JPS60260596A - 新規なペプチド及びこれを有効成分とする医薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は、ひな直腸筋標本弛緩作用、利尿作用及び似
磨斉千＝秤陰作用全Ｍするペプチド並びにその塩、並び
にこれらを含んで成る医薬に関する。

（従来の技術） 種々−の体液性因子、すなわち生理活性物質が、物理的
因子、例えば心拍出量、血管壁の弾性等と共に血圧を規
定する重要な因子であることはよく知られている。この
体液性因子か関与する系として、レニン−アンジオテン
シン−アルドステロン系、カテコラミン系、プロスタグ
ランジン系、カリフレ・ｆンーキニン系と共にナトリウ
ム利尿ホルモン系が存在し、ウアベイン様物質といわれ
るナトリウム利尿ホルモンが血圧の上昇に関与すること
もすでに周知である。

なお、この明細書において「ナトリウム利尿」とけカリ
ウムイオンに対してナトリウムイオンを選択的に排泄す
る利尿を言う。

ヒトの心房中には、ペプチドホルモン産生細胞中に見ら
れる顆粒と形態的に類似する顆粒が存在することが知ら
れている（　Ｊ、Ｄ、Ｊａｍｉｓ＠ｏｎ及びＧ、Ｅ、　
Ｐａ１ａｄｅ　、　Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂ１０１．．２３　
、１５１（１９６４））。また、ラットの心房のホモジ
ネート物及びその顆粒が、２．トに対してナトリウム利
尿を起すことも知られている（　Ａ、Ｊ、　Ｄ＠Ｂｏｌ
ｄ等、Ｌ１ｆ＠８ｅｉ−２Ａ８１８９（１９８１）”、
Ｒ，Ｋ＠ｅｌｌｅｒ　＋Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｐｈ７ｇ＋１
ｏ１．　Ｐｈａｒｍａｅｏｌ、　ｙ　６０　ａ　１０７
８（１９８２）＃　〕ｏさらに、最近において、Ｍ　ａ
　ｒ　ｋＧ、Ｃｕｒｒｉｅ　Ｓ、等はヒト、ウサギ、ブ
タ及びラットの心房中にナトリウム利尿作用を有する分
子量２万〜３万のペプチド様物質及び分子量１万以下の
ペプチド様物質が存在することを示唆した（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ、２２１．７１〜７３（１９−８３））ｏ最近にな
りて、アミノ酸数２８個のラット由来のペプチドが同定
された［Ｂ、Ｂ、Ｒ，Ｃ，Ｖｏｌ、１１７．Ｉ６３　。

８５９〜８６５頁（１９８３）］。また本発明者等は、
ヒト由来のα−ｈＡＮＰ　［特願昭５８−２４３６７５
：Ｂ−Ｂ−ＲｌＣ−Ｖｏｌ−１１８ｐＡｌ　、１３１”
ｌ　３９頁（１９８４）］、及びβ−ｈＡＮＰ　（特願
昭５９−３８８１７）、並びにラット由来のβ−ｒＡＮ
Ｐ　（特願昭５９−３８８１６）を見出し、その構造及
び薬理活性を明らかにした。

本発明者等は、引き続き、効果的な利尿作用を有する物
質を見出すべく鋭意研究を行った結果、ヒトの心房から
、１２６個のアミノ酸で構成され約１３．０００の分子
量を有する全く新しいペプチドを単離することに成功し
、このペプチドの構造を決定すると共に、このペプチド
が前記のα−ｈＡＮＰの前駆体であって、顕著な、利尿
作用、及び血圧降下作用を有することを見出し、この発
明を完成した。

（発明が解決しようとする問題点） すなわち、この発明は、顕著な利尿作用及び血圧降下作
用を有する新規なペプチド、並びに該ペプチドを含んで
成る利尿剤、及び血圧降下剤を提供することを目的とす
る。

なお、この明細書において、この新規ペプチドをｒ　−
ｈＡＮＰ　（１−ｈｕｍａｎ　ａｔｒｌａｌ　ｎａｔｒ
ｉｕｒｅｔｉｃｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）と称する。

（問題点を解決するための手段） 前記の目的は、次に記載する。　７−　ｈＡＮＰを提供
することによシ達成される。

（Ａ）　γ−ｈＡＮＰの構造及び物理化学的性質■　こ
の発明のペプチド７−　ｈＡＮＰは次の構造式％式％ （式中、１０５位のＣｙａと１２１位のＣｙａはジスル
フィド結合で結合している。） 上記の構造式において、このペプチドは左側にアミン末
端を有し右側にカルボキシ末端を有する。

