nucleico puede proporcionarse al ser humano administrando directamente un vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica para el inhibidor de péptidos inmunorreguladores al ser humano, por ejemplo, por medio de un vector retroviral o adenoviral o plásmido de expresión usado en inmunización genética (por ejemplo, pVAX). El vector de expresión puede proporcionarse a células del ser humano ex vivo, y las células pueden devolverse al ser humano o in vivo usando tecnología de electroporación. Se describen métodos de administración de ácidos nucleicos a una célula huésped por medio de vectores virales en la patente estadounidense n.° 7.572.906. Se describen métodos de transducción de células inmunitarias con un adenovirus ex vivo y devolución de las mismas a un paciente en la patente estadounidense n.° 8.012.468. En algunos ejemplos, se pone en contacto una célula huésped con un vector que codifica para el inhibidor de péptidos inmunorreguladores de P3028. El vector puede replicarse en la célula huésped. En algunos ejemplos, la célula huésped también se pone en contacto con un “vector de expresión auxiliar”, es decir, un genoma viral que promueve la replicación del vector en un huésped no infectado. En algunos ejemplos, el inhibidor se administra como en el ejemplo 16. En algunos ejemplos, la célula se pone en contacto ex vivo. En algunos ejemplos, la célula es una célula inmunitaria. En algunos ejemplos, la célula es una de un linfocito, una PBMC o un leucocito. En algunos ejemplos, el inhibidor se administra como en el ejemplo 13.
Preferiblemente, se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor de péptidos inmunorreguladores. Para un paciente que ya padece inmunosupresión dependiente de P3028, una cantidad terapéuticamente eficaz de inhibidor puede incluir una dosis de inhibidor de péptidos inmunorreguladores suficiente para detener al menos parcialmente un síntoma de la inmunosupresión (por ejemplo, una cantidad suficiente para mejorar la proliferación o migración de células inmunitarias). En algunos ejemplos, una cantidad terapéuticamente eficaz incluye al menos aproximadamente 1 nanogramo de inhibidor de péptidos inmunorreguladores sustancialmente puro, por ejemplo, al menos o igual a aproximadamente 1 nanogramo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 nanogramos, 1 microgramo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 microgramos, aproximadamente 1 miligramo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 miligramos, o 1,1 gramos, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2., 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 gramos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados pueden proporcionarse a un paciente que lo necesita.
En algunos ejemplos, puede proporcionarse una cantidad terapéuticamente eficaz según un programa que incluye una o más de una administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de inhibidor, por ejemplo, al menos o igual a aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 administraciones. Una administración puede proporcionarse cada hora o menos, por ejemplo no más de una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas, o no más de una vez cada 1 día, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 9, 10, 11, 12, 13,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días.
Mediante algunos métodos, tras la administración del inhibidor de péptidos inmunorreguladores, se mide, detecta u observa una reducción en la inmunosupresión. En algunos ejemplos, se detecta, mide u observa una reducción en la inmunosupresión obteniendo una muestra biológica del paciente que recibió el inhibidor de péptidos inmunorreguladores y detectando una reducción en unión del receptor de células inmunitarias a P3028 y/o una detección de la proliferación de células inmunitarias tras la inducción por IL-2 de las células inmunitarias presentes en la muestra biológica. En algunos ejemplos, el análisis de la muestra biológica obtenida del paciente anterior se compara con el mismo análisis (por ejemplo, determinación de la cantidad de unión del receptor de células inmunitarias a la secuencia/estructura de P3028 o proliferación inducida por IL-2 de células inmunitarias) realizado sobre una muestra biológica de control, por ejemplo, una muestra biológica del mismo paciente tomada antes de la administración del inhibidor de péptidos inmunorreguladores o una muestra biológica tomada de un ser humano sano. Los ejemplos 9 y 13 describen la detección de una reducción de la inmunosupresión en células en contacto con suero en comparación con una muestra de control.
Tal como se mencionó anteriormente, puede detectarse una reducción en la inmunosupresión como un aumento en la estimulación de células inmunitarias, por ejemplo, proliferación de células inmunitarias o citotoxicidad de células inmunitarias. Una reducción en la inmunosupresión inducida por P3028, que puede medirse en los métodos descritos anteriormente, puede incluir: aumento de la estimulación de receptores de células T (véase el ejemplo 3); aumento de la citotoxicidad de células NK (véase el ejemplo 4); aumento de la diseminación de leucocitos (véase el ejemplo 5); aumento de la migración de células inmunitarias (véase el ejemplo 5); y/o proliferación inducida por IL-2 (véase el ejemplo 6). La disminución de la producción de IL-6 también puede ser un pronóstico mejorado para pacientes con cáncer, por ejemplo, pacientes con cáncer que padecen inmunosupresión (véase la patente estadounidense n.° 8.110.347). Deseablemente, se detecta una reducción en la inmunosupresión mediante un aumento en la respuesta proliferativa de PBMC a IL-2, tal como se muestra en el ejemplo 9, o detectando la activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina, citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
En algunos ejemplos, la reducción en la inmunosupresión se detecta detectando la presencia o cantidad de marcadores de células inmunitarias y/o suero y/o albúmina recogidos de un paciente. En algunos ejemplos, la detección incluye recoger suero, sangre de un paciente y/o albúmina de un paciente, y poner en contacto el suero, plasma, sangre o albúmina del paciente con una célula inmunitaria ex vivo. En algunos ejemplos, la célula inmunitaria también se pone en contacto con IL-2. La respuesta proliferativa de la célula inmunitaria a IL-2 puede usarse para detectar una disminución en la inmunosupresión. La célula inmunitaria puede ser una célula del paciente o una célula de otro ser humano, o una célula del cultivo celular. En algunos ejemplos, la reducción en la inmunosupresión puede detectarse detectando los efectos del aumento de la actividad del sistema inmunitario, por ejemplo, reducción en el número de células cancerosas, una reducción en el tamaño tumoral o una reducción o inhibición de la proliferación de células cancerosas. En algunos ejemplos, pueden identificarse células cancerosas, y las células cancerosas pueden cuantificarse, por tanto, detectando células que se unen a la secuencia/estructura de P3028 (véase el ejemplo 7) o un inhibidor de la secuencia/estructura de P3028 (véase el ejemplo 14).
Métodos de inhibición de la unión de un fragmento de albúmina a un receptor
Los métodos adicionales incluyen enfoques para inhibir la unión de un fragmento de albúmina a un receptor de células inmunitarias (por ejemplo, un receptor de LFA-1 y/o de IL-2). El método puede incluir identificar a un ser humano que padece inmunosupresión, tal como se describe en el presente documento. La inmunosupresión puede estar provocada por uno o más péptidos inmunorreguladores o estructuras. Las estructuras o péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo incluyen la secuencia/estructura de P3028s, y/o proteínas o péptidos que comprenden, consisten en o consisten esencialmente en las secuencias de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246. El método puede incluir también poner en contacto una célula inmunitaria con un péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido inhibidor tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173). En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280,290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV,
LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT,
LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,
49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79,
80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107,
108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130,
131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270,
280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula(IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptido comprende un péptido de fórmula (IX): X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X911 es un aminoácido polar no cargado o H; X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y, o Q; X916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X901 comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente X901 es una R o K. Opcionalmente X917 es RR. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo,
, 28, 29, 3 , 59, 60, 6
Figure imgf000091_0001
, 90, 91, 9
550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,
38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68,
69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,
100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,
123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190,
200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750,
800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o
SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo p28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a
1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. La célula inmunitaria puede estar en presencia de suero humano, por ejemplo, albúmina o un fragmento de albúmina tal como se describe en el presente documento.
Se dan a conocer métodos de inhibición de la unión de un fragmento de albúmina humana (por ejemplo, un fragmento de albúmina que tiene la secuencia/estructura de P3028) con un receptor de LFA-1 o receptor de IL-2. P3028, un fragmento de albúmina, puede unirse al receptor de LFA-1 y al receptor de IL-2 (véanse los ejemplos 7 y 8) y esta unión puede inhibirse proporcionando una composición que comprende, consiste esencialmente en o consiste en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores. En algunos ejemplos, los métodos de inhibición de la unión de P3028 al receptor de LFA-1 o de IL-2 incluyen poner en contacto o unir un inhibidor de péptidos inmunorreguladores a P3028 in vivo o in vitro y, opcionalmente, detectar una inhibición de la unión de P3028 a un receptor de LFA-1 o un receptor de IL-2. La unión de P3028 al receptor de LFA-1 y receptor de IL-2 puede inhibirse uniendo P3028 a un anticuerpo que se une específicamente a P3028, por ejemplo (véase el ejemplo 9). Estos métodos también pueden ponerse en práctica uniendo un inhibidor de péptidos inmunorreguladores basado en péptido que tiene la capacidad de eliminar o inhibir el bloqueo de P3028 del receptor de LFA-1, por ejemplo, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores P28R (SEQ ID NO: 2) (véase el ejemplo 16) o el péptido de núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) (véase el ejemplo 38).
Preferiblemente, la composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un inhibidor de péptidos inmunorreguladores usada en estos métodos incluye un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende, consiste en o consiste esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. X3 puede ser uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLd (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDt F (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T, Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula(IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptido comprende un péptido de fórmula (IX): X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X911 es un aminoácido polar no cargado o H; X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X901 comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente X901 es una R o K. Opcionalmente X917 es RR. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un péptido inhibidor que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. Adicionalmente, puede proporcionarse un ácido nucleico que codifica para un inhibidor de péptido de este tipo, por ejemplo, un ácido nucleico de SEQ ID NO: 102-165.
Preferiblemente, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores usado en los métodos mencionados anteriormente es P28R, un derivado del mismo o un ácido nucleico que codifica para una molécula de este tipo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46­ 53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28r o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, o un ácido nucleico que codifica para una molécula de este tipo. Los inhibidores de péptidos inmunorreguladores usados en los métodos mencionados anteriormente pueden comprender al menos un D aminoácido, al menos un aminoácido no natural, un grupo acetilo N-terminal o un grupo amida C-terminal y dichos inhibidores de péptidos inmunorreguladores pueden estar glicosilados, nitrosilados, carbonilados, oxidados o unidos a un modificador farmacocinético unido, PEG, una citotoxina o un radionúclido.
Algunos ejemplos incluyen eliminar un ligando unido del receptor de LFA-1 o el receptor de IL-2 del receptor (por ejemplo, una molécula que comprende P3028). Tal como se muestra en el ejemplo 15, la unión de un inhibidor de la secuencia/estructura de P3028 a P3028 puede aumentar la disponibilidad del receptor de LFA-1 para un anticuerpo que se une específicamente al receptor de LFA-1, en comparación con una muestra de control en la que el inhibidor no se unió a P3028. En algunas realizaciones, P3028 se une al inhibidor, eliminando por tanto la unión de P3028 del receptor de IL-2 (véanse los ejemplos 9 y 13).
Métodos de unión de células cancerosas con un inhibidor de péptidos inmunorreguladores
Se dan a conocer métodos de unión de células cancerosas con un inhibidor de péptidos inmunorreguladores (por ejemplo, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores que tiene una citotoxina, radionúclido o marcador detectable). Estos métodos se ponen en práctica poniendo en contacto células cancerosas (por ejemplo, in vitro o in vivo) con una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento. Por ejemplo, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER, o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X es está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173). En algunas realizaciones, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD, D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126,127, 128, 129,130, 131, 132,133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula(VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. Adicionalmente, puede proporcionarse un ácido nucleico que codifica para un inhibidor de péptido de este tipo, por ejemplo, un ácido nucleico de SEQ ID NO: 102-165.
Preferiblemente, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores usado en los métodos mencionados anteriormente es P28R, núcleo P28, un derivado del mismo o un ácido nucleico que codifica para una molécula de este tipo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13, o un ácido nucleico que codifica para una molécula de este tipo (por ejemplo, s Eq ID NO: 102-165)). Los inhibidores de péptidos inmunorreguladores usados en los métodos mencionados anteriormente pueden comprender al menos un D aminoácido, al menos un aminoácido no natural, un grupo acetilo N-terminal o un grupo amida C-terminal y dichos inhibidores de péptidos inmunorreguladores pueden estar glicosilados o unidos a PEG, una citotoxina o un radionúclido.
Una vez que el inhibidor de péptidos inmunorreguladores o anticuerpo que se une específicamente a cualquier péptido inmunorregulador de las tablas 1-4 está unido a la célula cancerosa, puede detectarse. Es decir, opcionalmente, el método anterior incluye una etapa de detección mediante la cual se determina la unión del inhibidor de péptidos inmunorreguladores directa o indirectamente. En algunos ejemplos, la unión del inhibidor de péptidos inmunorreguladores se detecta directamente como en el ejemplo 14. En algunos ejemplos, la unión del inhibidor de péptidos inmunorreguladores se detecta indirectamente. Tal como se describe en el presente documento, la presencia de P3028 en células cancerosas puede suprimir localmente una respuesta inmunitaria. Por tanto, en algunos ejemplos, detectar la unión de un inhibidor de péptidos inmunorreguladores a una célula cancerosa también puede incluir una etapa de detectar una reversión de la inmunosupresión, tal como se describe en el ejemplo 13. La reversión de la inmunosupresión puede determinarse, por ejemplo, como una reversión de la proliferación de PBMC alterada (véanse los ejemplos 2 y 13), reversión de la estimulación de receptores de células T (véase el ejemplo 3), reversión de la disminución de la citotoxicidad de células NK (véase el ejemplo 4), reversión de la disminución de la diseminación de leucocitos (véase el ejemplo 5) o disminución de la migración de células inmunitarias (véase el ejemplo 6 ), o aumento de la proliferación inducida por IL-2 (véanse los ejemplos 6 y 9). En algunos ejemplos, las células cancerosas se unen a un inhibidor de péptidos inmunorreguladores in vivo. El ejemplo 16 describe el suministro de un inhibidor de P3028 a células cancerosas in vivo. El ejemplo 42 describe la detección de un inhibidor de P3028 en células cancerosas.
En algunos ejemplos, la detección de un inhibidor de péptidos inmunorreguladores puede producirse en biopsias tumorales obtenidas de un ser humano. En algunos ejemplos, las biopsias tumorales pueden incluir supuestas células cancerosas, o las biopsias pueden examinarse para detectar células cancerosas. Mediante estos métodos, las biopsias tisulares se ponen en contacto con un inhibidor de péptidos inmunorreguladores, tal como se describe en el presente documento. Preferiblemente, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores comprende un marcador detectable, tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, se ponen en contacto células vivas con el inhibidor de péptidos inmunorreguladores (véase el ejemplo 14). En algunos ejemplos, se unen secciones histológicas con el inhibidor de péptidos inmunorreguladores. El marcador detectable se detecta entonces, permitiendo por tanto la identificación de células cancerosas a las cuales no puede atacar el sistema inmunitario. El marcador detectable puede detectarse a través de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante inmunoensayo, una técnica de transferencia, ELISA, ELISpot, citometría de flujo, ensayo de perlas citométricas, proteómica y/o inmunohistoquímica.
Métodos de suministro de una citotoxina o un radionúclido a una célula cancerosa
Se dan a conocer métodos de suministro de una citotoxina o un radionúclido a una célula cancerosa. Algunos ejemplos incluyen dirigir una sustancia radiactiva (por ejemplo, 111I,131I, 90Y, 67Cu, 186 Re, 188Re, 212Bi o 211At) o un compuesto terapéutico (por ejemplo, una toxina) a una célula cancerosa. Tal como se describe en el presente documento, inhibidores de péptidos inmunorreguladores, por ejemplo, péptido P28R, se unen a células cancerosas, pero no a células inmunitarias sanas, por ejemplo, linfocitos (véase el ejemplo 14). Por tanto, en algunos ejemplos, la unión de un compuesto terapéutico a una célula cancerosa puede estar mediada por el inhibidor de péptidos inmunorreguladores. En algunos ejemplos, un compuesto terapéutico, por ejemplo, una citotoxina, una radiotoxina, o similares tal como se describe en el presente documento se une al inhibidor de péptidos inmunorreguladores que se une a P3028.
Estos métodos se ponen en práctica poniendo en contacto células cancerosas (por ejemplo, in vitro o in vivo) con una composición que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores descritos en el presente documento, que comprende una sustancia radiactiva (por ejemplo, IIII, 131I, 90Y, 67Cu, 186Re, 188Re, 212Bi o 211At) o un compuesto terapéutico (por ejemplo, una toxina). En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores usado en estos métodos comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1 1 0 0 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD, D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo,
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550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160,170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1 1 0 0 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT, T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1 1 0 0 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptido comprende un péptido de fórmula (IX): X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y, o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X911 es un aminoácido polar no cargado o H; X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X901 comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente X901 es una R o K. Opcionalmente X917 es RR. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90,91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320,
340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,
4 3 , 4 4 , 4 5 , 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102,
103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125,
126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220,
230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900,
950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5,
5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el péptido aislado de o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,
25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55,
56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 ,
87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130,131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Preferiblemente, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores usado en los métodos mencionados anteriormente es P28R, un derivado del mismo o un ácido nucleico que codifica para una molécula de este tipo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los inhibidores de péptidos inmunorreguladores proporcionados por SEQ ID NO: 1-33, 34, 46­
53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96 o 98 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1). Los inhibidores de péptidos inmunorreguladores usados en los métodos mencionados anteriormente pueden comprender al menos un D aminoácido, al menos un aminoácido no natural, un grupo acetilo N-terminal o un grupo amida C-terminal y dichos inhibidores de péptidos inmunorreguladores pueden estar glicosilados o unidos a PEG.
Una vez que el inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende la citotoxina o el radionúclido ha entrado en contacto con la célula cancerosa, (por ejemplo, en un paciente humano), la toxina y/o radionúclido puede inducir muerte de células cancerosas. En algunos ejemplos, la muerte de células cancerosas comprende apoptosis.
Opcionalmente, la muerte celular puede comprender activación de caspasa 3 (véase el ejemplo 39). En algunas realizaciones, el péptido aislado es P28R (SEQ ID NO: 2) o una composición farmacéutica que comprende o que consiste esencialmente en P28R para administración por vía peritumoral o cerca de un tumor (por ejemplo, dentro de 10 cm, 9 cm, 8 cm, 7 cm, 6 cm, 5 cm, 4 cm, 3 cm, 2 cm, 1 cm o 0,5 cm del tumor), e induce muerte celular de células tumorales. En algunas realizaciones, el tumor comprende células de cáncer de próstata. En algunas realizaciones, el tumor comprende un melanoma, por ejemplo, un melanoma B16. En algunas realizaciones, dicho péptido es para administración tumoral de al menos aproximadamente 10 ng/ 1 0 0 ml de péptido inhibidor, por ejemplo aproximadamente 10 ng/100 ml, 20 ng/100 ml, 30 ng/100 ml, 40 ng/100 ml, 50 ng/100 ml, 60 ng/100 ml,
70 ng/100 ml, 80 ng/100 ml, 90 ng/100 ml, 100 ng/100 ml, 200 ng/100 ml, 300 ng/100 ml, 400 ng/100 ml,
500 ng/100 ml, 600 ng/100 ml, 700 ng/100 ml, 800 ng/100 ml, 900 ng/100 ml, 1 |ig/100 ml, 2 |ig/100 ml, 3 |ig/100 ml,
4 |ig/100 ml, 5 |ig/100 ml, 6 |ig/100 ml, 7 |ig/100 ml, 8 |ig/100 ml, 9 |ig/100 ml, 10 |ig/100 ml, 20 |ig/100 ml,
30 |ig/100 ml, 40 |ig/100 ml, 50 |ig/100 ml, 100 |ig/100 ml, 200 |ig/100 ml, 500 |ig/100 ml, 1000 |ig/100 ml, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados, por ejemplo aproximadamente 10 ng-100 ng/100 ml, 10 ng-200 ng/100 ml, 10 ng-500 ng/100 ml, 10 ng-1 |ig/100 ml, 20 ng-10 |ig/100 ml, 100 ng-200 ng/100 ml, 100 ng-500 ng/100 ml, 100 ng-1 |ig/100 ml, 200 ng-10 |ig/100 ml, 200 ng-500 ng/100 ml, 200 ng-1 |ig/100 ml, 200 ng-10 |ig/100 ml, 1 |ig-100 |ig/100 ml, 1 |ig-500 |ig/100 ml, aproximadamente 1 |ig-1 5 |ig-100 |ig/100 ml, 5 |ig-500 |ig/100 ml, 5 |ig-1000 |ig/100 ml, 10 |ig-100 |ig/100 ml, 10 |ig-500 |ig/100 ml, 10 |ig-1000 |ig/100 ml, 50 |ig-100 |ig/100 ml, 50 |ig-500 |ig/100 ml, 50 |ig-1000 |ig/100 ml, 100 |ig-500 |ig/100 ml o aproximadamente 100 |ig-1000 |ig/100 ml. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es para administración sistémica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica para administración conjuntamente con un segundo agente terapéutico, por ejemplo, un agente terapéutico seleccionado para estimular una célula inmunitaria después de que un receptor de LFA-1 de la célula inmunitaria se haya desbloqueado (por ejemplo, los péptidos inmunorreguladores o estructuras de 3028 unidos se han desplazado del receptor de LFA-1).
