ITRM20120060A1 - Peptidi in grado di dissociare lo eterodimero mdm2/mdm4 e loro uso nel trattamento del cancro. - Google Patents
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Description
Peptidi in grado di dissociare 1'eterodimero MDM2/MDM4 e loro uso nel trattamento del cancro
La presente invenzione concerne peptidi in grado di dissociare l'eterodimero MDM2/MDM4 e loro uso nel trattamento del cancro. In particolare, l'invenzione concerne peptidi in grado di dissociare 1'eterodimero MDM2/MDM4 e mantenere il legame tra MDM4 e p53 in modo tale da riattivare la funzione oncosoppressoria di p53 in cellule tumorali aventi la proteina p53 wildtype, dirigendo detta funzione specificamente in direzione proapoptotica .
L'inattivazione dell'oncosoppressore p53 mediante mutazione diretta del gene p53 è una delle prime lesioni genetiche che sono state riconosciute nei tumori umani e di cui è stata dimostrata l'alta frequenza. Ulteriori studi hanno evidenziato metodi alternativi di inattivazione di p53 mediante deregolazione dei suoi partner MDM4 e MDM2. Questi ultimi sono due regolatori cruciali dell'oncosoppressore p53. Queste due proteine svolgono principalmente attività inibitoria verso p53 sia mediante controllo dei suoi livelli proteici sia mediante inibizione della sua funzione transcrizionale.
L'importanza delle proteine MDM sull'inibizione dell'attività di p53 ha generato lo sviluppo di differenti strategie aventi lo scopo di rompere l'associazione p53/MDM.
Sono note ad esempio le domande di brevetto WO 2008106507, WQ201105219 concernenti peptidi inibitori dell 'interazione di p53 con MDM2 e MDM4, ossia peptidi che mirano a liberare p53 dal legame con MDM4 e MDM2. Secondo la domanda di brevetto W0201105219, sembrerebbe che la dissociazione di p53 da MDM2 e MDM4 determini una risposta biologica sia di arresto proliferativo sia di morte cellulare, sebbene non sia specificato se si tratti di apoptosi.
W02008106507 descrive peptidi in grado di legare con alta affinità MDM2 e quindi, probabilmente, di inibire il legame tra MDM2 e tutti i membri della famiglia p53, tuttavia, tale affermazione non è provata sperimentalmente. Da un'analisi esclusivamente computazionale è previsto, inoltre, che tali peptidi possano essere in grado di legare MDM4 e quindi di dissociarlo da p53 . Nessun dato sperimentale è riportato riguardo alla possibile attività biologica in vitro o in vivo di tali peptidi. Non è pertanto prevedibile la loro efficacia.
Inoltre, la strategia di rompere il legame di p53 con MDM4 e MDM2 non tiene conto dei recenti lavori che suggeriscono che il legame di MDM4 a p53 potenzia l'attività apoptotica di quest'ultima . Nella domanda di brevetto W0201105219, i peptidi sarebbero in grado di inibire il legame con MDM2 in modo 10 volte superiore rispetto all'inibizione del legame con MDM4 (IC50 per MDM2=0.01pM; IC50 per MDM4=0.ΙμΜ) . Pertanto, non si può escludere che una parte della morte cellulare osservata in W0201105219 sia dovuta alla parziale ritenzione di complessi MDM4-p53 e quindi non totalmente alla dissociazione di p53 da MDM2 e MDM4.
La domanda di brevetto W0200061193 descrive composti antisenso che inibiscono l'espressione di MDM4. Anche in questo caso quindi non è stata presa in considerazione l'importanza del complesso MDM4-p53 nell'induzione dell'apoptosi.
I risultati più promettenti per la riattivazione di p53 sono stati ottenuti con piccole molecole (small molecules) inibitrici identificate mediante screening ad alta capacità di librerie di composti e disegno di farmaci mediante computer sulla base della struttura (Shangary S, Wang S. Targeting thè MDM2-p53 interaction for cancer therapy. Clin Cancer Res. 2008 Sep 1;14(17):5318-24) .
Tuttavia, le strategie terapeutiche note mostrano ancora diversi svantaggi. Ad esempio, i composti che spostano MDM2 da p53 sono inefficaci nello spostare MDM4 da p53 a causa delle differenze intrinseche nel dominio di legame con p53 di MDM4 e MDM2 e ciò andrebbe a vantaggio dell'induzione dell'apoptosi da parte del complesso MDM4-p53. Tuttavia, poiché tali composti non inibiscono il legame tra MDM4 e MDM2, si può prevedere che questo determini nell'insieme un'attività inibitoria, seppur ridotta, dell'eterodimero nei confronti di p53. L'associazione di MDM2 ad MDM4, inoltre, antagonizza l'attività proapoptotica di quest'ultimo prevenendone l'espletamento. Per di più, si verifica spesso un arresto della crescita delle cellule piuttosto che una risposta apoptotica, quest'ultima rappresentando invece il risultato preferito in qualsiasi terapia del cancro (Toledo F, Wahl GM. MDM2 and MDM4: p53 regulators as targets in anticancer therapy. Int J Biochem Celi Biol. 2007;39(7-8) :1476-82. Epub 2007 Apr 8; Shangary S, Wang S. Targeting thè MDM2-p53 interaction for cancer therapy. Clin Cancer Res. 2008 Sep 1;14(17) :5318-24). I metodi noti, aventi lo scopo di inibire l'interazione di p53 con MDM2 e/o MDM4, causano quindi un'attivazione di p53 non solo verso l'apoptosi, come sarebbe desiderabile, ma anche verso l'arresto proliferat ivo. Inoltre, la liberazione di MDM2 dal suo legame con p53 determina una maggiore attività degradativa, quindi inibitoria, dell 'eterodimero MDM2/MDM4 sia verso MDM4 stesso sia verso molecole proapoptotiche, come è stato dimostrato da alcune recenti pubblicazioni.
