JPS62240699A - 新規合成心房ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背絽 本発明は、有用なナトリウム利尿活性を有する新規合成
心房ペプチドに関する。

近年、心房ペプチドについて精力的に研究が行なわれて
いる。これらは、本来、６城の心房筋肉から抽出された
ペプチドホルモンでである。これらのホルモンは、カル
デイオナトリン （ｃａｒｄｉｏｎａＬｒｉｎ）　、心房す１〜リウム利
尿活性因子（ＡＮＦ＞、アトリＡペプブン（ａｔｒｉＯ
ｐｅｐｔｉｎ：ＡＰ）、アトリオペブチゲン（ａｔｒｉ
ｏｐｅｐｔｉｏｅｎ　）　。

Ａ−リフリン（ａｕｒｉｃｕｌｉｎ　）　、カルディオ
テイラ／−：／　（ｃａｒｄｉｏｄｉｌａｔｉｎ　）な
どの各種の用語で命名されている。これらのペプチドに
ついては、短いものは約１８個のアミノ酸からなるペプ
チドから、長いものは１５０個以上のアミノ酸からなる
ペプチドまで、その生物学的活性が調べられている。

かかる生物学的活性には、例えば利尿活性、プトリウム
尿排泄活性、平滑筋弛緩作用、自圧降下作用などの生物
学的活性、あるいはまた体積バランス、ナトリウムホメ
オタシス、面管の緊張等において重要な役割りを果たす
生物学的活性などがある。

各樟心房ペプチドの生物学的特性及び構造についＣは、
非常に多くの詳細な文献が報告されている。心房ペプチ
ドのスＩｆＷＡ技術については、以下に挙げる最近の文
献が参考となり、これらを本明細書に引用する： ５ａＱｎ０１１ａ及びＨａｃＧｒｅｇｏｒ、　　Ｎａｔ
ｕｒｅ　３０９　、　６６ロー６６７　　（１９Ｂ／ｌ
）　　； Ｐａ１ｌｕｋら、　　ＬｉｆｃＳｃｉ、　　３６　（１
５）、　　１４１５−１４２５： Ｎｃａｄｌｅｓａｎ　　ら、　　ｌ１ｙｐｅｒｔｅｎｓ
ｉｏｎ　　　７　　（４）　　、　　４　６９−４８２
　　（１９８５）： ｄａ　　Ｂｏｌｄ、５ｃｉｅｎｃｅ　　２３０．　７６
７−７７０（１９８５）　　。

アトリＡペプチン（Ａｔｒｉｏｐｅｐｔｉｎ　）　Ｉ　
、　ＩＦ　、　ｍとして知られる、非常に興味ある一連
の重要な心房ペプチドについて報告され工いる（Ｃｕｒ
ｒｉｅら。

５ｃｉｅｎｃｅ　２２３．６７−６９　（１９８４）　
：Ｇｅ１ｌｃｒら、　　Ｂｉｏｃｈｃ腸、　　Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、　　Ｒｅｓ、　　Ｃｏｍｍｏｎ、　　　１２０
　（２）、３３３−３３８　（１９８４）：Ｎｃｅｄｌ
ｅｍａｎ、　Ｕ、　Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４．
４９６．５４４）。酸化型（環状型）のこれらのペプチ
ドは、次に承りアミノ酸配列を有している。

７トリオペプチンエ ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−ｐｔｓｃ−ｏｌｙ−ｏｌｙ−
ａｒ＜＋−ｉ　＋ｅ−ａｓｐ−ａｒｇ−ｉ　ｌＱ−Ｑｌ
ｙ−ａｌａ−ｇｌｎ−ＦＩ３ｒ−（ＪＩＶ−１ｃｕ−Ｑ
ＩｆＣ’１Ｓ−ｎＳｎ−！ａｅｒアｉ・リオベプヂン■ Ｓｅｒ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−ｔ）ｈｃ−ｇ１ｙ−ｏｌｙ−
ａｒｇ−ｉ　ｌｅ−ａｓｐ−ａｒｇ−ｉ　ｌｅ−ｇｌｙ
−ａｌａ−ｇｌｎ−ｓｅｒ−ｇ　ｌｙ−ｓｅｒ−ｓｃｒ
−ｃｙｓ−ｐｈｅ−ｏ　１ｙ−ｏｌｙ−ａｒｇ−ｉ　１
０−ａＳｌ）−ａｒｇ−ｉ　ＩＯ−Ｑ１ｙ−ａｌａ−ｇ
ｌｎ−５（３ｒ−Ｑｌ？＋ｃｕ−ｇ＋ｙ−ｃｙｓ−ａｓ
ｎ−ｓｅｒ−ｐｈｃ−ａｒｇ−ｔｙｒアトリオベプチン
（ＡＰ）−ＩＦのカルボキシ末１ｊｌｐｈｅ−ａｒｑが
欠落すると、△１〕−■の血管拡張作用が著しく低下し
、他方ＡＰ−１のＣ−末端にＩ）ｈｅ−ａｒｇ−ｔＶｒ
がイ・ｊ加されても血管の反応性が３１選されないこと
が知られているＨｌａｋｉｔａｎｉら、　Ｊ、　　ｔａ
ｂ、　Ｃｌ１ｍ、　Ｈａｄ、　　Ｉ　Ｑ　５（３）、　
　３４９−３５２　　（１９８５））　　。