Opcionalmente, estos usos dados a conocer incluyen las etapas de observar o monitorizar el cáncer o la progresión del cáncer del paciente. En algunas realizaciones, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende la citotoxina o el radionúclido es para su administración a un paciente con cáncer que tiene cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, melanoma maligno, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (adenocarcinoma), carcinoma de células escamosas, cáncer de vejiga, osteosarcoma, cáncer bronquial o cáncer de células hematopoyéticas. En algunos ejemplos, se examina una muestra biológica de un ser humano para detectar la unión del inhibidor de péptidos inmunorreguladores antes de administrar el inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende la citotoxina o el radionúclido. Por ejemplo, un inhibidor de péptidos inmunorreguladores o anticuerpo que se une específicamente a un péptido inmunorregulador de una cualquiera de las tablas 1-4 unido a un marcador detectable puede administrarse a una muestra biológica como en el ejemplo 14 o el ejemplo 41. A partir de la detección del marcador detectable, puede confirmarse que el inhibidor de péptidos inmunorreguladores se une a las células cancerosas, y luego el mismo inhibidor de péptidos inmunorreguladores que comprende la citotoxina o el radionúclido puede proporcionarse al paciente.
Métodos de inhibición de la proliferación de células cancerosas
Se dan a conocer métodos de inhibición de la proliferación de células cancerosas. El método puede incluir identificar un paciente con cáncer humano. El paciente puede padecer uno o más cánceres, por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, melanoma maligno, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (adenocarcinoma), carcinoma de células escamosas, cáncer de vejiga, osteosarcoma, cáncer bronquial o cáncer de células hematopoyéticas. El método puede incluir poner en contacto células inmunitarias del ser humano mediante un inhibidor de péptidos inmunorreguladores. En algunos ejemplos, la puesta en contacto de las células inmunitarias comprende administración intratumoral, o administración cerca de un tumor, por ejemplo, dentro de 10, 9, 8 , 7, 6 , 5, 4, 3, 2, 1 o 0,5 cm del tumor. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos inmunorreguladores comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1 1 0 0 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLd (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP,
QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP,
VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR,
LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR,
VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos
ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER, E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos
aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a
1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,
85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,
112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,
135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320,
340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos,
incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir
esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una
secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181),
DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o
está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos
ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una
secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la
fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo,
, 30, 31, , 61, 62,
Figure imgf000103_0001
, 92, 93,
550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos
cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir
esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394),
tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser
K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y
puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una
secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia
opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia
opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y
puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V,
F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N,
P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N,
Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T,
V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N,
P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I,
L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N,
R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud
que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,
16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46,
47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77,
78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105,
106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128,
129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250,
260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050
o 1 1 0 0 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir
esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente
documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R,
T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV,
EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV,
LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV,
RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV,
LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1 1 0 0 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4,
5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67,
6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,
122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180,
190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,
750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula(IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el péptido inhibidor comprende un péptido de fórmula (IX): X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X911 es un aminoácido polar no cargado o H; X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente;
X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X901 comprende un aminoácido cargado positivamente.
Opcionalmente X901 es una R o K. Opcionalmente X917 es Rr . En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110,111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,
121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170,
180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650,
700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados tienen una longitud que es menor de o igual a
1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53,
54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,
85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,
112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,
135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320,
340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de
P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la
tabla 5.1 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoáci
menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,
118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 13
150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 38
Figure imgf000105_0001
550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos
cualesquiera de los valores enumerados.
En algunos ejemplos, el método incluye proporcionar al ser humano un polinucleótido que codifica para un inhibidor
de péptido de este tipo (por ejemplo, uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5,
5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las
tablas 5.3 y 13). Por ejemplo, puede proporcionarse un polinucleótido que codifica para un inhibidor de péptido de
este tipo, por ejemplo, un ácido nucleico de SEQ ID NO: 102-165.
La reducción de inmunosupresión asociada con el cáncer puede inducir y/o potenciar una respuesta inmunitaria
contra células cancerosas. Una respuesta inmunitaria contra células cancerosas puede reducir la proliferación de
células cancerosas y/o provocar que las células cancerosas experimenten muerte celular o apoptosis. Por tanto, el
método puede incluir detectar una inhibición en la proliferación de células cancerosas del paciente. El método puede
incluir detectar una inducción de muerte celular o apoptosis de células cancerosas del paciente. El método puede
incluir detectar una inhibición en la proliferación de células cancerosas del paciente, y una inducción de muerte
celular o apoptosis de células cancerosas del paciente. La apoptosis puede identificarse tal como se conoce en la
técnica, por ejemplo, mediante ensayo de rojo neutro, mediante exclusión de azul trípano de células muertas,
mediante tinción con naranja de acridina, mediante tinción TUNEL y/o mediante la detección de PARP escindido y/o
caspasas escindidas.
Métodos de eliminación de ligandos unidos al receptor de LFA-1
Se dan a conocer métodos de eliminación de un ligando unido al receptor de LFA-1 de linfocitos humanos. Los
métodos pueden incluir poner en contacto linfocitos humanos con un inhibidor de péptidos inmunorreguladores, o un
polinucleótido que codifica para un inhibidor de este tipo. En algunos ejemplos, el inhibidor de péptidos
inmunorreguladores comprende, consiste en o consiste esencialmente en un péptido tal como se describe en el
presente documento. Por ejemplo, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o
consistir esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166) tal como se describe en el presente
documento. En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SEQ ID NO: 167), RKLDT
(SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ
ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID
NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO:
259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT,
Ld Q, GDT, Gd Q, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV,
FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 es uno de LS, LQ, LM, LT, LH,
VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 es uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT,
QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT,
MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN,
LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN,
VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP,
LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP,
VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR,
LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR,
VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos
ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está
ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) usados en
estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4,
5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36,
37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67,
6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98,
99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,
122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180,
190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700,
750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los
valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir
esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKLD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID NO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER, E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser KKLDTF (SEQ ID NO: 179), KLDTF (SEQ ID NO: 180), LDTF (SEQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400,450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, o 1 1 0 0 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula (VIII), X800K Xb q -i K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la fórmula(IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el inhibidor de péptido comprende un péptido de fórmula (IX): X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X911 es un aminoácido polar no cargado o H; X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X901 comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente X901 es una R o K. Opcionalmente X917 es RR. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en y/o SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 68, 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, estos péptidos aislados usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1 1 0 0 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
Adicionalmente, el inhibidor de péptido usado en estos métodos puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunos ejemplos, el método incluye proporcionar al ser humano un polinucleótido que codifica para un inhibidor de péptido de este tipo. Por ejemplo, puede proporcionarse un polinucleótido que codifica para un inhibidor de péptido de este tipo, por ejemplo un ácido nucleico de SEQ ID NO: 102-165.
Tal como se muestra en el presente documento (véanse los ejemplos 15 y 24; véanse las figuras 15, 16, 17 y 26), inhibidores de péptidos inmunorreguladores pueden unirse a secuencias/estructuras de péptidos inmunorreguladores, impidiendo por tanto que las secuencias/estructuras de péptidos inmunorreguladores se unan al receptor de LFA-1. Los péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo pueden incluir estructuras/secuencias de P3028. Los péptidos inmunorreguladores a modo de ejemplo pueden incluir péptidos de SEQ ID NOS: 183-185 o 188-246. Por tanto, los métodos pueden incluir detectar una unión reducida de un ligando para el receptor de LFA-1 tal como se describe en el presente documento. La unión reducida de un ligando puede detectarse usando un anticuerpo que reconoce al menos un epítopo del receptor de LFA-1 que se bloquea cuando un ligando se une al mismo, por ejemplo el anticuerpo de los ejemplos 15 y 23. La unión reducida de un ligando puede detectarse usando un anticuerpo que se une específicamente a un ligando del receptor de LFA-1, por ejemplo un anticuerpo que se une específicamente a un péptido inmunorregulador tal como la secuencia/estructura de P3028 y similares (véase el ejemplo 9).
Métodos de identificación de un paciente necesitado
Se contempla en el presente documento que diferentes poblaciones de pacientes puedan tener diferentes péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina, y que un péptido inmunorregulador derivado de albúmina dado pueda tener diferentes efectos en diferentes pacientes individuales. Tal como se muestra en el ejemplo 30, algunos pacientes con cáncer tienen células inmunitarias con una alta respuesta proliferativa a IL-2, mientras que otros pacientes con cáncer tienen células inmunitarias con una baja respuesta proliferativa a IL-2. Tal como se muestra en los ejemplos 31 y 32, diferentes poblaciones de pacientes pueden responder de manera diferente al mismo inhibidor de péptidos inmunorreguladores. Adicionalmente, un inhibidor dado puede modular el sistema inmunitario en algunos pacientes, pero no en otros pacientes. Por tanto, algunos ejemplos dados a conocer en el presente documento son métodos de identificación de un paciente necesitado. Un paciente necesitado puede incluir un paciente que tiene péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina unidos a al menos algunas de sus células inmunitarias. Un paciente necesitado puede incluir un paciente que es probable que responda a un inhibidor de un péptido inmunorregulador. En algunos ejemplos, pueden aislarse células inmunitarias de un paciente. Puede detectarse la presencia de estructuras inmunorreguladoras en las células inmunitarias. Puede detectarse el efecto de un inhibidor de un péptido inmunorregulador sobre las células inmunitarias. Si está presente una estructura inmunorreguladora y/o si la función de células inmunitarias se modula mediante el inhibidor, el paciente puede clasificarse como un paciente necesitado. Opcionalmente, puede determinarse una dosis eficaz del inhibidor. Puede administrarse una dosis terapéuticamente eficaz del inhibidor al paciente necesitado.
Se dan a conocer métodos de detección de la presencia de péptidos inmunorreguladores en un ensayo in vitro. Se proporcionan métodos in vitro de detección de la presencia de péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina unidos a células inmunitarias, secuencias y estructuras inmunorreguladoras, y métodos in vitro de detección de los efectos de péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina sobre la actividad de células inmunitarias en la patente estadounidense n.° 8.182.983; patente estadounidense n.° 7.960.126; patente estadounidense n.° 8.133.688; patente estadounidense n.° 8.110.347; y la publicación estadounidense n.° 2011/0262470.
Algunos ejemplos incluyen detectar la respuesta de células inmunitarias inhibidas a un inhibidor de péptidos inmunorreguladores. En algunos ejemplos, se aíslan células inmunitarias de un paciente. En algunos ejemplos, las células inmunitarias incluyen PBMC. En algunos ejemplos, las células inmunitarias se ponen en contacto con un inhibidor de péptidos inmunorreguladores.
En algunos ejemplos, las células inmunitarias se ponen en contacto con un inhibidor que comprende un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en al menos un péptido de SEQ ID NO: 1-33, 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98, 264-393, 583-586 o 589 o uno cualquiera o más de los péptidos proporcionados en la tabla 5.1, 5.4, 5.5, 5.6, 6.1, 6.2 o 12 o cualquier variación o combinación de variaciones de P28R o núcleo P28 tal como se proporcionan en las tablas 5.3 y 13.
En algunos ejemplos, las células inmunitarias se ponen en contacto con un inhibidor que comprende un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (I), XX1VKX2X3X4 (SEQ ID NO: 166). En algunos ejemplos, X es una secuencia opcional, y puede ser KKLDT (SeQ ID NO: 167), RKLDT (SEQ ID NO: 168), KKGDT (SEQ ID NO: 169), KKEDT (SEQ ID NO: 170), KKLDQ (SEQ ID NO: 171), KKGDQ (SEQ ID NO: 252), KKEDQ (SEQ ID NO: 253), RKLDQ (SEQ ID NO: 254), RKGDQ (SEQ ID NO: 255), RKEDQ (SEQ ID NO: 256), RKGTD (SEQ ID NO: 257), RKEDT (SEQ ID NO: 258), KLDT (SEQ ID NO: 172), KGDT (SEQ ID NO: 259), KEDT (SEQ ID NO: 260), KLDQ (SEQ ID NO: 261), KGDQ (SEQ ID NO: 262), KEDQ (SEQ ID NO: 263), LDT, LDQ, GDT, GDQ, EDT, EDQ, DT, DQ, T o Q, o está ausente. En algunos ejemplos, X1 es uno de FF, FM, FS, FV, FT, FL, AF, AM, AS, AV, AT, AL, VF, VM, VS, VV, VT o VL. En algunos ejemplos, X2 puede ser uno de LS, LQ, LM, LT, LH, VS, VQ, VM, VT o VH. En algunos ejemplos, X3 puede ser uno de LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR. En algunos ejemplos, X4 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, si X está ausente, X1 es FF y X2 es LS. En algunos ejemplos, el péptido comprende una de SEQ ID NO: 2-33. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (I) tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunos ejemplos, las células inmunitarias se ponen en contacto con un inhibidor que comprende un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (II), X20TFFVKLSX21X22 (SEQ ID NO: 173). En algunos ejemplos, X20 es una secuencia opcional, y puede ser KKlD (SEQ ID NO: 174), RKLD (SEQ ID nO: 175), KKGD (SEQ ID NO: 176), KKED (SEQ ID NO: 177), KLD, LD o D, o está ausente. X21 es una secuencia opcional, y puede ser LFT, LMT, LQT, LHT, LNT, LPT, LST, LGT, LAT, LRT, QFT, QMT, QQT, QHT, QNT, QPT, QST, QGT, QAT, QRT, VFT, VMT, VQT, VHT, VNT, VPT, VST, VGT, VAT, VRT, MFT, MMT, MQT, MHT, MNT, MPT, MST, MGT, MAT, MRT, LFN, LMN, LQN, LHN, LNN, LPN, LSN, LGN, LAN, LRN, QFN, QMN, QQN, QHN, QNN, QPN, QSN, QGN, QAN, QRN, VFN, VMN, VQN, VHN, VNN, VPN, VSN, VGN, VAN, VRN, MFN, MMN, MQN, MHN, MNN, MPN, MSN, MGN, MAN, MRN, LFP, LMP, LQP, LHP, LNP, LPP, LSP, LGP, LAP, LRP, QFP, QMP, QQP, QHP, QNP, QPP, QSP, QGP, QAP, QRP, VFP, VMP, VQP, VHP, VNP, VPP, VSP, VGP, VAP, VRP, MFP, MMP, MQP, MHP, MNP, MPP, MSP, MGP, MAP, MRPR, LFR, LMR, LQR, LHR, LNR, LPR, LSR, LGR, LAR, LRR, QFR, QMR, QQR, QHR, QNR, QPR, QSR, QGR, QAR, QRR, VFR, VMR, VQR, VHR, VNR, VPR, VSR, VGR, VAR, VRR, MFR, MMR, MQR, MHR, MNR, MPR, MSR, MGR, MAR o MRR, o está ausente. En algunos ejemplos, X22 es una secuencia opcional, y puede ser ER o E, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (II) tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunos ejemplos, las células inmunitarias se ponen en contacto con un inhibidor que comprende un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (III), X30X31VKLX32LX33TEX34 (SEQ ID NO: 178). En algunos ejemplos, X30 es una secuencia opcional, y puede ser k KlDt F (SEQ ID NO: 179), KlDt F (SEQ ID NO: 180), LDTF (SeQ ID NO: 181), DTF, TF o F, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es una secuencia opcional, y puede ser F, S, M, V, T o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X31 es F. En algunos ejemplos, X32 puede ser S, Q, M, T o H. En algunos ejemplos, X32 es S. X33 puede ser F, M, Q, H, N, P, S, G, A o R. En algunos ejemplos, X34 es F. X34 es una secuencia opcional, y puede ser R, o está ausente. En algunos ejemplos, los péptidos aislados que comprenden la fórmula (III) usados en estos métodos tienen una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunos ejemplos, las células inmunitarias se ponen en contacto con un inhibidor que comprende un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (VII), X700K X701X702X703 X704X705X706K X707 X708 X709 X710 X711E X712 (SEQ ID NO: 394), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X700 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X701 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, Q, R, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X702 es una secuencia opcional, y puede ser D, A, E, I, V, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X703 es una secuencia opcional, y puede ser T, C, M, N, P, Q, R, S, W o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X704 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, I, M, N, P, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X705 es una secuencia opcional, y puede ser F, L, M, Q, S, T o V, o está ausente. En algunos ejemplos, X706 es una secuencia opcional, y puede ser V, F, G, L, P o R, o está ausente. En algunos ejemplos, X707 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, F, G, I, M, N, P, Q, R, S, T, V o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, X708 es una secuencia opcional, y puede ser S, H, M, N, Q o T, o está ausente. En algunos ejemplos, X709 es una secuencia opcional, y puede ser L, A, H, I, M, N, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X710 es una secuencia opcional, y puede ser F, A, C, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X711 es una secuencia opcional, y puede ser T, F, G, H, I, L, M, N, P, S, V o W, o está ausente. En algunos ejemplos, X712 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunos ejemplos, las células inmunitarias se ponen en contacto con un inhibidor que comprende un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (VIII), X800K X801K X802E X803 (SEQ ID NO: 395), tal como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, X800 es una secuencia opcional, y puede ser K, A, D, E, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, T, V o K, o está ausente. En algunos ejemplos, X801 es una secuencia opcional, y puede ser LDTFFV, GDTFFV, EDTFFV, LDQFFV, LDTAFV, LDTVFV, LDTFMV, LDTFSV, LDTFVV, LDTFTV, LDTFLV, LDGFFV, LDTFGV, LDTFFK, ADTFFV, CDTFFV, DDTFFV, FDTFFV, HDTFFV, IDTFFV, KDTFFV, MDTFFV, NDTFFV, QDTFFV, RDTFFV, SDTFFV, TDTFFV, VDTFFV, LATFFV, LETFFV, LITFFV, LVTFFV, LWTFFV, LYTFFV, LDCFFV, LDMFFV, LDNFFV, LDPFFV, LDRFFV, LDSFFV, LDWFFV, LDYFFV, LDTIFV, LDTMFV, LDTNFV, LDTPFV, LDTTFV, LDTFQV, LDTFFF, LDTFFG, LDTFFL, LDTFFP, LDTFFR, LDTFIV, LDTSFV, LDTFAV, LDTFCV, LDTQFV, LDTLFV, LTTFFV, LDTFFI, LDHFFV, LMTFFV, LDTFEV, LDTFWV, LFTFFV, LDVFFV, LDTFRV, LDTFHV, LDTYFV, LPTFFV, PDTFFV, LDTFPV, LDTFNV, LDTWFV, LDTGFV, LDAFFV, LQTFFV, LCTFFV, LSTFFV, YDTFFV, LDEFFV, WDTFFV, LDTKFV, LDTCFV, LDTFYV, LDTHFV, LHTFFV, LRTFFV, LDLFFV, LDTRFV, LLTFFV, LDTFDV, LDTFFA, LDTFFT, LNTFFV, LDDFFV, LDIFFV, LDFFFV, LKTFFV, LDTFFQ, LGTFFV, LDTFFC, LDKFFV, LDTFKV, LDTEFV, LDTFFW, LDTFFM, LDTFFS, LDTFFH, LDTFFY, LDTFFN, LDTDFV, LDTFFE, LDTFFD, LTFFV, LDTFF, TFFV, LDF, LDTE, FFV, LDV, LV o L, o está ausente. En algunos ejemplos, X802 es una secuencia opcional, y puede ser LSLFT, VSLFT, LQLFT, LMLFT, LTLFT, LHLFT, LSQFT, LSVFT, LSMFT, LSLMT, LSLQT, LSLHT, LSLNT, LSLPT, LSLST, LSLGT, LSLAT, LSLRT, LSLFN, LSLFP, LSLFR, LGLFT, ASLFT, FSLFT, GSLFT, ISLFT, MSLFT, NSLFT, PSLFT, QSLFT, RSLFT, SSLFT, TSLFT, YSLFT, LNLFT, LSAFT, LSHFT, LSIFT, LSNFT, LSRFT, LSSFT, LSTFT, LSWFT, LSLCT, LSLIT, LSLLT, LSLTT, LSLVT, LSLWT, LSLFF, LSLFG, LSLFH, LSLFI, LSLFL, LSLFM, LSLFS, LSLFV, LSLFW, LILFT, LVLFT, LSFFT, LSGFT, LSKFT, LSCFT, LCLFT, LRLFT, LPLFT, LWLFT, LKLFT, LDLFT, LSYFT, LALFT, WSLFT, LSLFA, LSLFQ, LSPFT, HSLFT, LSLYT, LILFT, KSLFT, CSLFT, LSLFY, LSLFK, LSLFC, LFLFT, LELFT, LSLKT, LLLFT, LSLFD, LSLDT, LSLFE, DSLFT, LSLET, LSDFT, LSEFT, ESLFT, SLFT, LSFT, LFT, LSL, LT, T, o está ausente. En algunos ejemplos, X803 es una secuencia opcional, y puede ser R, F, K, N, R, T o Y, o está ausente. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (VIII) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunos ejemplos, las células inmunitarias se ponen en contacto con un inhibidor que comprende un péptido que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la fórmula (IX). Por consiguiente, en algunos ejemplos, el péptido inhibidor comprende un péptido de fórmula (IX):
X901X902X903X904X905X906X907X908X909X910X911X912X913X914X915X916X917, en la que X901 es cualquier aminoácido o está ausente; X902 es un aminoácido cargado positivamente, F o N; X903 es cualquier aminoácido; X904 es cualquier aminoácido; X905 es un aminoácido polar no cargado, R, Y o W; X906 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo;
X907 es un aminoácido polar no cargado o hidrófobo; X908 es un aminoácido de cadena de carbono no aromática, hidrófobo que no es M o F; X909 es un aminoácido cargado positivamente, T, Q o Y; X910 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X911 es un aminoácido polar no cargado o H; X912 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X913 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X914 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; X915 es un aminoácido cargado negativamente, Y o Q; X916 es cualquier aminoácido que no esté cargado negativamente; y X917 es uno o más aminoácidos cargados positivamente o está ausente. Opcionalmente, X901 comprende un aminoácido cargado positivamente. Opcionalmente X901 es una
R o K. Opcionalmente X917 es RR. En algunos ejemplos, el péptido aislado que comprende la fórmula (IX) tiene una longitud que es menor de o igual a 1100 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 7 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104,
105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127,
128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240,
250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000,
1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados.