Nel complesso, tutti i metodi finora realizzati non hanno superato la fase I di alcun trial clinico evidenziando le limitazioni esistenti (Cheok CF, Verma CS, Baselga J, Lane DP . Translating p53 into thè clinic. Nat Rev Clin Oncol. 2011 Jan;8(l) :25-37. Epub 2010 Oct 26).
Alla luce di quanto sopra esposto risulta, pertanto, evidente l'esigenza di poter disporre di nuovi metodi terapeutici per il trattamento del cancro che superino gli svantaggi dei metodi noti.
Sulla base della stato dell'arte, è stato formulato un modello che indica 1'eterodimero MDM4/MDM2 come inibitore funzionale di p53. Ciò quindi potrebbe portare ad ipotizzare che eventuali agenti diretti alla sua dissociazione potrebbero rappresentare nuovi potenziali agenti terapeutici. D'altro canto, dati recenti suggeriscono attività distinte di MDM2 e MDM4 a seguito di condizioni di stress. In queste condizioni si ha anzitutto un'indebolimento dell'associazione e dell'attività degradativa di MDM2 verso p53 (Marchenko et al., 2007). Inoltre, a seguito di un danno di tipo subletale usualmente associato con un arresto della crescita, i livelli di MDM2 aumentano in modo significativo e ciò provoca la degradazione di MDM4 e di alcuni dei fattori proapoptotici come ad esempio HIPK2 (Rinaldo C, Prodosmo A, Mancini F, Iacovelli S, Sacchi A, Moretti F, Soddu S. MDM2-regulated degradation of HIPK2 prevents p53Ser46 phosphorylation and DNA damage-induced apoptosis. Mol Celi. 2007 Mar 9;25(5):739-50). Al contrario, a seguito di un danno letale che provoca apoptosi, i livelli di MDM2 non aumentano o addirittura diminuiscono (Ashcroft M, Taya Y, Vousden KH Stress signals utilize multiple pathways to stabilize p53 . Mol Celi Bici 200020: 3224-33; Latonen L, Taya Y, Laiho M UV-radiation induces dosedependent regulation of p53 response and modulates p53-HDM2 interaction in human fibroblasts. Oncogene 2001 20: 6784-93; Meng LH, Kohn KW, Pommier Y Dose-response transition from celi cycle arrest to apoptosis with selective degradation of Mdm2 and p21WAFl/CIPl in response to thè novel anticancer agent, aminoflavone (NSC 686,288). Oncogene. 2007, 26, 4806-16).
In base a questi dati, un recente modello considera la sopraregolazione di MDM2, durante l'arresto della crescita, un evento che favorisce questa risposta cellulare rispetto alla morte cellulare (Shmueli A, Oren M. Mdm2: p53's lifesaver? Mol Celi.
2007 Mar 23;25(6) :794-6). D'altro canto, MDM4 stabilizza p53 contrastando la sua degradazione mediata da MDM2 e promuove l'apoptosi mediata da p53 in condizioni di stress (Jackson MW, Berberich SJ. MdmX protects p53 from Mdm2-mediated degradation. Mol Celi Biol 2000; 20:1001-7; Stad R, Little NA, Xirodimas DP, Frenk R, van der Eb AJ, Lane DP, et al. Mdmx stabilizes p53 and Mdm2 via two distinct mechanisms. EMBO Rep 2001; 2:1029-34; Mancini F, Gentiletti F, D'Angelo M, Giglio S, Nanni S, D'Angelo C, et al. MDM4 (MDMX) overexpression enhances stabilization of stress-induced p53 and promotes apoptosis. J Biol Chem 2004, 279:8169-80; Barboza JA, Iwakuma T, Terzian T, El-Naggar AK, Lozano G. Mdm2 and Mdm4 loss regulates distinct p53 activities. Mol Cancer Res 2008; 6:947-54).
Pertanto, nonostante sia noto che 1'eterodimero MDM2/MDM4 sia un inibitore della funzione di p53, è stato finora ipotizzato che la dissociazione dell'eterodimero non sia la strategia adatta per favorire l'attività apoptotica di p53. Ciò perché la liberazione di MDM2, ossia il principale inibitore di p53, potrebbe comunque svolgere la sua funzione inibitoria nei confronti di p53 stesso. Per questo motivo le strategie note sono dirette alla dissociazione di p53 da MDM2 e MDM4 e non alla dissociazione dell'etorodimero.
Gli inventori della presente invenzione hanno ora dimostrato che MDM2 contrasta l'attività proapoptotica di MDM4 e che, quando si verifica la dissociazione di MDM4/MDM2 a seguito di condizioni di stress, viene promosso il pathway apoptotico mediato da p53, indipendentemente da MDM2 . Questi risultati sono coerenti con il modello proposto da Shmueli che indica i regolatori di p53 non solo per il controllo della attività di p53, ma anche come aventi un ruolo importante nella decisione mediata da p53 tra la vita e la morte cellulare (Shmueli A, Oren M. Mdm2 : p53's lifesaver? Mol Celi. 2007 Mar 23;25(6) :794-6;Mit ochondrial MDM4 (MDMX): An unpredicted role in thè p53-mediated intrinsic apoptotic pathway. Mancini F, Moretti F. Celi Cycle. 2009 Dee;8(23 ):3854-9) . In particolare, gli inventori della presente invenzione hanno osservato che la sopraespressione di un mutante di MDM4 (C437G), incapace di legare MDM2, induce l'attivazione di p53 e che l'attivazione di p53 non è inibita dalla concomitante espressione di MDM2 . Inoltre, la sopraespressione di MDM4 (eccedente i livelli di MDM2) in un modello di topo transgenico causa un aumento della morte cellulare (apoptosi) a seguito di irradiazione gamma e ritarda la comparsa del tumore a seguito di esposizione del topo ad agenti genotossici .