心房ペプチドのアミノ末端にアミノ酸がイ１加された例
として、例えば次のしのが知られている（　ｒｔｙｎｎ
　　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃ
ｏｍｍｕｎ。

１１７　（３）、８５９−８６５　（１９８３）：５（
ｊｉｄａｈら、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　＾ｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＩＩＳ八　　８　１　　。

２６４０−２６４４　（１９８４））：ｓｅｒ−Ｉｅｕ
−ａｒｇ−ａｒｇ−八Ｐ−１１１及びＡｒ！７−ａｒｌ
Ｊ−ＡＰ−１Ｎ、 心房ペプチドの主な環状型として、５ｃｒ−Ｉ　ｅｕ−
ａｒｏ−ａｒｇ−ＡＰ−ＩＩが報告されている（　Ｓｃ
ｈｗａｒｔｚら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２９．３９７−
４００　（１９８５））。

また、ナトリウム尿排泄活性剤あるいは腎面管拡張剤と
しての心房ペプチドの構造活性相関についての議論もな
されている（Ｔｈｉｂａｕｌｔら。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、ｌ１ｅｓ、　Ｃｏ
ｍｍｕｎ、　　１２５　（３）　。

９３８−９４６　（１９８４）：Ｃａｒｃｉａら、　　
Ｉｂ１ｄ。

１２６（’Ｉ）、１７８−１８４（１９８５）：Ｋａｔ
ＳｕｂＯら、Ｉｂ１ｄ、１２８　（１）、３２５−３３
０（１９８５）：及びＪｏｈｎｓｏｎ、　１ｉｆｅ　Ｓ
ｃｉ、　　３８（３）、　　２２５−２３１　　（１９
８５））　　。

ヒト由来の心房ペプチドは、ラット由来の心房ペプチド
とは異なり、上記したＡＰ−１，Ｉ［及び■のアミノ酸
配列において８番目のイソロイシンに代わりにメチオン
ニンを有している（例えば、Ｋａｎａｇａｗａら　、　
　Ｂｉｏｃｈｃａ＋、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　Ｒｃｓ
、　　Ｃｏｍｍｕｎ。

１１８　（１）、１３１−１３９　（１９８４））。

発明の要旨 本発明にＪこれば、ＡＰ−Ｉ、ＩＦ、Ｉあるいはこれら
に関連した心房ペプチドのＮ−末端の３ｅｒ　　−ｓｅ
ｒ２を、１又は２個のフルＸ！ニン残りで置換すること
によって生物学的活性が高まることが見出された。この
ように活性が高まることは、他のアミノ酸例えばりシン
、ヒスデシンでｈ１様に置換した場合には活性は改良さ
れずむしろ低下した事実から判ｒ！ｆｉｎれば、極めて
驚くべきことでありまた予期し得ないことである。更に
は、最初にあるシスティンの前にりもむしろ直ぐ後の位
置をアルギニンで置換することにより、活性が高められ
ず同様に低下することが見出された。

しかして、本発明により以下に示すアミノ酸配列を有す
る新規合成ペプチド又はその生理学的に許容し得る塩、
エステル又はアミドが提供される。

Ｒ，−ｃｙｓ−ｐｈｅ−Ｏｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｏ−ｘ−
ａＳｐ−ａｒｇ−ｉ　１Ｏ−（ｌ　１ｙａｌａ−ｃｌｌ
ｎ−３ｅｒ−（ＪＩＶ−１ｅｌＪ−ＵＩＶ−ＣＶＳ−ａ
Ｓｎ−Ｒ２ト述した如ぎ好ましい合成心房ペプチドは、
２つのシスディンの硫黄原子間の結合によって生成され
たジスルフィド環を有している。一般的に、「＜１の（
ｆ＞　ｉをＤ−フルギニンステレオアイソマーで置換す
るよりも、し−アルギニシステレオアインマーで置換す
るのが好ましい。フリーの酸の形態であるよりも、アミ
ドの方が好ましい。最も好ましいアミドは、例えばエチ
ルアミド等の、Ｃアルキルで置換された七ノー又はジー
低級アルキル置換アミドである。