En algunos ejemplos, las células inmunitarias se ponen en contacto con un inhibidor que comprende, consiste en o consiste esencialmente en un inhibidor de péptido que comprende, consiste en o consiste esencialmente en uno cualquiera o más de los péptidos expuestos en la tabla 5.1. En algunos ejemplos, el péptido aislado de la tabla 5.1 usado en estos métodos tiene una longitud que es menor de o igual a 1 1 0 0 aminoácidos, por ejemplo, menor de o igual a 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34,
35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 6 6 6 , 67, 6 8 , 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 8 6 , 87, 8 8 , 89, 90, 91, 92, 93, 94, 9 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120,
121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 150, 160, 170,
180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 550, 600, 650,
700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050 o 1100 aminoácidos, incluyendo intervalos entre dos cualesquiera de los valores enumerados. En algunos ejemplos, se detecta la respuesta de las células inmunitarias. En algunos ejemplos, se detecta la respuesta a la estimulación con IL-2 (véase el ejemplo 2). En algunos ejemplos, se detecta la estimulación de células T (véase el ejemplo 3). En algunos ejemplos, se somete a ensayo la citotoxicidad de células
NK (véase el ejemplo 4). En algunos ejemplos, se detecta la diseminación de leucocitos (véase el ejemplo 5). En algunos ejemplos, se detecta el desbloqueo del receptor de LFA-1 (véase el ejemplo 6 ). En algunos ejemplos, puede demostrarse la unión de P28R al tumor. En algunos ejemplos, se detecta la unión de P3028 (SEQ ID NO: 185) al receptor de IL-2 (véase el ejemplo 8 ). En algunos ejemplos, se detecta la conversión de MTS por las células inmunitarias, por ejemplo, en respuesta a la estimulación de células inmunitarias (véanse los ejemplos 31-32). En algunos ejemplos, se detecta la incorporación de BrdU por las células inmunitarias, por ejemplo, en respuesta a la estimulación de células inmunitarias (véanse los ejemplos 31-32). Se contempla en el presente documento que algunos pacientes presentarán algunas respuestas de células inmunitarias en respuesta al inhibidor, pero no presentarán otras respuestas de células inmunitarias en respuesta a ese mismo inhibidor (véanse los ejemplos 31­
32 y las figuras 34, 37 y 38, que muestran, entre otros resultados, que P28R potenciaba la estimulación inducida por
IL-2 de la captación de BrdU y la conversión de MTS en un paciente, pero potenciaba la captación de BrdU y no la conversión de MTS en otro paciente). Por tanto, algunos ejemplos incluyen detectar dos o más respuestas de células inmunitarias descritas en el presente documento. La detección de dos o más respuestas de células inmunitarias puede permitir la identificación de un paciente que es probable que provoque una primera respuesta, pero no una segunda respuesta, y puede ser útil para guiar decisiones clínicas tales como qué inhibidores o combinaciones de inhibidores aplicar, y si aplicar terapias adicionales al paciente necesitado. En algunos ejemplos, se realiza la detección de la activación o estimulación de una célula inmunitaria, tal como se evidencia por un aumento en la expresión de CD69 o CD71, inducción de la secreción de una sustancia señal, tal como se evidencia por la producción de interferón gamma o IL-12, o estimulación de la liberación de una sustancia citolítica, tal como se evidencia por la liberación de granzima B o perforina. En algunos ejemplos, la detección de la activación o estimulación de una célula inmunitaria incluye detectar una o más de citotoxicidad, producción de citocinas, migración celular y/o proliferación celular potenciadas.
En algunos ejemplos, opcionalmente, se determina una dosis eficaz del inhibidor para el paciente necesitado. En algunos ejemplos, se ponen en contacto células del paciente in vitro con dos o más dosis del inhibidor, y una respuesta inmunitaria. Tal como se muestra en las figuras 33A, 33B y 34, P28R puede tener efectos inmunomoduladores dependientes de la dosis, por ejemplo, sobre el metabolismo mitocondrial (véanse los ejemplos 28 y 29).
Tal como se muestra en la figura 34, se proporcionaron dosis crecientes de P28R (SEQ ID NO: 2) a las células inmunitarias de pacientes con cáncer in vitro. Una dosis de 20 |ig/ml de P28R dio como resultado una conversión de MTS significativamente mayor que una dosis de 40 |ig/ml de P28R. Por tanto, un experto en la técnica apreciará que algunos ejemplos incluyen determinar una dosis eficaz de un inhibidor para las células de un paciente in vitro, y luego proporcionar una dosis apropiada del inhibidor al paciente.
Materiales y métodos
Excepto cuando se establezca otra cosa, los siguientes materiales y o métodos se usaron según fuera apropiado en los ejemplos proporcionados a continuación.
Suero humano
Se recogió suero humano en tubos de recogida de suero sin aditivos (Vacutainer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) al mismo tiempo que muestras de sangre para el aislamiento de PBMC. Los sueros se inactivaron por calor a 56°C durante 30 minutos.
Aislamiento de PBMC
Para aislar PBMC, se extrajo sangre venosa de voluntarios sanos o de pacientes con cáncer en tubos de vacío de vidrio con disolución A de ácido-dextrosa-citrato como anticoagulante (Vacutainer, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Se retiraron los eritrocitos mediante sedimentación en disolución de dextrano al 2% T500 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) en NaCl al 0,9% (esta etapa se omitió para cultivos con estimulación con PHA, véase a continuación). Entonces se aislaron PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) tras lo cual se lavaron las células dos veces en modificación de Dutch de RPMI 1640 (Gibco, InVitrogen AB, Stockholm, Suecia) con albúmina sérica humana al 2% (HSA) (Pharmacia & Upjohn, Stockholm, Suecia) (RPMI/HSA al 2%). Para cultivos celulares con estimulación con PHA, se lavaron PBMC en solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con plasma autólogo al 10% en lugar de RPMI/HSA al 2%. Se evaluó la viabilidad celular mediante exclusión de azul trípano al 0,05% y estaba siempre por encima del 95%. Se tiñó la suspensión celular con disolución de Türk y se contó el número de linfocitos y monocitos en la preparación de PBMC en un hemocitómetro. Se suspendieron las PBMC en RPMI/HSA al 2% y la concentración celular se ajustó a 5 x 105 linfocitos/ml.
Proliferación inducida por IL-2 de PBMC en placas de cultivo recubiertas y no recubiertas
Recubrimiento previo de placas de cultivo con HSA y HSA/IgG. Se recubrieron previamente placas de cultivo tisular de 96 pocillos, de fondo redondo (Costar, Corning Inc. NY, US) con HSA solo o HSA e IgG humana agrupada para inyección intravenosa (Gammagard, Baxter AS, DK). se diluyó HSA en RPMI1640 sin suplementos hasta una concentración de 10 mg/ml. En algunos experimentos, se mezcló IgG 1 mg/ml en una disolución de HSA 9 mg/ml en RPMI (HSA/IgG). Entonces se añadieron 200 |il de HSA o HSA/IgG a cada pocillo de la placa. Se incubaron las placas a 4°C durante 30 minutos tras lo cual se lavaron los pocillos dos veces con 200 |il de RPMI1640. Se usaron las placas recubiertas inmediatamente.
Se añadieron 100 |il de RPMI1640 suplementado con penicilina 200 UI/ml, estreptomicina 200 pj/ml, L-glutamina 4 mM (todos de Sigma Chemical Co. MO, EE.UU.) y suero humano inactivado con calor al 20% (autólogo o de pacientes con cáncer) a placas de microtitulación de cultivo tisular no recubiertas, recubiertas con HSA o HSA/IgG. Se diluyeron PBMC, aisladas de individuos sanos o pacientes con carcinoma de células renales metastásico, en RPMI/HSA al 2% a una concentración de 5 x 105/ml y se añadieron 100 |il a los pocillos de microtitulación. Se añadió interleucina-2 (IL-2, Proleukin, Chiron, NL), a una concentración final de 120 UI/pocillo, a algunos pocillos. Se cultivaron las células durante 7 días en una atmósfera del 5 % de CO2, humidificada a 37°C. Se sometió a ensayo la proliferación mediante la incorporación de 1,6 ^Ci/pocillo de [3H]-timidina (Amersham Int., RU) durante las últimas 18 h. Se usaron valores medios de dpm (desintegraciones por minuto) de triplicados para los cálculos.
Proliferación inducida por interleucina-2 (IL-2) de PBMC en presencia de péptidos de albúmina
Se establecieron cultivos para la proliferación inducida por IL-2 con PBMC de donantes sanos y suero autólogo tal como se describió anteriormente con la excepción de que en primer lugar se preincubaron PBMC durante 30 min a temperatura ambiente con los péptidos de albúmina indicados a una concentración de 10 |ig/ml.
Proliferación inducida por interleucina-2 (IL-2) de PBMC en presencia de péptidos de albúmina en placas de cultivo tisular recubiertas y no recubiertas
Se recubrieron previamente placas de cultivo tisular de 96 pocilios, de fondo redondo (Costar, Corning Inc. NY, EE.UU.) con HSA solo o HSA e IgG humana agrupada para inyección intravenosa (Gammagard, Baxter AS, DK) tal como sigue; se diluyó HSA en RPMI1640 sin suplementos hasta una concentración de 10 mg/ml. También se preparó una mezcla de IgG 1 mg/ml en una disolución de HSA 9 mg/ml en RPMI (HSA/IgG). Entonces se añadieron 200 |il de HSA o HSA/IgG a cada pocillo de la placa. Se incubaron las placas a 4°C durante 30 minutos tras lo cual se lavaron los pocillos dos veces con 200 |il de RPMI1640. Se usaron las placas recubiertas inmediatamente. Se añadieron 100 |il de RPMI1640 suplementado con penicilina 200 Ul/ml, estreptomicina 200 |il/ml, L-glutamina 4 mM (todos de Sigma Chemical Co. MO, EE.UU.) y suero humano inactivado con calor al 20% (autólogo) a los pocillos de microtitulación de cultivo tisular recubiertos con HSA o HSA/IgG. Se diluyeron PBMC, aisladas de individuos sanos, en RPMI/HSA al 2% y se añadieron péptidos directamente a la suspensión celular a una concentración de 10 |ig/ml. Entonces se añadieron cien |il de esta suspensión celular (5x104 linfocitos) por pocillo proporcionando una concentración final de péptido 5 |ig/ml por pocillo. Se añadió a los pocillos IL-2 (Proleukin, Chiron, NL), a una concentración final de 120 UI/pocillo. Se cultivaron las células durante 7 días en una atmósfera del 5% de CO2, humidificada a 37°C. Se sometió a ensayo la proliferación mediante la incorporación de 1,6 |iCi/pocillo de [3H]-timidina (Amersham Int., RU) durante las últimas 18 h. Se usaron valores medios de dpm (desintegraciones por minuto) de triplicados para los cálculos.
Péptidos de albúmina
Se prepararon péptidos de albúmina sintéticos por encargo por CSBio Co, Menlo Park, CA. Los péptidos eran > 95% puros tal como se confirmó mediante HPLC. Los péptidos se mantuvieron secados por congelación a menos 20°C. Se reconstituyeron los péptidos en H2O estéril (Sigma) para su uso en ELISA o en RPMI1640 (GIBCO) para su uso en experimentos de cultivo celular. Los péptidos se esterilizaron por filtración a través de un filtro de jeringa de 0,22 |im (Millipore Co) antes de su uso en experimentos de cultivo celular.
ELISA para la detección de anticuerpos murinos que se unen a albúmina humana
Se recubrieron pocillos por duplicado en placas de microtitulación Hibinding (Costar 2592, Corning Inc, NY, EE.UU.) con 100 |il de dHSA diluida en PBS a diversas concentraciones o, alternativamente, muestra de albúmina de control a las mismas concentraciones. Se incubaron las placas a temperatura ambiente durante la noche. Entonces se lavaron los pocillos con tampón de lavado que consistía de Tween-20 al 0,05% en PBS (Sigma) seguido por bloqueo durante 1 h a 25°C con 200 |il de gelatina al 0,1% preparada a partir de piel bovina (Sigma) en PBS seguido por lavado en tampón de lavado. Cualquiera de dos anticuerpos monoclonales murinos (IgG1) con especificidad por albúmina humana desnaturalizada (anti-dAbclh040801 o anti-dAlbclh040809) se añadió a 1 |ig/ml en diluyente de reactivos de ELISA (gelatina al 0,01% (Sigma) y Tween-20 al 0,05% (Sigma) en solución salina tamponada con Tris 20 mM (TBS, Sigma)). Se incubaron los anticuerpos durante 1,5 h a 25°C seguido por lavado. Se añadió Envision-HRP (DakoCytomation Norden A/S, Glostrup, Dinamarca) diluido de 1/5 a 1/10 en diluyente de reactivos de ELISA y se incubó durante 30 min a 25°C seguido por lavado. Finalmente, se añadió una disolución de sustrato que consistía en H2O2 y tetrametilbencidina (R&D Systems Europe, Ltd, Abingdon, RU). Se detuvo la reacción con H2SO4 1 M y se midió la densidad óptica como absorbancia (Abs) a dos longitudes de onda, 450 nm y 570 nm, con un lector de microplacas Multiscan Ex (Labsystems).
ELISA con antisuero de conejo anti 3028
Se recubrieron pocillos por duplicado en placas de microtitulación Hi (Costar 2592, Corning Inc, NY, EE.UU.) con 100 |il de P3028 (10 ug/ml), HSA desnaturalizada (denHSA, 4,5 ug/ml) o muestra de HSA de control (4,5 ug/ml). Se diluyeron todos los reactivos de recubrimiento en PBS y se incubaron a temperatura ambiente durante la noche. Entonces se lavaron los pocillos con tampón de lavado que consistía en Tween-20 al 0,05% en PBS (Sigma) seguido por bloqueo durante 1 h a 25°C con 200 |il de gelatina al 0,5% preparada a partir de piel bovina (Sigma) en PBS seguido por lavado en tampón de lavado. Se añadieron sueros preinmunitarios de conejo o sueros anti-3028, diluidos 1/1000 000 en diluyente de reactivos de ELISA (gelatina al 0,01% y Tween-20 al 0,05% en PBS) y se incubaron durante 1 h a 25°C seguido por lavado. Entonces se añadió anticuerpo de caballo biotinilado anti-IgG de conejo/ratón (Vectastain ELITE, Vetor Laboratories Inc, CA, EE.UU.) diluido 1/5 en diluyente de reactivos de ELISA y se incubaron las placas durante 1 h a 25°C seguido por lavado. A continuación, se añadió estreptavidina conjugada con HRP (R&D Systems Europe, Ltd, RU). Finalmente, tras lavar en tampón de lavado, se añadió disolución de sustrato que consistía en H2O2 y tetrametilbencidina (R&D Systems). Se detuvo la reacción con H2SO4 1 M y se midió la densidad óptica como absorbancia (A) a dos longitudes de onda, 450 nm y 570 nm, con un lector de microplacas Multiscan EX (Labsystems).
Consideraciones estadísticas
Se realizaron comparaciones de las medias de diferentes grupos de pacientes o diferentes ocasiones de prueba usando una prueba de la t desapareada. Se analizó el tiempo hasta la progresión y la supervivencia usando el método de Kaplan-Meier y la prueba de rangos logarítmicos.
Se realizaron comparaciones entre la respuesta proliferativa a PHA en diferentes grupos o en diferentes ocasiones de prueba sobre los logaritmos de valores medios de dpm de triplicados usando una prueba de la t desapareada. Para la determinación del efecto de la adición de CHL sobre la respuesta proliferativa de PBMC estimuladas con PHA, se calculó un índice de modulación (MI) según la siguiente fórmula: MI = log (dpm PHA fármaco/dpm PHA). Ejemplo 1: Péptidos séricos con actividades inhibidoras inmunitarias
Identificación de péptidos inmunorreguladores
Se preparó una superficie celular artificial (ACS) biotinilando selectivamente estructuras de superficie celular de PBMC y después lisando las células que unían las proteínas biotiniladas a columnas de estreptavidina (véase el ejemplo 17 para una descripción adicional de la ACS). La mezcla de péptidos obtenida tras la tripsinización se adsorbió por ACS y se identificaron los péptidos que se unían comparando disoluciones de péptidos adsorbidos y no adsorbidos usando la técnica de EM de MALDI To F. Basándose en su grado de unión y su relación espacial con estructuras inmunorreguladoras previamente identificadas, se seleccionaron cuatro nuevos péptidos para sintetizar e investigar su actividad inmunorreguladora, principalmente el efecto sobre la respuesta proliferativa a IL-2. Uno de estos péptidos, P3028 (SEQ ID NO: 185), se encontró que tenía múltiples actividades inmunoinhibidoras.
Expresión del epítopo P3028 en tumores malignos
Se generaron anticuerpos policlonales de conejo contra P3028 y se purificaron por afinidad (véase el ejemplo 9). Para determinar la localización de P3028 en células tumorales, se inmunotiñeron secciones de metástasis malignas usando los anticuerpos policlonales de conejo anti-P3028. Se prepararon secciones tisulares a partir de biopsias fijadas con formalina de pacientes con cáncer. Se desparafinaron las secciones y se bloquearon con suero AB humano normal al 10% en disolución salina equilibrada de Hank complementada con Hepes 0,01 M (BSS, GIBCO BRL) durante una hora antes de la tinción. Entonces se tiñeron las secciones con anticuerpo de conejo purificado por afinidad anti-P3028 10 ug/ml diluido en BSS con suero AB al 2% y saponina 0,1 g/ml durante 30 min. Tras lavar en BSS con saponina 0,1 g/ml, se añadió polímero de fosfatasa alcalina Ultravison One específico para Ig de ratón y conejo (Lab Vision Co., CA, EE.UU.). Entonces se lavó el polímero en exceso de las secciones con BSS con saponina 0,1 g/ml. Se detectó el complejo de polímero unido mediante sustrato de fosfato de naftol y cromógeno líquido Fast Red (Lab Vision Corp.). Se contratiñeron las secciones en hematoxilina de Mayer y se montaron en Glycergel. Tal como se muestra en la figura 1, estructuras 1 a las que se unen anticuerpos anti-P3028 se expresan ampliamente en tumores malignos humanos, por ejemplo, melanoma maligno, carcinoma de células renales y cáncer colorrectal.
Se realizó inmunotransferencia de tipo Western sobre extractos de metástasis de melanoma maligno para detectar la presencia de estructuras de P3028. Se realizó inmunotransferencia de tipo Western usando técnicas convencionales, y se detectaron estructuras de P3028 usando anticuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad contra P3028 (véase el ejemplo 9). Se identificaron estructuras de P3028 en extractos tumorales de metástasis de melanoma maligno en los extractos de 7 de 7 metástasis de 4 pacientes que se examinaron (véase la figura 2). El péptido P3028 estaba presente en todos los pacientes. Adicionalmente, la estructura de P3028 estaba presente en albúmina de longitud completa. Además, se encontró esta estructura en moléculas más grandes. Estos resultados son compatibles con que la estructura de P3028 se genere no sólo mediante fragmentación proteolítica sino también mediante desnaturalización.
Aparición de la estructura de P3028 en suero
Se determinaron sustancias que exponen la estructura de P3028 en suero humano usando anticuerpos purificados por afinidad en un ELISA de tipo sándwich. Es decir, se confirmó la capacidad para detectar estructuras de P3028 en suero humano.
Se realizó un ELISA de tipo sándwich para detectar albúmina que expone el epítopo P3028 en suero tal como sigue: Se recubrieron micropocillos de ELISA de alta unión de proteínas con antisueros de conejo policlonales purificados por afinidad, específicos para albúmina humana P3028 (anticuerpo de captura; véase el ejemplo 9). Entonces se añadió a los pocillos una disolución al 1% de suero inactivado con calor (a partir de un conjunto de suero de 5 muestras de control sanas, 1 muestra de suero de control sana y 2 sueros obtenidos de pacientes con cáncer), con adiciones conocidas con concentraciones crecientes de P3028. Tras lavar, se añadió un anticuerpo monoclonal de ratón biotinilado anti-albúmina humana y se detectó la cantidad de anticuerpo unido con estreptavidina conjugada con HRP y sustrato de cromógeno de t Mb . (Se muestra en la figura 3 un experimento representativo de dos).
La cantidad de estructuras de P3028 se determinó como la cantidad de P3028 que inhibe el 50% de la unión de estructuras de P3028 en el suero al anticuerpo de captura (véase la figura 3). Se determinó que la concentración sérica estaba en el intervalo de 1,2-1,6 |ig/ml de equivalentes de P3028 en un conjunto de suero de 5 muestras de control sanas, 1 muestra de suero de control sana y 2 sueros obtenidos de pacientes con cáncer. La cantidad de estas sustancias de P3028 en suero puede ser considerablemente más ya que el peso molecular de la albúmina es aproximadamente 35 veces mayor que el de P3028. Se determinó de manera precisa la reactividad específica de epítopo de sustancias de P3028 usando los métodos de este ejemplo.
Ejemplo 2: Efecto de péptidos identificados mediante ACS sobre la proliferación inducida por IL-2
Modelo ex vivo humano para inmunosupresión en pacientes con cáncer
La interleucina-2 (IL-2) desempeña un papel importante en el inicio y la activación de una respuesta inmunitaria y su capacidad para inducir células citolíticas activadas por linfocinas (células LAK), proliferación y citotoxicidad de células T. Por consiguiente, se desarrolló un modelo ex vivo humano de estimulación por IL-2 de células inmunitarias. Este modelo era útil para estudiar los efectos de moduladores del sistema inmunitario, tales como P3028, e inhibidores de los mismos.
