JP2001503256A

JP2001503256A - レセプター選択的ｂｎｐ

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Publication number: JP2001503256A
Application number: JP51943698A
Authority: JP
Inventors: ジーロウ，デヴィッド; アールショーンフェルト，ジル
Original assignee: ジェネンテック，インコーポレーテッド
Priority date: 1996-10-22
Filing date: 1997-10-09
Publication date: 2001-03-13
Also published as: WO1998017690A1; AU4816497A; EP0939770A1; ZA979060B; CA2269656A1

Abstract

(57)【要約】ＢＮＰに関連する化合物が、ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＣに対して低い結合親和性を示すが、ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡに対して野生型ＢＮＰと同等もしくは改善された親和性を有する。このＢＮＰ関連化合物は、水または電解質のアンバランスと関連した種々の病状の治療または予防における使用に適している。

Description

【発明の詳細な説明】レセプター選択的ＢＮＰ発明の属する技術分野本発明は、哺乳動物においてナトリウム排泄増加性、利尿性および／または血管拡張性活性を備えた化合物に関する。本発明の化合物は、Ｂ型ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）に関する。好ましい実施態様としては、この化合物が、野生型ＢＮＰまたは野生型タイプＡナトリウム排泄増加性ペプチド（ＡＮＰ）と比較してナトリウム排泄増加性ペプチドクリアランスレセプター（ＮＰＲ−Ｃ）に対して低い結合親和性を示し、かつ、有利に強化された能力を備える。また、本発明は、新規化合物を含む薬学的組成物、並びに診断、治療および予防方法におけるそれらの使用にも関する。関連文献の説明３つのナトリウム排泄増加性ペプチド、タイプＡ、タイプＢおよびタイプＣが、血行力学においてある役割を演じることが同定された（Rosenzweig，AおよびS eidman，C.E.，（1992）Annu．Rev．Biochem．60:229-255(1991);Ruskoaho，H．（1992 Pharmacol．Rev．44:479-602）。これらの生物活性ペプチドは、全く別の遺伝子から生じるプロホルモンから誘導される（Steinhelper，M.，（1993）C irc．Res．72:984-992）。遺伝子は組織特異的に発現され（Seilhamerら，（198 9）Biochem．Biophys．Res．Commun．165，650-658）、体循環中に存在する。タイプＡ（ＡＮＰ）およびタイプＢ（ＢＮＰ）ペプチドは心筋層から誘導されるが、タイプＣ（ＣＮＰ）ペプチドは内皮細胞から誘導されると考えられている。生物活性ペプチドはいずれも、各プロホルモンのＣ末端部位から誘導され、それらの１７アミノ酸環構造内に高度の配列相同性を示す。ＡＮＰとＢＮＰの両方は、内分泌器官制御流体および電解質止血としての役割で心臓から放出される主要な心臓のホルモンである。ヒトＢＮＰは、成熟ホルモンとして心房および心室に貯蔵されるが（Hosodoら，（1991）Hypertension 17: 1 152-1156）、ＡＮＰは前駆物質として心臓細胞に貯蔵される。ＢＮＰは、最初にブタの脳から単離されたが（Sudohら，（1988）Nature 332:78-81）、ブタの心臓で合成され、そこから循環系に分泌される（Aburayaら，（1989）Biochem．Bi ophys．Res．Commun．158:360-368）。ブタＢＮＰは２６または３２アミノ酸ポリペプチドとして循環し、ＡＮＰと構造上の相同性を示す（Sudohら，(1988)Nat ure332:78-81）。ヒトＢＮＰ前駆物質をコードするｃＤＮＡ配列、ｈＢＮＰ［１ −１０８］が決定された（Sudohら，（1989）Biochem．Biophys．Res．Commun． 159:1427-1434）。また、ヒトＢＮＰは、ヒト心房から３２アミノ酸ポリペプチドとして単離され、循環形態はヒトＢＮＰ前駆体分子の配列残基［７７−１０８］と同一であった。ナトリウム排泄増加性ペプチドの作用は、細胞性レセプターにこのペプチドが結合することを介して行われる。少なくとも３つの構造上異なる細胞レセプターがある（Changら，（1989）Nature 341:68-72）。ＮＰＲ−Ａ（Chinkersら，（1 990）Nature 338:78-83）およびＮＰＲ−Ｂ（Loweら，（1990）Nucleic Acids R es．18:3412）レセプターは、単一のトランスメンブレンドメインを備えた、約４４０アミノ酸残基の相同な細胞外ドメインを備えている。両方とも、細胞内のグアニル酸シクラーゼおよびチロシンキナーゼ様ドメインを備えている（Chang ら（1989）,上掲）。第３のレセプターＮＰＲ−Ｃの細胞外ドメインは、ＮＰＲ −ＡおよびＮＰＲ−Ｂ細胞外ドメインに相同であるが、未知の機能を備えた３７アミノ酸の細胞内ドメインのみを含む（Fullerら（1988）J．Biol．Chem．263:9 395-9401）。血圧を制御することにおけるこれらのレセプターの役割は明瞭でないが、ＮＰＲ−ＡはＡＮＰおよびＢＮＰの生物学的効果のほとんどの原因であると考えられる（Maack T.，（1992）Annu．Rev．Physiol.，54，11-27）。ＢＮＰは、ナトリウム排泄増加、利尿および低血圧の効果、並びに平滑筋弛緩を含むＡＮＰと類似した末梢および中枢神経系作用を備える（Yoshimuraら，（1 991）Circulation 84：1581-1588;Mukoyamaら，（1991）J．Clin．Invest．87:1 402-1412）。生物活性ペプチドのＮＰＲ−Ａ細胞性レセプターに対する結合は、血管の平滑筋の弛緩による血圧の低減、塩と水の排泄の増大、間隙への血漿水の導入、アルドステロン、アンギオテンシンII、エンドセリン、レニンおよびバソプレシンの放出または作用の阻害を含む多くの作用を引き起こす。通常の細胞外流体量の維持は、腎臓によるナトリウムの排泄（ナトリウム排泄増加）および水の排泄（利尿）に主に依存する。これらは、（１）血漿が糸球体で濾過される速さ（糸球体濾過率、すなわちＧＦＲ）並びに（２）尿細管に沿ってナトリウムが積極的に再吸収される程度（おそらく次に水が受動的に再吸取される）によって主に調べられる。ナトリウム再吸収は、副腎のステロイドホルモンであるアルドステロンによって、あるいは、血圧、ヘマトクリットおよび血漿の粘性によって、そして、種々のナトリウム排泄増加性ファクターまたはホルモンによって部分的に制御される（deBold，A.J.ら，（1981）Life Sciences 28:8 9-94;Garcia R.，（1982）Experientia 38:1071-73;Currie，M.S．ら，（1983） Science 221:71-73;Flynn T.G.ら，（1983）Biochem．Biophys．Res．Commun．1 17:859-865;Currie，M.G．ら，（1984）Science 223:67-69;並びにKangawa，K. ら，（1984）Biochem．Biophys．Res．Commun．118:131-139;Mukoyamaら，（199 1）J．Clin．Invest．87:1402-1412）。低血圧性の制御因子として作用するナトリウム排泄増加性ペプチドの血清半減期が比較的短いこと（Crozier，I.G.ら，（1986）The Lancet II 1242-1245）、並びに、これらのペプチドが、蛋白分解およびＮＰＲ−Ｃによるレセプター仲介性エンドサイトーシスを含むいくつかのメカニズムによって血流から除去されること（Maack（1992）上掲）が知られている。ＡＮＰおよびＢＮＰの両方の半減期が短く、殆どまたは全く経口吸収されないことから、より長く循環し、望ましいin vivo特性を備えたＢＮＰの合成アナログが望まれている。発明の概要本発明は、哺乳動物においてナトリウム排泄増加性、利尿性および／または血管拡張性活性を備えた化合物を提供する。本発明の化合物は、Ｂ型ナトリウム排泄増加性ペプチド（ＢＮＰ）に関し、ＢＮＰと比較してナトリウム排泄増加性ペプチドクリアランスレセプター（ＮＰＲ−Ｃ）に対して低い結合親和性を示す。都合よく、この化合物はＮＰＲ−Ａレセプター親和性とｃＧＭＰ産生の観点において強化された能力を備える。好ましい実施態様では、この化合物並びに関連する組成物が低い投与量の薬学製剤を与える有効なＮＰＲ−Ａレセプター刺激を付与するものである。本発朋の組成物は、ナトリウム排泄増加性、利尿性または血管拡張を含む治療および予防方法、もしくは関連する方法において使用できる。ある実施態様では、本発明の化合物は、野生型ＢＮＰと比較してヒトクリアランスレセプター（ｈＮＰＲ−Ｃ）に対する結合親和性が低減したものである。好ましくは、本発明のこの態様に従って、この化合物が、タイプＡナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターに対して同じか、または増大した親和性を示す。さらに好ましくは、本発明のこの態様に従って、野生型ＢＮＰのアミノ酸残基Ｘａａ１９、Ｘａａ２３、Ｘａａ２４またはＸａａ２５の少なくとも一つが、本発明のＢＮＰ変異体または関連化合物を産生するために、以下に従って選択される。Ｘａａ１９は、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｇｌｙおよびこれらの保存的置換体からなる群から選択される；Ｘａａ２３は、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕおよびこれらの保存的置換体からなる群から選択される；Ｘａａ２４は、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅおよびこれらの保存的置換体からなる群から選択される；並びにＸａａ２５は、Ｇｌｙ、Ａｒｇおよびこれらの保存的置換体からなる群から選択される。さらに好ましい実施態様では、本発明の化合物は以下の式Ｉ［上式において、Ａは、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₆アルカノイル（alkanoyl）、およびＴｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）からなる群から選択され；Ｒ₁は、欠失しているか、あるいは１〜１０の間のアミノ酸からなるペプチド、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−、Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ −Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）からなる群から選択され；Ｘａａ１９は、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＳｅｒからなる群から選択され；Ｘａａ２３は、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＬｅｕからなる群から選択され；Ｘａａ２４は、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅからなる群から選択され；Ｘａａ２５は、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択され；Ｒ₂は、１から６のアミノ酸ペプチドおよびＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ａｒｇ−Ｈｉｓ−（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）からなる群から選択され；かつＢは、ＯＲ₃およびＮＲ₃Ｒ₄から選択され、Ｒ₃およびＲ₄は、独立に、Ｈ、Ｃ₁ −Ｃ₆アルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₂アリールおよびＣ₆−Ｃ₁₂アリール−Ｃ₁−Ｃ₆アルキルから選択される］によって示される。ある実施態様では、本発明の組成物はポリペプチドであり、本発明のポリペプチドをコードする核酸好ましくはＤＮＡを含む組成物を包含する。この態様によれば、本発明は、このＤＮＡ分子に連結される発現調節配列、このＤＮＡ分子を含む発現ベクター、好ましくはプラスミドをさらに包含する。ここで、調節配列とはベクターが形質導入された宿主細胞によって認識されるものであり、宿主細胞とはそのベクターで形質転換されたものである。ある実施態様では、本発明のポリペプチド組成物は、本発明のアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列を合成する工程、適切な宿主において核酸配列を発現することが可能な適切な発現ベクターに核酸配列をリゲーションする工程、核酸配列がリゲーションされた発現ベクターを用いて宿主を形質転換する工程、並びに核酸配列の発現に適した条件下で宿主を培養し、選別された核酸配列によってコードされたタンパク質が宿主によって発現される工程を含む方法によって製造されてもよい。好ましくは、このポリペプチドは宿主細胞培養から回収される。この方法において、リゲーションエ程は、核酸が実施可能に適切な分泌シグナルに連結されるように、適切な発現ベクターに核酸を連結し、それによって宿主からアミノ酸配列が分泌されることをさらに考慮してもよい。本発明は、ここに記載された化合物の治療的適用にまでさらに広げられる。しかして本発明は、薬学的に許容される賦形剤と本発明の化合物とを含む薬学的組成物を含む。これらの化合物を含む薬学的組成物は、水または電解質のアンバランスに関連する種々の病状および特に腎血管性高血圧等の高血圧の処置または予防に用いられる。このような症状は、例えば、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、ネフローゼ症候群および肝硬変、肺病、および腎臓潅流の無効または糸球体ろ過率の低下による腎不全を含む。