Sulla base dei dati sopra menzionati, è stata quindi caratterizzata la regione di interazione MDM4/MDM2. I residui amminoacidici responsabili del legame sono stati identificati e testati mediante mutagenesi molecolare. I residui L430, A434 in MDM2 e L433, 1489 in MDM4 sono stati identificati come rilevanti per il complesso MDM2/MDM4.
Pertanto, sono stati preparati peptidi appartenenti alla regione di interazione MDM4/MDM2 e in grado di dissociare 1'eterodimero in modo tale da diminuire l'attività inibitoria verso p53, ossia riattivare la funzione oncosoppressoria di p53 in cellule tumorali che mantengano ancora una proteina p53 wildtype (circa il 50% dei tumori umani), e mantenere la funzione proapoptotica di MDM4 dirigendo quindi la risposta di p53 verso l'apoptosi. Attualmente la maggior parte dei tumori umani è caratterizzata per il 50% da tumori esprimenti una p53 wildtype ed un rimanente 50% esprimente una p53 mutata. Pertanto, indipendentemente dal tipo di tumore, questo approccio si intende diretto a tumori esprimenti una p53 wildtype.
In particolare, sono stati preparati tre peptidi di 12 amminoacidi (12 mer) e sono stati testati a livello molecolare e biologico. Poiché i peptidi presentano alcune limitazioni nell'applicazione terapeutica a causa della loro instabilità intrinseca, sono state effettuate le modifiche chimiche necessarie per aumentare la loro biodisponibilità e permettere la somministrazione in vivo.
Le tecniche per aumentare la stabilità e la biodisponibilità dei peptidi e per permettere la loro somministrazione in vivo sono ben note all'esperto del ramo. In modo particolare, i peptidi sopra menzionati potrebbero essere modificati mediante l'inserimento di un ponte idrocarburo capace di aumentare la alfa elicità dei peptidi stessi (staples carboniosi). Queste modifiche sono in grado di promuovere l'uptake cellulare, conferire resistenza alle proteasi e aumentare la stabilità complessiva.
Forma pertanto oggetto specifico della presente invenzione un peptide appartenente alla (ossia compreso nella, facente parte della) sequenza di MDM4 o MDM2 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2, detto peptide avendo un numero di amminoacidi da 2 a 16, preferibilmente da 4 a 12. Preferibilmente, il peptide dell'invenzione comprende almeno uno dei residui Leucina o Alanina rispettivamente in posizione 430 o 434 di MDM2 o almeno uno dei residui Leucina o Isoleucina rispettivamente in posizione 433 o 489 di MDM4.
La sequenza di MDM4 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 può consistere nella seguente sequenza dall'amminoacido 413 all'amminoacido 490 di MDM4:
413 QLDNLSEQ RTDTENMEDC QNLLKPCSLC EKRPRDGNII HGRTGHLVTC FHCARRLKKA GASCPICKKE IQLVIKVFIA 490 (SEQ ID NO:5), oppure
nella seguente sequenza dall'amminoacido 428 all'amminoacido 490 di MDM4:
428 EDC QNLLKPCSLC EKRPRDGNII HGRTGHLVTC FHCARRLKKA GASCPICKKE IQLVIKVFIA 490 (SEQ ID NO:6)
La sequenza di MDM2 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 può consistere nella seguente sequenza dall'amminoacido 411 all'amminoacido 491 di MDM2:
411 VKEFEREETQ DKEESVESSL PLNAIEPCVI CQGRPKNGCI VHGKTGHLMA CFTCAKKLKK RNKPCPVCRQ 481 PIQMIVLTYF P 491 (SEQ ID NO:8), oppure
nella seguente sequenza dall'amminoacido 428 all'amminoacido 491 di MDM2:
428 SSL PLNAIEPCVI CQGRPKNGCI VHGKTGHLMA CFTCAKKLKK RNKPCPVCRQ PIQMIVLTYF P 491 (SEQ ID NO:9)
Secondo forme di realizzazione preferite della presente invenzione, il peptide appartenente alla sequenza di MDM4 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 può consistere nella seguente sequenza dall'amminoacido 479 all'amminoacido 490 di MDM4:
KEIQLVIKVFIA (SEQ ID NO:3); oppure
nella seguente sequenza dall'amminoacido 427 all'amminoacido 438 di MDM4:
MEDCQNLLKPCS (SEQ ID NO:2).
Sempre secondo una forma preferita di realizzazione, il peptide appartenente alla sequenza di MDM2 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 può consistere nella seguente sequenza dall'amminoacido 427 all'amminoacido 438 di MDM2:
ESSLPLNAIEPC (SEQ ID NO:1)
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione una sequenza nucleotidica isolata che codifica per un peptide come definito sopra.
Inoltre, l'invenzione concerne un vettore di espressione comprendente la sequenza nucleotidica come definita sopra.
L'invenzione si riferisce anche ad una composizione farmaceutica comprendente o consistente in almeno un peptide, o almeno una sequenza nucleotidica, o almeno un vettore come definiti sopra, come principio attivo, in associazione con uno o più coadiuvanti e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili.
Costituisce ulteriore oggetto della presente invenzione un peptide, sequenza nucleotidica, vettore o composizione farmaceutica, come definiti sopra, per l'uso nel trattamento dei tumori quali, preferibilmente, i tumori esprimenti p53 wildtype, o di patologie associate come sindromi iperprolif erat ive benigne .
Tali peptidi dell'invenzione possono, ad esempio, essere somministrati per via endovenosa, o mediante vettori liposomiali veicolabili direttamente al tumore, o infine mediante nanoparticelle . Inoltre, tali peptidi possono essere veicolati anche mediante terapia genica con vettori di espressione a DNA.