発明の詳細な記述 本発明の合成心房ペプチドは、慣用的ペプチド合成法を
採用することによりｍ製することができる。かくしてペ
プチド鎖は、一連のカップリング反応により調製するこ
とができ、この場合アミノ酸成分を次々に付加して目的
とする配列のペプチド鎖を得ることができる。例えばカ
ルボベルジルオキシ基、ｔ−ブブ・ルオキシーカルポニ
ルす（ＢＯ８）などの各種Ｎ−保ｓ基：例えばジシクＵ
へキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾールな
どの各種縮合剤；例えばＮ−ヒドロキシ−２タルイミド
、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどの各神酒性１スプ
ル：例えばトリフルＡ口酢酸、ジオキサン中のＨＣＬ、
ボロントリス（トリフルＡ［Ｊア廿テート）、シアノブ
ロマイドなどの各種１７１１製剤等は、古典的なペプチ
ド合成法に用いられる乙のとしてよく知られており、ま
た中間体の単離精製法も同様に周知である。

本発明のペプチドは、公知のＨｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相
支持法（Ｈｃｒｒｉｒｉｃｌｄ、　Ｊ、　Ａｍｅｒ、　
Ｃｈａｔ　Ｓｏｃ、　１３５　。

２１４９−５４　（１９６３）　：５ｃｉｃｎｃｃ　１
５０゜１７８−８５　（１９６５））ににり調ｙＪする
のが好ましい。この方法は、古典的ペプチド合成に使用
される多くの同様の化学反応及び保護基を用いるもので
あるが、この方法によれば、架橋ポリスチレン、スチレ
ンージビニルベンピンコボリマーなどの固相支持体にそ
のカルボキシ末端が固定されたペプチド鎖が得られる。

この方法では、単にポリマーを洗浄するだ＆Ｊで、各工
程での過剰の試薬を除去できるので、この方法は非常に
多くの操作が簡略化された方法と言える。

Ｈｅｒｒｉｒｉｅｌｄのペプチド合成の一般的反応スキ
ームは以下の通りである。

工稈工：り［１０メチルイエ程（べ１チドを結合させる
だめの反応性Ｕを導入する工程 であり、ＰＳはポリスチレン残基を示 す） トリエチルアンモニウム塩との反応） （ＣＨ３ＣＨ２）３Ｎ＋ＨＣｌ一 工程■：ペプチド形成工程（ジ　シクロへキシ、　　ル
カルボジイミドカップリング剤による） ○麿０ ニ ♂ Ｃう　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　Ｃ）■稈■に続いて、例えば５０％トリフルオ
ロｒｄ濱のメチリンク０ライド溶液でｔ　−　Ｂ　Ｏ　
Ｃ　１１を脱離ｕしめ、次いで過剰のトリエチルアミン
でＮ−末Ｑ７ミンをフリーにして、次の保護された７ミ
ノ１’ｉｌ：（Ｒ２）の活性化カルボキシル基との反応
が可能となるようにする。最終工程では、例えば無水ト
１Ｆのアニソール溶液．無水Ｈ　ＢｒのＭ１％ｆ又はト
リフルオロ酢酸溶液で処理して、ＰＳ樹脂から完成した
ペプチドを脱離せしめる。

固相合成法の背景技術についでは、Ｓｔｃｗａｒｔとｙ
ｏｕｎｇの論文“Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅＳｙｎｔｈｃｓｃｓ，”　Ｈ．　Ｉｆ．　ｌ’ｒｃ
ｃｎ＋ａｎ　＆　Ｃｏ．、　Ｓａｎｌｒａｎｃｉｓｃｏ
，　　１　９　６　９　：　Ｈｃｒｒｉｆｉｅｌｄの総
説＾ｄｖａｎｃｃｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓｏｌｏａｙ　　
３　２．　Ｄｏ．　２　２　１　−　２９　６　、　ｒ
．　ｒ．　Ｈｏｌｄ，　Ｅｄ．、　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，　Ｎｅｗ　Ｗｏｒｋ，　
　１　９　６　９　：及びＥｒｉｃｋｓｏｎとＨｃｒｒ
ｉｆｉｃｌｃｌの総説Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，　Ｖ
ｏｌ．　２　、　ｐ．　２５　５　ａｔ　ｓｅｑ．　（
ｅｄ．　Ｎｅｕｒａｔｈ　ａｎｄ旧１１）。

＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，
　１　９　７　Ｂが参考とされる。

本発明の合成心房ペプチドの生理学的活性の測定は、血
管平滑筋（ラビットの大動脈）の弛緩を測定するｉｎ　
ＶｉＬｒＯアッセイ法及び犬の腎での血流６尿の流れ及
び尿へのナトリウム排泄増加をモニターするｉｎ　ｖｉ
ｖｏアッセイ法により行なった。

ラビットの大動脈弛緩アッセイ（ＲＡ）は、本質的には
、ラットの７トリオベプチンＩ［［＝１．０をコン１〜
ロールどして用いるＣｕｒｒｉｅらの方法（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　２２１．７１−７３　（１９８３）　）により実
施した。このバイオアッセイ法では、ラビットの胸部大
動脈のらせん状小片を、３７℃で、酸素処理したフレ１
スーヘンセライ１〜（にｒｃｂｓ−１１ｅｎＳＯＩＯは
）溶液に常に浸し、そしＵ４．５Ｘ１０−８ＭＷ度のノ
ルエピネフリンを常に注入してこの小片の緊張度を一定
に保持する。次いで測定しようとりるペプチドの緩衝化
生理食塩水溶液をマイクロピペットで、大動脈組織上を
流れる培地の流れの中に加えて、ペプチドの効果を測定
する。

一定時間後、例えば３０分後におりる処理した大動脈ら
Ｕん状小ハの弛緩＜　ａｍ　）を測定し、コントロール
と比較する。

犬を用いた′？１機能テストは、木質的に、ラットのア
トすＡべ１チンＩ［［＝１．０をコントロールとして用
いるＫａｔｓｕｂｏらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｉｔｅｓ、　Ｃｏｍｎ＋ｕｎ、　　
１２８　（１）　、　３２５−３３０　（１９８５）に
より実施した。犬を用いたＦ［能テストぐは、ピーグル
犬をベンドパルビタールで麻酔し、４段階の濃爪の測定
しようとするペプチドの生理食塩水溶液を、ピーグル大
の腎臓内の動脈に注入し、用ｂ１依存曲線を作成して、
同様の投与量でのコントロールと比較した。コントロー
ルの場合には、瀧庭に依存して、電磁流プローブを用い
た腎血１（ＲＦ）及びフレーム光度計で測定したナトリ
ウム徘ｉ１ｊ’　（Ｕ　Ｎａ　Ｖ　）の増加が見られた
。

このバイオアツヒイでのスタンダードは、アトリオベプ
チン■を用いた。測定しようとするペプチドの各種生物
活性値は、コントロールの対応するそれぞれの活性値を
１．０として求めた。

以下に本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

以下の実施例では、前記したＨｅｒｒｉｒｉｃｌｄの古
典的固相法により、ペプチドを１％架橋ポリスチレン樹
脂支持体上に合成した。ペプチドアミドを合成する場合
には、同様にして４−メチルベンジルヒドリルアミン樹
脂を用いた。ペプチドのアルキルアミドを合成する場合
には、ペプチド合成を行なう前に、Ｈｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄｍｌｌｌｔをあらかじめ例えばエチルアミン等のアル
キルアミンで処理した。

一連の合成反応を下記表工に示した。

一般的に、３ｏｃ−７ミノＭ（Ｎ−保２ｉｉｉｉｔ−ブ
ブルＡキシカルボニル基を有する）とペプチド鎖との反
応速度は、基質の性質により変動するので、ペプチド樹
脂をニンヒドリン早色反応（Ｋａｉｓｃｒら、＾ｎａ１
．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　３　／Ｉ　、　　５９５−
５９８　（１９７０））でモニターし反応の終了を検定
した。反応が終了していない場合には、ベプヂドｌｉｌ
脂を更に新たなりｏｃ−アミノ酸及び縮合剤ジシクロへ
キシアミド（１）　ＣＣ）と反応せしめる。

本合成に用いたＮ−保護アミノ酸は、Ｂｏｃ−８ｃｒ　
（８２１）、Ｂｏｃ　　Ｃｙｓ　（４−ＭｃＢｚＪ）、
Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、Ｂｏｃ−Ｑｌｙ。