図面の簡単な説明図１：２９３細胞において発現されたヒトナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡにおけるｃＧＭＰ第二メッセンジャー産生の濃度応答。ｃＧＭＰ産生の最大刺激の半分を与えるナトリウム排泄増加性ペプチドの濃度に対する値が図示されている。値は平均士標準偏差（ｎ＝３）としてプロットされている。この図において、ＡＮＰはKangawaら，Biochem．Biophys．Res．Comm．（1984）118(1) :131-139に報告された２８アミノ酸残基ペプチドを指し：ＢＮＰはＳＥＱＩＤＮＯ：１を指し；ＢＮＰ０２はＳＥＱＩＤＮＯ：２を指し；ＢＮＰＯ４はＳＥＱＩＤＮＯ：７を指し；ＢＮＰ０５はＳＥＱＩＤＮＯ：７を指し、かつＡＮＦ１３１はＳＥＱＩＤＮＯ：５０を指す。この結果は、これらのペプチドが、ＢNPに類似した能力を備え、このレセプターにおける完全なアゴニストであることを示す。図２：２９３細胞において発現されたヒトナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡにおけるｃＧＭＰ第二メッセンジャー産生の刺激。４ｘ１０^-8Ｍにおけるナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＡのナトリウム排泄増加ペプチド刺激に対するｃＧＭＰ値が図中に与えられている。ｃＧＭＰ値は平均±標準偏差（ｎ＝３）としてプロットされている。この図中において、ＡＮＰはKangawaら，B iochem．Biophys．Res．Comm．（1984）118(1):131-139に報告された２８アミノ酸残基ペプチドを指し；ＢＮＰはＳＥＱＩＤＮＯ：１を指し；ＢＮＰ０２はＳＥＱＩＤＮＯ：２を指し；ＢＮＰ０４はＳＥＱＩＤＮＯ：７を指し；ＢＮＰ０５はＳＥＱＩＤＮＯ：７を指し、ＡＮＦ１３１はＳＥＱＩＤＮＯ：５０を指し；ＢＮＰ０６はＳＥＱＩＤＮＯ：４８を指し；かつ、ＢＮＰ０７はＳＥＱＩＤＮＯ：４９を指す。これらの結果は、このペプチドが、ＢＮＰに類似した能力を備え、このレセプターにおける完全なアゴニストであるであることを示す。図３：哺乳動物種のＢＮＰのアミノ酸配列の一致；ヒト（Sudohら，（1989）B iochem Biophy．Res．Commun．159:1427-1434）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、イヌ（Seilhamerら，（1989）Biochem Biophys．Res．Commun 165:650-658）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）、ブタ（Sudoh，T.ら，（1988）Nature 332:78-81）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）、ラット（Kojimaら，（1989）Biophys．Biochem．Re s．Commun．159:1420-1426）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）およびマウス（Ogawa ら，（1994）J．Clin．Invest 93:1911-1921）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）。ギャップ（−）は一致を最大にするために導入された。好ましい実施態様の詳細な説明定義特許請求の範囲および明細書において用いた用語は、他に特記しないかぎり以下のように定義される。ここで用いられるアミノ酸またはアミノ酸残基という用語は、天然に生じたＬ型アミノ酸、または変異体に関しては以下にさらに記載したようにＤ型アミノ酸を指す。通常用いられるアミノ酸の１および３文字省略形がここでも用いられる（Bruce Albertsら，Molecular Biology of the Cell，Garland Publishing，In c.，New York(3rd ed.1994)）。ここで用いられているように、用語“ＢＮＰ”、“タイプＢナトリウム排泄増加性ペプチド”、“野生型ＢＮＰ”等が交換可能に用いられ、天然に生じた哺乳動物ＢＮＰまたは組み換えＢＮＰを指す。哺乳動物種のＢＮＰの配列、例えば、ヒト（Sudohら，（1989）Biochem Biophy．Res．Commun．159:1427-1434）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、イヌ（Seilhamerら，（1989）Biochem Biophys．Res．C omm un 165:650-658）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）、ブタ（Sudoh，T.ら，（1988）N ature 332:78-81）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）、ラット（Kojimaら，（1989）B iophys．Biochem．Res．Commun．159:1420-1426）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）が知られている。用語“ヒトＢＮＰ”、“ｈＢＮＰ”等は、以下の主要なアミノ酸配列を備えた、Sudoh，T.ら，（1988）Nature 332:78-81に報告された３２アミノ酸残基を意味する。この構造の特定の残基の上の整数は、残基の位置番号を定義する。この残基の位置番号は、本発明のＢＮＰ関連化合物において置換がなされた残基を指定するために、３文字アミノ酸表記と共に用いられる。しかして、例えば、アルギニン（Ａｒｇ）が野生型ＢＮＰの残基位置番号１９のセリン（Ｓｅｒ）と置き換わったＢＮＰ関連化合物では、表記“ＢＮＰＳｅｒ１９Ａｒｇ”等が用いられる。多重置換は、各置換を分けるコンマを伴って同じ方法で記載される。しかして、例えば、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびアルギニン（Ａｒｇ）がヒトＢＮＰのアミノ酸２３、２４および２５とそれぞれ置き換わったＢＮＰ関連化合物では、表記“ｈＢＮＰＧｌｙ２３Ｐｈｅ、Ｌｅｕ２４Ｔｒｐ、Ｇｌｙ２５Ａｒｇ”が用いられる。用語“ＢＮＰ変異体”および“ＢＮＰ関連化合物”は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリペプチドと共通の少なくとも定性的な生物学的活性を備え、かつレセプター特異性を与えるために、ここで定義したような少なくとも一つのアミノ酸置換を備えた化合物として定義される。好ましいアミノ酸置換は、実施例１の表１に概説されている。定性的な生物学的活性とは、グアニル酸シクラーゼ結合ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＮＰＲ−Ａを発現する細胞におけるサイクリックＧＭＰ産生を刺激する能力である。このレセプターをコードするｃＤＮＡから推定されるＮＰＲ−Ａレセプターアミノ酸配列が知られている（Chinkersら，（1989）Nature 338:78-83;Loweら（1989）EHBO J.8:1377-1384）。グアニル酸シクラーゼ活性とＡＮＰおよびＢＮＰ結合の両方を与える培養された哺乳動物細胞におけるＮＰＲ−ＡレセプターｃＤＮＡの機能発現も知られている（Chinkers ら，（1989）Nature 338:78-83）。ＮＰＲレセプターに対する結合親和性およびｃＧＭＰ蓄積を測定するためのアッセイシステムが知られている（国際特許出願 PCT/US94/12591を参照）。さらに、好ましい実施態様において、本発明のＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物は、ＮＰＲ−Ａレセプターに結合することについて、野生型ＡＮＰ（Kang awaら，（1984）Biochem．Biophys．Res．Commun．118(1):131-139）またはＢＮＰと競合し、ｃＧＭＰの蓄積を誘発すると考えられる。それゆえ、何らかの理論に限定されることなく、定性的な生物学的活性は、ＮＰＲ−Ａレセプターに結合することについて、野生型ＢＮＰまたはＡＮＰと競合し、ｃＧＭＰの蓄積を誘発する能力として定義されてもよい。上記から認められるように、用語“競合”および“競合しうる能力”は、相対的な用語である。しかして、この用語は、ＢＮＰ変異体の活性を記載するために用いられた場合は、標準的なレセプター結合アッセイにおいて野生型ＢＮＰまたは野生型ＡＮＰに対して１０倍モル濃度過剰に淵加された場合に、野生型ＢＮＰまたは野生型ＡＮＰの結合を少なくとも５０％阻害するＢＮＰ変異体を意味する。好ましくはＢＮＰ変異体は、５倍モル濃度過剰で、また、最も好ましくは少なくとも２倍モル濃度過剰で結合を少なくとも５０％阻害する。本発明の最も好ましいＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物は、野生型ＢＮＰまたは野生型ＡＮＰと１：１の化学量論の比率で存在する場合に、結合を少なくとも５０％阻害する。ｈＮＰＲ−ＣおよびｈＮＰＲ−Ａに対するｈＢＮＰ、ｈＡＮＰおよび本発明の化合物の結合を測定するアッセイシステムとしては、Bennettら，（1991）J．Biol．Chem．266:23060-23067;Cunninghamら，（ 1994）J．EMBO 13:2508-2515;Chinkersら，（1989）Nature 338:78-83およびFul lerら，（1988）J．Biol．Chem．263:9395-9401;Schenk，D．B.,ら，（1985）Bi ochem．Biophys．Res．Comm．127:433-442;Scarborough，R．M.，（1986）J．Bi ol.Chem．261:12960-12964およびＷＯ９０／０１９４０を参照。本発明のＢＮＰ関連化合物またはＢＮＰ変異体の特徴は、ナトリウム排泄増加性クリアランスレセプターＮＰＲ−Ｃに対する親和性が低いことである。それゆえ、本発明の変異体または化合物は、少なくとも野生型ＢＮＰと共通する性質の生物学的活性を備えているが、ここに記載された標準的なレセプター結合アッセイにおいてＢＮＰと比較した場合に、クリアランスレセプターＮＰＲ−Ｃに対する親和性は低い（Bennettら，（1991）J．Biol．Chem．266:23060-23067参照）。本発明のＢＮＰ変異体および化合物は、一般的に、上記定性的な生物学的活性を備えた、in vitroで生成された相同的な変異体を含む、ラット、ブタ、イヌまたは他の哺乳動物のＢＮＰの相同アミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列の相同アミノ酸配列である。本発明のＢＮＰ変異体に関する相同性は、最大の同一性を達成するのに必要であれば、ここで定義したような哺乳動物のＢＮＰのアミノ酸配列または複合配列を並ベてギャップを導入した後に、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸の残基のいずれかと同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される（図３）。候補配列におけるＮ−またはＣ−末端の延長または欠失は、同一性を低減するものとして解釈しない。本発明の“複合アミノ酸”は、ヒトＢＮＰの３２アミノ酸残基構造と同じ位置を有する別のほ乳類の脊椎動物種に由来する可変的なアミノ酸を指す。それゆえ、複合アミノ酸置換と称されるアミノ酸置換は、同定されたアミノ酸を、別の哺乳動物種の等価すなわち複合アミノ酸で置換する。複合ＢＮＰ配列は、野生型配列の少なくとも一つのアミノ酸が別の哺乳動物種の複合アミノ酸で置換されたものと定義される。それゆえ、本発明は、少なくとも上述したような定性的な生物学的活性を備え、かつ例えばＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリペプチドと少なくとも約７５％のアミノ酸相同性を備えるＢＮＰ変異体、または、５つのカルボキシル末端アミノ酸残基および／または９つのアミノ末端残基を欠失するＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリペプチドを考慮する。ＢＮＰ変異体アミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列と好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは８５％以上の配列相同性を有する。しかしながら、ＢＮＰ変異体または関連する化合物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列と５０％末満の配列相同性を示し、かつ上述したＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物の特性を保持しているものでもよい。本発明のＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物の定義には、レセプター特異性を付与し、ここに記載されたものに加えて一つのアミノ酸が別の残基によって置換された、所定の変異（例えば、部位特異的ＰＣＲ変異誘発）を含むＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列変異体；上述のようなＢＮＰの別の哺乳動物種の別の複合アミノ酸置換体、並びに上述およびヒト配列の天然に生じる変異体が含まれる。本発明のこの態様では図３が参照され、そこにはアミノ酸配列データが示されている。ＢＮＰ変異体は、化学的、酵素学的または他の適切な手段によって、天然に生じるアミノ酸以外の分子で置換されることによって修飾された上述したようなＢＮＰ変異体も含まれ、この変異体は上述した定性的な生物学的活性を備えると解される。模範的な非天然産生性アミノ酸置換は、以下に記載されたものを含む。さらに、アミノ酸配列変異体は、Ｌ型よりＤ型のアミノ酸を利用する置換によって生成されうる。これは酵素分解に対する本発明のＢＮＰ変異体の安定化において特に使用できる。このような安定化アミノ酸置換は、ＡＮＰについて記載されている（NuttとVeber，（1987）Endocrin．and Metab．Clin．N．Amer．16(1) :19-41）。適切なところにＤ型アミノ酸を導入することを含むＡＮＰアナログのこのような構造／活性の研究は、ＢＮＰについても行うことができ、ＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物の定義に含まれる。