Come accennato sopra, i peptidi dell'invenzione possono essere modificati mediante tecniche note allo scopo di aumentare la stabilità e la biodisponibilità dei peptidi stessi e per permettere la loro somministrazione in vivo. In modo particolare, i peptidi possono essere modificati mediante l'inserimento di un ponte idrocarburo capace di aumentare la alfa elicità dei peptidi stessi (staples carboniosi) . Come riportato nella parte sperimentale, i peptidi sono stati modificati come segue:
Pept ide 1: FITC-Ahx-ESSLPLNAIEPS-C0NH2
Pept ide 2: FITC-Ahx-MEDSQNLLKPSS- C0NH2
Pept ide 3: FITC-Ahx-KEIQLVIKVFIA-C0NH2
in cui il termine Ahx indica un linker. Inoltre, i peptidi sono stati modificati ad esempio anche con acetile al posto del FITC-Ahx:
Peptide 1: Acet -ESSLPLNAIEPS-C0NH2
Peptide 2: Acet -MEDSQNLLKPSS- C0NH2
Peptide 3: Acet- KEIQLVIKVFIA-C0NH2
La presente invenzione verrà ora descritta a titolo illustrativo, ma non limitativo, secondo sue forme preferite di realizzazione, con particolare riferimento alle figure dei disegni allegati, in cui:
Figura 1 mostra analisi di apoptosi a seguito della sovra espressione di MDM4+p53, o MDM4C437G+p53 in presenza o assenza di MDM2, in fibroblasti embrionali murini Mdm4<_/_>p53<_/_>(DNX) rispetto a cellule di controllo trasfettate con un vettore vuoto (nuli). La percentuale di cellule apoptotiche è calcolata come rapporto tra le cellule risultate positive alla colorazione con il Trypan blu rispetto a tutte le cellule contate. Il valore riportato deriva dalla media di 2 diversi esperimenti.
Figura 2 mostra l'interfaccia di legame dei due domini RING finger di MDM4 e MDM2. Le posizioni riquadrate (in MDM4) e cerchiate (in MDM2)() rappresentano i potenziali amminoacidi chiave di questa interazione.
Figura 3 mostra l'analisi di legame tra MDM2 e diversi mutanti puntiformi di MDM4. Cellule DNX trasfettate con i vettori d'espressione per la proteina MDM2-wt e MDM4-wt o mutata (MDM4 L433N, L433D, I489Q, I489E) nelle combinazioni indicate nella parte superiore della figura, sono state raccolte e U sate.
700μρ di U sato totale sono stati immunoprecipitati con un anticorpo anti-MDM2 e gli immunocomplessi analizzati mediante western blot, come indicato nella figura (pannello a destra). Il pannello di sinistra mostra l'analisi per western blot di una frazione di U sato cellulare per controllare i livelli di espressione delle proteine indicate.
Figura 4 mostra l'analisi di legame tra MDM4 e diversi mutanti puntiformi di MDM2. Fibroblasti murini embrionali Mdm2<_/_>p53<_/_>(DN1) trasfettati con i vettori d'espressione per la proteina MDM4-wt e MDM2-wt o mutata (MDM2-L430Q, L430E, A434N, A434D) nelle combinazioni indicate nella parte superiore della figura, sono stati raccolti e U sati. 70C^g di U sato totale sono stati immunoprecipitati con un anticorpo anti-MDM4 e gli immunocomplessi analizzati mediante western blot, come indicato nella figura (pannello a destra). Il pannello di sinistra mostra l'analisi per Western blotting di una frazione di U sato cellulare per controllare i livelli di espressione delle proteine indicate.
Figura 5 mostra l'abilità del peptide 1 di dissociare il complesso MDM4/MDM2 mediante saggio di immunoprecipitazione . La trasfezione transiente dei peptidi è stata condotta nelle linee cellulari di carcinoma del colon HCT116 wt e p53-/- e la immunoprecipitazione di MDM4 è stata condotta sui U sati cellulari per valutare la presenza di MDM2 nell'immunocomplesso, mediante western blot.
Figura 6 mostra l'abilità del peptide 1 di indurre apoptosi cellulare. Saggio citofluorimetrico su cellule HCT116 wt e p53-/- trasfettate con peptidi fluorescenti verdi e addizione di PI a fresco per il rilevamento della morte cellulare specificatamente nella popolazione cellulare verde (trasfettata).
Figura 7 mostra l'abilità del peptide 3 di dissociare il complesso MDM4/MDM2 valutata mediante saggio di immunoprecipitazione. La trasfezione transiente dei peptidi è stata condotta in linee cellulari di carcinoma del colon HCT116 wt e p53-/- e la immunoprecipitazione di MDM4 in U sati cellulari per valutare la presenza di MDM2 nell'immunocomplesso mediante analisi western blot.
Figura 8 mostra l'abilità del peptide 1 di indurre apoptosi cellulare. Saggio citofluorimetrico di cellule HCT116 wt e p53-/- trasfettate con peptidi fluorescenti verdi e addizione di PI a fresco per rilevamento della morte cellulare specificatamente nella popolazione di cellule (trasfettate) verdi.
Esempio 1: Studio in vitro sull'effetto della dissociazione di MDM4 da MDM2 sulla morte cellulare; preparazione di peptidi in grado di dissociare 1'eterodimero e studio in vitro della loro efficacia apoptotica
1.1 Materiali e metodi
Trasfezioni Le trasfezioni transienti sono state realizzate con vettori lipofilici ( "Lipofectamine 2000" per DNA, Invitrogen). Questo metodo è basato sull'utilizzo di vescicole lipidiche (liposomi) che mediano il trasferimento di DNA all'interno di cellule eucariotiche.
Le cellule in piastre da 100 mm sono state transfettate con i vettori: pShutlle-hMDM4 (WT, C437G), pCMV-hMDM2 (WT), pCAG-p53.
I mutanti puntiformi sono stati ottenuti mediante amplificazione con PCR con primers specifici sui plasmidi contenenti cDNA di hMdm4 e hMDM2 e, i prodotti, utilizzati per la creazione di plasmidi contenenti cDNA di hMDM4 e hMDM2 tramite kit di mutagenesi Qiagen.
Immunoprecipitazione .