（３０Ｃ−ＡｒＱ　（１−ａｓ）、５ｏｃ−ｔｌｅ。

［，３ｏＣ−Ｍｅｔ、ＢＯＣ−ＡＳｐ（ＯＢ２１）Ｌ３
ｏｃ−Ａ　Ｉ　ａ、Ｂｏｃ−ＧＡ　ｎ、Ｂｏｃ−Ｌｅｖ
、８ｏｃ−Ａｓｎ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ−（２゜６−ジＣオ
Ｂ２１）であり、Ｉ８１脂は、ペプチド酸合成用にクロ
０メヂル化ボリスヂレンを使用し、ペプチドアミド川に
４−メチルベンズヒドリルアミンを使用した。ペプチド
を脱保護し、ＬＩ　Ｆで処理して樹脂から脱離せしめ、
次いでμＢｏｎｄａｐａｋ逆相カラムを用いた高圧クロ
マトグラフィーを使用して精製し、１５％−３０％アセ
トニトリル水溶液の溶出勾配（溶媒は０．０５％１〜リ
フルオロ酢酸で！１ｗｉ化した）で溶出せしめた。ペプ
チドの＄４瓜は、Ｖｙｄａｃカラムを用いた分析逆相Ｈ
Ｉ’）　Ｌ　Ｇ（丁ｈｅ　　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　
　Ｇｒｏｕｐ、　　１ｌｃｓｐｅｒｉａ。

Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　）を使用してモニターした。ペ
プチドを、空気にさらして炭酸アンモニウム液（ｐＨ７
．８）中で攪拌せしめて、酸化的にＩフ化（システィン
残基間のジスルフィド結合形成）せしめた。

環化反応の進行を分析ＨＰ　Ｌ　Ｃｔ−しニターし、反
応が終了した時に、ベプヂドを上２したと１６１様にし
て高圧カラムにより精製した。最終生成物を３０％Ｆｆ
ｔＭで凍結乾燥した。生成物のＭ４造を、アミノ酸分析
及びガス相マイクロシークエンシングで確認した。生成
物の純１ａは、２つの異なるカラム条件を用いたＩＩ　
Ｐ　Ｌ　Ｃにより確認した。

上記した固相ベブｆ−ド合成法で用いたＮ−保護アミノ
酸は以下の通りである。

Ｂｏｃ−Ｐｈｅ　　　　　　　＝　ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−フ
ェニルアラニン Ｂｏｃ−Ｇｌｙ　　　　　　　　＝　ｔ−Ｂｏｃ−グリ
シンＢｏｃ−１１ｅ　　　　　　　＝　ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ
−イソロイシンＢｏｃ−Ｎｅｔ　　　　　　　＝　ｔ−
Ｂｏｃ−Ｌ−メヂオニンＢｏｃ−Ａｌａ　　　　　　　
＝　ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニンＢｏｃ−Ｇｉｎ　　　　
　　　＝　ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−グルタミンＢｏｃ−Ｌｃｕ
　　　　　　　−ｔ−ＢｏＣ−Ｌ−ロイシン８ｏｃ−＾
Ｓｎ　　　　　　　−ｔ−ｅｏｃ−ｔ−アスパラギンＢ
ｏｃ−Ｔｙｒ（２，６−ｄｉｃｌＢｚｌ）　−ｔ−Ｂｏ
ｃ−０−２，（ｉ−ツク１］０−ベンジル−［−チロシ
ン 実／ｌ！１ＩＩｌ１１ 以下の如くして［ＡｒＱ　　、ａｒｑ２］　−ＡＰ−Ｉ
ｆ　−Ｎ　Ｈ２を合成し、そのｌＪ物活性をテストした
。

△０合成 上記した如き標準的固相ペプチド合成法により、ｐ−メ
チルベンズヒドリルアミン樹脂上に、その０．３５働ｍ
ｏｌ　　Ｎｌ２　／Ｅｌ　（樹脂）を置換することによ
りペプチドを構築した。１３　ｏ　ｃ−アミノ酸（３当
植）のカップリング反応をジシクロへキシルカルボジイ
ミド（３当ｈｓ　＞を用いてジク１］［１メタン／ＤＭ
Ｆ中で実施した。但しＧｌｎを縮合ヒしめる場合にμＦ
、１ｏｃ−Ｇ　Ｉ　ｎ−０Ｎｐ（２，５当吊）を用いた
。カップリング反応の終了は、ニンヒドリン？色テスト
によりモニターした。１−リフルオロ酢Ｍ／ジクｏｏメ
９ン（１：　１．Ｖ／Ｖ）を用い’ＣＢ　ｏ　ｃ　−１
ｉを脱ｌ１ＩＩせしめ、次いで１０％ジイソプロビルエ
ヂレンアミン／ジクロロメタン（Ｖ／Ｖｌで中和した。