しかして、変異体という用語は、レセプター特異性についてここに記載された置換体に加えて、代謝分解に対して耐性を付与するキラルアミノ酸置換体のようなＢＮＰ分子の安定性を増大させる置換体を含む。本発明は、中性のエンドペプチダーゼ２４．１１（ＥＣ３．４．２４．１１）（ＮＥＰ）およびアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）による加水分解に対する感受性が低減され、能力または作用持続性が改善されたＢＮＰ変異体および関連化合物を含む。例えば、任意にアミド同配体を用いたアミド結合の置換が、ＡＮＰについて証明されている。中性エンドペプチダーゼ２４．１１またはＡＣＥによる加水分解に対する感受性を低減する置換は、酵素学的分解に耐性のＢＮＰ変異体を産生する。方法としては、Ｎ−Ｍｅ−ＰｈｅのようなＮ−アルキル化アミノ酸を用いたアミノ酸の置換、並びにウロジラチン(urodilatin)ペプチド尾部Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）の付加を含む。また、野生型ＢＮＰのＮ末端またはＣ末端の１７成分の環構造において、アミノ酸が付加または欠失したＢＮＰ変異体も、ＢＮＰ変異体と関連化合物の範囲に含まれる。アミノ酸配列挿入物は、１残基から、記載されているようにプレおよびプロアミノ酸配列を含む１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のカルボキシル末端融合物を含む（例えば、Ogawaら，（1994）J．Cl in．Invest．93:1911-1921を参照）。末端挿入物の別の例は、他の哺乳動物種または他のナトリウム排泄増加性ペプチドの複合Ｎ末端またはＣ末端配列を具備するＢＮＰ変異体を含む（図３参照）。このようなアミノ末端置換体が、記載されている（Shimekakeら，（1992）FEBS，309(2):185-189）。適切なＮ末端配列は、国際公開公報ＷＯ８９／１２０６０に記載されており、以下のもの；Ｇｌｙ；ＳｅｒＧｌｙ；Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ；Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３４）；Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−ＳｅΓ− Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３５）；Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３６）；Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ−／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３７）；Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ− Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３８）；およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ／Ｍｅｔ−Ｍｅｔ／Ｖａｌ−Ａｒｇ／Ｈｉｓ／Ｇｌｎ−Ａｓｐ／Ｌｙｓ／Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３９）を含み、ブタ、イヌ、またはヒトＢＮＰの天然の上流配列、またはこれらの複合物に基づいている。模範となるＣ末端挿入物は、国際公開第８９／１２０６９に記載されており、以下のもの；（ＯＨ）、ＮＨまたはＮＲ’Ｒ’’を含み、ここでＲ’およびＲ’ ’は独立してＨ、低級アルキル、またはＡｓｎ／Ｌｙｓ；Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ；Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ；Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４０）；Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４１）；Ａｓｎ／Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ− Ａｒｇ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ（ＳＥＱＩＤＮＯ：４２）；またはこれらのアミド（ＮＨまたはＮＲ'Ｒ''）を含む。記載したように、ある実施態様では、アミノ酸置換変異体は、ＢＮＰ変異分子にレセプター特異性を付与するために、ここに記載されたものに加えて少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、その代わりに異なる残基が挿入されたものである。置換変異の部位は、様々な種のＢＮＰ変異体に見いだされたアミノ酸が、側鎖の体積、チャージおよび／または疎水性に関して実質的に異なる部位を含む。これらのアミノ酸は、模範的な非天然生成アミノ酸を含む、以下に記載された模範的な保存的置換によって置換される。別の関心が、野生型ＢＮＰと様々な種から得られた変異体の特定の残基が同一であることに向けられる。これらの位置はＢＮＰ変異体または関連化合物の生物学的活性に重要かもしれない。これらの部位、特に同一に保存された少なくとも３つの別の部位の配列に含まれる部位は、比較的保存された形式で置換される。このような保存的置換は、好ましい保存的置換の見出しの下に示されている。このような置換が、ここで定義したような定性的な生物学的活性を保存することを示す場合は、以下に模範的な保存的置換と称する、より実質的な変化がなされ、生物学的活性について試験されてもよい。これについて、アミノ酸は、側鎖の体積、チャージおよび／または疎水性に基づいて置換されると解される。アミノ酸残基は、例えば、国際公開第９０／０１９４０に記載されているように、４つの主なグループに分けられ、これに開示されていることは参照としてここに特別に含めることとし、これは以下のグループからなる。酸性：残基が、生理学的なｐＨにおけるＨイオンの欠失により陰性のチャージを備え、この残基を含むペプチドが水溶液中にある場合に、残基がペプチドのコンホメーションにおける表面部を求めるために、残基が水溶液に引きつけられる。塩基性：残基が、生理学的なｐＨにおけるＨイオンの結合により陽性のチャージを備え、この残基を含むペプチドか生理学的なｐＨの水性媒体中にある場合に、残基がペプチドのコンホメーションにおける表面部を求めるために、残基が水溶液に引きつけられる。中性／非極性：この残基は生理学的なｐＨでチャージせず、この残基を含むペプチドが水溶液中にある場合に、残基がペプチドのコンホメーションの内肺を求めるために、残基が水溶液にはじかれる。これらの残基は、“疎水性残基”とも称される。中性／極性：この残基は生理学的なｐＨでチャージしないが、この残基を含むペプチドが水溶液中にある場合に、残基がペプチドのコンホメーションの外部を求めるために、残基が水溶液に引きつけられる。アミノ酸残基は、側鎖基に関して環状または非環状性、芳香または非芳香性としてさらに分類され、これらの名称は当業者に周知である。ここに記載した標準的な固相合成法によって合成されたペプチドは、例えば、アミノ酸を含む置換体の遺伝子によってコードされたアミノ酸に限定されない。遺伝コードによってコードされていない通常見られるアミノ酸は、例えば、国際公開ＷＯ９０／０１９４０に記載されたもの、並びにＧｌｕおよびＡＳＰには２ −アミノアジピン酸（Ａａｄ）；ＧｌｕおよびＡｓｐには２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、および他の脂肪族アミノ酸には２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕおよび他の脂肪族アミノ酸には２−アミノヘプタン酸（aminoheptanoic acid）（Ａｈｅ）；Ｇｌｙには２−アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；ＶａｌおよびＬｅｕおよびＩｌｅにはシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ＡｒｇおよびＬｙｓにはホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉＳには２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇ１ｙ、ＰｒｏおよびＡｌａにはＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇ１ｙ、ＰｒｏおよびＡｌａにはＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；ＡｓｎおよびＧｌｎにはＮ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓにはヒドロキシルリシン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓにはアロヒドロキシルリシン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、ＳｅｒおよびＴｈｒには３−（および４）ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、ＬｅｕおよびＶａｌにはアロイソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａにはρ−アミジノフェニルアラニン：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、およびＡｌａにはＮ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅにはＮ−メチルイソロイシン（Ｍｅｌｌｅ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸にはノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔおよび他の脂肪族アミノ酸にはノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓにはオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎにはシトルリン（ｃｉｔ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；ＰｈｅにはＮ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）フェニルアラニン、トリフルオリル(triflouryl)フェニルアラニンを含む。レセプター特異性についてここに記載された以外のアミノ酸置換体のＢＮＰ変異体のある残基または領域の同定に使用できる方法は、CunninghamとWells（198 9）Science，244:1081-1085に記載されたいわゆるアラニンスキャニング変異誘発である。残基または標的残基のグループが同定され（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＧｌｕのようなチャージした残基）、細胞の内外においてアミノ酸と周辺水性環境との相互作用に影響するように中性または陰性にチャージしたアミノ酸によって置換される。この置換に対して機能的感度を示すドメインは、置換の部位において、さらなるまたは他の変化を導入することによって精製される。しかして、アミノ酸配列変化を導入するための部位が予め決められていたとしても、変異そのものの性質が予め決められている必要はない。例えば、所定の部位における変異の性能を最適化するために、Ａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が標的コドンまたは領域で行われ、発現されたＢＮＰ変異体を所望の活性の最適な組み合わせについて選別してもよい。タンパク質のファージディスプレイまたはペプチドライブラリーは、改良された親和性、変更された特異性、もしくは改良された安定性を備えたＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物を選別するための別の方法を提供する（Smith，G.P.，（1991）Curr．Opin．Biotechnol.2:668-673）。高親和性タンパク、Ｍ１３遺伝子III被覆タンパク（Clackson，T.，（1994）ら，Trends Biotechnol．12:173-1 83）と融合した一価で示されたタンパクは、多くの結合選別の後に、ファスミド粒子に収容された対応するＤＮＡをクローニングおよび配列決定することによって同定され得る。別の挿入ＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物は、例えばβラクタマーゼまたはE coliのTrp座にコードされた酵素のような細菌性ポリペプチドまたは酵母タンパク等の免疫原性ポリペプチドの、ＢＮＰ分子のＮ−またはＣ−末端への融合体、および、イムノグロブリン定常領域または他のイムノグロブリン領域、アルブミンまたはフェリチンのような長い半減期を備えたタンパクとＣ末端との融合体を含み、これらは１９８９年４月６日に公開されたＷＯ８９／０２９２２に記載されている。用語“Ｃ₁−Ｃ₆アルキル”は、ＢＮＰ変異体を記述するために用いられた場合には、分枝状、非分枝状もしくは環状の、特定された炭素原子の数を備える飽和脂助族炭化水素基を意味する。これらのアルキルラジカルの代表的な例は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ −ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２−メチルブチル、２，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、２−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、シコルヘキシル(cycolhexyl)等を含む。