JP2636500B2 - ブタ由来新規生理活性ペプチド - Google Patents
ブタ由来新規生理活性ペプチドInfo
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- JP2636500B2 JP2636500B2 JP3507547A JP50754791A JP2636500B2 JP 2636500 B2 JP2636500 B2 JP 2636500B2 JP 3507547 A JP3507547 A JP 3507547A JP 50754791 A JP50754791 A JP 50754791A JP 2636500 B2 JP2636500 B2 JP 2636500B2
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- amino acid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、ブタ由来のナトリウム利尿作用、血圧降下
作用更に血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有する新規な
生理活性ペプチド（CNP）に関する。
作用更に血管平滑筋細胞の増殖抑制作用を有する新規な
生理活性ペプチド（CNP）に関する。
背景技術 近年、哺乳類の心房及び脳から、体液及び血圧の恒常
性を調節しているホルモンとして、心房性ナトリウム利
尿ペプチド（atrial natriuretic peptide:ANP）と脳ナ
トリウム利尿ペプチド（brain natriuretic peptide:BN
P）と呼ばれる２種類のペプチドホルモンが発見され、
その構造及び生合成機構が明らかにされると共に、それ
らの生理作用についても明らかにされつつある。
性を調節しているホルモンとして、心房性ナトリウム利
尿ペプチド（atrial natriuretic peptide:ANP）と脳ナ
トリウム利尿ペプチド（brain natriuretic peptide:BN
P）と呼ばれる２種類のペプチドホルモンが発見され、
その構造及び生合成機構が明らかにされると共に、それ
らの生理作用についても明らかにされつつある。
ANPは最初、ヒト心房から分子量約3000のα型（α−h
ANP）、約6000のβ型（β−hANP）、13000のγ型（γ−
hANP）の３種類が単離され、それぞれの構造が明らかに
された（Kangawa,K.et al,Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,118 131,1984;Kangawa,K.et al,Nature,313 397,198
5）。
ANP）、約6000のβ型（β−hANP）、13000のγ型（γ−
hANP）の３種類が単離され、それぞれの構造が明らかに
された（Kangawa,K.et al,Biochem.Biophys.Res.Commu
n.,118 131,1984;Kangawa,K.et al,Nature,313 397,198
5）。
この結果、α−hANPは分子内に１個のＳ−Ｓ結合を
有した28個のアミノ酸からなる一本鎖ペプチドであるこ
と。β−hANPはα−hANPが分子間でＳ−Ｓ結合を形成
した逆平行２量体であること。γ−hANPはアミノ酸12
6個からなる高分子蛋白質で、そのＣ−末端部にα−hAN
P構造を有していることが判った。
有した28個のアミノ酸からなる一本鎖ペプチドであるこ
と。β−hANPはα−hANPが分子間でＳ−Ｓ結合を形成
した逆平行２量体であること。γ−hANPはアミノ酸12
6個からなる高分子蛋白質で、そのＣ−末端部にα−hAN
P構造を有していることが判った。
さらにα−hANPをコードするcDNAの解析から、hANP
（α−，β−，γ−hANP）の生合成は、いずれも同一の
前駆体タンパクから作られることが判った（Oikawa,S.e
t al,Nature,309 724,1984）。すなわちこれらのペプチ
ドは、まず、アミノ酸151残基よりなる前駆体（pre−hA
NP）として心房細胞で生合成され、ゴルジ（Golgi）体
でそのＮ−末端25残基から成るシグナルペプチドが切断
され、γ−hANPが生じる。次にγ−hANPはさらに酵素に
より切断、すなわちプロセシングを受けてα−hANPに転
換し、このα−hANPが主に血中に分泌されることが判っ
た。なお、β−hANPの生成過程は現在のところ不明であ
るが、α−hANPを経由して生成されると考えられてい
る。
（α−，β−，γ−hANP）の生合成は、いずれも同一の
前駆体タンパクから作られることが判った（Oikawa,S.e
t al,Nature,309 724,1984）。すなわちこれらのペプチ
ドは、まず、アミノ酸151残基よりなる前駆体（pre−hA
NP）として心房細胞で生合成され、ゴルジ（Golgi）体
でそのＮ−末端25残基から成るシグナルペプチドが切断
され、γ−hANPが生じる。次にγ−hANPはさらに酵素に
より切断、すなわちプロセシングを受けてα−hANPに転
換し、このα−hANPが主に血中に分泌されることが判っ
た。なお、β−hANPの生成過程は現在のところ不明であ
るが、α−hANPを経由して生成されると考えられてい
る。
hANPの構造が明らかになって以来、現在までに、他の
哺乳類動物のANP構造も明らかにされてきている。この
結果、ANPのアミノ酸配列はげっ歯類からヒトまでを含
む哺乳類動物において広い範囲で類似しており、特に、
α型ANP（α−ANP）はヒト、イヌ、ブタを含む高等哺乳
類においては同一のアミノ酸配列を持つこと、また、ラ
ットやウサギなどではα−hANPの12位メチオニン残基が
イソロイシンに置換している以外まったく同一のアミノ
酸配列を有していることが判ってきた（Oikawa,S.et a
l,Biochem.Biophys.Res.Commun.,132 892,1985;Forssma
nn,W.G.et al,Anat.Embryol.,168 307,1983）。
哺乳類動物のANP構造も明らかにされてきている。この
結果、ANPのアミノ酸配列はげっ歯類からヒトまでを含
む哺乳類動物において広い範囲で類似しており、特に、
α型ANP（α−ANP）はヒト、イヌ、ブタを含む高等哺乳
類においては同一のアミノ酸配列を持つこと、また、ラ
ットやウサギなどではα−hANPの12位メチオニン残基が
イソロイシンに置換している以外まったく同一のアミノ
酸配列を有していることが判ってきた（Oikawa,S.et a
l,Biochem.Biophys.Res.Commun.,132 892,1985;Forssma
nn,W.G.et al,Anat.Embryol.,168 307,1983）。
一方、抗α−hANP抗血清を用い、ANPの生体内分布を
調べたところ、ANPは心房の他にわずかながら脳にも分
布していることが判り、さらには脳で、視床下部、橋被
蓋（pontine tegmentum）にANP含有ニューロンの存在が
報告されていることから（Contin,M.et al,Histochemst
ry,80 113,1984;Saper,C.B.et al,Scienec,227 1047,19
85）、ANPは現在脳において心血管系の調節にかかわる
神経系の神経伝達物質としても作動しているのではない
かと考えられている。
調べたところ、ANPは心房の他にわずかながら脳にも分
布していることが判り、さらには脳で、視床下部、橋被
蓋（pontine tegmentum）にANP含有ニューロンの存在が
報告されていることから（Contin,M.et al,Histochemst
ry,80 113,1984;Saper,C.B.et al,Scienec,227 1047,19
85）、ANPは現在脳において心血管系の調節にかかわる
神経系の神経伝達物質としても作動しているのではない
かと考えられている。
一方、最近ブタの脳よりANPと構造は似ているが明ら
かに異なる新たなペプチドが単離同定され、さらにこの
ペプチドはANPと同様、ナトリウム利尿作用及び血圧降
下作用を有することが確認され、これらはBNPと命名さ
れた（Sudoh,T.et al,Nature,332 78,1988）。ブタ由来
BNP（pBNP）は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を有した26個
の一本鎖ペプチドであることが判り、また、ヒトのBNP
をコードするcDNAも単離され、BNPの前駆体構造も明ら
かになり、ANPとはまったく異なった前駆体から作られ
ることが判った（Sudoh,T.et al,Biochem.Biophys.Res.