以下に示した如くその側鎖に保ＳＵ＜カッコ内に示した
）を右する［ＡｒＯ、ａｒｇ　　］−］ＡＰ−ＩＩ−Ｎ
Ｈの配列を以下に示す。

−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−八ｒａ（Ｔｏｓ）−Ｃｙｓ（４−
１４ｅＢｚｌ　）−Ｐｈｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｏ（
Ｔｏｓ）−Ｉ　１ｃｍＡｓｐ（ＯＢｌｌ　）−Ａｒｏ（
ｌｏｓ）−１１ｅ−Ｇｌｙ−＾１ａ−Ｇｌｎ−３ｃｒ（
Ｂｚｌ　）−Ｇｌｙ−１ｃｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（４Ｈｅ
Ｂハ）−＾５ｎ−８ｃｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ−ＡｒＯ（
ｌｏｓ）−コノペプブトヲ、ＩＩＦ／７二’／−ル（９
：　１．Ｖ／Ｖ）と２−メルカプトビリジン（１５０１
９／９゛（べＩヂド樹脂））を用いて０℃で１ｖ１問処
理して樹脂から脱離せしめた。和ペプチドを３０％酢Ｉ
Ｉ／水で抽出し次いで凍結乾燥した。

Ｂ、庫笈反立１１ 粗ベプブドを、％ｅａｔｅｒｓ　ＲＰ　１ｔ　−Ｂｏｎ
ｄａｐａｋ　Ｇ　−１８カラム（１９履Ｘ１５０ａｍ）
を用いたＨ　Ｐ　ｌ−Ｃにより精製した。１５−３５％
アセトニトリル（０，０５％ＴＥＡ）の水（０，０５％
丁ＦＡ）溶液を直線勾配として３０分間以上使用した。

流速は９ＩＩ１１／１ｎ、であり、溶出液は波長２２５
ｎｍで。

追跡した。目的とする両分を集め分析して凍結乾燥した
。ペプチドを濃度０．１ａ！Ｆ／−の０．１Ｍ炭酸アン
モニウム緩衝液（ｐＨ７，８）中で２０時ｆ！ｌｌ　Ｉ
ＩＩ拌することににす、ペプチドの環化を行なった。次
いで得られる反応溶液を、酢酸でｐＨ２に酸性化し凍結
乾燥した。環化ペプチドを前記した如き条件で精製し、
１５−３５％アセトニトリル（０，０５％ＴＦＡ）の水
（０，０５％ＴＦＡ）溶液を溶出勾配としＶｙｄａｃ　
Ｃ−１８逆相カラム（４，６ａｍ＋Ｘ２５０ａｍ）を用
いた）−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより、得られるペプチドの純
瓜を分析した。流速は１１１１／ｓｉｎ、であった。ア
ミノ酸分析及びベプヂドシークエンシングを用いて、得
られた精製ペプチドの完全性を確認した。

ラビットの胸部大動脈のらせん状小片に１びの張力をか
けて、この小片をＭＩＡ処理したＫｒｃｂｓ−１１８１
１−３０１０ｉｔ溶液（３７℃）に流速１０μ！？／ｍ
ｉｎで常に浸した。４．５Ｘ１０−８Ｍノル１ピネフリ
ンにより静止緊張（ｒｅＳｔｉｎ（ｌ　ｔｏｎｅ）を誘
導した。

大動脈組織上を流れる培地の流れの中に、測定しようと
するペプチドをマイフロピヘットで加え、スタンダード
としてアトリオペブチン■を用いてペプチドのｈＩｌ性
を測定した。

Ｃ６２，レセプター結合アツＬイ ラビット肺膜上の心房ベブブドレセブターに対りる相対
的結合親和性を、合成した心房ペプチド誘η体について
測定した。各種濃度の測定しようと１Ｊるペプチドを、
　　　Ｉ−ラベル化ΔＰ−■及びラビツｔ・肺膜調整物
とインキニーベートした。

５０％の膜結合ラベル化ＡＰ−ＩＩＩとお換したペプチ
ド濃度を、そのペプチドのＩＣ５ｏｌｉｉ（５０％阻止
ｃＪ１ｆｆ＞とした。ＩＣ５−を、スタンダードとして
の非ラベル化ＡＰ−ＩＩＩの１Ｃ５ｏ値と比較し、測定
しようとするペプチドの相対的結合親和性を求。