用語“低級アルキル”および“Ｃ₁−Ｃ₆ アルキル”は類義語であって、交換可能に用いられる。好ましい“Ｃ₁−Ｃ₆アルキル”基はメチルである。用語“Ｃ₁−Ｃ₆アルカノイル”は、ＢＮＰ変異体を記述するために用いられた場合には、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル(pivaloyl)、カプロイル等の群を含む。用語“Ｃ₆−Ｃ₁₂アリール”は、ＢＮＰ変異体を記述するために用いられた場合には、融合されていると否とに関わらず、設計された数の炭素原子を含む同素環(homocyclic)炭化水素芳香族基を意味する。好ましいアリール基は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、フェナントレニル、ナフタセニル(naphthacenyl)等を含む（例えば、lang's Handbook of Chemistry（Dean，J．A.，ed）13^thed．表7 -2[1985]参照）。用語“Ｃ₆−Ｃ₁₂アリール−Ｃ₁−Ｃ₆アルキル”は、ＢＮＰ変異体を記述するために用いられた場合には、設計された数の炭素原子を有するアルキルラジカルに結合した、設計された数の炭素原子を備えた１、２または３つのアリール基を意味し、ベンジル、ナフチルメチル、フェネチル、ベンジヒドリル(benzyhydryl )（ジフェニルメチル）、フロレニル(florenyl)、トリチル等を含むが、これらに限定されない。好ましいアリールアルキル基はベンジル基である。 “薬学的に許容される塩”は、酸および塩基付加塩の両方を含む。 “薬学的に許容される酸付加塩”は、生物学的効果および遊離塩基の能力を保持する塩を指し、生物学的または別の点で望ましく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、並びに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸(maloneic acid)、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリシクリック酸(salicyclic acid)等の有機酸と共に形成される。 “薬学的に許容される塩基付加塩”は、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩等の無機塩基から誘導されたものを含む。アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が特に好ましい。薬学的に許容される有機非毒性塩基から誘導された塩は、第一級、第二級および第三級アミン、天然に生じる置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン(trimethamin e)、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペリジン(piperizine)、ピペリジン(piperidine)、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等の塩基性イオン交換樹脂の塩類を含む。特に好ましい有機性非毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、コリンおよびカフェインである。レセプター特異的ＢＮＰ変異体および関連化合物本発明に係るＢＮＰ変異体および関連化合物は、野生型ＢＮＰの少なくとも一つのアミノ酸が、ＮＰＲ−Ａレセプター特異性を付与するように、ここに記載されたように置換されている。それゆえ、本発明の好ましい化合物は、ヒトナトリウム排泄増加性ペプチドレセプター−Ａ（ｈＮＰＲ−Ａ）の合成ホルモンアゴニストである。このレセプターは、腎臓、平滑筋、副腎および他の組織において見いだされ（Napier M.A.ら，（1984）Proc．Nat．Acad．Sci．USA，81:5946-5950 ;Horiら，（1985）Biochem．Biophys．Res．Commun．129:773-779;Quirionら，（1986）Proc．Natl．Acad．Sci．83：174-175）、かつ、細胞内のグアニル酸シクラーゼドメインを含む。ｈＮＰＲ−Ａの作用は、ＧＴＰの加水分解によって仲介され、第二メッセンジャーであるｃＧＭＰを産生する。従って、本発明の好ましい化合物は、ｈＮＰＲ−Ａを刺激して、野生型ＢＮＰと少なくとも同じ程度までｃＧＭＰを産生する。しかしながら、本発明の好ましい化合物は、野生型ＢＮＰと同じ程度までヒトナトリウム排泄増加性ペプチドクリアランスレセプターＣ（ｈＮＰＲ−Ｃ）に結合しない。in vitroとin vivoの両方のシステムが、本発明の化合物を同定するために用いられる。ＮＰＲ−Ａ細胞性レセプターへのＢＮＰの結合は、定性的な生物学的活性に必須であると推定されるので、本発明のＢＮＰ関連化合物はＮＰＲ −ＡおよびＮＰＲ−Ｃレセプターに対する候補化合物の結合を選別することによって同定される。それゆえ、本発明の化合物の主な選別は、ラットおよびウサギの大動脈組織における血管緊張低下アッセイ、ひな鳥の直腸の平滑筋組織の弛緩、ラットにおけるナトリウム排泄増加、並びにレセプター特異的結合アッセイおよび細胞培養アッセイにおけるｃＧＭＰ形成を含み、これらは上述もしくは以下の実施例に記載されている。例えば、完全な培養細胞または細胞性レセプターを発現する培養細胞から誘導された膜調製物に結合することについて、ラベルされた本来のＢＮＰと競合するＢＮＰの能力を評価するアッセイが、ＢＮＰの選別のために開発された。例として、LoweとFendly（1992）J．Biol．Chem．267:21691-21697に記載されたように産生されたＮＰＲ−Ａを発現する２９３細胞が利用されてもよい。同様に、ＮＰＲ−ＣのｃＤＮＡ（Loweら，（1990）Nucleic acids Res．18:3412）が連続発現のために適切な宿主細胞に移入されてもよい。これらの競合的な置換アッセイは、レセプターリガンド相互作用を調べるための常套手段と考えられる。特定の細胞性アッセイに応じて、ラジオラベルまたは蛍光ラベルされたＢＮＰが、末標識の候補化合物の濃度を変化させて、固定されたＮＰＲ−ＡまたはＮＰＲ−Ｃレセプター−イムノグロブリンキメラと共にインキュベートされる。増大する濃度の連続する候補化合物は、固定されたレセプターキメラに対するラベルされたＢＮＰの結合を有効に阻害する。最大ＢＮＰの５０％が置換される未標識ペプチドの濃度は、ＥＣ５０と称され、レセプター結合親和性を反映する。それゆえ、１００ｎＭのＥＣ５０を備えた候補化合物は、１０ｎＭのＥＣ５０を備えたペプチドよりもレセプターと実質的に弱い相互作用を示す。上述したように、本発明の範囲のＢＮＰ関連化合物または変異体は、ＮＰＲ− Ｃに対して結合親和性が低く、対応するＮＰＲ−Ａレセプター特異性を有する。それゆえ、本発明によれば、ＮＰＲ−Ｃに対して野生型ＢＮＰよりも大きいＥＣ５０を備えたＢＮＰ変異体は、ＮＰＲ−Ｃレセプターに対して弱い親和性を示し、それゆえクリアランスレセプターに対して低減された親和性を示すと言うことができる。好ましい実施態様では、レセプター特異性は、ＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｃに対する候補化合物の結合親和性の比率に反映される。ＮＰＲ−Ｃと比較したＮＰＲ−Ａに対する候補化合物の結合親和性の比率における変化は、レセプター特異性における変化と称される。本発明のこの態様によれば、同じアッセイで野生型ＢＮＰと比較した場合に、ＮＰＲ−Ｃと比較してＮＰＲ−Ａに対する結合親和性の比率において減少を示すことが、ＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物の一つの特徴である。本発明のこの態様による好ましい化合物および変異体は、野生型ＢＮＰと比較して結合親和性の比率において少なくとも１０倍の低減を示し、さらに好ましくはこの比率において１００倍以上低減を示す。これは、実施例１の表１に記載されている基準に従って野生型ＢＮＰのアミノ酸を置換することによって達成されることが好ましい。従って、残基１９を塩基性アミノ酸、好ましくはＡｒｇ、Ｈａｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎおよびρ−アミジノフェニル−Ａｌａ、最も好ましくはＡｒｇで置換；残基２３を中性、非極性、巨大、芳香族または非芳香族アミノ酸、好ましくはＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ｔ−ＢｕＡ、Ｔ−ＢｕＧＮ、−ＭｅＩｌｅ、ＮｌｅおよびＣｈａ、好ましくはＭｅｔ、ＰｈｅまたはＬｅｕで置換；残基２４を芳香族アミノ酸、好ましくはＰｈｅ、Ｔｒｐ、およびＴｙｒで置換；並びに残基２５を塩基性アミノ酸、好ましくはＡｒｇ、Ｈａｒ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎおよびρ−アミジノフェニル−Ａｌａ、最も好ましくはＡｒｇで置換することにより、ＢＮＰ変異体または関連化合物が得られる。上記置換は、個別または組み合わせて行われてもよい。レセプター特異性を付与する個別の置換の中で好ましいものは、先の段落に記載されているように野生型ＢＮＰのアミノ酸残基１９を置換したＢＮＰ変異体または関連化合物である。レセプター特異性を付与する組み合わせ置換の中で好ましいものは、先の段落中の基準に従って、野生型ＢＮＰのアミノ酸２３，２４および２５のいずれかが置換されたＢＮＰ変異体または関連化合物である。このような好ましい組み合わせ置換体は、先の段落に記載された基準に従って残基１９の置換を伴うものであってもよい。模範的なペプチドを以下に示す：本発明の範囲に含まれるさらなる化合物を以下に示す：化学合成本発明の化合物を産生する一つの方法は、ポリペプチドの化学合成の後に、天然のコンホメーション、すなわち正確なジスルフィド結合を得るのに適切な酸化条件下で処理することを含む。これは、当業者に周知の方法を用いて行うことができる（Atherton，E.,とSheppardR.C.，Solid Phase Peptide Synthesis:A Pra ctical Approach，IRL Press，Oxford England(1989);Kelley，R.F.とWinkler， M.E．in Genetic Engineering Principles and Methods，Setlow，J.K.,ed.，Pl enum Press，N.Y.，vol.12，pp1-19(1990);Stewart，J.M．とYoung，J.D.Solid Phase Peptide Synthesis，Pierce Chemical Co．Rockford，IL(1984)を参照）。本発明のポリペプチドは、固相ペプチド合成を用いて簡単に調製されてもよい（Merrifield，（1964）J．Am．Chem．Soc.,85:2149;Houghten,(1985)Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 82:5132）。固相合成は、上記StewartとYoungの２頁と４頁の図１−１と１−２に示されているように、適切な樹脂（例えば、クロロメチル化ポリスチレン樹脂）に保護されたアミノ酸をカップリングすることによって推定ペプチドのＣ末端から開始される。α−アミノ保護基を、例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、例えばＴＥＡ中で中和した後に、この合成における次のα−アミノ−および側鎖が保護されたアミノ酸が加えられる。残りのα−アミノ−、および必要であれば側鎖が保護されたアミノ酸が、濃縮によって所望の順序で連続的に連結され、樹脂に結合した中間化合物を得る。あるいは、成長する固相ポリペプチド鎖にペプチドを付加する前に、アミノ酸が互いに連結してペプチドを形成してもよい。二つのアミノ酸、アミノ酸とペプチド、あるいはペプチドとペプチドの間の濃縮は、アジ化法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）またはＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法）、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール− １−イル−オキシ−tris（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフアート］法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法等、並びにWoodward試薬Ｋ法のような通常の濃縮法に従って行われる。アミノ酸のあらゆる反応性の側鎖基を適切な保護基で保護することが、ペプチドの化学合成に共通である。結局、これらの保護基は、所望のポリペプチド鎖が連続的に構成された後に除去される。本体がカルボキシル基において反応した後に、αアミノ保護基の選択的除去がなされることにより、次の反応をその位置で起こさせる問に、アミノ酸またはフラグメントにおけるαアミノ基を保護することも一般的である。従って、種々の残基に側鎖保護基が付着した、ペプチド鎖の所望の配列にアミノ酸残基が配置された中間化合物が生成されることが、ポリペプチド合成において一般的である。これらの保護基は、樹脂から除去された後に所望の最終的な産物を産生するために実質的に同時に共通して除去される。 α−およびε−アミノ側鎖基を保護するのに適した保護基は、ベンジルオキシカルボニル（省略してＺ）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、Ｏ −クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（２Ｃｌ）］、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ₂）］、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＯＭｅ）］、ｔ−ブトキシカルボニル、（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボロニルオキシカルボニル、アダマチルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、ジメチルオホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）等が例証される。