DE3853384T2

DE3853384T2 - Peptid.

Info

Publication number: DE3853384T2
Application number: DE3853384T
Authority: DE
Inventors: David Coy; William Murphy
Original assignee: Tulane University
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1987-01-07
Filing date: 1988-01-07
Publication date: 1995-08-31
Anticipated expiration: 2008-01-08
Also published as: ATE120204T1; EP0301087B1; JPH01501798A; EP0301087A1; US4871717A; CA1333647C; WO1988005052A1; DE3853384D1; EP0301087A4

Description

Diese Erfindung betrifft therapeutisch wirksame Peptide.
Eine Anzahl Somatostatin-analoger Verbindungen mit einer Wirksamkeit, die die Freisetzung von Wachstumshormonen hemmt, sind in der Literatur beschrieben, einschließlich analoger Verbindungen, die weniger als die vierzehn natürlich vorkommenden Aminosäuren enthalten. In der U.S.-Patentschrift Nr. 4,485,101, Coy et al., auf die hiermit Bezug genommen wird, sind beispielsweise Dodekapeptide mit einer N-endständigen Acetylgruppe, einem C-endständigen NH&sub2;, D-Trp an Position 6 und p-Cl-Phe an Position 4 beschrieben. (In dieser Beschreibung soll, soweit keine Angaben zur Konfiguration gemacht sind, das L-Isomer die gewünschte Konfiguration sein).
In Cai et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986 83 S. 1896 sind Oktapeptide beschrieben, die Somatostatin-analoge Verbindungen sind und wirkungsvoller die Freisetzung von Wachstumshormonen hemmen als Somatostatin. In der US-A-4 130 554, Holly et al., ist die Herstellung von β-Mercaptopropionyl-Lys-Asn-Phe-Phe- Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, einer Somatostatin-analogen Verbindung, beschrieben.
Im allgemeinen hat die Erfindung als Merkmal ein Peptid der Formel
A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-Cys-A&sub6;-A&sub7;
in der A&sub1; SH-CH&sub2; H-CO oder SH- H-CO
ist (wobei Q H oder eine C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe ist), worin A&sub1; über eine Disulfidbrücke einen Ring mit Cystin bildet; A&sub2; o-, m- - oder, vorzugsweise, p-substituiertes X-Phe oder X-D-Phe ist (wobei X H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy ist); A&sub3; ist X-Trp, x-D-Trp, α-N-Methyl-X-Trp oder α-N- Methyl-D-X-Trp (worin x ein Substituent auf dem Benzolring und H&sub1;-Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy ist); A&sub4; Lys, α-N-Methyl-Lys oder &epsi;-N-R&sub1;-Lys ist (wobei R&sub1; C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist);
A&sub5; Val oder Thr ist; A&sub6; Pro oder - - H ist,
wobei Z H oder CH&sub3; ist, und T H, Ch&sub2;OH, CH&sub2;CH&sub2;OH, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;OH, CH(CH&sub3;)OH, Isobutyl, Benzyl (an den o-, m- oder p-Positionen mit H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy substituiert), CH&sub2;-β-Naphthyl (an dem Benzolring mit H, Halogen, NH&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy substituiert) oder CH&sub2;-Pyridyl (an dem Benzolring mit H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy substituiert) ist; und A&sub7; OR&sub2; (wobei R&sub2; H oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist), CH&sub2;OH, CH&sub2;OCR&sub3; (wobei R&sub3; C&sub1;- C&sub1;&sub2;-Alkyl, C&sub8;-C&sub1;&sub2;-Aralkyl oder Phenoxy ist) oder
ist
(wobei R&sub4; H oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl und R&sub5; H, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Phenyl oder C&sub7;-C&sub1;&sub0;-Aralkyl ist); oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon ist.
In der oben angeführten Formel ist die Konfiguration des Moleküls am Kohlenstoffatom, das mit dem T verbunden ist, nicht angegeben, was darauf hindeutet, daß der Aminosäurenrest, an dem T ein Substituent ist, die D- oder L-Konfiguration haben kann.
Bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind unter anderem MPA- Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2; (MPA = Mercaptopropionsäure); MPA-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Phe-NH&sub2;; MPA-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys- p-Cl-Phe-NH&sub2;; und MPA-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-β-Nal-NH&sub2;.
In anderen bevorzugten Ausführungsformen bilden eine therapeutisch wirkungsvolle Menge der therapeutischen Verbindung und eine pharmazeutisch akzeptable Trägersubstanz, z.B. Magnesiumcarbonat, Laktose oder ein Phospholipid, mit dem die therapeutisch wirksame Verbindung eine Mizelle bilden kann, zusammen eine therapeutisch wirksame Zusammensetzung, z.B. eine Pille, Tablette, Kapsel oder eine Flüssigkeit zur oralen Verabreichung an einen menschlichen Patienten, eine verstreichbare Creme, Gel, Lotion oder Salbe zur Aufbringung auf die Haut eines menschlichen Patienten, der die Verbindung benötigt, eine Flüssigkeit, die nasal in Form von Tropfen oder Spray verabreichbar ist, oder eine Flüssigkeit zur intravenösen, parenteralen, subkutanen oder intraperitonealen Verabreichung. Die Pille, Tablette oder Kapsel kann mit einer Substanz beschichtet sein, die die Zusammensetzung für einen ausreichenden Zeitraum, in dem die Zusammensetzung unzersetzt in den Dünndarm des Patienten gelangen kann, vor der Magensäure im Magen des Patienten schützt. Die therapeutisch wirksame Zusammensetzung kann auch in Form einer biologisch abbaubaren Formulierung mit verzögerter Freisetzung zur intramuskulären Verabreichung vorliegen. Zur maximalen Wirksamkeit ist eine eine Freisetzung nullter Ordnung erwünscht. Eine Freisetzung nullter Ordnung läßt sich unter Verwendung einer implantierbaren oder externen Pumpe, z.B. einer Pumpe des Typs Infusoid (TM), zur Verabreichung der therapeutisch wirksamen Zusammensetzung erhalten.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung hemmen wirkungsvoll die Abscheidung von Wachstumshormonen, Insulin und Glucagon.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen sowie aus den Ansprüchen.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Struktur