めた。即ち、ベプ゛チドの相対的結合親和性は、（Ａト
］のＩＣ）／（ペプチドのＩＣ，、、）である。

Ｃ０３，ナトリウム尿祷泄増加 ナトリウム尿排泄増加活性及び腎血流の変化について、
約１２−１８月令の雄性純粋種ピーグル大（１２−１６
Ｎ９）を用いてベントバルピタールプ１−リウム麻酔下
に測定した。カフスの付いた気管内用チューブを挿入し
、空気を入れてふくらませた。大腿部動脈に力ｉ−デル
を刺し込み、面圧及び心拍速度を圧ｉ・ランジュー畳ナ
ーで追跡した。

右側腎臓部、尿管及び腎動脈を、腹膜の後ろを切開して
さらした。尿管にカテーテルを刺し込み、尿を５分間隔
で採集した。電磁流プローブを腎動脈の周辺にセットし
た。腎臓に近くかつ大動脈から離れた位冒で、自流とは
逆方向に、チューブを有するＬ型２２−ゲージニードル
を腎動脈内に挿入した。測定しようとするペプチドを、
緩衝化／１理食塩水溶液（ｐＨｃａ、　　７　、４　）
とし【注入し、１−のヘパリン（１０甲位／ｄ）で流い
出した。用品依存曲線を得るために、４段階の責なった
８１ａで、即ち１μｇ、３μｇ、１０μり及び３０μり
のＷＪ度で測定しようとするペプチドを注入した。

前に投与したテストサンプルのクリアランスｖＳｒｆＪ
に応じて、１５−３０分間ごとに定ＩＩ的に測定しよう
とするペプチドを投与した。測定後に犬を殺し、！Ｆ臓
を取り出し、その重さを測定した。尿ザンブルについて
は、その体積を測定し、ナトリウムＩ！ａｇＸはフレー
ム光度８１により測定した。

フリーのカルボンＭあるいはアミドの形態にあるアトリ
オベプヂン１．Ｉ、ＩＩのいくつかについて、そのＮ−
末端ｓｅｐ　　−ｓｅｒ２を、［ａｒｐ　　］、［ａｒ
ｇ　　、ａｒａ２１．［Ｄ−ａｒｇ　　］　、［Ｄ−ａ
ｒｇ　　、Ｄ−ａｒａ’　Ｊ。

Ｉｅｕ−［ａｒｇ　　、ａｒ０２］あるいはｓｅｒ−ｔ
ａｕ−［ａｒｇ　　、ａｒｇ２］Ｆｉｆｆｌｙｊ！Ｌ、
上記した如き方法でその生物話性を測定した。比較のた
めに、ＡＰ−ｎ−ＮＨ２の［ａｒｐ’ｌ。

［１ｙｓ　　、ｌｙｓ　　］及び［ｈ　ｉ　ｓ’　。

ｈｉｓ２Ｊ誘尋体を製造し、これらの生物活性寿測定し
た。次の表２は、これらの結果を示している。

に記結果から判るように、ＡＰ−１，Ｉｆ、ＩのＮ−末
端５ｃｒ１−ｓｅｒ２を、１又は２個（１）フルギニン
残基で買換することによって、一般的にその生物活性が
増強する。Ｎ−末端アルー亀＝ニン置換ＡＰ−Ｔアミド
の大動脈弛緩アッセイで２つの場合にのみ、有意な活性
低下が観察された。しかしく’Ｌがら後者の場合におい
ても、Ｎ−末端アルギニン置換ＡＰ−Ｉアミドは、対応
するＡＰ−Ｉのフリーのカルボン酸（ＡＰ−Ｉ−ＯＨ）
の形態の６のよりも、その大動脈弛緩活性は、高かった
。

Ｎ−一末端をリシンあるいはヒスデシンでＶ！ｉ換した
誘導体、又は最初のシスティン残りの前よりらむしろ直
ぐ後の位置をアルギニンでｔ１！！！シた誘導体は、そ
の生物活性が有意に低下することが上記結果の比較から
判る。後者のペプチドは、ラビットの肺膜のレヒブター
に結合するが、そのラビット大動脈弛緩アツ［イにおい
ては相対的に非活性である。