カルボキシ官能基の保護基は、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ−ブチルエステル（ｏｂｕｔ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等が例証される。アミノ基およびカルボキシル基以外の官能基を備えたアルギニン、システインおよびセリンのような特定のアミノ酸が、適切な保護基で保護されることが望ましい。例えば、アルギニンのグアニジノ基が、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｍｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護されてもよい。システインのチオール基は、ｐ−メトキシベンジル、トリフェニルメチル、アセチルアミノメチルエチルカルバモイル、４−メチルベンジル、２，４，６ −トリメチル−ベンジル（Ｔｍｂ）等で保護されてもよく、また、セリンのヒドロキシル基は、ベンジル、ｔ−ブチル、アセチル、テトラヒドロビラニル等で保護されてもよい。上記のStewartとYoungは、ペプチドを調製するための方法に関する詳細な情報を提供する。α−アミノ基の保護は、１４−１８頁に記載され、側鎖保護は１８ −２８頁に記載されている。アミン、ヒドロキシルおよびスルフヒドリル基の保護基の表が、１４９−１５１頁に記載されている。所望のアミノ酸配列が完成した後に、樹脂からペプチドを切断するだけでなく、残りの全ての側鎖保護基を切断する、液体ＨＦおよび一つ以上の硫黄含有スカベンジャー(thio-containing scavengers)のような試薬で処理することにより、樹脂支持体から中間ペブチドが除去される。ＨＦ切断の後に、タンパク配列はエーテルで洗浄され、大量の希酢酸に移され、水酸化アンモニウムで約８．０に調節されたｐＨで攪拌される。ポリペプチドにおける残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システインおよびチロシン残基のアルキル化）を避けるために、好ましくは、チオクレゾールおよびクレゾールスカベンジャー混合物が使用される。樹脂はエーテルで洗浄され、直ちに大量の希酢酸に移され、可溶化しかつ分子間架橋結合を最小限にする。２５０μＭのポリペプチド濃度が、約２リットルの０．１Ｍ酢酸溶液に希釈される。溶液を攪拌し、そのｐＨを水酸化アンモニウムを用いて約８．０に調節する。ｐＨ調節により、ポリペプチドはその望ましいコンホメーション配置をとる。非ペブチド（アミド同配体）結合本発明の一つの実施態様では、ＢＮＰのアミド結合（−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）は、当該技術分野において周知の方法によって、−ＣＨ₂−ＮＨ−、−ＣＨ₂−Ｓ −、−ＣＨ₂−Ｏ−、−ＣＨ₂−ＣＨ₂−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスとトランス）、 −Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₂−、−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂−、−ＣＨ（ＣＮ）−ＮＨ−、 − Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−および−ＣＨ₂−ＳＯ−のようなアミド同配体結合で置換されてもよい。以下の参照文献は、これらの選択的な結合分子を含むペプチドアナログの調製を記載する：Spatola，A.F.，Vega Data 1(3):“Peptide Backbo ne Modifications”(General Review)(Mar1983)，Spatola，A.F.，in“Chemistr y and Biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins”，B．Weinstein ，ed.，Marcel Dekker，New York，p.267(1983);Hudson，D.らInt．J．Pept.Pro t．Res．14:177-185(1979)（−ＣＨ₂ＮＨ−、−ＣＨ₂ＣＨ₂−）；Tourwe，D.らS tructural Biology 331-333(1989)（Ｅ，−ＣＨ＝ＣＨ−）;Spatola，A．F.ら， Life Sci 38:1243-1249(1986)（−ＣＨ₂−Ｓ−）；Almquist，R.G.らJ.Med.Chem .23:1392-1398(1980)（−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₂−）；Jennings-White C.らTetrahe dron Lett23:(1982)（−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ₂−）；Szelke，M.ら欧州特許出願第４５６５５号（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ₂）；Holladay，M.W.らTetrahedron Lett 24:4401-4404(1983)（−Ｃ（ＯＨ）−ＣＨ₂−）；Hruby，V.J.Life Sci 31:189- 199(1982)（−ＣＨ₂Ｓ−）;およびCho，C.Y.らScience 261:1303-1305(1993)（ −Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）。組み換え合成さらなる実施態様において、本発明は、ここに記載されたアミノ酸の置換を含むＢＮＰ変異体のタンパク成分をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを含む。本発明は、ＤＮＡ分子に連結された発現調節配列をさらに含み、発現ベクター、好ましくはプラスミドがこのＤＮＡ分子を含み、この調節配列はこのベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される。本発明の化合物は、ここに記載されたあらゆるアミノ酸配列をコードする核酸配列を（標準的な技術によって）合成し、適切な宿主においてこの核酸配列を発現することができる適切な発現ベクターにこの核酸配列をリゲーションし、核酸配列がリゲーションされた発現ベクターで宿主を形質転換し、選択された核酸配列にコードされたタンパクがこの宿主によって発現されるような、核酸配列の発現に適した条件下でこの宿主を培養する工程を含む方法によって調製されてもよい。この方法において、アミノ酸配列が宿主から分泌されるような、適切な分泌シグナルに核酸が連結されるように、リゲーション工程が、核酸を適切な発現ベクターにリゲーションすることをさらに考慮してもよい。分泌シグナルは、例えば、ｓｔＩＩ、ecotin、ｌａｍＢ、ヘルペスｇＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、およびα因子のリーダー配列からなる群から選択され、ｓｔＩＩが好ましい。例証として、手持ちの野生型ＢＮＰをコードする発現ベクターを用いて、部位特異的変異誘発（Kunkelら，Methods Enzymol．204:125-139[1991];Carter，P. ら，Nucl．Acids．Res.13:4331[1986]；Zoller，M.J.ら，Nucl．Acids Res．10: 6487[1982]）、カセット変異誘発（Wells，J.A.ら，Gene 34:315[1985]）、制限選択変異誘発（Wells，J.A.ら，Philos．Trans，R．Soc．London SerA 317,415[ 1986]）または他の周知の技術をＢＮＰＤＮＡに行ってもよい。変異ＤＮＡは、上記発現ベクターに挿入することにより、親ＤＮＡの代わりに用いることができる。変異ＤＮＡを備えた発現ベクターを含む宿主細菌の生育により、変異ＢＮＰを生成することができ、ここに記載されたようにして単離される。宿主細胞は、原核であっても真核であってもよい。原核生物は、親ポリペプチド、セグメント置換ポリペプチド、残基置換ポリペプチドおよびポリペプチド変異体を産生するためにＤＮＡ配列をクローニングおよび発現するのに好ましい。例えば、E.coli K12株２９４（ＡＴＣＣＮｏ．３１４４６）、E.coli B、E.col i X1776（ＡＴＣＣＮｏ．３１５３７）、およびE.coli c600およびc600hfl、E. coli W3110（Ｆ−、ガンマ−、原栄養菌／ＡＴＣＣＮｏ．２７３２５）、Bacil lus subtilisのようなバチルス属、Salmonella-typhimuriumまたはSerratia mar cesansのような別の腸内細菌科、並びに種々のシュードモナス属を用いてもよい。好ましい原核生物は、E.coli W3110（ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生物によって発現された場合には、ポリペプチドは通常、Ｎ末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。融合タンパクの場合には、Ｎ末端メチオニンまたはホルミルメチオニンは、融合タンパクのアミノ末端または融合タンパクのシグナル配列に存在する。これらの例は、もちろん、限定ではなく例証を意図するものである。原核生物に加えて、酵母培養物のような真核生物もしくは多細胞生物の細胞を用いてもよい。原理的には、このようなあらゆる細胞培養を行うことができる。しかしながら、脊椎動物細胞に最も大きな関心が向けられ、培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖が、再現性のある方法になった（Tissue Culture，Ac ademic Press，KruseとPatterson，editors(1973)）このような使用可能な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、Ｗ１３８、２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７およびＭＤＣＫ細胞系である。本発明の好ましい発現ベクターは、例えばｐＢＲ３２２，ｐｈＧＨ１、ｐＢＯ４７５、ｐＢ１５３７、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＤＲ５４０、ｐＰＬ−ラムダおよびｐＢ１５３７から選択することができ、最も好ましいベクターはｐＢ１５３７である。本発明のＢＮＰ変異体の直接的な発現の好ましいベクターは、ｐＢ１５３７であり（Cunninghamら（1994）EMBO J.13:2508-2515）、E.coliの複製起点、アルカリホスファターゼプロモーター、ＳｔＩＩシグナル配列、ＢＮＰ変異体遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。別の好ましいベクターは、ｐＲ１Ｔ５およびｐＲ１Ｔ２Ｔ（Pharmacia Biotechnology）である。これらのベクターは、適切なプロモーターと、プロテインＡのＺドメインを含み、ベクターに挿入された遺伝子を融合タンパクとして発現させる。別の好ましいベクターは、ここに記載されたベクターの適切な特性を組み合わせることによって標準的な技術を用いて作製される。この場合、ファージおよび E.coli間に共通する、これらの宿主の複製起点を含むベクターが用いられ、それによって変異誘発および発現の両方が容易となる（Cunningham，B.らScience 24 3:1330-1336[1989];Wells，J.とCunningham，B．１９９０年５月３日に公開された国際公開第９０／０４７８８号公報）。ベクターの適切な特性は、プロモーター、リボソーム結合部位、変異体遺伝子または遺伝子融合物（プロテインＡのＺドメインとＢＮＰ変異体およびそのリンカー）、シグナル配列、抗生物質耐性マーカー、コピー数、並びに適切な複製起点を含む。遺伝子融合物上記方法の変化は、ＢＮＰ変異体をコードする遺伝子が別のタンパクもしくは別のタンパクのフラグメントをコードする遺伝子と、ベクター中で結合された、遺伝子融合物の使用を考慮する。これは、別のタンパクとの融合物として宿主細胞によって産生されたＢＮＰ変異体を生じる。“別の”タンパクは、殆どの場合細胞によって分泌されうるタンパクまたはペプチドであり、培養培地から所望のタンパクを単離および精製することを可能にし、所望のタンパクが細胞の内部に残る場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を除去する。あるいは、融合タンパクは細胞内で発現されてもよい。高度に発現された融合タンパクを用いることが使用できる。遺伝子融合物の使用は、必須ではないが、E.coliにおける異種のタンパクの発現並びに遺伝子産物の精製を容易にする（Harris，T.J.R．in Genetic Engineer ing，Williamson，R.，Ed.，Academic，London，Vol．4，p.127[1983];Uhlen,M とMoks，T.，Methods Enzymol．185:129-143[1990]）。プロテインＡ、さらに特定すればプロテインＡのＺドメインのＩｇＧヘの結合が、融合タンパクの精製のための“アフィニティーハンドル(affinity handle)”を提供することから、プロテインＡ融合物がしばしば用いられる（Nilsson，B.とAbrahnLsen，L．Method s Enzymol．185:144-161[1990]）。また、E.coliで直接発現された場合には多くの異種のタンパクが分解されるが、融合タンパクとして発現された場合には安定であることも示されている（Marston，F.A.O.，Biochem J．240:1[1986]）。融合タンパクとして発現されたＢＮＰ変異体は、適切に折り畳まれてもよく、本来の構造を得るために折り畳みを必要としてもよい。適切に折り畳まれた融合タンパクは、薬剤として活性および使用可能であってもよい。変性および再度の折り畳みを必要とする場合には、通常、タンパクは、グアニジンＨＣｌのようなカオトロープ(chaotrope)で処理され、次いで、関心の向けられたタンパクが本来の構造に折り畳まれるような、適切な比率、ｐＨおよび温度において、例えば還元および酸化されたジチオトレイトールまたはグルタチオンを含有するレドックスバッファーで処理される。より好ましくは、当該技術分野において公知の方法によって、融合タンパクから得られた正確に折り畳まれた天然タンパクである。