Die erfindungsgemäßen Verbindungen habe die allgemeine Formel, die oben unter Zusammenfassung der Erfindung angegeben ist. Sie sind alle Peptid-analoge Verbindungen Somatostatins, die an Position 6 Cys aufweisen; dieser Rest bildet über eine Disulfidbrücke einen Ring mit dem Rest an Position 1. Es ist festgestellt worden, daß MPA an Position 1; Tyr an Position 2; D-Trp an Position 3; Lys an Position 4; und Val an Position 5 Modifikationen darstellen, die die Wirksamkeit besonders erhöhen.
Die Verbindungen können in Form von pharmazeutisch akzeptablen Salzen bereitgestellt werden. Beispiele bevorzugter Salze sind diejenigen mit therapeutisch wirksamen organischen Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Apfelsäure, Ascorbinsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Toluensulfonsäure oder Pamoasäure, sowie Polymersäuren wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose, und Salze mit anorganischen Säuren wie die Halogenwasserstoffsäuren, z.B. Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure.

Synthese

Nachstehend ist die Synthese eines Peptids beschrieben. Andere Peptide können hergestellt werden, indem an dem folgenden Syntheseverfahren entsprechende Modifikationen vorgenommen werden, die im Können des Durchschnittsfachmanns auf dem Gebiet liegen.
Der erste Schritt bei der Herstellung von MPA-Tyr-D-Trp-Lys- Val-Cys-Thr-NH&sub2; war die Herstellung des intermediären S-Methylbenzyl-3-MPA-Tyr-D-Trp-N-Benzyloxycarbonyl-Lys-Val-S- Methylbenzyl-Cys-O-Benzyl-Thr-Benzhydryl-Aminharzes wie folgt.
Benzhydrylamin-Polystyrolharz (Vega Biochemicals, Inc.) (1,00 g, 0,5 mmol) in Chloridionenform wurde in das Reaktionsgefäß eines Peptidsynthesegeräts des Typs Beckman 990B eingebracht, welcher zur Durchführung des folgenden Reaktionszyklus programmiert war: (a) Methylenchlorid; (b) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (zweimal jeweils 1 bzw. 25 Minuten lang); (c) Methylenchlorid; (d) Ethanol; (e) Methylenchlorid; (f) 10% Triethylamin in Chloroform.
Das neutralisierte Harz wurde mit Boc-O-Benzyl-Threonin und Diisopropylcarbodiimid (jeweils 1,5 mmol) in Methylenchlorid 1 h lang verrührt; das erhaltene Aminosäureharz wurde dann dem Kreislauf der Schritte (a) bis (g) des voranstehend erwähnten Reinigungsprogramms unterzogen. Als nächstes wurden die folgenden Aminosäuren (1,5 mmol) der Reihe nach durch dasselbe Verfahren verknüpft: Boc-S-Methylbenzyl-Cystein, Boc-Val, Boc- N-Benzyloxycarbonyl-Lysin, Boc-D-Trp, Boc-Tyrosin und Boc-S- Methylbenzyl-3-Mecarptopropionsäure. Nach dem Reinigen und Trocknen betrug das Gewicht des fertigen Harzes 1,89 g.
Das Harz wurde mit Anisol (4 ml) und wasserfreiem Wasserstofffluorid (36 ml) bei 0ºC vermischt und 45 Minuten lang gerührt. Überschüssige Fluorwasserstoffsäure wurde unter einem trockenen Stickstoff strom schnell verdampft und freies Peptid ausgefällt und mit Ether gewaschen. Das Rohpeptid wurde dann in 800 ml 90% Essigsäure gelöst, der I&sub2; in Methanol zugegeben wurde, bis sich eine permanente Braunfärbung ergab. Die Lösung wurde dann 1 h lang gerührt, ehe das Lösungsmittel im Vakuum entfernt wurde. Das resultierende Öl wurde in einem minimalen Volumen von 50 % Essigsäure gelöst und über eine Sephadex G- 25-Säule (2,5 x 100 mm) eluiert. Fraktionen, die eine durch UV-Absorption und Dünnschicht-Chromatographie feststellbare Hauptkomponente enthielten, wurden dann zusammengeführt, auf ein kleines Volumen eingedampft und auf eine Whatman LRP-1- Oktadecylsilan (15-20 uM)-Säule (2,5 x 50 cm) aufgebracht.
Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von 10-50% Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser eluiert. Fraktionen wurden mit Dünnschichtchromatographie und analytischer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie untersucht und zusammengebracht, um maximale Reinheit zu erzielen. Eine wiederholte Lyophilisation der Lösung aus Wasser ergab 129 mg des Produktes als weißes, flockiges Pulver.
In einer Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie und einer Dünnschichtchromatographie erwies sich das Produkt als homogen. In einer Aminosäureanalyse eines Säurehydrolysats und einer Massenspektrometrie mittels schnellem Atombeschusses bestätigte sich die Zusammensetzung des Peptids.
Die erf indungsgemäßen Peptide mit der Formel MPA-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Phe-NH&sub2;; MPA-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Cl-Phe-NH&sub2;; und MPA-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-β-Nal-NH&sub2; wurden in Verfahren hergestellt, die analog zu den oben beschriebenen sind.