El modelo incluía PBMC aisladas de muestras de sangre venosa de donantes de sangre sanos (muestras de control) o pacientes con cáncer. Se añadieron cien pI de medio de cultivo (modificación de Dutch de RPMI 1640 (Gibco, InVitrogenAB, Estocolmo, Suecia) suplementado con penicilina 200 UI/ml, estreptomicina 200 ug/ml, L-glutamina 4 mM (todos de Sigma Chemical Co. MO, EE.UU.) y suero humano inactivado con calor al 20%) a placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo (Costar, Corning Inc. NY, EE.UU.). Entonces se añadieron cien ul de PBMC en RPMI/HSA al 2% (5x104 linfocitos) por pocillo seguido por IL-2 (Proleukin, Chiron, NL) a una concentración final de 120 UI/pocillo. Se establecieron en paralelo pocillos de muestras de control sin IL-2. Se cultivaron las células durante 7 días en una atmósfera del 5% de CO2, humidificada a 37°C. Se sometió a ensayo la proliferación celular mediante la incorporación de 1,6 pCi/pocillo de [3H]-timidina (Amersham Int., RU) durante las últimas 18-24 h. Se usaron valores medios de dpm (desintegraciones por minuto) de pocillos por triplicado para los cálculos.
Se estudió la proliferación inducida por IL-2 mediante PBMC de muestras de control sanas y PBMC de pacientes con carcinoma de células renales (RCC) cultivadas en sueros autólogos al 10% usando este modelo. Los resultados del estudio se muestran en la figura 4. La proliferación inducida por IL-2 se redujo significativamente (p < 0,0002) para PBMC cultivadas en suero de un paciente con carcinoma renal en comparación con una muestra de control sana.
Correlación entre la respuesta de IL-2 en el modelo ex vivo y la supervivencia global de pacientes con carcinoma de células renales
Se demostró que la respuesta a IL-2 en este modelo se correlacionaba con la supervivencia global de pacientes con carcinoma de células renales. A los pacientes, incluidos en los análisis de supervivencia global según la respuesta proliferativa de PBMC a interleucina-2, se les diagnosticó carcinoma de células renales metastásico sistémico. No se trataron previamente y se programaron para el tratamiento con interleucina-2 (Proleukin, Chiron, NL). Se tomaron muestras de sangre antes del inicio del tratamiento. Se representaron gráficamente curvas de supervivencia usando el método de Kaplan y Meier y se realizaron comparaciones de tiempo hasta la progresión y supervivencia entre subgrupos usando la prueba de rangos logarítmicos. Además, se calculó también la significación del pronóstico del nivel de producción de IL- 6 estimulada por LPS usando regresión de Cox.
La figura 5 ilustra un análisis de Kaplan Meyer de pacientes con carcinoma de células renales según la respuesta proliferativa a IL-2. Se clasificaron los pacientes como que tenían una respuesta proliferativa de > 30.000 dpm 52, 15.000-30.000 dpm 54 o <15.000 dpm 56. Se realizó un análisis de rangos logarítmicos, y se correlacionó la supervivencia global de los pacientes con la respuesta proliferativa (p=0,0042). Tal como se ilustra en la figura 5, los pacientes con la proliferación inducida por IL-2 más baja de PBMC en suero autólogo en el modelo ex vivo 56 también tenían el tiempo de supervivencia global más bajo. Por tanto, una baja tasa proliferativa indica una escasa supervivencia.
Efecto de diferentes péptidos sobre la proliferación inducida por IL-2
Se analizó el efecto de diferentes péptidos sobre la proliferación inducida por IL-2 en el modelo ex vivo humano, usando PBMC de muestras de control sanas. Se cultivaron PBMC durante 7 días en presencia de IL-2 (20 U/ml) y los péptidos. También se realizó una muestra de control en la que no se añadió péptido (“ninguno”). Se midió la proliferación como la incorporación de 3H-timidina durante las 18 horas finales. Los péptidos incluían P3026 (SEQ ID NO: 183), P3027 (SEQ ID NO: 184), P3028 (SEQ ID NO: 185) y P3029 (SEQ ID NO: 186). Uno de los péptidos, P3028, inhibía regularmente la proliferación inducida por IL-2 (p < 0,0006, en comparación con la muestra de control; n=17), pero ninguno de los demás péptidos identificados por su unión a la superficie celular artificial tenía ninguna actividad inhibidora (para P3026, P3027, P3029 n= 4 o 5). La figura 6 ilustra el análisis del efecto de los cuatro péptidos diferentes.
También se observó la inhibición de la respuesta proliferativa a IL-2 por P3028 para PBMC de pacientes con cáncer estudiadas en el modelo ex vivo humano. El modelo ex vivo de estimulación IL-2 se constituyó usando las PBMC de un paciente con cáncer, y se comparó la estimulación con IL-2 en presencia y ausencia de P3028. Tal como se ilustra en la figura 7, la actividad inhibidora de P3028 sobre la proliferación inducida por IL-2 también puede demostrarse en cultivos con PBMC de pacientes con cáncer, incluso si la respuesta a IL-2 ya se suprimió (véase la figura 7).
Ejemplo 3: Efecto de P3028 sobre la estimulación de receptores de células T
Para examinar los efectos de P3028 sobre la estimulación de receptores de células T, se proporcionó sangre para el aislamiento de PBMC a partir de muestras de control sanas en bolsas de transfusión de 50 ml con disolución A de ácido-dextrosa-citrato. Se diluyó la sangre completa 1:1 en PBS que contenía EDTA 2 mM. Entonces se aislaron PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-paque Plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia) tras lo cual se lavaron las células en primer lugar en PBS con EDTA 2 mM y en segundo lugar en medios de cultivo de linfocitos. Se evaluó la viabilidad celular mediante exclusión de azul trípano al 0,02% y estaba siempre por encima del 95%. Se contó la suspensión celular en un hemocitómetro. Se suspendieron las PBMC en el medio de cultivo sin sueros y se ajustó la concentración celular a 1x 1 0 6 linfocitos/ml para los ensayos de proliferación y 6,4x105 para los ensayos de migración respectivamente. Se complementó el medio de cultivo de linfocitos RPMI 1640 (Invitrogen, Suecia) con penicilina/estreptomicina al 1% (Invitrogen, Suecia) y Gluta-Max 4 mM (Invitrogen, Suecia). Para la proliferación inducida por CD3, se recubrieron las placas con anticuerpos anti-CD3 humano purificados (BD Pharmingen, Suecia). Por tanto, se pipetearon 50 |il de disolución en PBS de anticuerpos 2,5 |ig/ml en cada pocillo incubado durante 1 hora. Se cultivaron las células durante 4, 5 o 7 días en una atmósfera del 5% de CO2, humidificada at 37°C. Se sometió a ensayo la proliferación celular mediante la prueba de actividad mitocondrial CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS, Promega, Suecia) durante las últimas 4 horas. A cada pocillo, se le añadieron 10 |il de la disolución de MTS y se midió tras 4 horas de incubación a 37°C. Los valores medidos del colorante de referencia se restaron de cada pocillo. Se prepararon disoluciones de péptidos disolviendo los péptidos 3028, SCF28R, 28209 y SCF27 (Schafer-N, Copenhague, Dinamarca) en medios de linfocitos hasta una concentración de 25 |ig/ml. La concentración final en los cultivos era de 5 o 10 |ig/ml.
Se estimularon células T en cultivos sobre placas prerrecubiertas con un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD3 y se determinó el número de células metabólicamente activas (es decir, proliferación celular) usando tinción de MTS tras de 3 a 7 días de cultivo. Se usó la detección de anticuerpo monoclonal frente a CD3 en fase sólida como medición de la proliferación de células T. La figura 8 ilustra el efecto de P3028 sobre la proliferación de linfocitos estimulada por TCR de PBMC de cuatro personas sanas. Para cada persona, se midió la proliferación de linfocitos en ausencia de estimulación 82, estimulación con IL-2 84, tratamiento con P3028 solo 8 6 y estimulación con IL-2 más P30288 8. Las barras del gráfico de barras de la figura 8 están en el mismo orden para cada persona.
Tal como puede observarse en la figura 8 , P3028 tuvo un efecto inhibidor en al menos tres de cuatro experimentos (p<0,001). Es improbable que la tinción de MTS reducida provocada por P3028 se debiera a un metabolismo celular reducido. Tomados conjuntamente, los resultados de ambos modelos de proliferación de linfocitos, un metabolismo reducido debe reducir razonablemente las reservas de timidina endógenas y de ese modo debe dar como resultado un aumento de la captación de timidina exógena/actividad específica de las reservas de timidina, que entonces debe registrarse erróneamente como una proliferación potenciada. La 3H-TdR se redujo realmente en estos experimentos, indicando una inhibición de la proliferación.
Ejemplo 4: Efecto de P3028 sobre la citotoxicidad de células NK
Se sometió a prueba la actividad citotóxica de células NK de células sanguíneas mononucleares de cuatro donantes sanos. Se separaron células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-paque Plus (Pharmacia AB, Suecia) convencional a partir de sangre heparinizada obtenida de donantes sanos. Entonces se sometió a prueba la actividad citotóxica de células NK de las células mononucleares usando un kit comercial (NKTEST, Orpegen Pharma GmblI, Heidelberg, Alemania) siguiendo el protocolo de los fabricantes. En resumen, el kit contiene células diana sensibles a NK, crioconservadas (K562) marcadas con un colorante de membrana fluorescente verde lipófilo, que permite la discriminación de células diana y efectoras. Tras la incubación con células efectoras, se identifican células diana destruidas mediante una tinción de ADN, que penetra en y tiñe específicamente los núcleos de células diana muertas. De este modo, puede determinarse el porcentaje de dianas destruidas mediante citometría de flujo. Las células mononucleares se preincubaron durante 30 min a 37°C con los péptidos indicados (los péptidos se han descrito anteriormente) a 10 ug/ml. Entonces se añadieron células diana, dando una razón de efector:diana de 40: 1, y se incubó la mezcla de células a 37°C durante 3-4 horas. Se analizaron las muestras en un instrumento FACSCalibur (BD Biosciences, San José, Calif.).
Las figuras 9A-B ilustran el efecto de péptidos de albúmina sobre la citotoxicidad de células NK (p = 0,015, prueba de la t apareada, valores log de transformación normal). Tal como se muestra en las figuras 9A-B, la presencia de P3028 y, en un menor grado, péptido 3026, redujo el porcentaje de lisis específica de células diana K562 por los cuatro donantes. No se observó inhibición en presencia del péptido de muestra de control 3027 sin relación estructural con P3028. La inhibición de la citotoxicidad de células NK, en este modelo, no se debía a un efecto de P3028 sobre la actividad de IL-2 ya que no se añadió IL-2 a los cultivos a corto plazo.
Ejemplo 5: Efecto de P3028 sobre la diseminación de leucocitos y migración de células inmunitarias
En sistema inmunitarios que funcionan apropiadamente, se reclutan células inmunitarias a los tejidos, y migran dentro de los tejidos. Se investigó el efecto de P3028 en dos pruebas funcionales, diseminación de leucocitos y migración de células inmunitarias.
Diseminación de leucocitos
Para analizar el efecto de P3028 sobre la diseminación de leucocitos, se prepararon células de la capa leucocitaria a partir de sangre heparinizada mediante sedimentación asistida por dextrano. Entonces se lavaron estas células dos veces en PBS y se transfirieron a portaobjetos lavados en etanol al 70% y el 96%. Se hizo gotear la suspensión celular sobre los portaobjetos y se incubaron durante 15 min en una cámara húmeda con o sin P3028, 10 |ig/ml, se eliminó por drenado cuidadosamente la disolución, se secaron al aire los portaobjetos y se tiñeron en May Grünewals Giemsa durante 1 minuto. Tal como se muestra en la figura 10A, las células se adhirieron fuertemente a la superficie de vidrio y se diseminaron. El pretratamiento de estas células con P3028 inhibió eficazmente la diseminación (véase la figura 10B).
Migración de células inmunitarias
Se proporcionó sangre para el aislamiento de PBMC a partir de muestras de control sanas en bolsas de transfusión de 50 ml con disolución A de ácido-dextrosa-citrato. Se diluyó la sangre completa 1:1 en PBS que contenía EDTA 2 mM. Entonces se aislaron PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-paque Plus (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suecia) tras lo cual se lavaron las células en primer lugar en PBS con EDTa 2 mM y en segundo lugar en medios de cultivo de linfocitos. Se evaluó la viabilidad celular mediante exclusión de azul trípano al 0,02% y estaba siempre por encima del 95%. Se contó la suspensión celular en un hemocitómetro. Se suspendieron las PBMC en el medio de cultivo sin sueros y se ajustó la concentración celular a 1x106 linfocitos/ml para los ensayos de proliferación y 6,4x105 para los ensayos de migración respectivamente. Se complementó el medio de cultivo de linfocitos RPMI 1640 (Invitrogen, Suecia) con penicilina/estreptomicina al 1% (Invitrogen, Suecia) y Gluta-Max 4 mM (Invitrogen, Suecia). Para la proliferación inducida por CD3, se recubrieron las placas con anticuerpos anti-CD3 humano purificados (BD Pharmingen, Suecia). Por tanto, se pipetearon 50 |il de disolución en PBS de anticuerpos 2,5 |ig/ml en cada pocillo incubado durante 1 hora. Se cultivaron las células durante 4, 5 o 7 días en una atmósfera del 5% de CO2, humidificada a 37°C. Se sometió a ensayo la proliferación celular mediante la prueba de actividad mitocondrial CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS, Promega, Suecia) durante las últimas 4 horas. A cada pocillo, se le añadieron 10 |il de la disolución de MTS y se midió tras 4 horas de incubación a 37°C. Los valores medidos del colorante de referencia se restaron de cada pocillo. Se prepararon disoluciones de péptidos disolviendo los péptidos 3028, SCF28R, 28209 y SCF27 (Schafer-N, Copenhague, Dinamarca) en medios de linfocitos hasta una concentración de 25 |ig/ml. La concentración final en los cultivos era de 5 o 10 |ig/ml.
Se pipetearon 50 |il de la dilución de 6,4x105 PBMC preparada en tubos Eppendorfs y se centrifugaron durante 5 minutos a 400 g, luego se añadieron las diluciones preparadas de blanco, P3028 y los inhibidores. Se incubaron las PBMC a 37°C con las sustancias de prueba durante una hora. Mientras tanto, se preparó la cámara de Boyden pipeteando 25 |il de o bien medios sin fMLP o bien medios que contenían 1x10-8M fMLP a los pocillos inferiores. Entonces se transfirieron 50 |il de la concentración final de PBMC, 3,2x104, a los pocillos superiores de la cámara. Se permitió que las PBMC migraran durante una hora a 37°C. Se retiraron los filtros y se almacenaron en etanol al 70% durante la noche. Después de eso se deshidrataron los filtros en concentración de alcohol creciente y finalmente se colocaron en xileno. Posteriormente, se colocaron sobre portaobjetos, se montaron y se contaron con un microscopio, que contenía una escala de |im. Cada prueba se realizó por duplicado y se calculó la migración como el porcentaje de la media de los duplicados de blanco sin fMLP. Tal como se muestra en la figura 11, P3028 es un potente inhibidor de la migración de células inmunitarias a través de la membrana de la cámara de Boyden (p<0,002). La migración para muestras de control sanas (N=6 ) se ilustra en la figura 11 usando barras oscuras (izquierda), mientras que los pacientes con cáncer (N= 3) se muestran como barras claras (derecha). En la figura 11, barras de error: IC del 95%. P3028 redujo la migración de PBMC de tanto células sanas como pacientes con cáncer.
Ejemplo 6 : Caracterización adicional del efecto de P3028 sobre la proliferación inducida por IL-2
Se sintetizaron las partes C y N-terminales de P3028 y se analizaron por separado y en combinación. La actividad inhibidora de estas dos partes de P3028 solas o en combinación es mucho más débil (véase la figura 12) y no inhiben el efecto de P3028 sobre la proliferación inducida por IL-2 (véase la figura 13) en el modelo humano ex vivo. La figura 12 ilustra los efectos de las partes C-(P3218) (SEQ ID NO: 187) y N-terminal (P3325) (SEQ ID NO: 186) de P3028 sobre la proliferación inducida por IL-2 en comparación con el efecto del P3028 de longitud completa. Se muestra un experimento representativo. La figura 13 ilustra que el efecto inhibidor de P3028 sobre la proliferación inducida por IL-2 no se neutraliza mediante las partes C-(P3218) y N-terminal (P3325) de P3028 solas o en combinación.
Ejemplo 7: Unión de P3028 a LFA-1
Se demostró la presencia de integrinas p2 en PBMC mediante tinción inmunocitoquímica. La aparición de factores que interfieren con la unión de anticuerpos monoclonales dirigidos contra integrinas p2 en sueros de pacientes con cáncer se analizó mediante la tinción de integrinas p2 en PBMC. Un procedimiento de tinción inmunohistoquímica convencional usando fijación con acetona, suero AB humano al 10% para bloquear, incubación con anticuerpo anti-LFA-1. Se separaron las PBMC tal como se describió anteriormente y se centrifugaron inmediatamente sobre portaobjetos de microscopio previamente limpiados en un instrumento Shandon Cytospin (Shandon Scientific Ltd, RU) a 1000 RPM durante 7 min a 5 x 104 células por portaobjetos. Los portaobjetos se dejaron secar a temperatura ambiente durante la noche, tras lo cual se envolvieron en parafilm y se almacenaron a 70°C. Inmediatamente antes de su uso, se descongelaron las citocentrifugaciones y se fijaron con acetona durante 5 min a temperatura ambiente. En primer lugar, se bloquearon las citocentrifugaciones con suero AB humano normal al 10% con y sin péptidos de albúmina (40 |ig/ml) o suero de pacientes con cáncer durante 1 h antes de la tinción. Se añadió anticuerpo primario, que consistía en un anticuerpo monoclonal de ratón anti-CD11a humana (BD Biosciences) diluido en solución salina tamponada con Tris (TBS, pH 7,6) a 1 |ig/ml (PBMC). Se incubaron los portaobjetos durante 30 min y luego se lavaron en TBS seguido por fosfatasa alcalina Envision (Dako Norden A/S, Dinamarca) o, alternativamente, fosfatasa alcalina Ultravision (Lab Vision Co) durante 30 min. Tras el lavado adicional en TBS, se incubaron los portaobjetos en sustrato de fosfatasa alcalina que consistía en sal Fast Red TR (Sigma), naftol AS-MX (Sigma) y levamisol 5 mM (Sigma) para bloquear la actividad fosfatasa alcalina endógena, durante 20 min seguido por lavado en TBS. Entonces se contratiñeron en hematoxilina de Mayer durante 1 minuto y se montaron en Glycergel (Dako Norden A/S). Se usó IgG1 de ratón monoclonal contra un antígeno irrelevante (glucooxidasa de Aspergillus niger, Dako Norden A/S) como muestra de control negativo. Todas las incubaciones se realizaron a temperatura ambiente en una cámara húmeda.
La preincubación con péptidos añadidos al suero AB fue o bien sin péptido añadido (véase la figura 15A) o bien P3028 añadido (véase la figura 15B). Notablemente, el anticuerpo anti-LFA-1 usado en estos experimentos era un potente inhibidor de la proliferación inducida por IL-2.
Tal como se muestra en la figura 14, la presencia de factores bloqueantes de integrinas p2 se demostró entonces como una capacidad de tinción reducida 5 de estas células tras la incubación con sueros de pacientes con cáncer (véase la figura 14B), en comparación con preparaciones preincubadas con muestra de suero de control (véase la figura 14A) que mostraron una tinción fuerte 3 para LFA-1.
Tal como se muestra en la figura 15, similar a los resultados descritos para sueros de pacientes con cáncer, el tratamiento con P3028 puede modular la unión del anticuerpo frente a LFA-1 a LFA-1 de células sanguíneas mononucleares. La figura 15 ilustra la inhibición de la unión de un AcM anti-LFA-1 a células sanguíneas mononucleares mediante P3028. Se observó tinción fuerte 3 para LFA-1 en células en la que no se añadió péptido (véase la figura 15A), mientras que se observó tinción débil 5 para LFA-1 en células en las que no se añadió P3028 (véase la figura 15B).
Con el fin de demostrar adicionalmente el bloqueo de LFA-1 por la estructura de P3028, se comparó la tinción de esta integrina en PBMC de muestras de control sanas y pacientes con cáncer. La figura 16 ilustra la tinción de LFA-1 en PBMC de una muestra de control sana (véase la figura 16A), y un paciente con cáncer antes (véase la figura 16B) y después (véase la figura 16C) del tratamiento con un anticuerpo dirigido contra P3028. Tal como se muestra en la figura 16A, se encuentra una tinción de membrana clara 3 en PBMC de muestras de control sanas en contraposición a PBMC de un paciente con cáncer avanzado, que mostraba tinción débil 5. Sin embargo, cuando las PBMC de este paciente se incubaron con un anticuerpo dirigido hacia la estructura de P3028 durante 24 horas, apareció la tinción de membrana 3, indicando que el anticuerpo se unía a la estructura de P3028 y de ese modo desbloqueaba LFA-1 (véase la figura 16C).
De manera similar, tal como se muestra en la figura 17, la incubación de PBMC de una muestra de control sana con o bien P3028 o bien suero de un paciente con cáncer bloqueó la tinción de membrana de LFA-1. La figura 17 ilustra que la tinción 3 de células sanguíneas mononucleares mediante un anticuerpo anti-LFA-1 (A) se bloquea 5 mediante P3028 (B) o suero de pacientes con cáncer (C).