融合タンパクは、メチオニンで切断する臭化シアン、もしくはＡｓｎおよびＧｌｙの間を切断するヒドロキシルアミンのような化学物質を用いて切断されてもよい。標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いた場合、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対が、ＢＮＰ変異体遺伝子の５’末端の直前に挿入されてもよい。あるいは、最近になって書評された融合タンパクのタンパク分解を用いることもできる（Carter，P．（1990）in Protein Purification:From Molecular Mech anisms to Large-Scale Processes，ladisch，M.R.，Willson，R．C.，Painton, C.C.，とBuilder，S.E.，eds.，American Chemical Society Symposium Series No．427，Ch13，181-193）。Ｘａ因子、トロンビン、サブチリシンおよびこれらの変異体のようなプロテアーゼが、融合タンパクを切断するために首尾よく用いられてきた。通常は、使用されたプロテアーゼによって切断されやすいペプチドリンカーは、“別の”タンパク（例えば、プロテインＡのＺドメイン）およびＢＮＰ変異体のような関心の向けられたタンパクとの間に挿入される。組み換えＤＮＡ技術を用いて、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対が、遺伝子間または別のタンパクをコードする遺伝子フラグメント間に挿入される。次いで、正確なリンカーを含む部分的に精製された融合タンパクのタンパク分解を、天然融合タンパク、もしくは還元または変性された融合タンパクのいずれかに行うことができる。精製および特徴決定ＢＮＰ変異体の精製および特徴決定を、通常の技術によって行ってもよい。例えば、ＢＮＰ変異体は、バッチ逆相クロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、およびＣ１８逆相ＨＰＬＣによって１０リットルの発酵槽で生育されたE.coli培養物の肉汁から精製されてもよい。有用性と投与本発明の化合物は、ナトリウム排泄増加性、利尿性および血管拡張性活性を備え、アルドステロンとレニンの放出を阻害する。しかして、これらの化合物は、水または電解質のアンバランスおよび高血圧、特に腎血管性高血圧に関連する種々の病状の処置における治療試薬として用途を見いだす。本発明の化合物は、治療および予防処置におけるＡＮＰペプチドに対するアナログとして使用できる。ＢＮＰは、利尿能力があり、かつ、全身性血管拡張能を備えている（Kambayashi ら，（1990）Biochem．Biophys．Res．Commun．173:599-605）。ＢＮＰレベルの増大は、うっ血性心不全と急な運動の際に報告されている（Kohne，M.ら，（199 2）Metabolism 41:1273-1275;Mukoyama M．ら（1991）J．Clin．Invest．87:140 2-1412）。ＢＮＰとＡＮＰの両方が、慢性低酸素症において釣り合うように統制されていない（Am．J．Physiol．（1994）266:L308-L315）。それゆえ、血液量または血圧の過負荷(overload)を引き起こすあらゆる症状が候補となる。このような症状は、例えば、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋症、心筋炎、リウマチ心疾患のような弁膜の病気、心筋虚血および梗塞形成のような心臓の冠状動静脈疾患、発作性心房性頻拍および心房性細動並びに粗動のような不整脈、先天性心臓欠陥、心膜炎および心臓のタンポナーデのような拘束型疾患、薬剤誘発性心臓病、本態性高血圧、二次性高血圧、肺高血圧および門脈圧亢進を含む高血圧、慢性腎不全およびネフローゼ等の腎臓疾患、肝硬変、原発性アルドステロン症、Cush ing’s病、子癇前症、妊娠期の毒血症、月経前緊張症候群、ネフローゼ症候群および肝性の肝硬変、肺病、および無効の腎性潅流または低減した糸球体濾過率による腎性疾患を含む。化合物および組成物は、ＡＮＰおよび他の同様の治療試薬と同様の方法でヒトに投与されうる。投与されるべき量は、通常のファクター、すなわち、年齢、体重、性別、患者の状態、処置されるべき特定の疾患および投与経路に依存する。一般的に、治療の効力に必要とされる投与量は、体重に対して約０．０１から１０００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．１から２５ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。あるいは、これらの範囲内の投与量を、所望の治療効果が得られるまでの間、一定速度の注入によって投与することができる。本発明は、本発明の化合物、その非毒性の付加塩、アミドおよびエステルであって、単独で上記治療の利益を付与する化合物の有効量を含む組成物を提供する。ペプチド化合物は、中性もしくは塩の形態として組成物中に製剤化されてもよい。薬学的に許容できる非毒性塩は、酸付加塩（フリーのアミノ基を用いて形成された塩）を含み、これは例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、もしくは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸を用いて形成される。フリーのカルボキシル基を用いて形成された塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基、並びにイソプロピルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導されてもよい。このような組成物は、生物学的に寛容な液体、ゲルまたは固体希釈剤、アジュバントおよび賦形剤と共に提供されうる。通常、このような組成物は、無菌の、注入可能な液体溶液または懸濁液として調製される。組成物は乳化されてもよい。活性成分は、多くの場合、活性成分と適合し生物学的に寛容な希釈剤または賦形剤と混合される。適切な希釈剤および賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール等、並びにこれらの混合物である。さらに、所望であれば、この組成物が、湿潤剤または乳化剤、安定化またはｐＨ緩衝化剤等の少量の補助的な物質を含んでもよい。これらに関するより詳細な説明については、Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co．Easton，PA.(1970)のような標準的な薬学のテキストを参照。ナトリウム排泄増加性、利尿性、または血管拡張性活性を示す本発明の化合物に加えて、本発明の化合物は、土記のような使用可能な化合物の合成における中間物としても用いられる。あるいは、適切に選別することにより、活性レベルが低減もしくは完全に消失した本発明の化合物は、例えば代わりのレセプターへの結合、レセプターのターンオーバーの刺激、もしくはレセプター活性の分解酵素の代わりの基質を提供し、それによって酵素またはレセプターを阻害することによって、本発明の範囲外の化合物を含む、別の利尿性、ナトリウム排泄増加性または血管拡張性化合物の活性を変更するために配合することができる。このように用いられる場合、これらの化合物は、他の活性化合物との混合用添加物とされるか、例えばそれ自身のキャリア中に別個に加えられる。薬学的組成物は、単独で、あるいは、例えばＳＣ−４６５４２のようなＣレセプターリガンド、またはＳＣＨ３２６１５、ＳＣＨ３４４８２６、ＳＣＨ３９３７０、ＳＱ２９０００７２、チオルファン（thiorfan）およびＵＫ６９５７８のようなＢＮＰ分解の主な原因となる酵素の阻害剤と組み合わせて調製される。Ｃレセプターを塞ぐ合成化合物は、循環ＢＮＰの濃度を増加させ、本願発明のペプチドと組み合わせて用いられてもよい。米国特許第４７４０４９９号には、心房のペプチドと同時に投与された、エンドペプチダーゼ２４．１１の二つの特異的阻害剤、チオルファンまたはケロトルファン（kelotorphan）を用いて心房ペプチドの生物学的活性を持続または増強する方法が記載されている。以下の例は、例証として示されたものであって、限定するものではない。明細書中の全ての引用文献に開示されたものは、参照として明確にここに含められる。実施例実施例１一価のファージディスプレイ（Bassら，（1990）Protein Struct．Funct．Gen ent.，8:309-314;Lowmanら，（1991）Biochemistry，30:10832-10838）を、ヒトＮＰＲ−Ａに堅固に結合するが、ＮＰＲ−Ｃには結合しないＢＮＰの変異体をスクリーニングするために用いられた。多価濃縮選別後に、ＮＰＲ−Ａに選択的に結合したＢＮＰ変異体を単離した。ライブラリーの作製：ＢＮＰの一価のファスミドライブラリー（Lowman,H.Bら，（1991）Methods:Companion Methods Enzymol．3:205-216）を、特定部位の突然変異誘発によって作製した（Kunkel，T．A.ら（1991）Methods Enzymol．204: 125-139）。各ライブラリーは、ＮＮＳ配列（Ｎは４つ全ての塩基の混合を示し、ＳはＣとＧの両方の混合である）に対して標的コドンを変異させたオリゴヌクレオチドを用いて、（以下の表１に示したように）全２０アミノ酸について完全に無作為化された３、４または５つのコドンを含む。ｍＬあたり約１０¹⁴のファスミドのストックが、プラスミドを含みかつＫＯ７ヘルパーファージで重感染されたＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞からの肉汁培地のＰＥＧ沈降から調製された。レセプター特異的ＢＮＰ変異体の選別：ＮＰＲ−Ａ特異的変異体を消極的に選別する前に、ＮＰＲ−ＡＩｇＧ融合物（Ａ−ＩｇＧ）を用いて、ライブラリーをＮＰＲ−Ａ結合体について予備濃縮した（Bennettら（1991）J.Biol.Chem.266 :23060-23067）。Maxisorbミクロタイタープレートのウェル（Nunccat．#439454 ）を、一晩中４℃で５０ｍＭの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６）中で２μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＦｃ抗体（Jackson Immuno Research cat．#309-006-008）１００μｌで被覆した。この被覆溶液を捨て、ウェルを２５ｍＭの炭酸ナトリウム中の５％スキムミルク（ｐＨ９．６）を用いて室温で１時間ブロックした。ＰＢＳ中の０．０１％のTween（登録商標）で洗浄した後に、ＮＰＲ−ＡＩｇＧを室温で１時間、結合バッファー（ＰＢＳ中に２％のスキムミルク）中に１μｇ／ｍｌで添加した。このウェルを再度洗浄した。１０μｌのファージストック（成長培地から２５０倍に濃縮され、ＰＢＳ中に貯蔵）を結合バッファーを用いて１００μｌとし、室温で２時間ウエル中でインキュベートした。２０−３０回洗浄した後に、ファージを１００μｌの０．２Ｍグリシン（ｐＨ２．０）で溶出し、１３μｌの１ＭＴｒｉｓＢａｓｅで中和し、E.coliを感染させることによって滴定した（ＸＬ１−blue Stratagene，Inc.，San Diego，CA）。残りの選別されたファスミド粒子を、次の選別サイクルに用いるために増殖させた。レセプター特異的選別を、ＮＰＲ−ＡＩｇＧ被覆ウェル中でファージ結合段階の際に競合ＮＰＲＣＩｇＧ（Bennettら（1991）上掲）を添加することによって行った。これは、２０ｎＭから２００ｎＭまで増大する量の競合ＣＩｇＧを用いて７回選別することによって行われた。各ライブラリー毎に、競合ＣＩｇＧ、もしくはＡＩｇＧ被覆とＣＩｇＧの両方を欠く対照ウェルを作製した。ＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｃに対するファージミック(phagemic)アフィニティーのＥＬＩＳＡ測定：ファージＥＬＩＳＡを、Cunningham，B.C.ら，（1994）EM BO J.，13:2508-2515の方法に従って測定した。ミクロタイタープレート（Nunc, Maxisorb，96ウェル）を、４℃で一晩中５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９．６）中の精製されたＡ−ＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ）で被覆した。プレートを５％のスキムミルクでブロックし、ＰＢＳ、０．０１％ＴＷＥＥＮ２０で洗浄した。競合するレセプター（Ａ−ＩｇＧまたはＣ−ＩｇＧ）の連続的希釈溶液、およびほぼ飽和する濃度のＢＮＰ−ファスミドを、１００μｌの結合バッファー（ＰＢＳ中に２％のスキムミルク）でウェルに添加した。２時間後にプレートを洗浄し、結合したファスミドをヒツジ抗Ｍ１３ＨＲＰ結合抗体（Pharmacia #279402-01）で染め、アッセイした。親和性（ＥＣ５０）を、最大ファスミド結合の半分を生じる競合レセプターの濃度として計算した。結果７回の選別後に無作為化された各位置に見いだされたアミノ酸残基が表１に示されている。プライマー変異誘発によって無作為化された３から５アミノ酸の８セグメントが、図の一番上に示され、すぐ上に３２アミノ酸のヒトＢＮＰに対して番号が付されており、この配列は一文字表記のアミノ酸コードで示されている。ＮＰＲ−Ａに結合するのに必須なジスルフィド結合を形成することから、システイン残基１０および２６は変異させなかった。Ｋ３のＤへの置換（表示ＢＮＰ）は、E.coliにおける分泌発現を容易にするために用いられたＡＮＰ中の酸性置換Ｒ３Ｄに対するアナログである（Cunninghamら(1994)）。各クローンを取り出して、ＤＮＡ配列を決定した。特定の配列が観察された回数が左に示されている。Ａ−ＩｇＧに結合するＡＮＰファスミドに対する変異ＢＮＰファスミド結合親和性の比率が右に示されている。変異誘発窓の外で起こる変異は、変異ＢＮＰファスミドに選別優位性を付与するポリメラーゼの導入ミス変異から生じる（Cunn inghamら(1994)）。実施例２以下の実施例において、中間体および最終産物を指す場合に、アミノ酸は標準的な３文字アミノ酸コードによって記載される。ここに記載された直鎖状ペプチドと中間体は、固相ペプチド合成法によって調製された（R．