Le cellule sono state U sate con un reagente di lisi Saito modficato (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.5% Triton-X100, 5 mM EDTA). Per 1'immunoprecipitazione di p53 e l'analisi di BCL2 e MDM4 è stata usata una soluzione modificata EBC (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.12 M NaCl, 0.4% NP-40, 1 mM EDTA, 1 Mm β-mercaptoetanolo).
400pg di estratto proteico totale sono stati incubati con la proteina G (Invotrogen) per 2h in agitazione a 4°C al fine di permettere il legame aspecifico tra le proteine e tale substrato. In seguito l'estratto cellulare è stato centrifugato, i complessi aspecifici allontanati con il precipitato e il sovranatante è stato incubato per 16 h con un anticorpo specifico. Successivamente, è stata aggiunta la proteina G per 2h in incubazione a 4°C. Infine, 1'immunoprecipitato è stato lavato due volte con il tampone Saito e risospeso in 10μ1 di tampone di soluzione di caricamento (loading buffer 4X: βmercaptoetanolo 0,6 M; SDS 8%; Tris-HCl 0,25 M pH 6,8; glicerolo 40%; Blu di Bromofenolo 0,2%). I campioni sono stati denaturati a 95°C per 5 minuti prima di essere caricati su gel per la corsa elettroforetica e il successivo western blot.
Analisi Western Blot.
Quantità variabili (70-100 μρ per campione da analizzare) di U sati totali di proteine sono state separate per corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide (29% acrilammide e 1% bis-acrilammide) alla concentrazione finale del 12%. Ai campioni è stata aggiunta la soluzione di caricamento (loading buffer 4X: β-mercaptoetanolo 0,6 M; SDS 8%; Tris-HCl 0,25 M pH 6,8; glicerolo 40%; Blu di Bromofenolo 0,2%) capace di denaturare definitivamente i campioni (tramite la rottura dei ponti disolfuro ad opera del βmercaptoetanolo) e di attribuire una definitiva carica negativa a tutte le proteine (mediante la coniugazione con SDS). I campioni sono stati bolliti a 95°C per 5 minuti e successivamente caricati su gel. La corsa elettroforetica è stata effettuata a 100 volts per circa 2 ore in un tampone ionico contenente Tris-HCl 25 mM pH 8,8, glieina 200 mM e SDS 0,1%.
Al termine della corsa elettroforetica le proteine sono state trasferite su filtro di PVDF (Millipore) sotto l'azione di un campo elettrico in un tampone costituito da Tris base 25 mM, glieina 200 mM e metanolo al 20%. Il trasferimento delle proteine dall'anodo verso il catodo è stato effettuato per 3 ore a 70 volts.
Dopo il trasferimento delle proteine, il filtro è stato incubato in agitazione per 1 ora nel tampone TPBS IX (Tris-HCl 10 mM pH 7,6, NaCl 150 mM e 0,1% di Tween 20) contenente il 5% di latte magro in polvere (Bio-Rad), al fine di bloccare i siti aspecifici di legame agli anticorpi. Il filtro è stato successivamente incubato per 2 ore con 1'anticorpo primario opportunamente diluito. Al termine dell'incubazione il filtro è stato sottoposto a due lavaggi di circa 10 minuti ciascuno in TPBS IX ed è stato poi incubato per 45 minuti con il corrispondente anticorpo secondario coniugato con la perossidasi. Dopo due lavaggi di circa 10 minuti in TPBS IX, 1'immunoreattività è stata valutata utilizzando una reazione di chemioluminescenza basata sull'ossidazione del luminolo (Amersham). Successivamente, la chemioluminescenza è stata rivelata per autoradiografia su lastre sensibili (Kodak).
1.2 Effetti della dissociazione di MDM4 da MDM2 L'eterodimero MDM2/MDM4 è la forma principale di controllo dei livelli di p53 e quindi della sua inibizione all'interno della cellula in condizioni normali di crescita (Wade e Wahl, 2009). Si è quindi ipotizzato che la dissociazione di MDM4 da MDM2 possa favorire lo svolgimento della sua funzione proapoptotica, oltre che impedire l'attività di degradazione nei confronti di p53. Il legame per la formazione dell 'eterodimero avviene a livello del dominio "RING finger" di entrambe le proteine (Tanimura et al., 1999). Per evidenziare il ruolo della dissociazione nell'espletamento dell'attività proapoptotica di MDM4, è stato utilizzato un mutante di MDM4 mutato nel residuo cisteina 437. Tale mutazione determina l'impossibilità di formare un corretto dominio RING finger e pertanto l'impossibilità di legare MDM2. Pertanto, cellule DNX sono state trasfettate con i costrutti per l'espressione delle proteine p53, MDM4 o MDM4C437G, e MDM2. E' stata poi eseguita una conta di cellule morte positive alla colorazione al Trypan Blue e queste sono state rapportate al numero delle cellula totali contate (Fig. 1). I dati hanno dimostrato che la presenza di MDM4 potenzia l'attività proapoptotica di p53, come osservato in precedenza e che l'espressione di MDM4C437G si comporta in maniera analoga a MDM4-wt. Tuttavia, l'espressione di MDM2 recupera la morte cellulare indotta dalla coespressione di p53 e MDM4-wt, ma non quella indotta dal mutante MDM4C437G. Questi dati suggeriscono, pertanto, che fattori capaci di impedire l'associazione tra MDM2 e MDM4 possano evitare l'inibizione funzionale di MDM2 e quindi in definitiva potenziare la funzione proapoptotica di p53.
1.3 Preparazione dei peptidi in grado di rompere l'interazione tra MDM2 e MDM4
Per il disegno del peptide in grado di rompere l'interazione tra MDM2 e MDM4, è stata inizialmente condotta un'analisi all'interfaccia della struttura cristallizzata dei domini RING di MDM2 e MDM4 (codice pdb: 2vjf). Tale analisi, in particolare, è stata eseguita impiegando un programma (SiteMap, software Schrodinger.) in grado di individuare cavità di legame nelle proteine. Come risultato, sono state trovate due piccole cavità di legame rispettivamente a livello delle regioni N-terminale di MDM2 e MDM4.