Commun.,159 1427,189）。さらに、現在までに、ラット
のBNPの構造も明らかにされている（Kojima,M.et al,Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.,159 1420,1989）。
かに異なる新たなペプチドが単離同定され、さらにこの
ペプチドはANPと同様、ナトリウム利尿作用及び血圧降
下作用を有することが確認され、これらはBNPと命名さ
れた（Sudoh,T.et al,Nature,332 78,1988）。ブタ由来
BNP（pBNP）は分子内に１個のＳ−Ｓ結合を有した26個
の一本鎖ペプチドであることが判り、また、ヒトのBNP
をコードするcDNAも単離され、BNPの前駆体構造も明ら
かになり、ANPとはまったく異なった前駆体から作られ
ることが判った（Sudoh,T.et al,Biochem.Biophys.Res.
Commun.,159 1427,189）。さらに、現在までに、ラット
のBNPの構造も明らかにされている（Kojima,M.et al,Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.,159 1420,1989）。
ブタ脳においてBNPはANPに比べ10倍量存在しているこ
とが判り、このことはBNPが脳内において、体液や血圧
の恒常性を調節している神経系の神経伝達物質として作
用している可能性が高まった（Ueda,S.et al,Biochem.B
iophys.Res.Commun.,155 733,1988）。
とが判り、このことはBNPが脳内において、体液や血圧
の恒常性を調節している神経系の神経伝達物質として作
用している可能性が高まった（Ueda,S.et al,Biochem.B
iophys.Res.Commun.,155 733,1988）。
一方、BNPは脳以外にANPと同様心房にも存在し（ただ
し、心房でのBNPの存在量はANPの２〜３％）、心房から
血中へ分泌されていることから、ANPと同様に体液及び
血圧の恒常性を調節しているホルモンであることも判っ
た（Minamino,N.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1
55 740,1988;Aburaya,M.et al,Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,165 872,1989）。実際、pBNPはラットを用いた系
でα−hANPと同程度のナトリウム利尿作用、及び血圧降
下作用を有していることが確認されている。従って、現
在までのところ哺乳動物においては、少なくともタイプ
の明らかに異なる２種類の（ANP,BNP）のホルモンが存
在し、これらが体液及び血圧の恒常性を調節しているこ
とが判った。また、これらのペプチドはいずれも心房か
ら血中に分泌され、体液及び血圧の恒常性を調節するホ
ルモンとして作用している。さらにこれらは脳内にも存
在し、神経系の神経伝達物質として体液及び血圧の恒常
性を調節していることも判った。一方、現在までの研究
で、これらペプチドに対し、３種類のレセプターcDNAが
クローニングされ、その構造も明らかにされている。こ
のうち２種類は細胞内ドメインにグアニン酸シクラーゼ
（guanylatecyclase）ドメインを持っており、もう１種
は、一般にＣ−レセプター（clearance receptor）と呼
ばれており、このレセプターは細胞内ドメインにグアニ
ン酸シクラーゼドメインを持っていない（Chinkers,M.e
t al,Nature,338 78,1989;Chang,M.S.et al,Nature,341
68,1989;Schulz,et al,Cell58 1155,1989;Fuller,F.et
al,J.Biol.Chem.,263 9395,1988）。
し、心房でのBNPの存在量はANPの２〜３％）、心房から
血中へ分泌されていることから、ANPと同様に体液及び
血圧の恒常性を調節しているホルモンであることも判っ
た（Minamino,N.et al,Biochem.Biophys.Res.Commun.,1
55 740,1988;Aburaya,M.et al,Biochem.Biophys.Res.Co
mmun.,165 872,1989）。実際、pBNPはラットを用いた系
でα−hANPと同程度のナトリウム利尿作用、及び血圧降
下作用を有していることが確認されている。従って、現
在までのところ哺乳動物においては、少なくともタイプ
の明らかに異なる２種類の（ANP,BNP）のホルモンが存
在し、これらが体液及び血圧の恒常性を調節しているこ
とが判った。また、これらのペプチドはいずれも心房か
ら血中に分泌され、体液及び血圧の恒常性を調節するホ
ルモンとして作用している。さらにこれらは脳内にも存
在し、神経系の神経伝達物質として体液及び血圧の恒常
性を調節していることも判った。一方、現在までの研究
で、これらペプチドに対し、３種類のレセプターcDNAが
クローニングされ、その構造も明らかにされている。こ
のうち２種類は細胞内ドメインにグアニン酸シクラーゼ
（guanylatecyclase）ドメインを持っており、もう１種
は、一般にＣ−レセプター（clearance receptor）と呼
ばれており、このレセプターは細胞内ドメインにグアニ
ン酸シクラーゼドメインを持っていない（Chinkers,M.e
t al,Nature,338 78,1989;Chang,M.S.et al,Nature,341
68,1989;Schulz,et al,Cell58 1155,1989;Fuller,F.et
al,J.Biol.Chem.,263 9395,1988）。
しかし、現在までのところ、これらレセプターとリガ
ンド（ANP,BNP）との関係は明らかにされていない。言
い換えれば、各レセプターと生理作用との関係、リガン