Ejemplo 8 : Unión de P3028 a la cadena a (CD25) del receptor de IL-2
Debido a que P3028 inhibe significativamente la respuesta proliferativa a IL-2, se estudió el efecto de P3028 sobre la unión de IL-2 a su receptor, CD25. La proteína de fusión de CD25 y la parte Fc de IgG se unió a placas de ELISA/microplacas recubiertas con proteína G y se incubaron las placas con IL-2 biotinilada con o sin P3028 presente. Las figuras 18-B ilustran los resultados de este ensayo ELISA para la dilución de IL-2 biotinilada que fueron tal como sigue: (rombo ♦ ) 1:300, (cuadrado ■ ) 1:600, (triángulo ▲ ; véase la figura 18B) IL-2 no biotinilada. La unión de IL-2 biotinilada a rhuIL-2R alfa aumentó mediante cantidades crecientes de P3028. Sorprendentemente, la unión de IL-2 a CD25 se potenció mediante P3028, indicando una interacción de tres partes entre IL-2, CD25 y P3028 (véase la figura 18-B). Incluso si la unión de IL-2 a CD25 se potencia, el ensamblaje apropiado del receptor de alta afinidad y/o la transducción de señales se bloquea ya que P3028 es un potente inhibidor de la proliferación inducida por IL-2.
Se demostró usando modelado molecular asistido por ordenador que P3028 se une a CD25 en el sitio de unión de IL- 2 (véase la figura 19). La estructura cristalina del receptor de lL- 2 unido a IL- 2 se conoce en la técnica (véanse Wang et al., Science 2005, 310(5751): 1159-1163, y Stauber et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103(8): 2788­ 2793), y la unión de P3028 se modeló por consiguiente. En la figura 19, se representa la cadena a 190 del receptor de IL-2 (CD25) que se une a P3028192 (A) en el sitio de unión de IL-2194 (b ). También se muestra IL-2196.
Ejemplo 9: Anticuerpos que se unen a P3028
Se generaron antisueros de conejos dirigidos contra P3028 de albúmina. Se sintetizó P3028 con una cisteína añadida al extremo N-terminal y luego se conjugó con hemocianina de lapa californiana (KLH) como proteína portadora. Se generaron antisueros policlonales mediante inmunizaciones repetidas de conejos con P3028 conjugado con KLH y adyuvantes de Freund. Para algunos experimentos, los antisueros se purificaron por afinidad mediante cromatografía sobre geles de yodoacetilo Ultralink conjugados con P3028 (Pierce Biotechnology Inc.). Para experimentos de cultivo celular, se realizó intercambio de tampón a modificación de Dutch de RPMI 1640 (Gibco, InVitrogen AB, Estocolmo, Suecia) mediante pase sobre columnas de PD-10 sephadex (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) seguido por esterilización por filtración sobre filtros de jeringa de 0,22 |im Millex (Millipore Co., MA, EE.UU.). Las inmunizaciones de conejos y la purificación de antisueros las llevó a cabo Agrisera AB, Suecia.
Dos antisueros, R y L, de dos conejos diferentes se sometieron a prueba para determinar su capacidad para unirse a suero humano y albúmina sérica humana desnaturalizada (dHSA). Se sometió a prueba albúmina sérica humana comercialmente disponible para fines terapéuticos, calentada 10 veces con el fin de que estuviera libre de virus. Se recubrieron los pocillos con el P3028, dHSA o HSA tratada de muestra de control (no desnaturalizada, sino calentada 10 veces), que se ha preparado justo como la HSA desnaturalizada excepto por el procedimiento de desnaturalización. Tal como se muestra en la figura 20, los antisueros, pero no los sueros preinmunitarios, de dos conejos inmunizados con el P3028 de albúmina se unen a las placas recubiertas con el P3028204, dHSA 206 y, en menor grado, con HSA tratada de muestra de control 208. No se detectó unión sustancial para pocillos sin recubrimiento 202. Por tanto, los antisueros de conejo dirigidos contra el P3028 de albúmina se unen a dHSA y en un menor grado a HSA de muestra de control.
La unión del suero anti-P3028 de conejo a fragmentos de P3028 se sometió a ensayo usando ensayo ELISA de competición. Se preincubaron antisueros de conejo, diluidos 1/1000000 en diluyente de reactivos de ELISA, durante 1 h a temperatura ambiente con las concentraciones indicadas de los péptidos. Entonces se añadieron 100 |il del anticuerpo monoclonal solo o, alternativamente, el anticuerpo monoclonal mezclado con péptidos, a pocillos recubiertos con P3028 y se llevó a cabo el ELISA. Se determinó la inhibición de la unión de suero anti-P3028 de conejo L a pocillos recubiertos con el P3028 para los péptidos de albúmina 2607 (SEQ ID NO: 192), 3218 (C terminal de P3028) (SEQ ID NO: 187), 3325 (N terminal de P3028) (SEQ ID NO: 186) y P3028 de longitud completa (SEQ ID NO: 185). El péptido 2607, que contiene la estructura de E5K, se usó como muestra de control negativo. Tal como se muestra en la figura 21, estos anticuerpos séricos se unían preferentemente al 3325 pero no al fragmento 3218 de P3028. Se obtienen también resultados similares con los anticuerpos purificados por afinidad.
Los efectos de anticuerpos purificados por afinidad dirigidos contra P3028 sobre la respuesta proliferativa a IL-2 se estudiaron en el modelo ex vivo, usando PBMC de pacientes con cáncer inmunosuprimidos y muestras de control normales. Se realizaron cultivos para someter a prueba el efecto inmunomodulador de anticuerpos de conejo purificados por afinidad específicos para 3028 tal como se describió anteriormente para la proliferación inducida por IL-2 con las siguientes excepciones; se omitió HSA al 2% del medio de lavado y del medio de suspensión de Pb Mc . Se incubó previamente medio de cultivo que contenía suero (100 ^l/pocillo) con 20 |ig/ml de anticuerpos de conejo durante 30 min a temperatura ambiente antes de la adición de 100 |il de suspensión de PBMC a los pocillos de cultivo.
P21 tenía carcinoma de células renales y p26, p28 y p29 tenían melanoma maligno. Tal como se muestra en la figura 22, los anticuerpos de conejo purificados por afinidad contra P3028 superaron la inhibición de la respuesta proliferativa a IL-2 en pacientes con cáncer inmunosuprimidos (figura 22A). En muestras de control normales con respuesta proliferativa normal a IL-2, no se observó efecto de la adición de estos anticuerpos (véase la figura 22B) (anticuerpo: R., pacientes con cáncer, p = 0,0002, prueba de la t apareada, valores log de transformación normal). En muestras de control normales con regulación por disminución de la reactividad inmunitaria que tenían una tasa proliferativa de menos de 1 0 0 .0 0 0 dpm, la tasa proliferativa se estimuló de manera similar a la situación en cultivos de pacientes con cáncer.
Se añadió IgG policlonal de conejo a cultivos de muestras de control con el fin de garantizar que el efecto de los anticuerpos purificados por afinidad no se debía a una actividad inespecífica de IgG de conejo en este modelo. La IgG de conejo tenía solo actividad mínima. La especificidad de los anticuerpos anti-P3028 se demostró adicionalmente ya que el efecto estimulador de estos anticuerpos se neutralizó mediante una pequeña cantidad de P3028 que no tenía actividad inhibidora per se. Similar a los resultados en el modelo ex vivo autólogo, la actividad inmunosupresora de sueros de personas con una baja respuesta proliferativa a IL-2 se superó mediante la adición de los anticuerpos anti-P3028 a los cultivos.
Ejemplo 10: Péptidos que se unen a P3028
La información obtenida estudiando el efecto de sueros de pacientes con cáncer y el péptido sintético P3028 sobre la tinción de la cadena a, CD11a, de LFA-1 en PBMC se usó con el fin de diseñar la estructura de un posible agente de unión/inhibidor del péptido inmunomodulador P3028. El epítopo del anticuerpo monoclonal de ratón particular usado, HI 111, se mapeó en los residuos 249-300 de CD11a (Ma Q, et al., J Biol Chem. 2002;277:10638-41). Basándose en la complementariedad de secuencias de aminoácidos cargados e hidrófobos, se diseñó el primer candidato que se une al péptido P3028. Esta secuencia se optimizó entonces sintetizando y sometiendo a prueba la eficacia de unión de péptidos candidatos en los que cada aminoácido se sustituyó por los 19 L-aminoácidos.
Se identificaron tres inhibidores peptídicos candidatos de secuencias/estructuras de P3028 y se sometió a prueba su capacidad de bloqueo en disolución. Se sintetizaron posibles inhibidores peptídicos de P3028 sobre un chip. Se sintetizaron los péptidos de CLIPS y/o lineales basándose en la secuencia de aminoácidos de la proteína diana usando química de Fmoc convencional y se desprotegieron usando ácido trifluórico con eliminadores. Se sintetizaron los péptidos constreñidos sobre armazones químicos con el fin de reconstruir los epítopos conformacionales, usando la tecnología de péptidos unidos químicamente sobre armazones (Chemically Linked Peptides on Scaffolds, CLIPS) (Timmerman et al. (2007)). Por ejemplo, se sintetizaron los péptidos en bucle individuales que contenían una dicisteína, que se cicló mediante tratamiento con alfa, alfa'-dibromoxileno y el tamaño del bucle se varía introduciendo residuos de cisteína a una separación variable. Si están presentes otras cisteínas además de las cisteínas recién introducidas, se reemplazaron por alanina. Las cadenas laterales de las múltiples cisteínas en los péptidos se acoplan a moldes de CLIPS mediante reacción sobre tarjetas PEPSCAN de polipropileno con formato de tarjeta de crédito (455 formatos de péptido/tarjeta) con una disolución 0,5 mM de molde de CLIPS tal como 1,3-bis(bromometil)benceno en bicarbonato de amonio (20 mM, pH 7,9)/acetonitrilo (1:1(v/v)). Las tarjetas se agitaron suavemente en la disolución durante de 30 a 60 minutos mientras se cubrían completamente con la disolución. Finalmente, se lavaron las tarjetas extensamente con exceso de H2O y se sonicaron en tampón de disrupción que contenía el 1 por ciento de s Ds/0,1 por ciento de beta-mercaptoetanol en PBS (pH 7,2) a 70°C durante 30 minutos, seguido por sonicación en H2O durante otros 45 minutos. Se sometió a prueba la unión de P3028 etiquetado con His a cada péptido en un ELISA basado en PEPSCAN. Las tarjetas de polipropileno con formato de tarjeta de crédito de 455 pocillos que contenían los péptidos unidos covalentemente se incuban con disolución de péptido que consiste por ejemplo en 1 microgramos/ml diluido en disolución de bloqueo, por ejemplo, suero de caballo al 4%, ovoalbúmina al 5% (p/v) en PBS/Tween al 1%. Tras lavar, se incubaron los péptidos con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-etiqueta de his (1/1000, Novagen, 70796-3) y posteriormente tras lavar con un conjugado de anticuerpo de conejo anti-ratón-peroxidasa (1/1000, Southern Biotech, 6175-05) durante una hora a 25°C. Tras lavar, se añadieron el sustrato de peroxidasa sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolina (ABTS) y 2 microlitros de H2O2 al 3 por ciento. Tras una hora, se midió el desarrollo de color. Se cuantificó el desarrollo de color con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) y un sistema de procesamiento de imágenes.
Los datos sin procesar (datos sin procesar: densidad óptica, unidades de DO arbitrarias) son valores ópticos obtenidos mediante una cámara de CCD. Los valores oscilan principalmente entre 0 y 3000, una escala logarítmica similar a de 1 a 3 de un lector de ELISA de placas de 96 pocillos convencional. En primer lugar, la cámara de CCD hace una fotografía de la tarjeta antes de la coloración de la peroxidasa y luego de nuevo una fotografía tras la coloración de la peroxidasa. Estas dos fotografías se restan una de cada otra, lo que da como resultado los datos que se denominan datos sin procesar. Esto se copia en la base de datos Peplab™. Entonces se copian los valores a Excel y se marca este archivo como archivo de datos sin procesar. Se permite una manipulación de seguimiento. Algunas veces un pocillo contiene una burbuja de aire dando como resultado un valor de falso positivo, las tarjetas se inspeccionan manualmente y cualquier valor provocado por una burbuja de aire se puntúa como 0.
Tal como se muestra en la posición 17, 22 y 26 estaban contenidos buenos agentes de unión de P3028 (PGE73 = etiqueta de His-P3028). Tal como se muestra en el diagrama, los péptidos SCF28 y SCF29 bloquean eficazmente la unión de P3028 (PGE73) pero SCF27 no. El péptido SCF28 (SEQ ID NO: 1) tenía una solubilidad suficientemente buena como para permitir pruebas en modelos ex vivo humanos biológicos. Basándose en esta estructura, se desarrolló el péptido P28R (SEQ ID NO: 2). Para cada posición, se muestran datos para el ensayo sin péptido añadido en tampón de PBS 230, ensayo de SCF027 en tampón de PBS 232, ensayo de SCF029 en tampón de PBS DMSO 234 al 10%, sin péptido añadido en tampón de PBS DMSO 236 al 10% y ensayo de SCF028 en tampón de PBS DMSO 238 al 10%. En el gráfico de barras de la figura 23, las barras que representan cada ensayo estaban en el mismo orden de izquierda a derecha para cada posición. Cada péptido, cuando estaba presente en un ensayo, estaba a una concentración de 0,5 mg/ml.
Ejemplo 11: Interacciones de péptidos con P3028
La información obtenida estudiando el efecto de sueros de pacientes con cáncer y el péptido sintético P3028 sobre la tinción de la cadena alfa, CD11a (SEQ ID NO: 248), de LFA-1 en PBMC se usó con el fin de diseñar la estructura de un posible agente de unión/inhibidor del péptido inmunoinhibidor P3028. El epítopo del anticuerpo monoclonal de ratón particular usado, HI111, se mapeó en los residuos 274-325 de CD11a, (SEQ ID NO: 248) (código de registro de UniProt P20701; Ma Q, et al., J Biol Chem. 2002; 277: 10638-41). Basándose en la complementariedad de secuencias de aminoácidos cargados e hidrófobos (véase la figura 31), se diseñó el primer candidato que se unía al péptido P3028 usando la secuencia que comprende 312-326 de CD11a. Esto dio como resultado el péptido KKL15 (SEQ ID NO: 1).
El péptido KKL15 (SEQ ID NO: 1), por ejemplo, parece ser complementario a P3028. Tal como se muestra en la figura 31, los aminoácidos cargados positivamente interaccionan con aminoácidos cargados negativamente de P3028 y los aminoácidos hidrófobos hacen contactos hidrófobos que potencian la interacción.
Ejemplo 12: Péptidos que se unen a P3028
Basándose en la estructura del péptido P28R, se identificaron péptidos adicionales que se unen a P3028. Los agentes de unión adicionales incluían deleciones, truncamientos y o sustituciones de aminoácido del péptido P28R. La unión de péptidos a P3028 se evaluó usando la tecnología PEPSCAN. La tecnología PEPSCAN, o ensayos de “rampo”, son ensayos de unión bioquímicos, cuyos detalles se proporcionan a continuación:
Se usó tecnología de examen de microalineamientos de péptidos para medir la unión de P28R (SEQ ID NO: 2) y variantes de P28R a P3028 (SEQ ID NO: 185). En esta tecnología, se sintetizan bibliotecas de péptidos sintéticos y se unen covalentemente sobre chips de microalineamientos de polipropileno. Se sintetizaron los péptidos lineales sobre tarjetas de polipropileno con formato de tarjeta de crédito (455 formatos de péptido/tarjeta) tal como se describe (Timmerman et al., 2004) usando química de Fmoc convencional usando hexametilendiamina (HMDA) como ligador y desprotección usando ácido trifluoroacético (TFA) con eliminadores.
Se sometió a prueba la unión de P3028 etiquetado con His a cada péptido en la tarjeta en un ensayo ELISA. Las tarjetas de polipropileno con formato de tarjeta de crédito de 455 pocillos que contenían los péptidos unidos covalentemente se incubaron con disolución de péptido P3028 etiquetado con His (PGE73) que consistía en de 0,5 |ig/ml diluido en disolución de bloqueo (suero de caballo al 4%, ovoalbúmina al 5% (p/v) en PBS/Tween al 1%). Tras lavar, se incubaron los péptidos con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-etiqueta de His (Novagen, 70796-3, diluido 1 / 1 0 0 0 en el tampón de incubación) y posteriormente tras lavar con un conjugado de anticuerpo de conejo anti-ratón-peroxidasa (Rampo) (Southern Biotech, 6175-05, diluido 1/1000), durante una hora a 25°C. Tras lavar, se añadieron el sustrato de peroxidasa sulfonato de 2,2'-azin-di-3-etilbenztiazolina (ABTS) y 2 |il de H2O2 al 3%. Se midió la capacidad de unión del AcM como desarrollo de color a 405 nm (densidad óptica, DO405). Se cuantificó el desarrollo de color con una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) y un sistema de procesamiento de imágenes
Los valores de DO405 obtenidos mediante una cámara de CCD se consideraron como valores de datos sin procesar (“valores de rampo”, “unidades de rampo” o “puntuaciones de rampo”). Los valores oscilaban principalmente entre 0 y 3000, una escala logarítmica similar a de 1 a 3 de un lector de ELISA de placas de 96 pocillos convencional. En primer lugar, la cámara de CCD hizo una fotografía de la tarjeta antes de la coloración de la peroxidasa y luego de nuevo una fotografía tras la coloración de la peroxidasa. Estas dos fotografías se restan una de cada otra, lo que dio como resultado los datos que se consideraron datos sin procesar. Estos valores se copian a un archivo de Excel y se marca como archivo de datos sin procesar. Se permite una manipulación de seguimiento. Algunas veces un pocillo contiene una burbuja de aire dando como resultado un valor de falso positivo. Si la inspección manual de las tarjetas detecta una burbuja de aire, el valor se establece como 0 para ese pocillo.
Una biblioteca de péptidos sometidos a prueba para detectar la unión al péptido P3028 incluía todas las sustituciones para cada posición del péptido P28R (SEQ ID NO: 2) (es decir, 19 sustituciones para cada posición). Los resultados de los experimentos de unión se muestran en las figuras 27, 28, 29 y 30 y la tabla 5.1. Las puntuaciones de rampo oscilaban entre 102 y 1190 para todas las sustituciones en cada una de las 16 posiciones de P28R. P28R tenía valores de rampo que oscilaban entre 262 y 460 con un valor medio de 370. Tal como se muestra en la figura 28, 31 sustituciones de aminoácidos individuales del péptido P28R (SEQ ID NO: 2) tenían una puntuación de rampo por encima de 500. Estos 31 péptidos sustituidos incluyen SEQ ID NO: 3-31, y se muestran en la tabla 6.1. Se observaron valores superiores significativos para las sustituciones M, Q, H, N en la posición 13 (SEQ ID NO: 22 a 25, respectivamente), todas con valores por encima de 800. Además, M y S en la posición 7 (SEQ ID NO: 9 y 10, respectivamente), y Q y M en la posición 11 (SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente) tienen todas valores de rampo por encima de 700.
Tabla 6.1: Péptidos que se unen a P3028 con una puntuación de rampo por encima de 500
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Para cada posición de P28R, se compararon las puntuaciones de rampo del grupo de 19 péptidos diferentes que contenían una sustitución de L-aminoácido con la puntuación de rampo de un péptido P28R de muestra de control (SEQ ID NO: 2) para ese grupo. Se identificaron sustituciones de un solo aminoácido que tenían una puntuación de rampo mayor de o sustancialmente equivalente a P28R. Tal como se usa en el presente documento, una puntuación de rampo “sustancialmente equivalente a P28R” es una puntuación de rampo que es al menos el 98% de la puntuación de rampo de P28R. Por tanto, se identificaron variantes de P28R que tienen una unión equivalente o mejor a P3028.
Por ejemplo, en la posición 8 de P28R (SEQ ID NO: 2) es una V. El péptido P28R de muestra de control tenía una puntuación de rampo de 308, y péptidos que tenían una F, G, L, P o R en la posición 8 (SEQ ID NO: 326-330, respectivamente) cada uno tenían una puntuación de rampo mayor de o igual a 302 (el 98% de 308). Las sustituciones de un solo aminoácido de P28R que tenían una puntuación mayor que igual a la del péptido P28R de muestra de control para ese grupo se muestran en la tabla 6.2.
Tabla 6.2: Péptidos que se unen con una puntuación de rampo mayor de o sustancialmente equivalente a la de P28R
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Las sustituciones posicionales de P28R en la tabla 6.2, (SEQ ID NO: 268-393) se resumen en la figura 32. Se indica que las posiciones 2 (K), 9 (K) y 15 (E) toleran relativamente pocas sustituciones mientras que todavía se unen a P3028. La sustitución del residuo en las posiciones 2, 9 y/o 15 de P28R puede dar como resultado unión a P3028 (tal como se mide mediante puntuaciones de rampo) sustancialmente inferior a P28R no sustituido. Por tanto, se contempla en el presente documento que estas 3 posiciones parecen modular la transducción de señales. Un experto en la técnica apreciará que la actividad moduladora de la transducción de señales de estas posiciones puede ser útil en el diseño de inhibidores de péptidos inmunomoduladores.