Di seguito sono riportate le sequenze proteiche di MDM4 e MDM2 umane, le sequenze amminoacidiche di MDM4 e MDM2 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 e le sequenze amminoacidiche di MDM4 e MDM2 presenti nella struttura cristallografica del dimero MDM4/MDM2:
Sequenza proteica MDM4 umana (SEQ ID NO: 4)
1 MTSFSTSAQC STSDSACRIS PGQINQVRPK LPLLKILHAA GAQGEMFTVK EVMHYLGQYI
61 MVKQLYDQQE QHMVYCGGDL LGELLGRQSF SVKDPSPLYD MLRKNLVTLA TATTDAAQTL
121 ALAQDHSMDI PSQDQLKQSA EESSTSRKRT TEDDIPTLPT SEHKCIHSRE DEDLIENLAQ
181 DETSRLDLGF EEWDVAGLPW WFLGNLRSNY TPRSNGSTDL QTNQDVGTAI VSDTTDDLWF
241 LNESVSEQLG VGIKVEAADT EQTSEEVGKV SDKKVIEVGK NDDLEDSKSL SDDTDVEVTS
301 EDEWQCTECK KFNSPSKRYC FRCWALRKDW YSDCSKLTHS LSTSDITAIP EKENEGNDVP
361 DCRRTISAPV VRPKDAYIKK ENSKLFDPCN SVEFLDLAHS SESQETISSM GEQLDNLSEQ
421 RTDTENMEDC QNLLKPCSLC EKRPRDGNII HGRTGHLVTC FHCARRLKKA GASCPICKKE
481 IQLVIKVFIA 490
Sequenza in MDM4 del domino di interazione MDM4-MDM2 (SEQ ID NO:5)
413 QLDNLSEQ RTDTENMEDC QNLLKPCSLC EKRPRDGNII HGRTGHLVTC FHCARRLKKA GASCPICKKE IQLVIKVFIA 490
Sequenza di MDM4 presente nella struttura cristallografica del dimero MDM4-MDM2 (SEQ ID NO:6)
428 EDC QNLLKPCSLC EKRPRDGNII HGRTGHLVTC FHCARRLKKA GASCPICKKE IQLVIKVFIA 490
Sequenza proteica MDM2 umana (SEQ ID NO: 7)
1 MCNTNMSVPT DGAVTTSQIP ASEQETLVRP KPLLLKLLKS VGAQKDTYTM KEVLFYLGQY
61 IMTKRLYDEK QQHIVYCSND LLGDLFGVPS FSVKEHRKIY TMIYRNLVW NQQESSDSGT
121 SVSENRCHLE GGSDQKDLVQ ELQEEKPSSS HLVSRPSTSS RRRAISETEE NSDELSGERQ
181 RKRHKSDSIS LSFDESLALC VIREICCERS SSSESTGTPS NPDLDAGVSE HSGDWLDQDS
241 VSDQFSVEFE VESLDSEDYS LSEEGQELSD EDDEVYQVTV YQAGESDTDS FEEDPEISLA
301 DYWKCTSCNE MNPPLPSHCN RCWALRENWL PEDKGKDKGE ISEKAKLENS TQAEEGFDVP
361 DCKKTIVNDS RESCVEENDD KITQASQSQE SEDYSQPSTS SSIIYSSQED VKEFEREETQ
421 DKEESVESSL PLNAIEPCVI CQGRPKNGCI VHGKTGHLMA CFTCAKKLKK RNKPCPVCRQ
481 PIQMIVLTYF P
Sequenza in MDM2 del domino di interazione MDM4-MDM2 (SEQ ID NO:8)
411 VKEFEREETQ DKEESVESSL PLNAIEPCVI CQGRPKNGCI VHGKTGHLMA CFTCAKKLKK RNKPCPVCRQ PIQMIVLTYF P 491
Sequenza di MDM2 presente nella struttura cristallografica del dimero MDM4-MDM2 (SEQ ID NO:9)
428 SSL PLNAIEPCVI CQGRPKNGCI VHGKTGHLMA CFTCAKKLKK RNKPCPVCRQ PIQMIVLTYF P 491
Partendo dalle regioni N-terminali di MDM2 e MDM4, si è proceduto ad individuare un set di aminoacidi chiave coinvolti nel mediare le interazioni presenti all'interfaccia del complesso MDM2/MDM4. Tra questi residui, sono stati identificati Leu^o<1411142>, Ala434<MDM2>, Leu433<MDM4>e Ile^g<1>^<1>'<44>come particolarmente importanti nella stabilizzazione del complesso eterodimerico del dominio RING (figura 2). Per confermare che tali aminoacidi svolgano un ruolo determinante nell'interazione delle due proteine, essi sono stati sostituiti con altri residui aminoacidici mediante esperimenti di mutagenesi puntiforme. Le mutazioni sono state condotte in modo da sostituire ciascun aminoacido di interesse con uno in grado di comprometterne l'abilità di formare il legame ma, allo stesso tempo, di mantenere intatto il corretto "folding" del dominio corrispondente e quindi della proteina. Inoltre, per accertare che la causa della eventuale dissociazione fosse effettivamente 1'aminoacido sostituito e non 1'aminoacido inserito, ciascun residuo aminoacidico è stato sostituito con due diversi residui a diversa carica totale. Sono stati così scelti amminoacidi con netta carica negativa della catena laterale, Glutammato e Aspartato, e il corrispettivo amminoacido dalla catena laterale polare, Glutammina e Asparagina. Sono stati così prodotti mediante mutagenesi in vitro, 8 diversi mutanti:
1. MDM4L433N
2. MDM4L433D
3. MDM4I489Q
4. MDM4I489E
5. MDM2L430Q
6. MDM2L430E
7. MDM2A434N
8. MDM2A434D
A questo punto, è stata analizzata la capacità di ciascun mutante di interagire con la corrispettiva proteina "wild-type". Cellule DNX sono state trasfettate con i costrutti esprimenti la proteina MDM2-wt e ciascuno dei quattro mutanti di MDM4 oppure la proteina MDM4-wt come controllo. Le cellule sono state successivamente raccolte e i lisati immunoprecipitati con un anticorpo anti-MDM2 e gli immunocomplessi analizzati per la presenza delle varie forme di MDM4 (Fig. 3). I risultati hanno dimostrato che tutti e quattro i mutanti di MDM4 risultano incapaci di legare MDM2 mentre si può vedere molto bene il legame delle due proteine "wild-type". Questo dato indica pertanto che la leucina in posizione 433 e l'isoleucina in posizione 489 di MDM4 sono determinanti