ドとレセプターとの特異性などについては不明な点が多
い。
ンド（ANP,BNP）との関係は明らかにされていない。言
い換えれば、各レセプターと生理作用との関係、リガン
ドとレセプターとの特異性などについては不明な点が多
い。
以上述べたことを総合的に考えると、哺乳類におい
て、体液及び血圧の恒常性を調節しているホルモンは、
現在までに判っているANP,BNPだけであるかという疑問
が生じる。特に、前記したようにレセプターの多様性を
考えると、ANP,BNP以外第３の新規のペプチドホルモン
（新規リガンド）が存在している可能性が高い。
て、体液及び血圧の恒常性を調節しているホルモンは、
現在までに判っているANP,BNPだけであるかという疑問
が生じる。特に、前記したようにレセプターの多様性を
考えると、ANP,BNP以外第３の新規のペプチドホルモン
（新規リガンド）が存在している可能性が高い。
しかし、現在までのところ、新規リガンドの存在の有
無については不明である。
無については不明である。
従って、本発明では哺乳類で既に知られているANP,BN
Pと同様な薬理活性（例えば、ナトリウム利尿作用、血
圧降下作用）を示すが、これらとは構造が明確に区別さ
れる新規ペプチドホルモンを哺乳類から見いだし、この
ペプチドを提供する方法を確立することを目的とする。
Pと同様な薬理活性（例えば、ナトリウム利尿作用、血
圧降下作用）を示すが、これらとは構造が明確に区別さ
れる新規ペプチドホルモンを哺乳類から見いだし、この
ペプチドを提供する方法を確立することを目的とする。
発明の開示 本発明者は、ANPとBNPを単離・精製する際、比較的簡
単でしかも確実な生物活性測定法（bioassay）としてヒ
ヨコ直腸標本を用いた弛緩活性測定が有用であったこと
に着目し、このバイオアッセイを指標にブタの脳からナ
トリウム利尿作用及び血圧降下作用を有する新規ペプチ
ドホルモンを見つけだすことを計画した。
単でしかも確実な生物活性測定法（bioassay）としてヒ
ヨコ直腸標本を用いた弛緩活性測定が有用であったこと
に着目し、このバイオアッセイを指標にブタの脳からナ
トリウム利尿作用及び血圧降下作用を有する新規ペプチ
ドホルモンを見つけだすことを計画した。
本発明では、まず、ブタの脳を適当な酸性溶媒例えば
氷酢酸などの中でホモジネートし、これを出発原料に、
ペプチドの精製に常用される各種精製法を組み合わせ、
前記したバイオアッセイを指標に分子量約3000を示すペ
プチド画分を精製したところ、最終的には第２図に示す
ように、ヒヨコ直腸標本を用いたバイオアッセイ系で弛
緩活性を有するペプチドを単一で純粋な状態までに精製
することに成功した。次に、このペプチドの一部を還元
し、このペプチドに含まれるシステイン残基をカルボキ
シメチル化し、このペプチドのアミノ酸組成を決定した
ところ、第１表に示すごとく２個のシステイン残基を含
む22個のアミノ酸残基から成るペプチドであることが判
った。さらに、このペプチドのアミノ酸一次配列を決定
したところ、最終的にこのペプチドは以下に示す構造を
有する新規ペプチドであることを見いだした。
氷酢酸などの中でホモジネートし、これを出発原料に、
ペプチドの精製に常用される各種精製法を組み合わせ、
前記したバイオアッセイを指標に分子量約3000を示すペ
プチド画分を精製したところ、最終的には第２図に示す
ように、ヒヨコ直腸標本を用いたバイオアッセイ系で弛
緩活性を有するペプチドを単一で純粋な状態までに精製
することに成功した。次に、このペプチドの一部を還元
し、このペプチドに含まれるシステイン残基をカルボキ
シメチル化し、このペプチドのアミノ酸組成を決定した
ところ、第１表に示すごとく２個のシステイン残基を含
む22個のアミノ酸残基から成るペプチドであることが判
った。さらに、このペプチドのアミノ酸一次配列を決定
したところ、最終的にこのペプチドは以下に示す構造を
有する新規ペプチドであることを見いだした。
（式中、（１）と（２）、（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と22位のシステイン残基（Cys）は分子内
でＳ−Ｓ結合を形成している。） 以下本明細書において、この新規ペプチドをCNP（Ｃ
−type−natriuretic peptide）と称する。
ており、６位と22位のシステイン残基（Cys）は分子内
でＳ−Ｓ結合を形成している。） 以下本明細書において、この新規ペプチドをCNP（Ｃ
−type−natriuretic peptide）と称する。
CNPのアミノ酸一次配列及び構造をブタ由来α−ANP,B
NPと比較したところ（第４図参照）、これらのペプチド
はいずれも分子内に１個のＳ−Ｓ結合を有し、17アミノ
酸残基で構成される環状構造を持っており、さらにこの
環状構造を形成しているアミノ酸一次配列は、CNP,α−
ANP,BNPで高い相同性を持ち、17アミノ酸残基のうち、1
2残基は同じアミノ酸残基であることが判った。
NPと比較したところ（第４図参照）、これらのペプチド
はいずれも分子内に１個のＳ−Ｓ結合を有し、17アミノ
酸残基で構成される環状構造を持っており、さらにこの
環状構造を形成しているアミノ酸一次配列は、CNP,α−
ANP,BNPで高い相同性を持ち、17アミノ酸残基のうち、1
2残基は同じアミノ酸残基であることが判った。
しかしながら、CNPの構造はこの環状構造部分を除く
と、Ｎ−及びＣ−末端部分でα−ANPまたはBNPとまった
く異なった構造をしている。特に、特徴的なことは、Ｃ
−末端部分の構造であり、α−ANP,BNPのＣ−末端部分
の構造が環状構造を形成しているシステイン残基をさら
に数個のアミノ酸残基を付加したtail構造を有している
のに対し、CNPはＣ−末端が22位システイン残基である
ことから、このtail構造を持たない。また、CNPはＮ−
末端部分のアミノ酸一次配列はα−ANP,BNPのいずれと
も相同性は見られない。これらのことから、CNPは従来