式中、Ａｓｎはアスｉ＋ラギン、Ｐｒｏはプローリン、
Ｍｅｔはメチオニン、Ｔｙｒはチロシン、Ａ　１　ａ　
ハ７ラニン、Ｖａｌｉｊ：バリン、Ｓｅｒはセリン、Ａ
ｓｐｉｊアスパラギン酸、Ｌｓｕはロイシン、Ｐｈｏは
フェニルアラニイ、Ｌｙｇはリジン、Ｈｉｓはヒスチジ
ン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｉｎはグルタミン、Ｇｌ
ｙはグリシｙ、Ｔｈｒはスレオニン、Ａｒｇハアルギニ
ン、Ｔｒｐはトリプトファン、ＣｙＩＩはシーティン、
そしてｌｉｅはイソロイシンをそれぞれ表わし、いずれ
もＬ−アミノ酸である。

この構造はアミノ酸分析の結果、及び心房から得られた
ｍＲＮＡからのｅＤＮＡの解析から得られた遺伝子の同
定結果から決定されたものである（同日出願に係る「新
規ＤＮＡおよびその用途」を参照のこと）。

■　分子量：約１３，０００（？ル濾過法による。）理
論分子量　１３６７９゜ ■　紫外線吸収スペクトル：Ｍａｘ＝＝２７６ｎｍ。

■　呈色反応：エールリッヒ反応陰性、坂道反応、及び
パクリ反応いずれも陽性。

■　酸性・中性・塩基性の別：塩基性 ■　溶剤に対する溶解性：水、メタノール及び酢酸に溶
解し、酢酸エチル、酢酸ブチル、エチルエーテル、ヘキ
サン、石油エーテル、ベンゼン及びクロロホルムに難溶
である。

■　７ｊ／＠ｉ成　よ工余白 アミノ酸　実測値（モル比）　理論値（モル比）Ａａｘ
　１３．６９　１４ Ａ１ｍ　１１．９８　１１ Ａｒｇ　１０．２４　１０ １１ｅ　１．４５　１ Ｇ３Ｆ　１１．６１　１１ Ｇｌｘ　１３．２２　１２ （Ｇｙｓ）２　０．　ｔ　６ｉ ８ｅｒ　１２．３７　１３ Ｔｙｒ　２．０１　２ Ｐｈｅ　３．４８　３ Ｍａｔ　３．６１　４ Ｌｓｕ　１７．２２　１６ Ｖａｌ　５．９８　６ Ｔｈｒ　２．６８　２ Ｈ１ｓ　１．４３　１ Ｌｙｅ　５．１４　４ なお、この化合物は前記のごとく塩基性であシ、無機酸
、例えば塩酸、硫酸、燐酸等、又は有機酸、例えば蟻酸
、酢酸、ゾロピオン酸、コハク酸、りエン酸等と共に常
法に従って酸付加塩に転換することができる。

φ）　γ−ｈＡＮＰの生物学的性質 この発明のペプチド７−−　ｈＡＮＰは顕著な利尿作用
、及び血圧降下作用を有する。

試験方法 雄性ＳＤ系う、ト（体重３００〜４００１にぺ／ドパル
ビターｌし６０号勺を腹腔内投与することによって麻酔
し、以下Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎａ＠ｓ　ｒ　Ｖｏｌ。

２８、ｐｐ３９〜９４に記載されている方法に準じて行
った。

気道確保のため、気管力＋ｘ−レ（ＦＢ　−２４０Ｃ１
ａｙ−Ａｄａｍｓ　）を施し、股動脈に血圧測定用の動
脈カニユーレ（ＰＥ−１０ＫＰＨｉ−５０を接続）ｔ−
挿入し、股静脈にリンダル液投与用の静脈カニー−レを
挿入した。この静脈カニユーレを通して１．２ｄの＋）
７）ｆル液を約１０分間にわたって注入した後１、２　
ｍ／時の速度で定常注入（ｃｏｎｓｔａｎｔ　１ｎｆｕ
ｓｉｏｎ）を行った。

シラスティック・チェー２（内径０．０２インチ、外径
０．０３フインチ、ダウコーニング社製）の膀胱カニー
−レから試験管内に採尿した。この採尿は被験物質を投
与する前３０分間と投与後５分間又はその後経時的に行
い、この尿試料の分析値を比較すると、とによシ被験物
質の作用を測定し、た。

被験物質ｒ−ｈＡＮＰは、その１ｎモルを５μＩのバシ
トラシン（抗菌剤）と共に５０μＬの滅菌生理食塩水に
溶解し、頚静脈から投与した。

被験物質を投与した後経時的に採尿して経過を観察した
場合の結果は第１図のようであった。この図から明らか
なごとく、この発明のγ−ｈＡＮＰの利尿作用は、微量
の投与によシ生じる。