Merrifield，（196 4）J.Am.Chem.Soc.85:2149およびM.Bodansky，”Principles of Peptide Synthe siS”Springer-Verlag，(1984)）。使用された略語は以下の通りである：tert- ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）：p-トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）；4-メチルベンジル（ＭｅＢｚｌ）；ベンジル（Ｂｚｌ）；2-ブロモベンジルオキシカルボニル（Ｂｒ−Ｚ）；シクロヘキシルエステル（Ｏｃｈｅｘ）；4-メトキシベンジル（ＭｅＯＢｚｌ）、2-クロロベンジルオキシカルボニル（Ｃｌ−Ｚ）；フッ化水素（ＨＦ）；ベンゾトリアゾリルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフアート（ＢＯＰ）；塩化メチレン（ＤＣＭ）；トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）；およびジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）。ペプチドは、Applied Biosystems 430A自動ペプチド合成装置を用いて製造された。側鎖保護は、Ａｓｐ（Ｏｃｈｅｘ）、Ｃｙｓ（ＭｅＯＢｚｌ）、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）およびＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）であった。ペプチドを、０．７ｇ（１．０ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）ＰＡＭ樹脂（Applied Biosystems）上で製造した。カップリングのプロトコルは、Ap plied Biosystemsから推奨されているものであり、溶媒としてＤＭＦの代わりにＤＭＡを用いた。鎖製造後にＮ末端Ｂｏｃ基をＴＦＡを用いて除去した。ペプチド樹脂を、ジクロロメタン、次いでメタノールで洗浄し、真空乾燥させた。このペプチドの保護を外し、ペプチド−樹脂を２０ｍｌのＨＦ（９２．５％）、アニソール（５％）およびエチルメチルスルフィド（２．５％）の混合物中で０度で１時間攪拌することによって樹脂から外した。次いでＨＦをin vacuoで除去し、樹脂をエーテルで洗浄した。この樹脂を水中に１０％の酢酸、アセトニトリル、水を用いて洗浄し、ろ過物を回収し、凍結乾燥した。粗な直鎖状ペプチド（３００ｍｇ）を、濃縮された水酸化アンモニウムでｐＨが７．４−７．６に調節された１０Ｌの蒸留水に溶解された。激しく攪拌しながら、０．００３ＭのＫ₃［Ｆｅ（ＣＮ）₆］（１００ｍＬの蒸留水に１ｇを溶解）を滴状（１滴／１０秒）に加えることにより直ちに環化を開始した。明るい黄色のままの場合は、鉄溶液(iron solution)の添加を中止し、反応混合物をさらに４から５時間攪拌した。環化された溶液のｐＨを、ＨＯＡｃを月いて４．５に調節した。 Bio Rex 70カチオン交換樹脂、Ｎａ⁺形態の２００−４００メッシュを１ＮのＨＣｌ、次いで蒸留水で洗浄した。約１１０ｇのこの樹脂を環化されたペプチド溶液中に添加し、一晩中攪拌した。この樹脂をろ過し、蒸留水で激しく洗浄し、スラリーをカラムに収容した。ペプチドを７０％水性ＨＯＡｃを用いて溶出し、ＴＬＣで同定し（ニンヒドリン視覚化）、凍結乾燥した。このペプチドを水中の０．１％ＴＦＡに溶解させ、２．５ｃｍｘ５０ｃｍＣ−１８逆相カラム（１５ミクロン、３００Ａ）に導入し、浅い勾配で増加するアセトニトリルで溶出した。溶出条件は、０．５％分^-1で１０％から５０％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡを含む）勾配からなるものであった。水相は水中の０．１％ＴＦＡであった。画分を含む産物を凍結乾燥させて、純粋な表題のペプチドを供給した。実施例１の手段を行った後に、実施例３−６の化合物を類似して調製した。実施例３実施例４実施例５実施例６実施例７ＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｃに対する折り畳み親和性の測定。方法膜調製ＮＰＲ−Ａ（LoweとFendly(1992)J．Biol．Chem.）またはＮＰＲ−Ｃ（Cunninghamら(1994)上掲）を発現する安定な２９３細胞系に由来する膜を、ＰＢＳ中の０．５ｍＭＥＤＴＡを用いて組織培養皿から細胞を外し、２２５ｘｇ、４℃で遠心し、かつ５０ｍＭＨｅｐｅｓＰｈ７．４、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、２５０ｍＭショ糖、０．７μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、０．５ μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭＰＭＳＦ、１μＭホスホラミドン(Phosphora midon)中に再懸濁することによって調製した。得られた細胞を、Brinkman polyt ronを用いて３０秒間５回ホモゲナイズした。ホモゲナイズしたものを、４℃で１０分間４００ｘｇ（１５００ｒｐｍ）でSorval HB-4ローターで３０ｍｌコレックス(corex)チューブ中で遠心した。この上清を、Beckman TI60ローターを用いて、４℃、３０分間１０００００ｘｇ（３１５００ｒｐｍ）で、ネジ蓋付きポリカーボネートチューブ（Beckman355618）中で再度遠心した。沈殿物を、５０ｍＭＨｅｐｅｓ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、５．０ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＮａＣｌ、０．７μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、０．５μｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍＭＰＭＳＦ、１μＭホスホラミドンに再愁濁し、Dounceホモケナイザー(Wheaton 7ml，＃357542)中で１５ストロークで再度ホモケナイズした。この膜を２２ゲージ針に数回通過させた後に、エッペンドルフチューブに分注して− ８０℃で貯蔵した。ＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｃに対する結合親和性の測定膜を、５０ｍＭＨｅｐｅｓ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＮａＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２％ＢＳＡ、１μＭホスホラミドンに希釈し、３０ｐＭのＩ¹²⁵ラベルされたラットＡＮＰ（Amersham）を加えた同じ量の希釈された純粋な合成ペプチドに加えた。優しく揺り動かしながら、９６ウェルのＵ底ミクロタイターポリプロピレンプレート（Sigma M-4029）中で、室温で２時間結合させた。結合したホルモンは、 Packard Filtermate 196細胞収穫機と１％ポリエチレンイミン飽和Packard unif ilter-96 GF/Bプレートを用いて、真空ろ過によって、遊離のホルモンから分けられた。４０μｌのMicroscint-20シンチレーション試薬を添加する前に、このプレートを真空チャンバーで１０分間乾燥させ、Packard Topcountシンチレーションカウンターでカウントした。それそれの親和性は、３回の別個のアッセイの内、２回の測定値を示す。結果：アッセイ＃１実施例７ペプチドを、ＣＧＭＰ産生の刺激についてアッセイした。ｃＧＭＰ産生の全体的な細胞刺激、並びにｃＧＭＰＲＩＡ細胞培養：細胞をＦ１２（ｗ／ｏＧＨＴ）／低グルコースＤＭＥＭ（５０／５０）、２５ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．２、２ｍＭグルタミン、４００マイクログラム／ｍｌＧ４１８および１０％透析小ウシ血清中で維持した。対数期細胞をＰＢＳ中の０．５ｍＭＥＤＴＡを用いてプレートから外し、培地に取り込み、コルター(coulter)カウンターを用いて細胞濃度を測定した。刺激を与える１８から２４時間前に、細胞を３０００００細胞／ウェルの密度で１２ウェル皿にプレートした。全体的な細胞刺激：プレートを３７℃の温暖なプレートに移し、培地を吸引し、１０分間３７℃のインキュベーション培地を添加した（５０／５０、２５ｍＭＨｅｐｅｓｐＨ７．２、０．１ｍＭイソブチルメチルキサンチン、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）。この反応を以下に示すように対照値用に終結させるか、培地を吸引して、テストサンプルを含むインキュベーション培地を添加した。この反応を１０分間続けた後、０．５ｍｌの氷冷された１２％トリクロロ酢酸を、この反応を停止し、かつ環状ヌクレオチドを抽出するために添加した。プレートをドライアイスのベッドの上で素早く凍結させ、溶解させ、細胞破片を含むＴＣＡを１２ｘ７５ｍｍの使い捨てガラスチューブに導入し、２０００ｘＧで１０分間遠心した。この上清を新鮮なガラスチューブに移し、ＴＣＡを水飽和エーテルを用いて３回抽出することによって除去した。残余のエーテルを５０℃で２０分間煮沸することによって除去した。このサンプルはｃＧＭＰ含量のＲＩＡ測定に使用できる。ＲＩＡ：１００マイクロリットルのサンプル（そのまま、またはこれらの希釈物）を二回測定した。最も高い濃度のｃＧＭＰを用いて最初に標準曲線を作製した。アセチル化のプロトコールを、記載された通り(Biomedical Techniques Inc .，Stoughton，MA）に行った。一晩インキュベーションを行い、遠心した後に、ペレットをイソデータ(isodata)カウンター中でカウントした。データを、ＲＳ／１でｃＧＭＰＲＩＡ分析プログラムを用いて分析された。結果図１および２は、ｈＮＰＲ−Ａを発現する２９３細胞中のｃＧＭＰ産生の測定結果を示すものである。野生型および変異体は、ｃＧＭＰ産生によって測定されたように、膜調製物におけるグアニル酸シクラーゼ活性を刺激する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年１０月１３日（１９９８．１０．１３）【補正内容】残基ペプチドを指し；ＢＮＰはＳＥＱＩＤＮＯ：１を指し；ＢＮＰ０２はＳＥＱＩＤＮＯ：２を指し；ＢＮＰ０４はＳＥＱＩＤＮＯ：７を指し；ＢＮＰ０５はＳＥＱＩＤＮＯ：７を指し、ＡＮＦ１３１はＳＥＱＩＤＮＯ：５０を指し；ＢＮＰ０６はＳＥＱＩＤＮＯ：４８を指し；かつ、ＢＮＰ０７はＳＥＱＩＤＮＯ：４９を指す。これらの結果は、このペプチドが、ＢＮＰに類似した能力を備え、このレセプターにおける完全なアゴニストであるであることを示す。図３：哺乳動物種のＢＮＰのアミノ酸配列の一致；ヒト（Sudohら，（1989）B iochem Biophy．Res．Commun．159:1427-1434）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、イヌ（Seilhamerら，（1989）Biochem Biophys．Res．Commun 165:650-658）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）、ブタ（Sudoh，T.ら，（1988）Nature332:78-81）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）、ラット（Kojimaら，（1989）Biophys．Biochem．Res ．Commun．159:1420-1426）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）およびマウス（Ogawaら，（1994）J．Clin．Invest93:1911-1921）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４７）。ギャップ（−）は一致を最大にするために導入された。好ましい実施態様の詳細な説明定義特許請求の範囲および明細書において用いた用語は、他に特記しないかぎり以下のように定義される。ここで用いられるアミノ酸またはアミノ酸残基という用語は、天然に生じたＬ型アミノ酸、または変異体に関しては以下にさらに記載したようにＤ型アミノ酸を指す。通常用いられるアミノ酸の１および３文字省略形がここでも用いられる（Bruce Albertsら，Molecular Biology of the Cell，Garland Publishing，In c.，New York(3rded.1994)）。ここで用いられているように、用語“ＢＮＰ”、“タイプＢナトリウム排泄増加性ペプチド”、“野生型ＢＮＰ”等が交換可能に用いられ、天然に生じた哺乳動物ＢＮＰまたは組み換えＢＮＰを指す。哺乳動物種のＢＮＰの配列、例えば、ヒト（Sudohら，（1989）Biochem Biophy．Res．Commun．159:1427-1434）（ＳＥＱＩＤＮＯ：１）、イヌ（Seilhamerら，（1989）Biochem Biophys．Res．C omm n 165:650-658）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４４）、ブタ（Sudoh，T.ら，（1988）Na ture332:78-81）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４５）、ラット（Kojinlaら，（1989）Bi ophys．Biochem．Res．Commun．159:1420-1426）（ＳＥＱＩＤＮＯ：４６）が知られている。用語“ヒトＢＮＰ”、“ｈＢＮＰ”等は、以下の主要なアミノ酸配列を備えた、Sudoh，T.ら，(1989) 上掲に報告された３２アミノ酸残基を意味する。この構造の特定の残基の上の整数は、残基の位置番号を定義する。この残基の位置番号は、本発明のＢＮＰ関連化合物において置換がなされた残基を指定するために、３文字アミノ酸表記と共に用いられる。しかして、例えば、アルギニン（Ａｒｇ）が野生型ＢＮＰの残基位置番号１９のセリン（Ｓｅｒ）と置き換わったＢＮＰ関連化合物では、表記“ＢＮＰＳｅｒ１９Ａｒｇ”等が用いられる。