per il legame con MDM2 e pertanto per la formazione dell'eterodimero . In maniera speculare, sono stati testati i mutanti di MDM2. Cellule derivate da fibroblasti murini derivati dal topo "knock-out" per p53 e Mdm2 (DN1) sono state trasfettate con i costrutti esprimenti la proteina MDM4 e ciascuno dei diversi mutanti di MDM2 oppure MDM2-wt come controllo. Dopo 24 ore, le cellule sono state raccolte e i U sati immunoprecipitati utilizzando un anticorpo anti-MDM4 (Fig. 4). Dal western blot di questa immunoprecipitazione possiamo osservare, come atteso, che MDM2-wt lega MDM4 mentre i mutanti di MDM2 L430E e A434D non sono in grado di associare a MDM4 nelle stesse condizioni. I mutanti di MDM2 L430Q e A434N risultano invece capaci di legare MDM4 sebbene in misura inferiore a quanto osservabile per la proteina MDM2-wt. Questo risultato indica pertanto che la leucina 430 e l'alanina 434 sono due siti determinanti per il legame tra MDM2 e MDM4. Tuttavia l'inserimento in tali siti di un amminoacido con catena laterale debolmente polare non compromette in modo netto l'abilità di MDM2 di legare MDM4 mentre l'inserimento di aminoacidi con catena laterale a carica netta negativa è in grado di dissociare completamente il complesso, suggerendo che a livello di questi siti il legame risieda nella catena laterale degli aminoacidi coinvolti. A partire da questi residui, sono stati disegnati tre peptidi 12mer di MDM2 ed MDM4, corrispondenti alle seguenti sequenze amminoacidiche (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3):
1) ESSLPLNAIEPC ossia Glui-Ser2-Ser3-Leu4-Pro5-Leu6-Asn7-Ala8-Ile9-Gluio-Pron-Cysi2(SEQ ID NO:1)
2) MEDCQNLLKPCS ossia Meti-Glu2-Asp3-Cys4-Gln5-Asn6-Leu7-Leu8-Lysg-Proio-Cysii-Seri2(SEQ ID NO:2)
3) KEIQLVIKVFIA ossia Lysi-Glu2-Ile3-Gln4-Leu5-Val6-Ile7-Lys8-Val9-Pheio-Ileii-Alai2 (SEQ ID NO:3)
Poiché la stabilità in conformazione di alfa elica (elicità) è un parametro importante per favorire una forte interazione tra i peptidi ed i domini RING di MDM2 e MDM4, si è proceduti a valutare 1'elicità dei peptidi 1 e 2 con simulazioni di dinamica molecolare. Queste simulazioni sono state condotte impiegando il programma Desmond ed il campo di forza OPLS 2005, così come implementati nel pacchetto software Schrodinger. In particolare, le simulazioni sono eseguite per una lunghezza temporale di 20 nanosecondi in solvente acquoso, ad una temperatura di 300°K, e seguendo il protocollo NPT Berendesen. Le traiettorie prodotte dalle due simulazioni sono state poi analizzate attraverso il calcolo della struttura secondaria assunta dai peptidi nell'arco dei 20 nanosecondi. L'elicità risultante dei peptidi, espressa in percentuale, è stata pari al 23.7% e 12.5% rispettivamente per il peptide 1 e 2. Per il peptide 3 non è stato possibile eseguire un'analisi simile.
1.4 Studio di efficacia apoptotica dei peptidi 1 e 3
I peptidi SEQ ID No: 1-3 sono stati modificati con l'aggiunta di FITC al N-term seguito da uno spacer. Al c-term è stato legato un gruppo ammidico per aumentare la stabilità del peptide:
peptide 1: FITC-Ahx-ESSLPLNAIEPS-C0NH2
Peptide 2: FITC-Ahx-MEDSQNLLKPSS- C0NH2
Peptide 3: FITC-Ahx-KEIQLVIKVFIA-C0NH2
Il termine Ahx indica un linker.
Di seguito sono mostrate le loro proprietà.
Peptide 1 (SEQ ID NO:l): il peptide è stato testato mediante saggi di immunoprecipitazione e rilevazione della morte cellulare.
E' stato verificato se i peptidi erano in grado di entrare nella cellula aggiungendo semplicemente un peptide ad una data concentrazione (5μΜ) nel mezzo di coltura delle cellule e analizzando la loro presenza mediante microscopio a fluorescenza e confocale poiché ciascun peptide è stato marcato con fluoroforo verde (FAM). E' stato osservato che i peptidi venivano rilevati nella cellula solo dopo trasfezione dei peptidi stessi mediante liposomi. Successivamente, è stata valutata la capacità dei peptidi di rompere il legame mediante immunoprecipitazione di MDM4 o MDM2 dopo trasfezione del peptide nella linea cellulare di cancro HCT116, e rilevazione della presenza del corrispondente partner nell 'immunocomplesso mediante saggio western blot. Sono state usate due linee cellulari singeniche HCT116 wild type e HCT116 p53 -/-per capire anche la dipendenza degli effetti osservati dalla presenza di p53. Il peptide SEQ ID NO:1 è risultato capace di dissociare le due proteine, sebbene non completamente, e di indurre una parziale risposta apoptotica (Fig. 5, 6).