また、第２図に示すごとく、この発明の１−　ｈＡＮＰ
を投与した後、血圧は緩かに約２０ＩＩＩＩＩ）Ｉｇ降
下し、約１時間持続した。この結果によりｒ−ｈＡＮｐ
がα−ｈＡＮＰよシ顕著に持続する血圧降下作用を有す
ることが明らかになった。

ｒ　−ｈＡＮＰの医薬としての適性 前記のごとくこの発明のペプチドｒ　−ｈＡＮＰは顕著
な利尿作用及び血圧降下作用を有する。

このペプチドは繰返し投与しても抗体産生を惹起せず、
アナフィラキシ−ショックを起こさない０また、この発
明のペプチドはＬ−アミノ酸のみからなシ、投与後、生
体内の各種グロテアーゼによシ徐々に分解されるため毒
作用をｔｌとんど有しない。

前記のごとく、ｒ　−ｈＡＮＰはμｇ／ｋＦｉのオーダ
ーで効果を発揮し、毒性が非常に低いから、１μル匂〜
１０１１Ｖ′ｋｇの範囲で投与することができ、１０μ
Ｖｋｇ〜１吟勺の範囲で投与するのが好ましい。

この発明のｒｈＡＮＰは、ペプチド系医薬の投与に一般
に使用されている投与方法、すなわち非経口的投与方法
、例えば静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等によって
投与するのが好ましい。経口投与した場合、ｒ−ｈＡＮ
ｐａ消化管内で分解を受けるためこの投与方法は一般的
には効果的でないが、消化管内で分解を受けにくい製剤
、例えば活性成分である７　−ｈＡＮＰ　ｆ、リポゾー
ム中に抱容したマイクロカプセル剤として経口投与する
ことも可能である。又、直腸、舌下、鼻内など消化管以
外の粘膜から吸収せしめる投与方法を採用することも可
能であり、この場合、例えば層剤、舌下錠２点鼻スプレ
ー繭等の形で投与することができる・（Ｃ）　γ−ｈＡ
ＮＰの製造方法 この発明の４ノチドｒ−ｈＡＮＰは、う、トの心房組織
を適当な酸性溶媒、例えば燐−緩衝液、塩酸含有酢酸等
の中でホモゾネートシ、ヒナ直腸標本弛緩活性全指標と
して、遠心分離１等電沈澱、溶媒抽出、限外Ｖ過、ケ０
ル濾過、吸Ｎ′／ロマトグ２フィー等、ペプチドの精製
に常用される各種処理を適宜組合わせて分子量約１３，
０００のペプチドを分離することによシ得られる。

次に実施例によシ、この発明をさらに屍体的に説明する
。

実施例１　ｒ−ｈＡＮＰの製造 ヒトの心房３７．７ｇを摘出し、１０倍量のＩＮ酢酸を
加え、ホモジナイズし、さらに冷却アセトンを加え、２
倍量になし、ホモジナイズすることにより抽出を行った
。これを１６０００Ｘｐで３０゛分間遠心分離し、その
上清から、減圧蒸留によりアセトンを除去し、１５０−
の抽出液１ｃ得た。

得られた抽出液に水を加え１ｔとなし逆層カラムＴ、Ｃ
３ＯＲＢ　５Ｐ−Ｃ−ＯＤＳ　（Ｃｈａｍａｏ＃）　９
０−に附し、０、ＩＮ酢酸溶液４５０ｍ１３１ｃ流し、
ついで水ニアセトニトリル；１０チドリフルオロ酢酸（
４Ｏ：６０ｚす４５０Ｊ！／で溶出する。溶出において
は、前期に緑色、後期に茶色の両分が溶出されるが、そ
の緑色の両分２２５プを採取し、凍結乾固させ、９０ｍ
２の乾固物を得た。

得られた乾固物を５−のＩＮ酢酸に溶解し、ＩＮ酢酸溶
液で平衡化した５ｓｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−７５（ファル
マシア製；カラムサイズ１．８　Ｘ　ｌ　３５ｔＭ；流
速１０．３ｄ／時間；フラクションサイズ５　ｒｒｔ　
）によシグルい遇した。この結果を第３図に示す。

ヒナ回腸標本弛緩作用画分（フラクション番号３９〜４
４）３０祷を得、仁れの２５０μｔずつを試料として液
体高速クロマドグ２フイーに付した。このクロマトグラ
フィーにおいては、ＴＳＫＯＤＳ　（東洋曹達（株）製
〕カラム（サイズ４．０×２５０　ｍ　）を使用し、流
速１．Ｇｍ１１分、圧力１１０〜１３０　ｋｇ／１ｙｎ
２とし１、溶出溶媒として、（ト）水ニアセトニトリル
＝１０チドリフルオロ酢酸（９０：１０：Ｊ）、及びω
）水２アセトニトリル：１０チドリフルオロ酢酸（４０
：６０：１）を使用した。