También se realizó análisis de PEPSCAN sobre truncamientos y deleciones internas del péptido P28R. Se muestran en la figura 29 puntuaciones de rampo para péptidos que tienen las secuencias KKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 2); KKLDTFFVKLSLFTE (SEQ ID NO 34); KKLDTFFVKLSLFT (SEQ ID NO: 35); KKLDTFFVKLSLF (SEQ ID NO 36); KKLDTFFVKLSL (SEQ ID NO: 37); KKLDTFFVKLS (SEQ ID NO: 38); KKLDTFFVKL (SEQ ID NO: 39); KKLDTFFVK (SEQ ID NO: 40); KKLDTFFV (SEQ ID NO: 41); KKLDTFF (SEQ ID NO: 42); KKLDTF (SEQ ID NO: 43); KKLDT (SEQ ID NO: 44); KKLD (SEQ ID NO: 45); KLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 46); LDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 47); DTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 48); TFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 49); FFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 50); FVKLSLFTER (SEQ ID NO:51); VKLSLFTER (SEQ ID NO: 52); KLSLFTER (SEQ ID NO: 53); LSLFTER (SEQ ID NO: 54); SLFTER (SEQ ID NO: 55); LFTER (SEQ ID NO: 56); FTER (SEQ ID NO: 57); KLDTFFVKLSLFTE (SEQ ID NO: 58); LDTFFVKLSLFT (SEQ ID NO: 59); DTFFVKLSLF (SEQ ID NO: 60); TFFVKLSL (SEQ ID NO: 61); FFVKLS (SEQ ID NO: 62); FVKL (SEQ ID NO: 63).
Se muestran en la figura 30 puntuaciones de rampo para péptidos que tienen las secuencias KKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 2); KLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 46); KKLTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 64); KKLDTFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 65); KKLDTFFKLSLFTER (SEQ ID NO: 66); KKLDTFFVKSLFTER (SEQ ID NO: 67); KKLDTFFVKLSFTER (SEQ ID NO: 68); KLDTFFVKLSLFER (SEQ ID NO: 69); KLDTFFVKLSLFTE (SEQ ID NO: 58); LDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 47); KKTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 70); KKLDFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 71); KKLDTEKLSLFTER (SEQ ID NO: 72); KKLDTFFVSLFTER (SEQ ID NO:73); KKLDTFFVKLFTER (SEQ ID NO: 74); KKLDTFFVKLSLER (SEQ ID NO: 75); LDTFFVKLSLFT (SEQ ID NO: 59); DTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 48); KKFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 76); KKLDVKLSLFTER (SEQ ID NO: 77); KKLDTFLSLFTER (SEQ ID NO: 78); KKLDTFFVLFTER (SEQ ID NO: 79); KKLDTFFVKLTER (SEQ ID NO: 80); KKLDTFFVKLSLR (SEQ ID NO: 81); KFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 82); KKLVKLSLFTER (SEQ ID NO: 83); KKLDTLSLFTER (SEQ ID NO: 84); KKLDTFFLFTER (SEQ ID NO: 85); KKLDTFFVKTER (SEQ ID NO: 86); KKLDTFFVKLSR (SEQ ID NO: 87); KFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 88); KKLKLSLFTER (SEQ ID NO: 89); KKLDTSLFTER (SEQ ID NO:90); KKLDTFFFTER (SEQ ID NO: 91); KKLDTFFVKER (SEQ ID NO: 92); KKLDTFFVKLS (SEQ ID NO: 38); GKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 93); KKGDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 94); KKLDGFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 95); KKLDTFGVKLSLFTER (SEQ ID NO: 96); KKLDTFFVGLSLFTER (SEQ ID NO: 97); KKLDTFFVGLSLFTER (SEQ ID NO: 98); KKLDTFFVKLGLFTER (SEQ ID NO: 99); KKLDTFFVKLSLGTER (SEQ ID NO: 100); KKLDTFFVKLSLFTGR (SEQ ID NO: 101).
Tal como se muestra en la figura 30, varias deleciones y truncamientos del péptido P28R tienen una puntuación de rampo comparable a, o mayor que el péptido P28R, incluyendo péptidos de las secuencias SEQ ID NO: 64, 65, 68 y 76. Adicionalmente varias sustituciones de glicina tenían puntuaciones de rampo comparables a P28R, incluyendo péptidos de SEQ ID NO: 94, 95, 96, 98 y 99. La deleción de hasta al menos 8 aminoácidos del extremo N-terminal de P28R (SEQ ID NO: 46 a 53) retuvo una alta afinidad por P3028 tal como se mide mediante la puntuación de rampo. La deleción de la R C-terminal de P28R (SEQ ID nO: 34) retuvo una alta afinidad por P3028.
Ejemplo 13: Efecto de un inhibidor de bajo peso molecular de P3028 sobre la activación de linfocitos
Se realizaron análisis del inhibidor de P3028, P28R, en modelos ex vivo humanos. La actividad estimuladora en PBMC, medida usando las técnicas de MTS o CFSE, se estudió en 7 muestras de control sanas y 7 pacientes con cáncer de diversos diagnósticos. De manera interesante, incluso en ausencia de otros tipos de estimulación, P28R tiene una actividad estimuladora significativa en 6 de 7 pacientes con cáncer, mientras que los PBMC de las muestras de control mostraron solo una estimulación débil o nula.
Tal como se muestra en la figura 24, actividad estimuladora de P28R sobre la respuesta proliferativa suprimida a IL-2. Se cultivaron PBMC durante 7 días con IL-2 y se determinó la tasa proliferativa como incorporación de BrdU. Cada barra representa el valor medio de tripletes. Similar a los estudios sobre la eficacia de los anticuerpos (véase la figura 22) dirigidos contra P3028 para revertir la inmunosupresión relacionada con el cáncer determinada como una escasa respuesta proliferativa de PBMC de pacientes con cáncer a IL-2, se investigó la eficacia del inhibidor de bajo peso molecular de P28R en la reversión de la proliferación inducida por IL-2 suprimida. Los resultados de los cultivos de PBMC de cuatro pacientes diferentes sin tratamiento previo se muestran en la figura 24. Para cada cantidad de P28R añadido, las células estimuladas con IL-2240 se muestran a la izquierda, y las no estimuladas 242 se muestran a la derecha. PBMC con una baja proliferación inicial (véanse las figuras 24A y 24B) se estimularon notablemente por P28R, mientras que una alta proliferación inicial no se vio afectada esencialmente por el fármaco (véanse las figuras 24C y 24D). Tal como se esperaba, no estaba presente inmunosupresión sistémica en todos los pacientes y solo aquellos con inmunosupresión se estimularon.
Ejemplo 14: Unión de un inhibidor de bajo peso molecular de P3028 a células tumorales
Tal como se demuestra en el presente documento, están presentes estructuras de P3028 en tumores. Se usó un inhibidor biotinilado de P3028, P28R, para estudiar adicionalmente la distribución de estructuras de 3028 y la unión del inhibidor en tejido tumoral. Se analizaron tres cánceres de mama, dos carcinomas de células renales y cuatro melanomas malignos. Todos los tumores investigados se unieron al inhibidor. Un ejemplo de cáncer de mama teñido se muestra en la figura 25, y se observa una fuerte reacción positiva 7 que indica la presencia de la estructura de 3028 inhibidora en este tumor. Puesto que la estructura de P3028 inhibe la migración de linfocitos, así como la actividad citotóxica (descrito anteriormente), un ataque mediado inmunitariamente contra áreas tumorales que se tiñen positivamente puede suprimirse eficazmente siempre que P3028 expuesto no se bloquee por la unión a P28R. Sin embargo, no se tiñeron linfocitos por este procedimiento ya que la estructura de P3028 se bloqueó por la unión a LFA-1 en estas células.
Ejemplo 15: Desbloqueo del receptor de LFA-1 por P28R
Tal como se describe en el presente documento, las integrinas p2 desempeñan un papel en la función normal del sistema inmunitario. También se describen en el presente documento mecanismos inmunosupresores basados en la unión de un inhibidor endógeno, P3028, a la integrina p2 LFA-1. Tal como se describe en el ejemplo 7, la tinción de la membrana de PBMC de pacientes con cáncer disminuye notablemente en comparación con muestras de control normales. Sin embargo, la exposición de LFA-1 podría potenciarse incubando PBMC de pacientes con cáncer con un anticuerpo dirigido contra el inhibidor P3028 (véanse el ejemplo 7 y la figura 16). La tinción para LFA-1 se realizó usando el anticuerpo anti-LFA-1 del ejemplo 7 y un anticuerpo secundario (Ultravision) seguido por desarrollo con Fast Red. Se incubaron secciones tumorales congeladas frescas sin ninguna fijación durante 4-20 horas con el candidato a fármaco, P28R antes de teñir para detectar LFA-1 (véase la figura 26B). Para comparación, se incubaron secciones tumorales de muestra de control solo con solución salina tamponada con fosfato (véase la figura 26A).
Tal como se muestra en la figura 26, P28R desbloqueó LFA-1, y de ese modo potenció notablemente la expresión funcional de LFA-1 permitiendo la migración y actividad citotóxica de estas células. La tinción fuerte de LFA-1 3 en células tratadas con P28R contrasta con la tinción débil de LFA-1 5 en células no tratadas. Estos resultados muestran que LFA-1 se desbloqueó mediante la eliminación de la estructura de P3028 por el P28R.
Ejemplo 16: Suministro de inhibidores de péptidos inmunorreguladores por medio de nanodosificación a pacientes con cáncer
Se seleccionan pacientes con cáncer con inmunosupresión debido a la presencia de estructuras de P3028 y que tienen metástasis de melanoma subcutáneo. Se inserta un catéter de microdiálisis en una de estas metástasis después de determinar el infiltrado inflamatorio mediante una biopsia con aguja fina. La línea base: infiltrado inflamatorio, perfil de citocinas y concentración de estructuras P3028 se determinan antes de la infusión del inhibidor de péptido inmunorregulador específico de P3028. Los cambios en el perfil de citocinas y la concentración de estructuras de P3028 se determinan entonces durante y después de la infusión. La infusión continuará durante 24 o 48 horas y el área suministrada por el catéter de microdiálisis se extirpará inmediatamente después de la infusión y luego después de una y dos semanas con el fin de estudiar el infiltrado inflamatorio y los cambios regresivos del tumor. Se espera que la administración del inhibidor de péptidos inmunorreguladores reducirá la inmunosupresión del paciente con cáncer, tal como se mide, por ejemplo, desbloqueando LFA-1, uniendo estructuras de P3028 y/o potenciando el reclutamiento de células inmunitarias.
Ejemplo 17: Agentes de unión de péptidos de albúmina de moléculas de superficie celular
Fragmentos de albúmina que se unen a moléculas de la superficie celular.
Tal como se enseña en la publicación estadounidense n.°: 2011/0262470, algunos fragmentos de albúmina pueden unirse a moléculas de superficie celular. La publicación estadounidense n.°: 2011/0262470 notifica la identificación de péptidos séricos que se unen a columnas de superficie celular artificial (SCA). Las columnas de ACS se prepararon tal como sigue:
En primer lugar, se prepararon proteínas de superficie celular biotiniladas. Se recogieron capas leucocitarias generadas a partir de 450 ml de sangre cada uno de 4 donantes sanos. Los eritrocitos se eliminaron por sedimentación en disolución de dextrano al 2% T500 (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala Suecia) en NaCl al 0,9%. Entonces se aislaron células mononucleares (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare BioscienceAB Suecia). Las PBMC se suspendieron entonces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Ca y Mg (GIBCO) a una concentración de 10 x 106/ml. Se añadió EZ Link Sulfo-NHS-biotina (Pierce, EE.UU.) a una concentración final de 0,2 mg/ml y se incubó la mezcla en un agitador a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego se eliminó la biotina en exceso lavando las PBMC en PBS. Entonces se lisaron las PBMC biotiniladas añadiendo 1,0 ml de tampón de lisis enfriado con hielo (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, con NaCI 0,15 M, MgCI2 5 mM que contenía glucósido de octilo 100 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM) por 2 x 107 células granuladas con agitación suave, luego se incubaron durante 30 min sobre hielo. Se eliminaron los residuos por centrifugación a 5000xg a 4°C durante 10 minutos y se recogieron los sobrenadantes y se agruparon de los cuatro donantes. El lisado se almacenó entonces a -70°C en tubos de plástico de polipropileno.
Para estudiar las absorciones por el fragmento de tripsina dHSA, se prepararon columnas de afinidad con proteínas de superficie celular biotiniladas de células mononucleares acopladas a estreptavidina-sefarosa tal como sigue: se diluyeron 18 ml de lisado celular biotinilado en tampón de lisado 1/10 en tampón de unión (NaH2P0420 mM, NaCl 0,15 M, pH 7,5). Esta cantidad de lisado corresponde a 36x107 células mononucleares. Se añadió a una columna de afinidad de estreptavidina HP Hitrap de 1 ml (Amersham Biosciences). Para bloquear la posible biotina libre restante, se añadieron 5 ml de glicina 0,1 M (Sigma) a la columna. La estreptavidina insaturada en la columna se hizo reaccionar entonces con 150 ug de biotina (Sigma) en tampón de unión. La columna se lavó cuidadosamente con PBS y se almacenó en PBS con NaN3 al 0,1% a 4°C hasta su uso.
Para estudiar las absorciones por dHSA fragmentada con ASP-N, se prepararon columnas de afinidad con proteínas de superficie celular biotiniladas de células mononucleares acopladas a estreptavidina-sefarosa tal como sigue: el lisado celular biotinilado en el tampón lisado se sometió a intercambio de tampón mediante tubos de diálisis Spectrapore 4 (Spectrum Europa, Breda, Países Bajos) en tampón de unión (NaH2P04 20 mM, NaCI 0,15 M pH 7,5). Se añadieron 27 ml de lisado celular biotinilado en tampón de unión (correspondiente a 54 x 107 células mononucleares) a 1,5 ml de estreptavidina sefarosa HP lavada (Amersham Biosciences). Para bloquear la posible biotina libre restante, se añadieron 25 ml de glicina 0,1 M (Sigma) a estreptavidina sefarosa. La estreptavidina insaturada se hizo reaccionar entonces con 225 ug de biotina (Sigma) en tampón de unión. La estreptavidina sefarosa se lavó cuidadosamente en PBS. Un ml de la estreptavidina sefaorsa acoplada a lisado celular biotinilado se empaquetó entonces en una columna vacía (Tricorn Empty High Performance Column, Amersham Bioscience) y se lavó con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Ca2+ y Mg2+ (GIBCO).
La digestión con tripsina o ASP-N se realizó tal como sigue. Se reconstituyó dHSA secada por congelación (0,5 mg) en NH4HCO3 25 mM, pH 8 , que contenía 10 mg de tripsina modificada de calidad de secuenciación (Promega Corporation, WI) o 2 mg de endoproteinasa ASP-N (Sigma) y se incubó a 37°C durante la noche. Para eliminar la enzima y albúmina no fragmentadas, la muestra se sometió a ultrafiltración a través de un filtro centrífugo Amicon Ultra 4 (punto de corte de PM de 5000) o Centriplus (punto de corte de PM de 10000) (Millipore AB, Solna, Suecia). El filtrado, que contenía dHSA fragmentada sin enzimas, se recogió y diluyó con PBS con Ca y Mg (GIBCO).
Se tripsinizó dHSA y la mezcla de péptidos obtenidos después de la tripsinación se adsorbió por ACS. Se hicieron pasar dos ml de dHSA fragmentada con enzima en PBS, correspondiente a un total de 0,2 mg de proteína, sobre la columna de ACS. Se recogió la fracción no retenida teniendo en cuenta el volumen vacío y la dilución de la muestra adsorbida recogiendo en pequeñas porciones de 0,2 ml. Treinta microlitros de cada muestra, incluyendo una muestra de control que no se ha adsorbido, se secaron en una centrífuga Speed-Vac. Los péptidos de unión se identificaron comparando disoluciones de péptidos adsorbidos y no adsorbidos usando la técnica de espectrometría de masas MALDI TOF. Las muestras secadas se reconstituyeron en 10 ul de TFA al 0,1%. Se utilizaron puntas de pipeta Zip Tip (Millipore, EE. UU.) que contenían medios de fase inversa C18 para desalar las muestras reconstituidas. Para el análisis de muestras en el intervalo de masa de 700 a 3600 Da, se mezcló 1 |il de cada muestra eluida con Zip Tip con 1 |il de una disolución saturada de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico (0,02 mg/ml) en acetonitrilo al 70%/ácido trifluoroacético al 0,3%. Para el análisis de muestras en el rango de masa de 1500 -9000 Da, se mezcló 1 |il de cada muestra eluida con Zip Tip con 1 |il de ácido sinapínico (ácido 3-metoxi-4-hidroxicinámico). Se dispuso en manchas 1 |il de la mezcla sobre la placa de MALDI y se analizó usando EM MALDI-TOF (Voyager-DE PRO, Applied Biosystems, CA, EE.UU.). La búsqueda de identidad de masa de los espectros resultantes se realizó en las bases de datos SwissProt o NCBI usando MS-Fit.
Estos péptidos se muestran en la tabla 7.
Tabla 7: Fragmentos de albúmina generados por tripsina que se unen a ACS
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Debido a que la secuencia peptídica completa de la albúmina no se recupera usando la técnica de MALDI-TOF tras la degradación con tripsina, y debido a que algunas secuencias con la capacidad de unirse a receptores de superficie celular de células inmunitarias podrían haberse degradado por el tratamiento con tripsina, dHSA también se degradó mediante asparaginasa (ASN-N), y la mezcla de péptidos obtenida tras la degradación se adsorbió por ACS. Los péptidos de unión se identificaron comparando disoluciones de péptidos adsorbidos y no adsorbidos usando la técnica de EM MALDI TOF. Estos péptidos se muestran en la tabla 8.
Tabla 8 : Fragmentos de albúmina generados por Asp-N que se unen a ACS
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Adicionalmente, se sintetizaron nueve péptidos de albúmina sintéticos, tal como se muestra en la tabla 9.
Tabla 9: Péptidos de albúmina sintéticos
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Ejemplo 18: Agentes de unión de péptidos de albúmina de moléculas de superficie celular
Se mostró que el anticuerpo monoclonal AcM A tiene actividad inmunomoduladora. Se investigaron adicionalmente las estructuras del epítopo al que se une el AcM A. En resumen, se incubaron fragmentos de albúminas con anticuerpo, y se usó espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz tiempo de vuelo (EM MALDI-TOF) con el fin de definir el posible sitio o sitios en albúmina sérica humana a los que se une un anticuerpo monoclonal de ratón específico para albúmina desnaturalizada. Un enfoque aprovechó el hecho de que algunos péptidos trípticos a los que se une un anticuerpo no generarán espectros de masas característicos en MALDI ya que están “escondidos” del análisis. Otro enfoque aprovecha el hecho de que sitios en una proteína en donde se ha unido un anticuerpo están protegidos de la proteólisis.
Se desnaturalizó albúmina sérica humana (HSA) purificada con urea, se redujo con DTT y se alquiló. Entonces se sometió la HSA desnaturalizada a tratamiento con tripsina con una baja concentración (0,02-2 ng/ml) de tripsina. Sin embargo, los espectros obtenidos con MALDI no fueron satisfactorios, ya que no se encontraron las masas de péptidos típicas para albúmina. Basándose en la electroforesis en gel, se encontró que esta preparación (digerida mediante 0,02 ng/ml de tripsina) contiene cantidades sustanciales de albúmina no digerida. Por tanto, se continuó la digestión con tripsina, a una concentración más alta (5 ug/ml) con el fin de obtener los espectros de masa habitualmente usados para la identificación de proteínas mediante MALDI.
Para identificar fragmentos de albúminas a los que se une el AcM A, se incubó parte de la disolución de albúmina ahora completamente escindida con el AcM A. Se realizó EM MALDI-TOF y se compararon los espectros de albúmina desnaturalizada tratada con enzima en presencia o ausencia de AcM A. Catorce masas de albúmina (SEQ ID NO: 231-244) estaban ausentes o reducidas tras la incubación con AcM A. La secuencia de aminoácidos de estos péptidos se muestra en la tabla 10. Los espectros representan múltiples áreas que abarcan los residuos 6 6 a 508 de la molécula de albúmina.
Con el fin de confirmar adicionalmente estos resultados, se permitió que el anticuerpo monoclonal AcM A se uniera a la albúmina desnaturalizada (previamente digerida mediante tripsina a una concentración de 0 , 0 2 ng/ml) con el fin de proteger las secuencias peptídicas del epítopo. El complejo se trató de nuevo con tripsina. Entonces se realizó EM MALDI-TOF y se compararon los espectros de masas de péptidos generados a partir de la albúmina con los espectros generados a partir de albúmina desnaturalizada tratada con tripsina en ausencia de anticuerpo. Las mismas catorce masas de 39 masas de albúmina desaparecieron completamente o estaban significativamente reducidas en la muestra en la que estaba presente el AcM durante el tratamiento con tripsina (véase la tabla 10, columna 6 ). Se tomaron múltiples lecturas para verificar los resultados.
Tabla 10: Péptidos de albúmina que se unen al anticuerpo monoclonal AcM A
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Algunos fragmentos peptídicos de albúmina pueden no identificarse mediante la unión de un anticuerpo a fragmentos de albúmina tripsinizados debido a la posibilidad de que el epítopo de unión al AcM de la albúmina se escinda por la tripsina, dando como resultado fragmentos del epítopo con una afinidad de unión demasiado baja como para unirse al AcM. Por tanto, se usó un método adicional para identificar fragmentos a los que se une el anticuerpo. Se repitió el mapeo de epítopos por MALDI del AcM A basándose en protección por el anticuerpo frente a la proteólisis. Esta vez se usó un enfoque ligeramente diferente. Se incubó HSA desnaturalizada con el AcM A. La albúmina a la que no se unió el anticuerpo se retiró de la muestra mediante exclusión por tamaño sobre un ultrafiltro. Los AcM libres restantes y los complejos de AcM-albúmina se digirieron entonces con tripsina (las secuencias de la molécula de albúmina a las que se une el AcM deben resistir la digestión con tripsina). Entonces se retiraron fragmentos escindidos pequeños de AcM y albúmina no protegida de la muestra mediante ultrafiltración (30 kD). Los complejos de AcM y fragmentos de albúmina unidos se disociaron disminuyendo el pH hasta 2,7. De nuevo, se realizó ultrafiltración a 30 kD para separar AcM completo de fragmentos de albúmina menores de 30 kD. El análisis de MALDI TOF de estos fragmentos no identificó espectros típicos de albúmina. Razonablemente, porque los fragmentos que contenían el epítopo de AcM A eran todavía demasiado grandes. Este filtrado (< 30 kD) se digirió entonces adicionalmente con tripsina (para la escisión de sitios previamente protegidos por el AcM) con el fin de generar masas de péptidos adecuadas para el análisis con EM MALDI TOF.