本発明の新規な合成ペプチドは、利尿剤、ナトリウム尿
排泄六進剤、血管拡張剤、平滑筋弛緩剤。

降圧剤として、そのような治療を必要とする患者に投与
することができる。かかるペプチドの通常の投与檄は、
患者の物理的特性、病気の重症度等によっている。投ち
聞は、有効量であって、医薬的に有利な囚であり利点を
越えて毒性を現わすような聞であってはならない。好ま
しい投与ルートは、非経口であり、特に静脈投与が好ま
しい。ペプチドを生理的食塩水に溶解して静脈投与する
方法が例示できる。薬理学的に許容し得る希釈剤。

担体とペプチドからなる好ましい投与形態としては、例
えばＲｅｎ＋１ｎａｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｅ（１，＾ｒｔｈｕｒ　
０ｓｏｌ、　１６ｔｈ　ｃｄ、、　１９８Ｇ。

Ｈａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔ
ｏｎ、　Ｐｃｎｎ５ｙｌｖａｎｉａなどの一般的テキス
トを参照して調製される投与形態のらのが挙げられる。

アメリカ特許出願Ｎｎ７３２．７８１　（出願日：１９
８５年５月１０日）に記載されている如き杼の剤も好ま
しい。かかる特許出願明細書の記載を本明細書に引用す
る。

水用ＭＪ書の記載から、当業者にとっては本発明の精神
及び範囲内にある他の各種の例が明らかであろう。でし
てかかる例ｂ１°ｂとより木切ａＳの特許請求の範囲内
にあるものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）以下のアミノ酸配列からなる強力なナトリウム利
   尿活性を有する合成ペプチド； Ｒ＿１−ｃｙｓ−ｐｈｃ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ−Ｘ
   −ａｓｐ−ａｒｇ−ｉｌｅ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｎ−
   ｓｅｒ−ｇ１ｙ−ｌｅｕ−ｇｌｙ−ｃｙｓ−ａｓｎ−Ｒ
   ＿２［式中、Ｒ＿１はａｒｇ、ａｒｇ−ａｒｇ、ｌｅｕ
   −ａｒｇ−ａｒｇ、ｓｅｒ−ｌｅｕ−ａｒｇ−ａｒｇ、
   Ｄ−ａｒｇ又はＤ−ａｒｇ−Ｄ−ａｒｇ、Ｒ＿２はＯＨ
   、ｓｅｒ、ｓｅｒ−ｐｈｅ、ｓｅｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ又
   はｓｅｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ｔｙｒ、 Ｘはｍｅｔ又はｉｌｅを表わす。］ 又はその生理学的に許容し得る塩、エステル又はアミド
   。 （２）２つのシステイン残基間にジスルフィド結合を有
   する酸化型の特許請求の範囲第１項記載の合成ペプチド
   。 （３）アミドがモノ又はジ低級アルキル置換アミドであ
   る特許請求の範囲第１項記載の合成ペプチド。 （４）Ｘがイソロイシン（ｉｌｅ）である特許請求の範
   囲第１項記載の合成ペプチド。 （５）Ｘがイソロイシンである特許請求の範囲第２項記
   載の合成ペプチド。 （６）Ｒ＿２がｓｅｒ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ｔｒｙである
   特許請求の範囲第５項記載の合成ペプチド。 （１）Ｒ＿２がアミドの形態にあるｓｅｒ−ｐｈｅ−ａ
   ｒｇである特許請求の範囲第５項記載の合成ペプチド。 （８）アミドがエチルアミドである特許請求の範囲第３
   項記載の合成ペプチド。 （９）アミドがエチルアミドである特許請求の範囲第７
   項記載の合成ペプチド。 （１０）Ｒ＿１がａｒｇである特許請求の範囲第１項記
   載の合成ペプチド。 （１１）Ｒ＿１がａｒｇ−ａｒｇである特許請求の範囲
   第１項記載の合成ペプチド。 （１２）Ｒ＿１がａｒｇである特許請求の範囲第２項記
   載の合成ペプチド。 （１３）Ｒ＾１がａｒｇ−ａｒｇである特許請求の範囲
   第２項記載の合成ペプチド。 （１４）Ｒ＾２がアミドの形態にあるｓｅｒ−ｐｈｅ−
   ａｒｇである特許請求の範囲第１１項記載の合成ペプチ
   ド。 （１５）アミドがエチルアミドである特許請求の範囲第
   １４項記載の合成ペプチド。 （１６）特許請求の範囲第１項記載の合成ペプチドの治
   療学的有効量を哺乳動物に投与することからなる、哺乳
   動物においてナトリウム尿排泄亢進、利尿、血管拡張又
   は腎の血流変化を引き起す方法。