多重置換は、各置換を分けるコンマを伴って同じ方法で記載される。しかして、例えば、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびアルギニン（Ａｒｇ）がヒトＢＮＰのアミノ酸２３、２４および２５とそれぞれ置き換わったＢＮＰ関連化合物では、表記“ｈＢＮＰＧｌｙ２３Ｐｈｅ、Ｌｅｕ２４Ｔｒｐ、Ｇｌｙ２５Ａｒｇ”が用いられる。用語“ＢＮＰ変異体”および“ＢＮＰ関連化合物”は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１のポリペプチドと共通の少なくとも定性的な生物学的活性を備え、レセプター特異性を与えるために、ここで定義したような少なくとも一つのアミノ酸置換を備えた化合物として定義される。好ましいアミノ酸置換は、実施例１の表１に概説されている。定性的な生物学的活性は、グアニル酸シクラーゼ結合ナトリウム排泄増加性ペプチドレセプターＮＰＲ−Ａを提示する細胞におけるサイクリックＧＭＰ産生を刺激する能力である。このレセプターをコードするｃＤＮＡから推定ら推定されるＮＰＲ−Ａレセプターアミノ酸配列が知られている（Chinkersら，（1989）Nature338:78-83；Loweら（1989）EHBO J.8:1377−1384)。グアニル酸シクラーゼ活性とＡＮＰおよびＢＮＰ結合の両方を与える培養された哺乳動物細胞におけるＮＰＲ−ＡレセプターｃＤＮＡの機能発現も知られている（Chinkers ら，（1989）Nature338:78-83）。ＮＰＲレセプターに対する結合親和性およびｃＧＭＰ蓄積を測定するためのアッセイシステムが知られている（国際特許出願 PCT/US94/12591を参照）。さらに、好ましい実施態様において、本発明のＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物は、ＮＰＲ−Ａレセプターに結合することについて、野生型ＡＮＰ（Kang awaら，（1984）Biochem．Biophys．Res．Commun．118(1):131-139）またはＢＮＰと競合し、ｃＧＭＰの蓄積を誘発すると考えられる。それゆえ、何らかの理論に限定されることなく、定性的な生物学的活性は、ＮＰＲ−Ａレセプターに結合することについて、野生型ＢＮＰまたはＡＮＰと競合し、ｃＧＭＰの蓄積を誘発する能力として定義されてもよい。上記から認められるように、用語“競合”および“競合しうる能力”は、相対的な用語である。しかして、この用語は、ＢＮＰ変異体の活性を記載するために用いられた場合は、標準的なレセプター結合アッセイにおいて野生型ＢＮＰまたは野生型ＡＮＰに対して１０倍モル濃度過剰に添加された場合に、野生型ＢＮＰまたは野生型ＡＮＰの結合を少なくとも５０％阻害するＢＮＰ変異体を意味する。好ましくはＢＮＰ変異体は、５倍モル濃度過剰で、また、最も好ましくは少なくとも２倍モル濃度過剰で結合を少なくとも５０％阻害する。本発明の最も好ましいＢＮＰ変異体またはＢＮＰ関連化合物は、野生型ＢＮＰまたは野生型ＡＮＰと１：１の化学量論の比率で存在する場合に、結合を少なくとも５０％阻害する。ｈＮＰＲ−ＣおよびｈＮＰＲ−Ａに対するｈＢＮＰ、ｈＡＮＰおよび本発明の化合物の結合を測定するアッセイシステムとしては、Bennettら，（1991）J．Biol．Chem．266:23060-23067；Cunningha・ら，（1994）J．EHBO13:2508-2515；Chinkersら，（1989）Nature338:78-83およびFu llerら，（1988）J．Biol．Chem．263:9395-9401；Schenk，D．B.,ら，（1985） Biochem．Biophys．Res．Comm．127:433-442；Scarborough，R．M.,（1986）J． Biol.Chem．261:12960-12964およびＷＯ９０／０１９４０を参照。請求の範囲１．野生型ＢＮＰのアミノ酸残基Ｘａａ１９、Ｘａａ２３、Ｘａａ２４またはＸａａ２５の少なくとも一つアミノ酸残基が、以下の基準：Ｘａａ１９は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＡｒｇ、並びにこれらの保存的置換体からなる群から選択される；Ｘａａ２３は、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＬｅｕおよびＰｈｅ、並びにこれらの保存的置換体からなる群から選択される；Ｘａａ２４は、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ、並びにこれらの保存的置換体からなる群から選択される；並びにＸａａ２５は、ＧｌｙおよびＡｒｇ、並びにこれらの保存的置換体からなる群から選択されるに従って選択される、ヒト野生型ＢＮＰと比べてヒトクリアランスレセプター（ｈＮＰＲ−Ｃ）に対する結合親和性が低いＢＮＰ変異体。２．Ｘａａ１９がＡｒｇである、請求項１記載のＢＮＰ変異体。３．Ｘａａ２３がＰｈｅである、請求項１記載のＢＮＰ変異体。４．Ｘａａ２４がＴｒｐである、請求項１記載のＢＮＰ変異体。５．Ｘａａ２５がＡｒｇである、請求項１記載のＢＮＰ変異体。６．Ｘａａ２３が、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＬｅｕからなる群から選択され：Ｘａａ２４が、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅからなる群から選択され；かつＸａａ２５が、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択される、請求項２記載のＢＮＰ変異体。７．以下の式Ｉ：［式中、Ａは、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₆アルカノイルおよびＴｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）からなる群から選択され；Ｒ１は、欠失しているか、あるいは１ないし１０のアミノ酸からなるペプチド、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）からなる群から選択され：Ｘａａ₁₉は、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＳｅｒからなる群から選択され：Ｘａａ₂₃は、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅからなる群から選択され；Ｘａａ₂₄は、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅからなる群から選択され；Ｘａａ₂₅は、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択され；Ｒ₂は、１ないし６アミノ酸ペプチドおよびＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ａｒｇ−Ｈｉｓ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）からなる群から選択され；かつＢは、ＯＲ₃およびＮＲ₃Ｒ₄から選択され、ここでＲ₃およびＲ₄はＨ、Ｃ₁−Ｃ₆ アルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₂アリールおよびＣ₆−Ｃ₁₂アリール−Ｃ₁−Ｃ₆アルキルから独立に選択される］によって表される、請求項１記載のＢＮＰ変異体。８．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。９．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。１０．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。１１．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。１２．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。１３．無菌の賦形剤および請求項１記載のＢＮＰ変異体を含む組成物。１４．薬学的に有効な量の請求項１３記載の組成物を啼乳動物に投与することを含む、哺乳動物における電解質バランスの疾患を治療する方法。１５．薬学的に有効な量の請求項１３記載の組成物を噛乳動物に投与することを含む、ナトリウム排泄増加、利尿または血管拡張を誘発する方法。１６．医療用途のための請求項１ないし１２のいずれか一項に記載のＢＮＰ変異体。１７．哺乳動物における電解質バランスの疾患を処置するための医薬の調製における請求項１ないし１２のいずれか一項に記載のＢＮＰ変異体の使用。１８．哺乳動物におけるナトリウム排泄増加、利尿または血管拡張を誘発するための医薬の調製における請求項１ないし１２のいずれか一項に記載のＢＮＰ変異体の使用。１９．請求項１ないし１２のいずれか一項に記載のＢＮＰ変異体をコードする単離されたＤＮＡ分子。２０．発現調節配列に実施可能に連結された、請求項１９記載の単離されたＤＮＡ分子。２１．発現調節配列がベクターで形質転換された宿主細胞によって認識される、請求項２０記載の単離されたＤＮＡ分子を含む発現ベクター。２２．請求項２１記載のベクターで形質転換された宿主細胞。２３．ＢＮＰ変異体の発現に適した条件下で請求項２２記載の宿主細胞を培養することを含む方法。２４．請求項２３記載の培養の後に、培養培地からＢＮＰ変異体を回収することを含む方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/58 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/00 Ａ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．野生型ＢＮＰのアミノ酸残基Ｘａａ１９、Ｘａａ２３、Ｘａａ２４またはＸａａ２５の少なくとも一つアミノ酸残基が、以下の基準：Ｘａａ１９は、ＳｅｒおよびＡｒｇ、並びにこれらの保存的置換体からなる群から選択される；Ｘａａ２３は、Ｇｌｙ、ＭｅｔおよびＰｈｅ、並びにこれらの保存的置換体からなる群から選択される；Ｘａａ２４は、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ、並びにこれらの保存的置換体からなる群から選択される；並びにＸａａ２５は、ＧｌｙおよびＡｒｇ、並びにこれらの保存的置換体からなる群から選択されるに従って選択される、野生型ＢＮＰと比べてヒトクリアランスレセプター（ｈＡＮＰＣ）に対する結合親和性が低いＢＮＰ変異体。２．Ｘａａ１９がＡｒｇである、請求項１記載のＢＮＰ変異体。３．Ｘａａ２３がＰｈｅである、請求項１記載のＢＮＰ変異体。４．Ｘａａ２４がＴｒｐである、請求項１記載のＢＮＰ変異体。５．Ｘａａ２５がＡｒｇである、請求項１記載のＢＮＰ変異体。６．Ｘａａ２３が、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＬｅｕからなる群から選択され；Ｘａａ２４が、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅからなる群から選択され；かつＸａａ２５が、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択される、請求項２記載のＢＮＰ変異体。７．以下の式Ｉ：［式中、Ａは、Ｈ、Ｃ₁−Ｃ₆アルカノイルおよびＴｈｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３０）からなる群から選択され；Ｒ１は、欠失しているか、あるいは１ないし１０のアミノ酸からなるペプチド、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ、Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３１）およびＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ− Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３２）からなる群から選択され；Ｘａａ₁₉は、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＳｅｒからなる群から選択され；Ｘａａ₂₃は、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅからなる群から選択され；Ｘａａ₂₄は、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅからなる群から選択され；Ｘａａ₂₅は、ＧｌｙおよびＡｒｇからなる群から選択され；Ｒ₂は、１ないし６アミノ酸ペプチドおよびＬｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ −Ａｒｇ−Ｈｉｓ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３３）からなる群から選択され；かつＢは、ＯＲ₃およびＮＲ₃Ｒ₄から選択され、ここでＲ₃およびＲ₄はＨ、Ｃ₁−Ｃ₆ アルキル、Ｃ₆−Ｃ₁₂アリールおよびＣ₆−Ｃ₁₂アリール−Ｃ₁−Ｃ₆アルキルから独立に選択される］によって表される、請求項１記載のＢＮＰ変異体。８．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。９．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。１０．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。１１．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。１２．以下の組成：を備える、請求項７記載のＢＮＰ変異体。１３．無菌の賦形剤および請求項１記載のＢＮＰ変異体を含む組成物。１４．薬学的に有効な量の請求項１３記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における電解質バランスの疾患を治療する方法。１５．薬学的に有効な量の請求項１３記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む、ナトリウム排泄増加、利尿または血管拡張を誘発する方法。