Después de este segundo tratamiento con tripsina, ocho de 32 masas detectadas mediante EM MALDI TOF coincidían con la albúmina (véase la tabla 11). Por tanto, estas nuevas secuencias de aminoácidos representan una parte del epítopo, que también contiene secuencias en el otro lado del punto de escisión de la tripsina. Seis de las ocho masas de péptidos ((SEQ ID NO: 231, 233, 235, 236, 242 y 243) eran masas de péptidos que también desaparecieron cuando se analizaron previamente cuando se incubó albúmina completamente escindida con el AcM A antes del análisis de MALDI-TOF (véase la tabla 10). Dos de los ocho péptidos (SEQ ID NO: 245 y 346) no se habían identificado en los ensayos de unión con albúmina completamente escindida. El/los epítopo/s de este anticuerpo se estableció/establecieron por tanto. Es importante observar que están presentes múltiples de tales estructuras en la molécula de albúmina, que pueden provocar entonces reticulación de los receptores a los que se unen. Sin embargo, de hecho, pueden existir múltiples sitios epitópicos para AcM A en la albúmina.
Tabla 11: Péptidos de albúmina que se unen al anticuerpo monoclonal AcM A
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Ejemplo 19: Péptidos cíclicos que se unen a P3028
Con el fin de identificar péptidos cíclicos que se unen a P3028, se sintetizaron todas las posibles variantes de di- y tripéptidos sobre chips y se analizó la unión del P3028 marcado con etiqueta de His usando la técnica de ELISA. Basándose en los motivos de unión identificados, se produjeron 6 meros en bucle y se sometieron a prueba. Estos resultados conjuntamente permiten la construcción de un péptido cíclico líder CLALNVMCG (SEQ ID NO: 264). Se realizaron barridos posicionales en cada posición del péptido cíclico líder que se reemplazó con cada uno de los otros 19 L-aminoácidos. Se sometió a prueba la unión de cada uno de los péptidos sustituidos, y se identificaron secuencias peptídicas con incluso mejor capacidad de unión que la del péptido líder. Los dos péptidos con la afinidad más alta fueron CLRLNVFCG (SEQ ID NO: 265) y CLRLIVMCG (SEQ ID NO: 266). Los dos mejores péptidos en bucle que se unen a P3028 basándose en el ensayo de unión de barrido posicional se resumen en la tabla 1 2.
Tabla 12: Péptidos cíclicos que se unen a P3028
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Los residuos de aminoácido sustituibles en el péptido en bucle líder que se identificó en los barridos posicionales que proporcionaban una unión mejorada a P3028 (SEQ ID NO: 185) se resumen en la figura 33 (es decir, SEQ ID NO: 264 a 266). Sustituciones posicionales de P28R que dan como resultado una unión equivalente o mejor de P28R a P3028 que se identificó que proporcionaban una unión superior o sustancialmente igual a P3028 (véanse las tablas 6.1 y 6.2) también se resumen en la figura 33. Se observó que había una homología muy buena entre secuencias peptídicas en bucle que se unían a P3028 basándose en los datos de barrido (SEQ ID NO: 264-266) y secuencias de péptidos lineales que se identificó que se unían a P3028 (SEQ ID NO: 2-31 y 268-393) (véase la figura 33). Se indica que los residuos de C N-terminales y residuos de CG C-terminales de los péptidos cíclicos están implicados en la ciclación del péptido. Por tanto, tal como se muestra en recuadros sombreados en la figura 33, hay una fuerte homología entre péptidos cíclicos de 6 meros identificados como agentes de unión de P3028 (SEQ ID NO: 264-266) y o bien el extremo N-terminal o bien C-terminal del péptido relacionado con P28R (SEQ ID NO: 2-31 y 268-393). Se contempla que puedan identificarse péptidos cíclicos adicionales que se unen a e inhiben péptidos inmunorreguladores derivados de albúmina.
Ejemplo 20: Efecto de péptidos de albúmina sobre la proliferación inducida por IL-2
El efecto de péptidos de albúmina incluyendo al menos una de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 se determina usando el modelo humano ex vivo tal como se describe en el ejemplo 2.
Se aíslan PBMC de muestras de sangre venosa de donantes de sangre sanos (muestras de control) o pacientes con cáncer. Se añadieron cien pI de medio de cultivo (modificación de Dutch de RPMI 1640 (Gibco, InVitrogenAB, Estocolmo, Suecia) suplementado con penicilina 200 UI/ml, estreptomicina 200 ug/ml, L-glutamina 4 mM (todos de Sigma Chemical Co. Mo , EE.UU.) y suero humano inactivado con calor al 20%) a placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo (Costar, Corning Inc. NY, EE.UU.). Para cultivos experimentales, el medio de cultivo de cada pocillo se complementa con un péptido de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246. Entonces se añadieron cien pl de PBMC en RPMI/hSa al 2% (5x104 linfocitos) por pocillo seguido por IL-2 (Proleukin, Chiron, NL) a una concentración final de 120 UI/pocillo. Se establecieron en paralelo pocillos de muestras de control sin IL-2. Se cultivaron las células durante 7 días en una atmósfera del 5% de CO2, humidificada a 37°C. Se sometió a ensayo la proliferación celular mediante la incorporación de 1,6 pCi/pocillo de [3H]-timidina (Amersham Int., RU) durante las últimas 18-24 h. Se usan valores medios de dpm (desintegraciones por minuto) de pocillos por triplicado para los cálculos.
Por tanto, se identificaron péptidos de albúmina que inhiben la estimulación por IL-2 de las PBMC.
Ejemplo 21: Efecto de péptidos de albúmina sobre la estimulación de receptores de células T
El efecto de péptidos de albúmina incluyendo al menos uno de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 sobre la estimulación de receptores de células T se determina como en el ejemplo 3. Se estimulan células en cultivos sobre placas recubiertas previamente con un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD3 y se determina el número de células metabólicamente activas (es decir, proliferación celular) usando tinción de MTS después de 3 a 7 días de cultivo. Se usa detección de anticuerpo monoclonal frente a CD3 en fase sólida como medición de la proliferación de células T. Por tanto, se identifican péptidos de albúmina que inhiben la estimulación de receptores de células T.
Ejemplo 22: Efecto de péptidos de albúmina sobre la citotoxicidad de células NK
El efecto de péptidos de albúmina incluyendo al menos uno de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 sobre la citotoxicidad de células NK se determina como en el ejemplo 4.
Se separan células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll-paque Plus (Pharmacia AB, Suecia) convencional a partir de sangre heparinizada obtenida de donantes sanos. Entonces se somete a prueba la actividad citotóxica de células NK de las células mononucleares usando un kit comercial (NKTEST, Orpegen Pharma GmblI, Heidelberg, Alemania) siguiendo el protocolo de los fabricantes. En resumen, el kit contiene células diana sensibles a NK, crioconservadas (K562) marcadas con un colorante de membrana fluorescente verde lipófilo, que permite la discriminación de células diana y efectoras. Tras la incubación con células efectoras, se identifican células diana destruidas mediante una tinción de ADN, que penetra en y tiñe específicamente los núcleos de células diana muertas. De este modo, puede determinarse el porcentaje de dianas destruidas mediante citometría de flujo. Las células mononucleares se preincubaron durante 30 min a 37°C con los péptidos indicados (los péptidos se han descrito anteriormente) a 10 ug/ml. Entonces se añadieron células diana, dando una razón de efector:diana de 40: 1, y se incubó la mezcla de células a 37°C durante 3-4 horas. Se analizaron las muestras en un instrumento FACSCalibur (BD Biosciences, San José, Calif.).
Por tanto, se identifican péptidos de albúmina que inhiben la citotoxicidad de células NK.
Ejemplo 23: Efecto de péptidos de albúmina sobre la diseminación de leucocitos
El efecto de péptidos de albúmina incluyendo al menos uno SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 sobre la diseminación de leucocitos se determina como en el ejemplo 5. Se preparan células de capa leucocitaria a partir de sangre heparinizada mediante sedimentación asistida por dextrano. Para someter a prueba los efectos de cada péptido, se tratan muestras de células con uno de los péptidos de (SEQ ID NO: 183-185 o 188-246) a una concentración de 10 |ig/ml durante 15 minutos inhibió eficazmente la diseminación. Estas células se lavan entonces dos veces en PBS y se transfieren a portaobjetos limpios. Se detecta la adherencia de las células a la superficie de vidrio y la diseminación.
Por tanto, se identifican péptidos de albúmina que inhiben la diseminación de leucocitos.
Ejemplo 24: Efecto de péptidos de albúmina sobre la migración de células inmunitarias
El efecto de péptidos de albúmina incluyendo al menos uno de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 sobre la migración de células inmunitarias se determina como en el ejemplo 5. Se estudia la migración de PBMC usando la técnica de cámara de Boyden. La migración para PBMC de muestras de control sanas y pacientes con cáncer se evalúa tanto en presencia como en ausencia de cada uno de los péptidos de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246. Por tanto, se identifican péptidos de albúmina que inhiben la migración de células inmunitarias.
Ejemplo 25: Unión de péptidos de albúmina a LFA-1
La unión de péptidos de albúmina incluyendo al menos uno de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 a LFA-1 se determina como en el ejemplo 7. Se realiza un procedimiento de tinción inmunohistoquímica convencional usando fijación con acetona, suero Ab humano al 1 0 % para bloquear, incubación con anticuerpo anti-LFA-1 y un anticuerpo secundario (Ultravision) seguido por desarrollo con Fast Red. La preincubación con péptidos añadidos al suero AB es o bien sin péptido añadido, o se añade un péptido de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246.
Los péptidos que se unen a LFA-1 impiden la unión del anticuerpo, disminuyendo por tanto la cantidad de tinción de Fast Red en células tratadas con anticuerpo en comparación con muestras de control no tratadas.
Ejemplo 26: Anticuerpos que se unen a péptidos de albúmina
Se generan anticuerpos que se unen específicamente a péptidos incluyendo al menos uno de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 como en el ejemplo 9. Se generan antisueros de conejo dirigidos contra cada uno de los péptidos de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246. Cada péptido de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 se sintetiza con una cisteína añadida al extremo N-terminal y luego se conjuga con hemocianina de lapa californiana (KLH) como proteína portadora. Se generan antisueros policlonales mediante inmunizaciones repetidas de conejos con P3028 conjugado con KLH y adyuvantes de Freund. Los antisueros se purifican por afinidad mediante cromatografía sobre geles de yodoacetilo Ultralink conjugados con P3028 (Pierce Biotechnology Inc.).
Los antisueros se someten a prueba para determinar su capacidad para unirse a suero humano y dHSA. Se somete a prueba suero humano comercialmente disponible para fines terapéuticos, calentado 10 veces con el fin de que esté libre de virus. Por tanto, los antisueros de conejo que se unen específicamente al péptido de albúmina se unen a dHSA y/o HSA de muestra de control.
La unión del antisuero de conejo a péptidos de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 se somete a ensayo usando ensayo ELISA de competición.
Los efectos de anticuerpos purificados por afinidad dirigidos contra SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 sobre la respuesta proliferativa a IL-2 se examinan en el modelo ex vivo, usando PBMC de pacientes con cáncer inmunosuprimidos y muestras de control normales.
Por tanto, se identifican anticuerpos que se unen a péptidos de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246.
Ejemplo 27: Péptidos que se unen a péptidos derivados de albúmina
Se identifican péptidos que se unen a péptidos incluyendo al menos uno de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 como en el ejemplo 10. Se sintetizan posibles agentes de unión de los péptidos. Para cada péptido de SEQ ID NO: 183­ 185 o 188-246, se pone en contacto un péptido etiquetado con His con los posibles agentes de unión en disolución, y luego se aísla de la disolución usando la etiqueta de His. Se aíslan agentes de unión de cada péptido junto con el péptido, y posteriormente se identifican.
Adicionalmente, se identifican sustituciones, truncamientos y deleciones de péptidos que se unen a cada uno de los péptidos de albúmina como en el ejemplo 12. Se sintetizan sustituciones, truncamientos y deleciones sobre un chip, y se ponen en contacto con el péptido de albúmina de uno de SEQ ID NO: 183-185 o 188-246 para determinar la unión. La cantidad de péptido unido se cuantifica usando un ensayo de rampo como en el ejemplo 12. Se aíslan los agentes de unión con las puntuaciones de rampo más altas.
Los agentes de unión con la puntuación más alta de cada péptido se evalúan para determinar su capacidad para reducir la inmunosupresión, como en los ejemplos 13 y 15. Cada agente de unión se evalúa para determinar su capacidad para inducir activación de linfocitos y desbloquear el receptor de LFA-1. Adicionalmente, cada agente de unión se evalúa para unirse a células tumorales, como en el ejemplo 14.
Ejemplo 28: Efecto de P28R sobre el metabolismo mitocondrial y la conversión de MTS
PBMC de ocho muestras de control sanas y nueve pacientes con cáncer con diversos diagnósticos (incluyendo cáncer de células renales, melanoma maligno, cáncer rectal, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (adenocarcinoma), carcinoma de células escamosas, cáncer de vejiga, osteosarcoma, cáncer pancreático o cáncer bronquial) se cultivaron en una versión modificada del modelo ex vivo el ejemplo 2 durante siete días en presencia de diversas cantidades de P28R (SEQ ID NO: 2), y las muestras de control no se trataron con P28R. Tal como se muestra en las figuras 33A y 33B, se cultivaron las células en o bien sin P28R 322, 5 |ig/ml 324, 10 |ig/ml 326 o 20|ig/ml 328 de P28R. Se observó una estimulación dependiente de la dosis del metabolismo mitocondrial medida como conversión de MTS en 5/8 (véase la figura 33A) muestras de control y 9/9 pacientes con cáncer (véase la figura 33B). Se obtuvieron resultados similares cuando las PBMC se cultivaron durante solo tres días.
Ejemplo 29: Efectos de inhibidores de péptidos inmunorreguladores sobre el metabolismo mitocondrial y la conversión de MTS
Se comparó el efecto de P28R (SEQ ID NO: 2) sobre el metabolismo mitocondrial basándose en la conversión de MTS con el efecto de un péptido estrechamente relacionado, P27. P27 (también conocido como “SCF 27”) tiene la secuencia KKLDTFFKKlSlFTER (SEQ ID NO: 264), y es una variante de P28R que difiere en que V8 de P28R se sustituye a K8 en P27. P28R se une a P3028 más eficazmente que P27 (P27 se une a P3028 con una puntuación de rampo de 253, mientras que una muestra de control de P28R se une a P3028 con una puntuación de rampo de 308; véase el ejemplo 12).
Se cultivaron PBMC de pacientes con cáncer con diversos diagnósticos en una versión modificada del modelo ex vivo del ejemplo 2 con diversas concentraciones de P28R o P27 (N=9 para P28R: N= 8 para P27). Las concentraciones fueron o bien muestras de control no tratadas, 5 |ig/ml (“SCF28-R5” y “SCF275”), 10 |ig/ml (“SCF28-R10” y “SCF2710”), 20 |ig/ml (“SCF28-R20” y “SCF2720”) o bien 40 |ig/ml (“SCF28-R40” y “SCF2740”). Los resultados se muestran en la figura 34. Mientras que P28R estimuló las células de pacientes con cáncer de una manera dependiente de la dosis, P27 no tuvo efecto.
Ejemplo 30: Efecto de P28R sobre la proliferación inducida por IL-2 (incorporación de BrdU)
El efecto de P28R (SEQ ID NO: 2) sobre la proliferación inducida por IL-2 se midió en un ensayo de incorporación de BrdU. Se recogieron PBMC de seis muestras de control sanas y diez pacientes con cáncer (incluyendo cáncer de células renales, melanoma maligno, cáncer rectal, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (adenocarcinoma), carcinoma de células escamosas, cáncer de vejiga, osteosarcoma, cáncer pancreático o cáncer bronquial) en una versión modificada del modelo ex vivo del ejemplo 2. Se añadieron cien pI de medio de cultivo (modificación de Dutch de RPMI 1640 (Gibco, InVitrogenAB, Estocolmo, Suecia) suplementado con penicilina 200 UI/ml, estreptomicina 200 ul/ml, L-glutamina 4 mM (todos Sigma Chemical Co. MO, Ee .UU.) y suero humano inactivado con calor al 20%) a placas de cultivo tisular de 96 pocillos de fondo redondo (Costar, Corning Inc. NY, EE.UU.). Entonces se añadieron cien pI de PBMC en RPMI/HAS al 2% (5x104 linfocitos) por pocillo seguido por IL-2 (Proleukin, Chiron, NL) a una concentración final de 120 UI/pocillo. Se establecieron en paralelo pocillos de muestras de control sin IL-2. Se cultivaron las células durante 7 días en una atmósfera del 5% de CO2 humidificada a 37° C. Se sometió a ensayo la proliferación celular mediante incorporación de BrdU.
Tal como se muestra en la figura 35, cuatro de seis muestras de control tenían una alta respuesta proliferativa a IL-2 en comparación con cuatro de diez pacientes con cáncer. Estas diferencias en la respuesta proliferativa a IL-2 en PBMC demostraron la existencia de diferencias de pacientes con alta y baja respuesta a IL-2.
Se comparó la respuesta de pacientes con alta respuesta y baja respuesta a diversas dosis de P28R. Se cultivaron células de o bien pacientes con alta respuesta o bien pacientes con baja respuesta durante 7 días con o bien sin P28R, 5 |ig/ml, 10 |ig/ml o bien 20 |ig/ml de P28R. Se midió la proliferación inducida por IL-2 como incorporación de BrdU, como en el ejemplo anterior, y los resultados se muestran para pacientes con alta respuesta en la figura 36A y pacientes con baja respuesta en la figura 36B. Mientras que P28R no tuvo efecto estimulador en células de pacientes con una alta respuesta a IL-2 (N=4) (véase la figura 36A), P28R tuvo un efecto estimulador sobre células de pacientes con una baja respuesta a IL-2 (N=6) (véase la figura 36B).
Ejemplo 31: Efectos de inhibidores de péptidos inmunorreguladores sobre la proliferación inducida por IL-2 (incorporación de BrdU y conversión de MTS)
Se comparó el efecto de P27, un péptido relacionado con P28R, con el efecto de P28R sobre la proliferación inducida por IL-2 tal como se mide mediante Incorporación de BrdU. P27 (también conocido como “SCF 27”) tiene la secuencia KKLDTFFKKLSLFTER (SEQ ID NO: 2 6 4 ), y es una variante de P28R que difiere en que V8 de P2 8 R se sustituye a K8 en P27. P28R se une a P3028 más eficazmente que P27 (P27 se une a P3028 con una puntuación de rampo de 253, mientras que una muestra de control de P28R se une a P3028 con una puntuación de rampo de 308; véase el ejemplo 12).
Se cultivaron PBMC de pacientes con cáncer con baja respuesta del ejemplo 30 como en el ejemplo 30, excepto porque algunas muestras se cultivaron con diversas concentraciones de P28R (también conocido como “SCF28-R”), y otras se cultivaron con diversas concentraciones de P27 (también conocido como “SCF27”). Las concentraciones fueron o bien sin péptido (“células no tratadas”), 5 |ig/ml, 10 |ig/ml o 20 |ig/ml. Se midió la incorporación de BrdU como en el ejemplo 30. Tal como se muestra en la figura 37, tanto P28R como P27 potenciaron la tasa proliferativa de PBMC inducidas por IL-2. Puede trazarse una comparación con los datos del ejemplo 29 y la figura 34, en los que P28R, pero no P27, potenció la estimulación por IL-2 del metabolismo mitocondrial, tal como se mide mediante la conversión de MTS. Se observó que P27 potencia la estimulación por IL-2 de la proliferación celular tal como se mide mediante la incorporación de BrdU, pero no el metabolismo mitocondrial tal como se mide mediante la conversión de MTS. Por otro lado, se observó que P28R potencia ambos parámetros. El péptido inhibidor P3028 se une a diferentes receptores, incluyendo CD25 (véase el ejemplo 8 y las figuras 18-19) y LFA-1 (véase el ejemplo 7 y las figuras 15-16), tal como se describe en el presente documento. Se contempla que el agente de unión más eficaz de P3028, P28R, sea capaz de eliminar P3028 de LFA-1 y/o desbloquear CD25. Sin embargo, se contempla que P27, con una unión inferior/más débil a P3028, no tenga la capacidad de desbloquear LFA-1 pero pueda desbloquear CD25. Por tanto, se contempla que diferentes poblaciones de pacientes puedan verse afectadas de diferentes modos por péptidos inmunorreguladores tales como P3028. Además, se contempla que diferentes inhibidores de péptidos inmunorreguladores puedan modular la actividad de diferentes receptores y/o diferentes rutas de transducción de señales.
Ejemplo 32: Comparación de ensayos de MTS y BrdU
Los dos ensayos de proliferación celular en este estudio se usan ambos ampliamente con el fin de medir la proliferación celular. El péptido P28R tuvo una actividad estimuladora de la conversión de MTS en cultivos de siete días de PBMC en 9/9 pacientes y en 5/8 muestras de control sanas. En cambio, P28R estimuló la incorporación de BrdU en cultivos de siete días de PBMC de solo 1/6 y 2/10 pacientes.