Verwendung

Bei Verabreichung an Säuger, insbesondere Menschen, (z.B. oral, lokal, intravenös, parenteral in einer biologisch abbaubaren Form mit verzögerter Freisetzung, nasal oder durch Zäpfchen) können die Verbindungen wirkungsvoll zur Hemmung einer Freisetzung von Wachstumhormonen sowie zur Hemmung einer Abscheidung von Insulin, Glucagon und einer exokrinen Sekretion der Pankreas sowie zur therapeutischen Einwirkung auf das zentrale Nervensystem beitragen.
Die Verbindungen können einem Säuger, z.B. einem Menschen, in den für Somatostatin verwendeten Dosierungen oder aufgrund ihrer höheren Wirksamkeit in geringeren Dosierungen verabreicht werden. Die erf indungsgemäßen Verbindungen können zur Behandlung von Krebs, insbesondere von Wachstumshormonen abhängigem Krebs (z.B. Knochen-, Knorpel-, Pankreas- (endokrin und exokrin), Prostata- oder Brustkrebs), von Akromegalie und verwandten hypersekretorischen endokrinen Zuständen oder von blutenden Magengeschwüren bei Notfallpatienten und bei Patienten, die an Pankreatitis oder Diarrhoe leiden, verwendet werden. Die Verbindungen können auch bei der Behandlung von Diabetes und zum Schutz der Leber bei Patienten mit Zirrhose und Hepatitis verwendet werden. Die Verbindungen können auch zur Behandlung von Alzheimer, als Analgetikum zur Schmerzbehandlung durch spezifische Einwirkung auf gewisse Opiatrezeptoren und als die Magenzellen schützende Verbindungen zur Therapie von Magengeschwüren eingesetzt werden. Die Verbindungen lassen sich auch zur Behandlung gewisser Arten von Pilzvergiftungen einsetzen.
Die Verbindungen finden ebenfalls Anwendung bei der Behandlung einer diabetes-bedingten Retinopathie. Die krebshemmende Wirkung der Verbindungen kann mit ihrer Fähigkeit zusammenhängen, Wachstumsfaktoren wie dem epidermalen Wachstumsfaktor, die mit Krebs im Zusammenhang stehen, entgegenzuwirken.
Die Verbindungen können einem Säuger, z.B. einem Menschen, in einer Dosierung von 0,01 bis 1000 mcg/kg/Tag, vorzugsweise 0,1 bis 100 mcg/kg/Tag verabreicht werden.
Andere Ausführungsformen liegen innerhalb des Umfangs der nachstehenden Ansprüche.