知られているα−ANP,BNPとは構造的に似ているが明ら
かに異なる新規ペプチドであることが判った。
と、Ｎ−及びＣ−末端部分でα−ANPまたはBNPとまった
く異なった構造をしている。特に、特徴的なことは、Ｃ
−末端部分の構造であり、α−ANP,BNPのＣ−末端部分
の構造が環状構造を形成しているシステイン残基をさら
に数個のアミノ酸残基を付加したtail構造を有している
のに対し、CNPはＣ−末端が22位システイン残基である
ことから、このtail構造を持たない。また、CNPはＮ−
末端部分のアミノ酸一次配列はα−ANP,BNPのいずれと
も相同性は見られない。これらのことから、CNPは従来
知られているα−ANP,BNPとは構造的に似ているが明ら
かに異なる新規ペプチドであることが判った。
さらに、CNPのα−hANPまたはBNPとの構造類似性から
考え、本発明者はCNPがナトリウム利尿作用及び血圧降
下作用を示すのではないかと考え、CNPをラット静脈に
投与し、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を調べた
ところ、CNPは明らかにこれらの作用を持つことを見い
だし（第２表参照）、本発明を完成した。すなわち、本
発明者は、哺乳動物で既に知られているANP,BNPと同様
な薬理活性（例えば、ナトリウム利尿作用、血圧降下作
用）を持っているが、これらとは構造が明確に区別され
る新規ペプチドホルモンを、哺乳動物から見いだすべく
鋭意研究を行った結果、ブタの脳より22個のアミノ酸残
基より構成される新規ペプチド（CNP）を単離すること
に成功し、このペプチドの構造を決定すると共に、この
ペプチドが顕著なナトリウム利尿作用、血圧降下作用を
有することを見いだし、本発明を完成した。
考え、本発明者はCNPがナトリウム利尿作用及び血圧降
下作用を示すのではないかと考え、CNPをラット静脈に
投与し、ナトリウム利尿作用及び血圧降下作用を調べた
ところ、CNPは明らかにこれらの作用を持つことを見い
だし（第２表参照）、本発明を完成した。すなわち、本
発明者は、哺乳動物で既に知られているANP,BNPと同様
な薬理活性（例えば、ナトリウム利尿作用、血圧降下作
用）を持っているが、これらとは構造が明確に区別され
る新規ペプチドホルモンを、哺乳動物から見いだすべく
鋭意研究を行った結果、ブタの脳より22個のアミノ酸残
基より構成される新規ペプチド（CNP）を単離すること
に成功し、このペプチドの構造を決定すると共に、この
ペプチドが顕著なナトリウム利尿作用、血圧降下作用を
有することを見いだし、本発明を完成した。
また、本発明のペプチドについて、血管平滑筋培養細
胞系における増殖抑制活性を有することを見出し、更
に、同じ系において弛緩作用のセカンドメッセンジャー
と考えられているサイクリックグアノシンモノフォスフ
ェート（cGMP）の産生を促進する活性も見出された。こ
れらの血管平滑筋細胞の増殖抑制作用とcGMP産生活性と
を考えれば本発明のペプチドはアテローム性動脈硬化症
の有効な治療薬となり得ることが予想される。
胞系における増殖抑制活性を有することを見出し、更
に、同じ系において弛緩作用のセカンドメッセンジャー
と考えられているサイクリックグアノシンモノフォスフ
ェート（cGMP）の産生を促進する活性も見出された。こ
れらの血管平滑筋細胞の増殖抑制作用とcGMP産生活性と
を考えれば本発明のペプチドはアテローム性動脈硬化症
の有効な治療薬となり得ることが予想される。
以上説明した通り、本発明のペプチド又はその塩は優
れた平滑筋弛緩作用を有し、さらに利尿及びナトリウム
利尿作用、血圧降下作用を有するので、例えば心臓性浮
腫、腎臓性浮腫、肝臓性浮腫、高血圧症、うっ血性心不
全、急性及び慢性陣不全等の治療薬として有用である。
れた平滑筋弛緩作用を有し、さらに利尿及びナトリウム
利尿作用、血圧降下作用を有するので、例えば心臓性浮
腫、腎臓性浮腫、肝臓性浮腫、高血圧症、うっ血性心不
全、急性及び慢性陣不全等の治療薬として有用である。
本発明のペプチドはナトリウム、カリウム、リチウ
ム、カルシウム等の金属塩、有機篠基による塩の形態で
あってもよい。また硫酸、塩酸、リン酸等の鉱酸、ある
いは酢酸、マレイン酸等の有機酸との塩の形態であって
もよい。もちろん本発明に関するペプチドを医薬に使用
するときには、遊離形または医薬的に許容し得る塩であ
ってもよい。
ム、カルシウム等の金属塩、有機篠基による塩の形態で
あってもよい。また硫酸、塩酸、リン酸等の鉱酸、ある
いは酢酸、マレイン酸等の有機酸との塩の形態であって
もよい。もちろん本発明に関するペプチドを医薬に使用
するときには、遊離形または医薬的に許容し得る塩であ
ってもよい。
本発明のペプチドもしくはその薬理学的に許容しうる
塩は、自体公知の薬理的に許容しうる単体、賦形剤、希
釈剤などと混合してペプチド医薬に一般に使用されてい
る投与方法、すなわち非経口投与方法、例えば静脈内投
与、筋肉内投与、皮下投与等によって投与するのが好ま
しい。経口投与した場合、本発明の医薬組成物は消化管
内で分解を受けるためこの投与方法は一般的には効果的
でないが、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活
性成分である本ペプチドをリボソーム中に抱容したマイ
クロカプセル剤として経口投与することも可能である。
また、直腸、鼻内、舌下などの消化管以外の粘膜から吸
収せしめる投与方法も可能である。この場合は坐剤、点
鼻スプレー、舌下錠といった形態で投与することができ
る。
塩は、自体公知の薬理的に許容しうる単体、賦形剤、希
釈剤などと混合してペプチド医薬に一般に使用されてい
る投与方法、すなわち非経口投与方法、例えば静脈内投
与、筋肉内投与、皮下投与等によって投与するのが好ま
しい。経口投与した場合、本発明の医薬組成物は消化管
内で分解を受けるためこの投与方法は一般的には効果的