La proliferación inducida por IL-2, medida como incorporación de BrdU, se estimuló por P28R en cultivos de PBMC de pacientes con cáncer con una baja respuesta proliferativa a IL-2 (las condiciones experimentales eran tal como se describe en el ejemplo 30). PBMC de 2/3 muestras de control sanas y 2/4 pacientes con cáncer no se estimularon por IL-2 cuando se midió el efecto como conversión de MTS (las condiciones experimentales fueron tal como se describe en el ejemplo 28). Sin embargo, las PBMC de todas estas personas (“pacientes que no responden”) que no respondieron cuando se midieron con MTS se estimularon significativamente mediante IL-2 cuando el efecto se midió como incorporación de BrdU.
Los resultados anteriores se ilustran en la figura 38. Cultivos de PBMC de dos pacientes diferentes (A, B) y (C, D), con IL-2 382 (barras a la izquierda) o sin IL-2 384 (barras a la derecha). El efecto de IL-2 y los péptidos P28R (también conocido como “SCR28R”) y P27 (también conocido como “SCF27”) se midió a concentraciones de o bien sin péptido (“células no tratadas”), 5 |ig/ml, 10 |ig/m o 20 |ig/ml de péptido.
En dos pacientes, la respuesta a IL-2, medida como incorporación de BrdU, se potenció por P28R (véanse las figuras 38A y 38C), pero este efecto de P28R solo se observó en uno de estos pacientes cuando se usó la conversión de MTS (véase la figura 38B). Por tanto, mientras que en un paciente (véanse las figuras 38A y 38B) la actividad estimuladora de IL-2 se registró usando tanto BrdU como MTS, en el otro paciente, la actividad estimuladora de IL-2 se registró usando BrdU solo (véase la figura 38C). Basándose en estas observaciones, se concluye que los efectos sobre la actividad metabólica medida como conversión de MTS no siempre se correlacionan con la síntesis de ADN medida como incorporación de BrdU.
Adicionalmente, P28R potenció el efecto de IL-2 medido tanto con BrdU como MTS, pero el efecto estimulador de SCF27 se observó solo cuando se mide la incorporación de BrdU. En el paciente mostrado en C, los resultados son muy similares a los mostrados en A, pero en D no se observa efecto estimulador cuando el efecto se determina usando la conversión de MTS.
Estos resultados indican que estructuras inmunomoduladoras derivadas de albúmina tales como P3028 parecen modular la transducción de señales a través de diferentes mecanismos. Por tanto, diferentes poblaciones de pacientes pueden responder de manera diferente a inhibidores de péptidos inmunomoduladores. Se contempla que ensayos de diagnóstico in vitro puedan ser útiles en la identificación de qué pacientes tienen estructuras inmunomoduladoras derivadas de albúmina, y puedan ser útiles en la identificación de qué pacientes responderán a determinados inhibidores (o combinaciones de inhibidores) de estructuras inmunomoduladoras.
Ejemplo 33: Efectos de agentes de unión de péptidos inmunorreguladores sobre la activación de linfocitos Agentes de unión de péptidos inmunorreguladores, por ejemplo, los péptidos de las tablas 5.1, 6.1, 6.2 o 12 (SEQ ID NO: 1-32, 265-393), o SEQ ID NO: 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98 o 264, se someten a ensayo para determinar sus efectos sobre la activación de linfocitos, como en el ejemplo 13. Se realizan análisis de estos péptidos en modelos ex vivo humanos. La actividad estimuladora sobre PBMC, medida usando las técnicas de MTS o CFSE, se estudia en 7 muestras de control sanas y 7 pacientes con cáncer de diversos diagnósticos. Los péptidos se someten a ensayo para determinar su actividad estimuladora incluso en ausencia de otros tipos de estimulación, y se comparan con muestras de control no tratadas.
Actividad estimuladora de los péptidos de las tablas 5.1, 6.1, 6.2 o 12 (SEQ ID NO: 1-32, 265-393), o SEQ ID NO: 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98 o 264 sobre una respuesta proliferativa a IL-2 suprimida por una secuencia o estructura de P3028. Se cultivan PBMC durante 7 días con IL-2 y se determina la tasa proliferativa como incorporación de BrdU. Cada conjunto de condiciones se somete a ensayo por triplicado. Se compara la proliferación inicial de PBMC con la proliferación de PBMC del mismo donante tras el tratamiento con cada péptido.
Ejemplo 34: Unión de inhibidores de péptidos inmunorreguladores a células tumorales
Una versión biotinilada de cada uno de los péptidos P28R de las tablas 5.1, 6.1, 6.2 o 12 (SEQ ID NO: 1-32, 265­ 393), o SEQ ID NO: 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 7 6 , 94-96, 98 o 264, cada uno de los cuales se ha mostrado que se une a P3028, se usa para someter a ensayo la unión del péptido a células tumorales. Se analizan cinco cánceres de mama, dos carcinomas de células renales y cuatro melanomas malignos, como en el ejemplo 14.
Ejemplo 35: Desbloqueo del receptor de LFA-1 por inhibidores de péptidos inmunorreguladores
Tal como se describe en el presente documento, las integrinas p2 desempeñan un papel en la función normal del sistema inmunitario. También se describen en el presente documento mecanismos inmunosupresores basados en la unión de un inhibidor endógeno, P3028, a la integrina p2 LFA-1. Tal como se describe en el ejemplo 7, la tinción de membrana de PBMC de pacientes con cáncer disminuye notablemente en comparación con muestras de control normales. Sin embargo, la exposición de LFA-1 podría potenciarse incubando PBMC de pacientes con cáncer con un anticuerpo dirigido contra el inhibidor P3028 (véase el ejemplo 7 y la figura 16).
La tinción para LFA-1 se realiza con el anticuerpo anti-LFA-1 del ejemplo 7 y un anticuerpo secundario (Ultravision) seguido por desarrollo con Fast Red. Se incuban secciones tumorales congeladas frescas sin ninguna fijación durante 4-20 horas con cada uno de los péptidos P28R de las tablas 5.1,6.1,6.2 o 12 (SEQ ID NO: 1-32, 265-393), o SEQ ID NO: 34, 46-53, 64-66, 6 8 , 76, 94-96, 98 o 264, cada uno de los cuales se ha mostrado que se une a P3028, antes de la tinción para LFA-1. Para comparación, se incubaron secciones tumorales de muestras de control con solución salina tamponada con fosfato solo. Se observa la cantidad de tinción de anticuerpo anti-LFA-1 , y se usa para determinar la cantidad de bloqueo, si lo hay, del receptor de LFA-1. También está en marcha la migración y actividad citotóxica de células tratadas.
Ejemplo 36: Barridos posicionales de residuos de aminoácido en SEQ ID NO: 2
Se usaron datos de barridos posicionales para estudiar la influencia de la sustitución de diferentes tipos de aminoácidos en cada posición de P28R (SEQ ID NO: 2) sobre la unión de P3028 (SEQ ID NO: 185). Cada aminoácido en la secuencia peptídica de P28R (SEQ ID NO: 2) se intercambió por todos los aminoácidos que se producen de manera natural, y se inmovilizó sobre un chip en fase sólida. La unión de P3028 a estos péptidos P28R “mutados” sintetizados sobre un chip se determinó usando la técnica de ELISA. Los resultados se resumen en la tabla 13. En vista de los resultados, la tabla 13 incluye una columna que identifica sustituciones opcionales en cada posición que pueden mantener la unión a P3028.
Tabla 13: Análisis de la unión de P3028 a variantes de P28R en fase sólida
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*Se indica que M tiene un átomo de azufre en la cadena lateral, y sin querer restringirse a la teoría, se contempla que la sustitución de M solo en las posiciones 8 , 9 y/o 15 pueda dar como resultado una unión reducida del péptido inhibidor a P3028.
Se indica que las siguientes categorías de residuos de aminoácido en las siguientes posiciones es probable que estén implicadas en la unión de P3028 a P28R (algunas “posibles” sustituciones adicionales se indican en la tabla 13):
K2 aminoácidos cargados positivamente
T5 aminoácidos polares no cargados
F6 hidrófobos y polares no cargados
F7 hidrófobos y polares no cargados
V8 aminoácidos de cadena de carbono no aromática, hidrófobos
K9 aminoácidos cargados positivamente
S11 aminoácidos polares no cargados
E15 aminoácidos cargados negativamente
Por tanto, en algunos ejemplos, un núcleo central, T5-S11, y dos aminoácidos adicionales, K2 y E15, se identifica que están implicados en la unión del péptido P3028.
A partir de los datos de barridos posicionales también se indica que puede identificarse un “péptido núcleo”, FFVKLS (SEQ ID NO: 62) (también denominado en el presente documento “núcleo P28”), que se une al péptido 3028 tan eficazmente como el péptido de longitud completa P28R. Sin embargo, el péptido núcleo P28 no estimula la activación de PBMC (CD69 y CD71) en cultivos a corto plazo de este modelo, mientras que el péptido P28R sí estimula la activación de PBMC en cultivos a corto plazo de este modelo.
Sin embargo, en cultivos con sueros de cáncer humanos y de perro, el núcleo P28 tiene una actividad estimuladora. Como tal, sin querer restringirse a la teoría, se contempla que el núcleo P28 pueda ser útil en el desbloqueo de los efectos inhibidores de P3028 (por ejemplo, desplazando estructuras de 3028 unidas de los receptores celulares). Por ejemplo, en algunos ejemplos, el núcleo P28 puede ser útil en el desbloqueo de la inhibición mediada por P3028 del receptor de LFA-1.
Basándose en los datos de barridos posicionales, se contempla que sustituciones de SEQ ID NO: 2 puedan ser útiles en la unión a P3028, el desbloqueo del receptor de LFA-1 de la inhibición mediada por P3028 y/o la estimulación de células inmunitarias.
Ejemplo 37: Efecto de péptidos modificados sobre la activación de PBMC
Se estudió la actividad del péptido P28R (SEQ ID NO: 2) y modificaciones de P28R en un modelo ex vivo humano usando PBMC en cultivos a corto plazo, 24 o 48 horas. Se estudiaron los efectos de P28R y modificaciones de P28R sobre PBMC de una persona de control sana. Se midió la activación como el porcentaje de células con marcador CD69 potenciado usando citometría de flujo. Se incubaron PBMC con los péptidos (40 |ig/ml) durante 24 horas en RPMI más suero AB humano al 10%.
Se estudió la influencia de diversas sustituciones de aminoácido sobre el efecto estimulador (medido como expresión de CD69) en este modelo ex vivo. Se evaluaron los efectos estimuladores de P28R y sustituciones de aminoácido que presentan una buena capacidad de unión según el barrido posicional. Se examinaron P28R (KKLDTFFVKLSLFTER) (SEQ ID NO: 2), péptido 30677 (KKLDTFFVKLSLMTER) (SEQ ID NO: 583), péptido 30678 (KKLDTFFVKLQLFTER) (SEQ ID NO: 584) y péptido 30680 (KKLDTVMVKLQLMTER) (SEQ ID NO: 585) (véase la figura 41A). La figura 41A ilustra los resultados de dos experimentos (410 y 412) para cada péptido. Los cuatro péptidos indujeron la activación de PBMC de la persona de control sana.
Se examinaron P28R (SEQ ID NO: 2), péptido 30864 (KSLDTFFVKLSLFTER, SEQ ID NO: 586); péptido 30685 (KKLDTFFVKLSLFTFR, SEQ ID NO: 587); péptido 31135 (KKLDTFFVILSLFTER) (SEQ ID NO: 588); péptido 31136 (KKLDTFFVNLSLFTER) (SEQ ID NO: 589) y péptido 31138 (KKLDTFFVDLSLFTER) (SEQ ID NO: 590) (véase la figura 41B). La figura 41B muestra dos experimentos (414 y 416) para cada péptido. El péptido 31135 también estimuló células inmunitarias. Por consiguiente, además de los análisis de la tabla 13, la tirosina también puede sustituirse en la posición 9 de SEQ ID NO: 2 según algunos ejemplos en el presente documento.
Estos resultados muestran un acuerdo general con los datos de los análisis basados en el barrido posicional en la tabla 13 (véase el ejemplo 36). Sin querer restringirse a la teoría, algunas diferencias entre los datos de barridos posicionales y los datos de estimulación de células inmunitarias no son inconsistentes con la divulgación en el presente documento. Se indica que la tabla 13 se refiere a la capacidad de unión a P3028 en un ensayo ELISA, mientras que las figuras 41A-B se refieren a un ensayo para la activación de PBMC. En algunos ejemplos, un péptido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en SEQ ID NO 2 o 583-585 estimula a células inmunitarias sanas, por ejemplo, PBMC.
Ejemplo 38: Efecto del péptido de núcleo P28 sobre la activación de PBMC
Tal como se observa en el ejemplo 37, P28R (SEQ ID NO: 2) puede estimular PBMC de controles sanos en cultivos a corto plazo cuando se usa RPMI más suero AB humano normal al 10% como medio de cultivo. También se evaluaron truncamientos de P28R para determinar su capacidad para activar PBMC. Se incubaron PBMC con los péptidos (40 |ig/ml) durante 24 horas en RPMI más suero AB humano al 10%. La activación de PBMC se midió como porcentaje de células con expresión potenciada de o bien CD69 (figura 42A) o bien CD71 (figura 42B) usando citometría de flujo. Se realizaron dos experimentos para cada péptido.
Tal como se muestra en las figuras 42A y 42B, el péptido P28R (SEQ ID NO: 2) activó eficazmente PBMC sanas en este modelo, pero el péptido 32251 (SEQ ID NO: 592) y el péptido 32230 (“núcleo P28”) (FFVKLS) (SEQ ID NO: 62) no activaron PBMC sanas en este modelo.
Sin embargo, en cultivos de PBMC donde el suero AB humano normal en el medio de cultivo se sustituyó por sueros de perros con cáncer o pacientes humanos con cáncer, P28R (SEQ ID NO: 2) y núcleo P28 (péptido 32230 (FFVKLS) (SEQ ID NO: 62) activaron cada uno PBMC, medido como expresión potenciada de CD69 (véase la figura 43). La figura 43 muestra una comparación entre el péptido P28R de longitud completa (SEQ ID NO: 2) y la secuencia de núcleo P28 de 6 aminoácidos (péptido 32230) (FFVKLS) (SEQ ID NO: 6 2 ) en medio de cultivo que contiene sueros de dos pacientes con cáncer diferentes (suero ca humano1 430 y suero ca humano 2432). Tanto P28R (SEQ ID NO: 2) como núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) activaron PBMC en presencia de suero de cáncer.
Además, se ha demostrado que P28R biotinilado se une directamente a las PBMC tal como se demuestra por inmunocitoquímica o formación de rosetas de perlas recubiertas con P28R (unión de perlas a las células).
Tomados conjuntamente, estos resultados muestran que P28R (SEQ ID NO: 2) puede unirse a P3028 y desbloquear los receptores celulares y también puede tener una actividad estimuladora directa sobre células inmunes. Además, núcleo P28 (SEQ ID NO: 62) puede unirse a P3028 y desbloquear receptores celulares.
Ejemplo 39: Actividad citotóxica de P28R
Se estudió adicionalmente el efecto de P28R (SEQ ID NO: 2) en modelos in vivo en ratones desnudos e inmunocompetentes. La inyección de P28R por vía intratumoral en cáncer de páncreas humano en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos demostró una capacidad para inducir apoptosis de células tumorales después de un día. Las figuras 44A y 44B muestran tinción inmunohistoquímica para caspasa 3 (440), indicando una apoptosis en curso) con una activación significativamente potenciada de esta enzima en tumores tratados con P28R (figura 44A) en comparación con tumores que se trataron solo con el disolvente del fármaco (figura 44B). También se indica una ausencia de tinción 442. Se observa que los resultados mostrados se obtuvieron solo un día después de la administración de P28R en animales sin capacidad de formar una reactividad inmunitaria al tumor.
Como tal, la administración intratumoral de P28R a puede tener una acción citotóxica sobre células tumorales de acuerdo con algunos ejemplos en el presente documento. En algunos ejemplos, P28R tiene una acción citotóxica directa sobre células tumorales.
Ejemplo 40: Actividad terapéutica de P28R
Se estudió la capacidad de P28R (SEQ ID NO: 2) para activar el sistema inmunitario y, de ese modo, inducir lisis de células tumorales, en ratones inmunocompetentes, C57Bl, con melanoma B16 inoculado. Se inyectó P28R, 40 microgramos en 100 microlitros, por vía intratumoral y los tumores se extrajeron después de 3 días. Tal como se muestra en la figura 45, las células dominantes en los tumores después de este tratamiento son células inflamatorias, que se identificaron mediante tinción inmunohistoquímica 450 usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-CD45 (figura 45A). Para comparación, se incubó una sección tumoral de control con IgG de conejo a la misma concentración (figura 45B). También se indica una ausencia de tinción 452.
Por consiguiente, se demostró que P28R puede inducir la infiltración de un tumor de melanoma B16 por células inflamatorias. De acuerdo con algunos ejemplos en el presente documento, P28R puede inducir la infiltración de tumores, por ejemplo, melanomas, por células inmunitarias.
Ejemplo 41: Efectos de péptidos modificados sobre la estimulación de células inmunitarias
Se estudió la influencia de diversas sustituciones y adiciones de aminoácidos sobre el efecto inmunoestimulador. Se evaluaron los efectos de péptidos modificados sobre la activación de PBMC de una persona de control sana. La activación se determinó como el porcentaje de células con marcador CD69 o CD71 potenciado usando citometría de flujo. Se incubaron PBMC con los péptidos (40 |ig/ml) durante 48 horas en RPMI más suero AB humano al 10%. Se realizaron dos experimentos (460 y 462 en la figura 46A; 464 y 466 en la figura 46B, respectivamente) para cada péptido. Se sometieron a prueba los péptidos P28R (SEQ ID nO: 2), núcleo P28 (péptido 32230) (SEQ iD NO: 62), 32251 (KKLDTFFPKLSLFTER) (SEQ ID NO: 592), 32814 (RKLDTFFVKLSLFTERRR) (SEQ ID NO: 591), 32815 (KKLDQFFVKLSQHNER) (SEQ ID NO: 595), 32665 (SEQ ID NO: 593) y 32819 (SEQ ID NO: 594).
Tal como se muestra en la figura 46, el péptido 32814 (SEQ ID NO: 591) tuvo un efecto estimulador en cultivos a corto plazo similar al de P28R (SEQ ID NO: 2) (lote CS8040). Por consiguiente, el péptido 32814 (SEQ ID NO: 591) activó PBMC sanas tal como se indica mediante CD69 potenciado (figura 46A) y también por CD71 potenciado (figura 46B).
Ejemplo 42: Usos de diagnóstico
Además de las aplicaciones terapéuticas, también se contemplan aplicaciones de diagnóstico de P28R y truncamientos y modificaciones del mismo. Por ejemplo, puede obtenerse información sobre el estado inmunitario sistémico y local (intratumoral) de los pacientes usando reactivos que comprenden P28R, o un truncamiento o modificación del mismo.
Se contempla que la aparición de estructuras de 3028 inmunoinhibidoras en tumores pueda identificarse mediante tinción inmunohistoquímica usando o bien un anticuerpo dirigido contra P3028 o bien usando P28R marcado (SEQ ID NO: 2) o núcleo P28 (SEQ ID NO: 62), por ejemplo, núcleo P28R biotinilado o P28. La figura 47 muestra dos áreas de un cáncer de mama humano teñido con P28R biotinilado. Se observa tinción 470 en la figura 47B. No se observa tinción en la figura 47A. Se indica una ausencia de tinción 472.
Como tales, las áreas de tumores que comprenden estructuras se P3028 (así como áreas que no comprenden estas estructuras) pueden identificarse usando péptidos marcados de acuerdo con los ejemplos en el presente documento.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Péptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos FFVKLS (SEQ ID NO: 62) que comprende no más de 30 aminoácidos, en el que, si el péptido aislado se pone en contacto con un segundo péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos v Fd EFKPLVEEpQn LIK (SEQ ID NO: 185), el péptido aislado se une específicamente al segundo péptido.
  2. 2. Péptido aislado según la reivindicación 1, en el que el péptido aislado tiene una longitud menor de o igual a 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 o 6 aminoácidos.
  3. 3. Péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el péptido aislado está en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  4. 4. Péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos KKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 2).
  5. 5. Péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el péptido aislado comprende la secuencia de aminoácidos RKLDTFFVKLSLFTERRR (SEQ ID NO: 586).
  6. 6. Péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el péptido aislado consiste en la secuencia de aminoácidos FFVKLS (SEQ ID NO: 62).
  7. 7. Péptido aislado según la reivindicación 4, en el que el péptido aislado consiste en la secuencia de aminoácidos KKLDTFFVKLSLFTER (SEQ ID NO: 2).
  8. 8. Péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el péptido aislado comprende un péptido sintético.
  9. 9. Péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el péptido aislado está unido a un soporte.
  10. 10. Composición que comprende:
    un péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y
    un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  11. 11. Composición según la reivindicación 10, que comprende un tampón seleccionado del grupo que consiste en: Trizma, Bicina, Tricina, MOPS, MOPs O, MOBS, Tris, Hepes, He PBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazol-láctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.
  12. 12. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10-11 para su uso en el tratamiento del cáncer.
  13. 13. Composición para su uso según la reivindicación 12, en la que el cáncer comprende al menos uno de cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de mama, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, melanoma maligno, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas (adenocarcinoma), carcinoma de células escamosas, cáncer de vejiga, osteosarcoma, cáncer bronquial o cáncer de células hematopoyéticas.
  14. 14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 10-11 para su uso en la mejora de la inmunosupresión.
  15. 15. Péptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 10-11 para su uso como medicamento.
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