Claims

1. Ein Peptid der Formel

A&sub1;-A&sub2; -A&sub3;-A&sub4;-A&sub5;-Cys-A&sub6;-A&sub7;

in der A&sub1; SH-CH&sub2;- H-CO oder SH- H-CO

ist (wobei Q H oder eine C&sub1;-C&sub8;-Alkylgruppe darstellt), wobei A&sub1; über eine Disulf idbindung einen Ring mit Cystin bildet; A&sub2; o-, m- oder p-substitutiertes X-Phe oder X-D- Phe ist (wobei X H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy darstellt); A&sub3; X-Trp, X-D-Trp, α-N- methyl-X-Trp oder α-N-methyl-D-X-Trp ist (wobei X ein Substituent auf dem Benzolring ist und H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy ist); A&sub4; Lys, α-N- methyl-Lys oder 6-N-R&sub1;-Lys ist (wobei R&sub1; C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist); A&sub5; Val oder Thr ist; A&sub6;

Pro oder - - H ist,

wobei Z H oder CH&sub3; ist und T H, CH&sub2;OH, CH&sub2;CH&sub2;OH, CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;OH, CH(CH&sub3;)OH, Isobutyl, Benzyl (an den o-, m- oder p-Positionen mit H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;- Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy substituiert), CH&sub2;-β-Naphtyl (auf dem Benzolring mit H, Halogen, NH&sub2;, NO&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;-C&sub3;-Alkoxy substituiert) oder CH&sub2;-Pyridyl (auf dem Benzolring mit H&sub1; Halogen, NH&sub2;, OH, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl oder C&sub1;- C&sub3;-Alkoxy substituiert) ist;

und A&sub7; ist OR&sub2; (wobei R&sub2; H oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl ist), CH&sub2;OH, CH&sub2;OH, CH&sub2;OCR&sub3; (wobei R&sub3; C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, C&sub8;-C&sub1;&sub2;-Aralkyl oder Phenoxy ist), oder

(wobei R&sub4; H oder C&sub1;-C&sub3;-Alkyl und R&sub5; H, C&sub1;-C&sub3;-Alkyl, Phenyl oder C&sub7;-C&sub1;&sub0;-Aralkyl ist); oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz daraus.

2. Peptid nach Anspruch 1, mit der Formel Mercaptopropionsäure-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH&sub2; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz daraus.

3. Peptid nach Anspruch 1, mit der Formel Mercaptopropionsäure-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Phe-NH&sub2; oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz daraus.

4. Peptid nach Anspruch 1, mit der Formel Mercaptopropionsäure-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-p-Cl-Phe-NH&sub2; oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz daraus.

5. Peptid nach Anspruch 1, mit der Formel Mercaptopropionsäure-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-β-Nal-NH&sub2; oder einem pharmazeutisch akzeptablen Salz daraus.

6. Therapeutische Zusammensetzung, die in der Lage ist, die Freisetzung von Wachstumshormonen, Insulin, Glukagon oder eine exokrine Sekretion des Pankreas zu hemmen, mit einer therapeutisch wirksamen Menge der Verbindung nach Anspruch 1, zusammen mit einer pharmazeutisch akzeptablen Trägersubstanz.

7. Verbindung nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Verringerung der Ausscheidung von Wachstumshormonen, Insulin, Glukogon oder der exokrinen Sekretion des Pankreas in einem Säuger.

8. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die Zusammensetzung in Form einer Pille, einer Tablette oder einer Kapsel zur oralen Verabreichung an einen menschlichen Patienten vorliegt, der die Verbindung benötigt.

9. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin die Zusammensetzung in Form einer Flüssigkeit zur oralen Verabreichung an einen menschlichen Patienten vorliegt, der die Verbindung benötigt.

10. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung mit einer Substanz überzogen ist, die in der Lage ist, diese Zusammensetzung für eine Zeitdauer, die ausreicht, daß die Zusammensetzung unaufgelöst in den Dünndarm des menschlichen Patienten gelangen kann, vor der im Magen des menschlichen Patienten vorhandenen Magensäure zu schützen.

11. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung in Form einer Creme, eines Gels, eines Sprays oder einer Salbe zur Aufbringung auf die Haut eines menschlichen Patienten vorliegt, der die Verbindung benötigt.

12. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung in Form einer Flüssigkeit vorliegt, die einem menschlichen Patienten, der diese Verbindung benötigt, nasal als Tropfen oder Spray verabreicht werden kann.

13. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung in Form einer Flüssigkeit zur intravenösen, subkutanen, parenteralen oder intraperitonealen Verabreichung an einen menschlichen Patienten, der die Verbindung benötigt, vorliegt.

14. Therapeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei die Zusammensetzung in Form einer biologisch abbaubaren Zusammensetzung mit verzögerter Freisetzung zur intramuskulären Verabreichung an einen menschlichen Patienten, der die Verbindung benötigt, vorliegt.