でないが、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活
性成分である本ペプチドをリボソーム中に抱容したマイ
クロカプセル剤として経口投与することも可能である。
また、直腸、鼻内、舌下などの消化管以外の粘膜から吸
収せしめる投与方法も可能である。この場合は坐剤、点
鼻スプレー、舌下錠といった形態で投与することができ
る。
本発明の医薬組成物の投与量は、疾患の種類、患者の
年齢、体重、症状の程度および投与経路などによっても
異なるが、一般的に0.1μg/kg〜100mg/kgの範囲で投与
することができ、0.5μg/kg〜5mg/kgの範囲で投与する
のが好ましく、１μg/kg〜1mg/kgが更に好ましい。
年齢、体重、症状の程度および投与経路などによっても
異なるが、一般的に0.1μg/kg〜100mg/kgの範囲で投与
することができ、0.5μg/kg〜5mg/kgの範囲で投与する
のが好ましく、１μg/kg〜1mg/kgが更に好ましい。
なお、本発明ではCNPをブタの脳から単離・精製した
が、本発明でこのCNPの構造を明らかにしたことから、C
NPは一般によく知られている化学合成法又は遺伝子操作
法により簡単に製造できることは言うまでもない。
が、本発明でこのCNPの構造を明らかにしたことから、C
NPは一般によく知られている化学合成法又は遺伝子操作
法により簡単に製造できることは言うまでもない。
図面の簡単な説明 第１図は、ブタ脳から抽出物（SP−III分画をさらにS
ephadex G−50とＧ−25を用い分画した分子量約3000の
ペプチド画分）をCMイオン交換クロマトグラフィーを用
いてさらに精製したときの溶出経過及び各画分のヒヨコ
直腸弛緩活性を示すグラフである。
ephadex G−50とＧ−25を用い分画した分子量約3000の
ペプチド画分）をCMイオン交換クロマトグラフィーを用
いてさらに精製したときの溶出経過及び各画分のヒヨコ
直腸弛緩活性を示すグラフである。
第２図は、CNPの最終精製に用いた逆相HPLCの溶出経
過及び各画分のヒヨコ直腸弛緩活性を示すチャートであ
る。
過及び各画分のヒヨコ直腸弛緩活性を示すチャートであ
る。
第３図は、（RCM）CNPのエドマン分解における各サン
プルのPTH−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列を示すグ
ラフである。各アミノ酸は一文字表記で表され、CmはＳ
−カルボキシメチルシステイン残基を示す。
プルのPTH−アミノ酸の収率及びアミノ酸配列を示すグ
ラフである。各アミノ酸は一文字表記で表され、CmはＳ
−カルボキシメチルシステイン残基を示す。
第４図は、ブタのα−hANP,BNP及びCNPのアミノ酸一
次配列及びこれらのペプチドのアミノ酸一次配列の相同
性を示す表である。
次配列及びこれらのペプチドのアミノ酸一次配列の相同
性を示す表である。
第５図はCNP,ANP及び８−br−cGMPのチミジン取込み
阻害活性を示すグラフである。
阻害活性を示すグラフである。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
実施例1.ブタ脳からのCNPの単離・精製 ブタ480匹から40kgの脳を摘出し、細断した後、プロ
テアーゼを不活化するために２容量の沸騰水で５分間処
理する。冷却後氷酢酸を最終濃度が1Mになるように加
え、この組織をポリトロンミキサーを用いてホモジナイ
ズする。次に、このホモジナイトを遠心分離することに
より、沈澱画分と上清画分に分離し：この上清画分をペ
リコン カセット（Pellicon cassette;PCAC＃000−05,
Millipore）を用いて濃縮する。この濃縮液にアセトン
を最終濃度66％になるように加え、生じた沈澱を遠心操
作で除去し、上清を減圧濃縮した。ここで得られた濃縮
液を0.5M酢酸に溶かし、４回に分けてC18シカゲルカラ
ム（1.5容量,LC−SORB SPW−Ｃ−ODS,Chemco）にか
け、カラムに吸着したペプチドを水、アセトニトリル
（CH3CN）、10％トリフルオロ酢酸（TFA）が40:60:1（V
/V）になるように調製した溶液で溶出し、この溶出液を
濃縮することにより、乾燥重量26gのペプチドを含有す
る残渣を得た。このうち1/2量を1Mを酢酸に溶かし、1M
酢酸で平衡化したSP−セファデックスＣ−25カラム（H+
−form,3×38cm）を用いたイオン交換クロマトグラフィ
ーにかけた。次に、カラムに吸着したペプチドを1M酢
酸、2Mピリジン、及び2Mピリジン−酢酸（pH5.0）を用
いて溶出し、各溶出液による溶出画分をSP−Ｉ、SP−II
及びSP−IIIとし、これらをそれぞれ凍結乾燥した。こ
のようにした得たSP−III画分（乾燥重量5.2g）をセフ
ァデックスＧ−50カラム（fine,7.5×145cm,ファルマシ
ア）を用いたゲル濾過にかけることにより、分子量約10
00〜5000のペプチド含有画分を乾燥重量2.96g得た。さ
らに、この画分をセファデックスＧ−25カラム（fine,
7.5×150cm,ファルマシア）を用いたゲル濾過にかけ、
分子量3000のペプチド画分を乾燥重量440mg得た。次に
この画分をCM（CM−52,2.4×45cm,whatman）を用いたイ
オン交換クロマト〔溶出液A;10mM HCOONH4（pH6.6）:CH
3CN＝90:10（V/V），溶出液B;0.5M HCOONH4（pH6.6）:C
H3CN＝90:10（V/V），溶出条件；溶出液Ａと溶出液Ｂを
用いた直線濃度勾配、流速:35ml/hr,画分サイズ;20ml/t
ube〕でさらに分画（第１図参照）、第１図に示すfract
ion number51〜53の画分を集めた。次に、この画分（29
mg）を抗−ANP抗体を用いたイムノアフィニティクロマ
トグラフィー（このカラムの作製に関しては本発明者等
の報告に詳細に記載されている;Ueda,S.et al,Biochem.