カラムを（Ａ）で平衡化した後、試料を注入し、（４）
からω）へ、の涙腺グラジェント法で８０分間溶出した
。

この結果を第４図に示す。ヒナ回腸標本弛緩画分（保持
時間５０分）のピークを分取し、得られた両分を上記と
同じカラムにて（ト）水；アセトニトリル：１０チドリ
フルオロ酢酸（７０：３０：１）及びω）水ニアセトニ
トリル：１０％トリフルオロ酢酸（４０：６０：１）で
同様に再クロマトグラフィーを行った。この結果を第５
図に示す。主要ピーク（保持時間１８分）を分取し、純
粋なｒ−ｈＡＮｐ　ｔ−ａた。１回につき３．３７ｎモ
ルのｒ−ｈＡＮＰが得られ、どれを反復することによシ
合計４０４ｎモルのγ−ｈＡＮＰが得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明のｒｈＡＮＰの利尿作用を示し、。 第２図は血圧降下作用を示すグラフであシ、篤３図は５
ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−７５τ使用するクロマトグツフィ
ーの溶ＩＢ経過を示し、第４図及びｔば５図は液体高速
クロマドグ２フイーにおける６出経過を示す。 特許出願人 松尾壽之 サントリー株式会社 特許出願代理人 弁理士　宵　木　朗 弁理士西舘和之 弁理士　福　本　私 弁理士　山　口　昭　之 弁理士　西　山　雅　也 第５図 ０　１０　２０ 保持時間（分） 手続補正書（自緊） 昭和６０年７月Ｓ日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １、事件の表示 昭和５９年　特許願　第１Ｌ６６Ｊ６号２、発明の名称 新規なぺ１チド及びこれを有効成分とする医薬３、補正
をする者 事件”との関係　特許出願人 氏名松尾壽之 名　称　（，１９０，）す１ントリー株式会社４、代理
人 （外　４　名）””’ ５、補正の対象 （１）明細書の「特許請求の範囲」の欄。 （２）明細書の「発明の詳細な説明」の欄０６、補正の
内容 （１）　特許請求の範囲を別紙の通りに補正する。 （２）■〜明細書第５頁第９行目「Ｓ、」を削除する。 ■　同第５頁第１３行目１’−２２１Ｊをｒ２２１Ｊに
補正する〇 ■　同第１０頁第８行目ｒ（Ｇｙｓ）Ｊをｒ（Ｃｙｓ）
□」に補正する。 ■　同第１１頁第８行目［ベンドパルビタール」ヲ「ベ
ンドパルビタール」に補正する。 ■　同第１１頁第８ をｒｐｐ８９−９４（１９８１）Ｊに補正する。 ０　同第１４頁＃！８行目「等電沈澱Ｊをｒ等電点沈澱
」に補正する。 の　同第１４頁第１３行目「屍体的Ｊを「具体的」に補
正する。 ７、添付書類の目録 補正特許請求の範囲　１通 ２、特許請求の範囲 １、次の構造式 ％式％ （式中、１０５位の（Ｊ８と１２１位のＣｙｓはジスル
フィド結合により結合している、） で表わされるペプチド及びその酸付加塩０２、次の構造
式 ％式％ （式中、１０５位）Ｃｙｓと１２１位のＣｙｓはジスル
フィド結合により結合している、）で表わされるペプチ
ド又はその酸付加塩を含んで成る利尿剤。 ３、次の構造式 ％式％ （式中、１０５位（／Ｊ　Ｃｙａと１２１位０）　Ｃｙ
ｓ　ハシスルフィド結合により結合している） で表わされるペプチド又はその酸付加塩を含んで成る血
圧降下剤。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の構造式 ％式％ （式中、１０５位のＣｙｓと１２１位のＣｙｓはジスル
   フィド結合によ多結合している、）で表わされるペプチ
   ド及びその酸付加塩。 ２、次の構造式 ％式％ （式中、１０５位のＣｙｓと１２１位のＣｙａはジスル
   フィド結合によ多結合している、）で表わされるペプチ
   ド又はその酸付加塩を含ルで成る利尿剤。 ３、次の構造式 １０ ％式％ （式中、１０５位のＣｙｓと１２１位のＣｙｓはジスル
   フィド結合によシ結合している） で表わされるペプチド又はその酸付加塩を含んで成る血
   圧降下剤。