Peptide 3 (SEQ ID NO:3): in analogia al peptide 1, anche per questo peptide è stata valutata la capacità di penetrazione all'interno della cellula valutando il numero di cellule positive per la presenza del fluoroforo FITC. Questo peptide si è dimostrato capace di essere internalizzato all'interno delle cellule sia mediante vettori liposomali sia indipendentemente da essi sebbene con minore efficienza. Successivamente, è stata analizzata la sua capacità di dissociare il complesso MDM4/MDM2 mediante esperimenti di immunoprecipit azione. Abbiamo osservato che il peptide è altamente efficace nel dissociare le due molecole mentre non dissocia p53 da MDM4 (Figura 7).
Inoltre, questo peptide si è dimostrato altamente efficace nell 'indurre apoptosi cellulare, in modo specifico poiché un altro peptide che non è in grado di dissociare MDM4/MDM2 non induce morte (dati non mostrati) . L'effetto di apoptosi è inoltre dipendente da p53 poiché la morte indotta in cellule che mancano di p53 è significativamente inferiore rispetto a quelle con p53 (Figura 8).
Claims (3)
- RIVENDICAZIONI 1) Peptide appartenente alla sequenza di MDM4 o MDM2 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2, detto peptide avendo un numero di amminoacidi da 2 a 16, preferibilmente da 4 a 12.
- 2) Peptide secondo la rivendicazione 1 comprendente almeno uno dei residui scelti nel gruppo consistente in Leucina o Alanina rispettivamente in posizione 430 o 434 di MDM2 o almeno uno dei residui scelti nel gruppo consistente in Leucina o Isoleucina rispettivamente in posizione 433 o 489 di MDM4.
- 3) Peptide secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui la sequenza di MDM4 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 consiste nella seguente sequenza dall'amminoacido 413 all 'amminoacido 490 di MDM4 : 413 QLDNLSEQ RTDTENMEDC QNLLKPCSLC EKRPRDGNI I HGRTGHLVTC FHCARRLKKA GASCPICKKE IQLVIKVFIA 490 (SEQ ID NO:5) 4) Peptide secondo la rivendicazione 3, in cui la sequenza di MDM4 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 consiste nella seguente sequenza dall 'amminoacido 428 all'amminoacido 490 di MDM4: 428 EDC QNLLKPCSLC EKRPRDGNI I HGRTGHLVTC FHCARRLKKA GASCPICKKE IQLVIKVFIA 490 (SEQ ID NO:6) 5) Peptide secondo ognuna delle rivendicazioni 1-2, in cui la sequenza di MDM2 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 consiste nella seguente sequenza dall'amminoacido 411 all 'amminoacido 491 di MDM2 : 411 VKEFEREETQ DKEESVESSL PLNAIEPCVI CQGRPKNGCI VHGKTGHLMA CFTCAKKLKK RNKPCPVCRQ PIQMIVLTYF P 491 (SEQ ID NO:8) 6) Peptide secondo la rivendicazione 5, in cui la sequenza di MDM2 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 consiste nella seguente sequenza dall'amminoacido 428 all'amminoacido 491 di MDM2: 428 SSL PLNAIEPCVI CQGRPKNGCI VHGKTGHLMA CFTCAKKLKK RNKPCPVCRQ PIQMIVLTYF P 491 (SEQ ID NO:9) 7) Peptide secondo ognuna delle rivendicazioni 1-4, in cui detto peptide appartenente alla sequenza di MDM4 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 consiste nella seguente sequenza dall'amminoacido 479 all'amminoacido 490 di MDM4: KEIQLVIKVFIA (SEQ ID NO:3). 8) Peptide secondo ognuna delle rivendicazioni 1, 5-6, in cui detto peptide appartenente alla sequenza di MDM2 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 consiste nella seguente sequenza dall'amminoacido 427 all'amminoacido 438 di MDM2: ESSLPLNAIEPC (SEQ ID NO:1) 9) Peptide secondo ognuna delle rivendicazioni 1-4, in cui detto peptide appartenente alla sequenza di MDM4 del dominio di interazione tra MDM4 e MDM2 consiste nella seguente sequenza dall'amminoacido 427 all'amminoacido 438 di MDM4: MEDCQNLLKPCS (SEQ ID NO:2) 10) Sequenza nucleotidica isolata che codifica per un peptide come definito in ognuna delle rivendicazioni da 1 a 9. 11) Vettore di espressione comprendente la sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 10. 12) Composizione farmaceutica comprendente o consistente in almeno un peptide come definito in ognuna delle rivendicazioni da 1 a 9, o almeno una sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 10, o almeno un vettore come definito nella rivendicazione 11, come principio attivo, in associazione con uno o più coadiuvanti e/o eccipienti farmaceuticamente accettabili. 13) Peptide come definito in ognuna delle rivendicazioni da 1 a 9, sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 10, vettore come definito nella rivendicazione 11 o composizione farmaceutica come definita nella rivendicazione 12, per l'uso nel trattamento dei tumori. 14) Peptide come definito in ognuna delle rivendicazioni da 1 a 9, sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 10, vettore come definito nella rivendicazione 11 o composizione farmaceutica come definita nella rivendicazione 12, per l'uso secondo la rivendicazione 13, in cui i tumori sono tumori esprimenti p53 wildtype. 15) Peptide come definito in ognuna delle rivendicazioni da 1 a 9, sequenza nucleotidica come definita nella rivendicazione 10, vettore come definito nella rivendicazione 11 o composizione farmaceutica come definita nella rivendicazione 12, per l'uso nel trattamento di sindromi iperproliferative benigne .
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Non-Patent Citations (6)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2639240A3 (en) | 2013-12-04 |
| US20130217634A1 (en) | 2013-08-22 |
| EP2639240B1 (en) | 2016-06-22 |
| EP2639240A2 (en) | 2013-09-18 |
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