Biophys.Res.Commun.,1987 149 1055−1067）にかけ、
このカラムに吸着着したペプチドを10％CH3CNを含む1M
酢酸溶液で溶出した。本発明における新規生理活性ペプ
チドの収精製は、前記イムノアフィニティカラムに吸着
したペプチド画分をさらに、ジフェニルカラム（219 TP
54,4.6×250mm,Vydac）を用いた逆相HPLC〔流速;1ml/mi
n,溶出液;H2O:CH3CN:10％TFA＝（Ａ）90:10:1,（Ｂ）4
0:60:1（V/V），溶出条件；溶出液Ａと溶出液Ｂを用い
た直線濃度勾配;120分間〕で分離・精製し、各画分をヒ
ヨコ直腸標本弛緩活性を調べた。この結果、第２図に示
すごとくヒヨコ直腸標本で弛緩活性を示すペプチドを、
HPLCで単一ピークを示すまで精製することに成功し、こ
れをCNPと命名した。なお、CNPの収率はブタ脳40kgから
スタートして約１μｇ（400pmol）得ることができた。
テアーゼを不活化するために２容量の沸騰水で５分間処
理する。冷却後氷酢酸を最終濃度が1Mになるように加
え、この組織をポリトロンミキサーを用いてホモジナイ
ズする。次に、このホモジナイトを遠心分離することに
より、沈澱画分と上清画分に分離し：この上清画分をペ
リコン カセット（Pellicon cassette;PCAC＃000−05,
Millipore）を用いて濃縮する。この濃縮液にアセトン
を最終濃度66％になるように加え、生じた沈澱を遠心操
作で除去し、上清を減圧濃縮した。ここで得られた濃縮
液を0.5M酢酸に溶かし、４回に分けてC18シカゲルカラ
ム（1.5容量,LC−SORB SPW−Ｃ−ODS,Chemco）にか
け、カラムに吸着したペプチドを水、アセトニトリル
（CH3CN）、10％トリフルオロ酢酸（TFA）が40:60:1（V
/V）になるように調製した溶液で溶出し、この溶出液を
濃縮することにより、乾燥重量26gのペプチドを含有す
る残渣を得た。このうち1/2量を1Mを酢酸に溶かし、1M
酢酸で平衡化したSP−セファデックスＣ−25カラム（H+
−form,3×38cm）を用いたイオン交換クロマトグラフィ
ーにかけた。次に、カラムに吸着したペプチドを1M酢
酸、2Mピリジン、及び2Mピリジン−酢酸（pH5.0）を用
いて溶出し、各溶出液による溶出画分をSP−Ｉ、SP−II
及びSP−IIIとし、これらをそれぞれ凍結乾燥した。こ
のようにした得たSP−III画分（乾燥重量5.2g）をセフ
ァデックスＧ−50カラム（fine,7.5×145cm,ファルマシ
ア）を用いたゲル濾過にかけることにより、分子量約10
00〜5000のペプチド含有画分を乾燥重量2.96g得た。さ
らに、この画分をセファデックスＧ−25カラム（fine,
7.5×150cm,ファルマシア）を用いたゲル濾過にかけ、
分子量3000のペプチド画分を乾燥重量440mg得た。次に
この画分をCM（CM−52,2.4×45cm,whatman）を用いたイ
オン交換クロマト〔溶出液A;10mM HCOONH4（pH6.6）:CH
3CN＝90:10（V/V），溶出液B;0.5M HCOONH4（pH6.6）:C
H3CN＝90:10（V/V），溶出条件；溶出液Ａと溶出液Ｂを
用いた直線濃度勾配、流速:35ml/hr,画分サイズ;20ml/t
ube〕でさらに分画（第１図参照）、第１図に示すfract
ion number51〜53の画分を集めた。次に、この画分（29
mg）を抗−ANP抗体を用いたイムノアフィニティクロマ
トグラフィー（このカラムの作製に関しては本発明者等
の報告に詳細に記載されている;Ueda,S.et al,Biochem.
Biophys.Res.Commun.,1987 149 1055−1067）にかけ、
このカラムに吸着着したペプチドを10％CH3CNを含む1M
酢酸溶液で溶出した。本発明における新規生理活性ペプ
チドの収精製は、前記イムノアフィニティカラムに吸着
したペプチド画分をさらに、ジフェニルカラム（219 TP
54,4.6×250mm,Vydac）を用いた逆相HPLC〔流速;1ml/mi
n,溶出液;H2O:CH3CN:10％TFA＝（Ａ）90:10:1,（Ｂ）4
0:60:1（V/V），溶出条件；溶出液Ａと溶出液Ｂを用い
た直線濃度勾配;120分間〕で分離・精製し、各画分をヒ
ヨコ直腸標本弛緩活性を調べた。この結果、第２図に示
すごとくヒヨコ直腸標本で弛緩活性を示すペプチドを、
HPLCで単一ピークを示すまで精製することに成功し、こ
れをCNPと命名した。なお、CNPの収率はブタ脳40kgから
スタートして約１μｇ（400pmol）得ることができた。
実施例2.CNPの構造決定 A.CNPのＳ−カルボキシメチル化 実施例１で得たCNPの3/4量を0.5M Tris−HCl buffer
（pH8.0）中50mMのdithiothreitol（DTT）を用い37℃、
４時間反応させ、次いで100mMのヨード酢酸（iodoaceta
te）を加え５分間処理することにより、CNPのＳ−カル
ボキシメチル体すなわち（RCM）CNPを得た。
（pH8.0）中50mMのdithiothreitol（DTT）を用い37℃、
４時間反応させ、次いで100mMのヨード酢酸（iodoaceta
te）を加え５分間処理することにより、CNPのＳ−カル
ボキシメチル体すなわち（RCM）CNPを得た。
B.（RCM）CNPのアミノ酸組成の決定 実施例２のＡで得た（RCM）CNP約150pmolを、まず0.1
％フェノールと0.02％の２−メルカプトエタノールを含
んだ6N塩酸で110℃、24時間処理することにより（RCM）
CNPを完全水解した。次ぎにこのサンプルをHitachi L−
8500アミノ酸分析機を用いて（RCM）CNPのアミノ酸組成
を求めたところ、第１表に示す値が得られ、この結果CN
Pは２個のシステイン残基を含む22個のアミノ酸残基よ
り成るペプチドであることが判った。
％フェノールと0.02％の２−メルカプトエタノールを含
んだ6N塩酸で110℃、24時間処理することにより（RCM）
CNPを完全水解した。次ぎにこのサンプルをHitachi L−
8500アミノ酸分析機を用いて（RCM）CNPのアミノ酸組成
を求めたところ、第１表に示す値が得られ、この結果CN
Pは２個のシステイン残基を含む22個のアミノ酸残基よ
り成るペプチドであることが判った。
第１表は（RCM）CNPのアミノ酸組成を示す。なお、
（ ）内の数値は測定値に最も近い整数値を示し、CmCy
sはＳ−カルボキシメチルシステインを示す。
（ ）内の数値は測定値に最も近い整数値を示し、CmCy
sはＳ−カルボキシメチルシステインを示す。
C.（RCM）CNPのアミノ酸一次配列の決定 実施例２のＡで作製した（RCM）CNP約150pmolを用
い、アミノ酸配列自動分析機（Applied Biosystems470A
/120A）に供し、エドマン分解法によりアミノ酸一次配
列を分析した結果、第３図に示す結果が得られ、（RC
M）CNPのアミノ酸一次配列を決定した。
い、アミノ酸配列自動分析機（Applied Biosystems470A
/120A）に供し、エドマン分解法によりアミノ酸一次配
列を分析した結果、第３図に示す結果が得られ、（RC
M）CNPのアミノ酸一次配列を決定した。
D.CNPの化学合成及びＳ−Ｓ結合様式の同定 実施例２のＣで決定したアミノ酸一次配列を基にCNP
をペプタイド合成機（Applied Biosystems430A）を用い
た固相合成法で合成した。
をペプタイド合成機（Applied Biosystems430A）を用い
た固相合成法で合成した。
なお、合成の際システイン残基のSH保護基として４−
メチルペンジル（４−methylbenzyl）を用い、HFを用い
て完全脱保護した後、CNPの6,22位のシステイン残基のS
H基をフェリシアン化カリウム〔K3Fe（CH）６〕で処理
することにより分子内Ｓ−Ｓ結合を形成させた。このよ
うにして合成したCNPは、アミノ酸分析、アミノ酸一次
配列の解析を行いその構造を確認した。さらに、この化
学合成したCNPと実施例１で得た天然由来のCNPはHPLCの
溶出時間が完全に一致したことから、最終的にCNPの構
造は、 （式中、（１）と（２）、（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と22位のシステイン残基（Cys）は分子内
でＳ−Ｓ結合を形成している。）であると決定した。
メチルペンジル（４−methylbenzyl）を用い、HFを用い
て完全脱保護した後、CNPの6,22位のシステイン残基のS
H基をフェリシアン化カリウム〔K3Fe（CH）６〕で処理
することにより分子内Ｓ−Ｓ結合を形成させた。このよ
うにして合成したCNPは、アミノ酸分析、アミノ酸一次
配列の解析を行いその構造を確認した。さらに、この化
学合成したCNPと実施例１で得た天然由来のCNPはHPLCの
溶出時間が完全に一致したことから、最終的にCNPの構
造は、 （式中、（１）と（２）、（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と22位のシステイン残基（Cys）は分子内
でＳ−Ｓ結合を形成している。）であると決定した。
実施例3.CNPの生物学的性質 A.CNPのヒヨコ直腸弛緩活性 ヒヨコ直腸弛緩活性はCurris等の方法（Currie et a
l.Mature,221 １−13,1983）に従い測定した。この測
定系でCNPはα−hANPに比べ約３〜４倍高い活性を示し
た。
l.Mature,221 １−13,1983）に従い測定した。この測
定系でCNPはα−hANPに比べ約３〜４倍高い活性を示し
た。
B.CNPのナトリウム利尿作用及び血圧効果作用 雄性SD系ラット（体重230−290g）ペントバルビター
ル65mg/kgを腹腔内投与し、麻酔し、気道確保のため気
管カニューレ（PE−240クレイ・アダムス社製）を施
す。股動脈に血圧測定用のカニューレ（PE−50）を挿入
し、また股静脈に挿入したカニューレ（PE−10）を通じ
てリンゲル液を1.8ml/hrの速度で定常注入する。シラス
ティックチューブ（内径0.02インチ、外径0.037イン
チ、ダウコーニング社製）の膀胱カニューレより試験管
内に採尿し、この採尿は被験物質を投与する前15分間と
投与後５分間ずつ15分後まで及びその後経時的に行っ
た。この試料の量そして試料中の電解質濃度を比較する
ことにより、及び血圧の変化により被験物質の作用を測
定した。
ル65mg/kgを腹腔内投与し、麻酔し、気道確保のため気
管カニューレ（PE−240クレイ・アダムス社製）を施
す。股動脈に血圧測定用のカニューレ（PE−50）を挿入
し、また股静脈に挿入したカニューレ（PE−10）を通じ
てリンゲル液を1.8ml/hrの速度で定常注入する。シラス
ティックチューブ（内径0.02インチ、外径0.037イン
チ、ダウコーニング社製）の膀胱カニューレより試験管
内に採尿し、この採尿は被験物質を投与する前15分間と
投与後５分間ずつ15分後まで及びその後経時的に行っ
た。この試料の量そして試料中の電解質濃度を比較する
ことにより、及び血圧の変化により被験物質の作用を測
定した。
なお、被験物質CNPは、その所定量を0.1N酢酸に溶解
した後、1/10容量の1.3Mトリス溶液で中和する。これを
50μの減菌生理水で希釈し、頚静脈から投与した。こ
の結果、第２表に示すように、CNPはナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示すことが判り、さらに、これら
の作用は容量依存的に増大することが判った。
した後、1/10容量の1.3Mトリス溶液で中和する。これを
50μの減菌生理水で希釈し、頚静脈から投与した。こ
の結果、第２表に示すように、CNPはナトリウム利尿作
用及び血圧降下作用を示すことが判り、さらに、これら
の作用は容量依存的に増大することが判った。
第２表は、CNPのナトリウム利尿作用及び血圧降下作
用を示す。
用を示す。
C.細胞増殖抑制活性の測定 細胞増殖能はKariyaらの方法に従い（Athero scleros
is,80 143−147,1990）、ラットのVSMCを用いDNA合成活
性として3Hチミジンの細胞内へのとりこみを測定した。
静止期に同調させた細胞を１％の血清存在下で種々の濃
度のα−hANPないしCNPと37℃14時間インキュベート
し、37KBq/mlの〔3H〕チミジンを加えてさらに４時間イ
ンキュベートした。細胞内にとりこまれた〔3H〕チミジ
ンの放射能を測定した。なお、測定値は、ペプチド非存
在下で１％serumのみを加えた時の〔3H〕チミジンの放
射能を100％とし、書く濃度のペプチドによる抑制率を
算出した。
is,80 143−147,1990）、ラットのVSMCを用いDNA合成活
性として3Hチミジンの細胞内へのとりこみを測定した。
静止期に同調させた細胞を１％の血清存在下で種々の濃
度のα−hANPないしCNPと37℃14時間インキュベート
し、37KBq/mlの〔3H〕チミジンを加えてさらに４時間イ
ンキュベートした。細胞内にとりこまれた〔3H〕チミジ
ンの放射能を測定した。なお、測定値は、ペプチド非存
在下で１％serumのみを加えた時の〔3H〕チミジンの放
射能を100％とし、書く濃度のペプチドによる抑制率を
算出した。
結果を第５図に示す。
産業上の利用可能性 以上のように、本発明者は、ブタの脳よりヒヨコ直腸
弛緩活性を指標として新規生理活性ペプチドを単離・精
製することに成功し、このペプチドの構造を決定すると
共に、このペプチドがナトリウム利尿作用及び血圧降下
作用を有することを見いだした。すなわち、本発明によ
り、哺乳類において、体液及び血圧の恒常性を調節して
いるホルモンとして既に知られているANP,BNP以外に第
３のホルモンの存在が明らかになり、このことは、今後
哺乳類における体液及び血圧の恒常性維持のメカニズム
を解明するうえで大いに貢献するものである。
弛緩活性を指標として新規生理活性ペプチドを単離・精
製することに成功し、このペプチドの構造を決定すると
共に、このペプチドがナトリウム利尿作用及び血圧降下
作用を有することを見いだした。すなわち、本発明によ
り、哺乳類において、体液及び血圧の恒常性を調節して
いるホルモンとして既に知られているANP,BNP以外に第
３のホルモンの存在が明らかになり、このことは、今後
哺乳類における体液及び血圧の恒常性維持のメカニズム
を解明するうえで大いに貢献するものである。
更に、本発明のペプチドが血管平滑筋細胞の増殖抑制
作用とcGMP産生活性とを示すことを考えれば本発明のペ
プチドはアテローム性動脈硬化症の有効な治療薬となり
得ることが予測される。
作用とcGMP産生活性とを示すことを考えれば本発明のペ
プチドはアテローム性動脈硬化症の有効な治療薬となり
得ることが予測される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/22 ＡＤＤ Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＢＸ
Claims (1)
- 【請求項１】以下の構造式を有する新規生理活性ペプチ
ド及びその酸付加塩。 （式中、（１）と（２）、（３）と（４）は直接結合し
ており、６位と22位のシステイン残基（Cys）は分子内
でＳ−Ｓ結合を形成している。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3507547A JP2636500B2 (ja) | 1990-04-20 | 1991-04-20 | ブタ由来新規生理活性ペプチド |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-105047 | 1990-04-20 | ||
| JP10504790 | 1990-04-20 | ||
| JP3507547A JP2636500B2 (ja) | 1990-04-20 | 1991-04-20 | ブタ由来新規生理活性ペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2636500B2 true JP2636500B2 (ja) | 1997-07-30 |
Family
ID=14397086
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3507547A Expired - Lifetime JP2636500B2 (ja) | 1990-04-20 | 1991-04-20 | ブタ由来新規生理活性ペプチド |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5352770A (ja) |
| EP (1) | EP0478797B1 (ja) |
| JP (1) | JP2636500B2 (ja) |
| AT (1) | ATE121102T1 (ja) |
| DE (1) | DE69108830T2 (ja) |
| DK (1) | DK0478797T3 (ja) |
| ES (1) | ES2073751T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015762T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991016342A1 (ja) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| BRPI0203172B8 (pt) | 2001-09-28 | 2021-05-25 | Nakao Kazuwa | composição farmacêutica para acondroplasia |
| US20080214437A1 (en) * | 2002-09-06 | 2008-09-04 | Mohapatra Shyam S | Methods and compositions for reducing activity of the atrial natriuretic peptide receptor and for treatment of diseases |
| US7488713B2 (en) * | 2004-03-18 | 2009-02-10 | University Of South Florida | Cancer treatment using C-type natriuretic peptides |
| US8759317B2 (en) | 2004-03-18 | 2014-06-24 | University Of South Florida | Method of treatment of cancer using guanosine 3′, 5′ cyclic monophosphate (cyclic GMP) |
| EP3620530A1 (en) | 2004-03-31 | 2020-03-11 | Kazuwa Nakao | Composition for increasing body height |
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