ES2732205T3 - Proteínas de fusión para uso en el tratamiento del cáncer - Google Patents

Proteínas de fusión para uso en el tratamiento del cáncer Download PDF

Info

Publication number
ES2732205T3
ES2732205T3 ES09762019T ES09762019T ES2732205T3 ES 2732205 T3 ES2732205 T3 ES 2732205T3 ES 09762019 T ES09762019 T ES 09762019T ES 09762019 T ES09762019 T ES 09762019T ES 2732205 T3 ES2732205 T3 ES 2732205T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
protease
amino acid
polypeptide
cancer
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES09762019T
Other languages
English (en)
Inventor
Frederic Madec
Phil Lecane
Philip Marks
Keith Foster
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ipsen Bioinnovation Ltd
Original Assignee
Ipsen Bioinnovation Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB0810782.3A external-priority patent/GB0810782D0/en
Priority claimed from GB0820965A external-priority patent/GB0820965D0/en
Application filed by Ipsen Bioinnovation Ltd filed Critical Ipsen Bioinnovation Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2732205T3 publication Critical patent/ES2732205T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/48—Nerve growth factor [NGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/5759—Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • C07K7/086—Bombesin; Related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/06—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a lysosomal/endosomal localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Un polipéptido para uso en la supresión de un cáncer mediante inhibición de la secreción de la hormona del crecimiento a partir de una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, comprendiendo dicho polipéptido: (a) una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, comprendiendo la proteasa no citotóxica una endopeptidasa de neurotoxina clostridial o una proteasa contra IgA; (b) una Fracción Guiada (Targeting Moiety, TM) que se une a un Sitio de Unión en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, Sitio de Unión que puede experimentar una endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, consistiendo la TM en un péptido de hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH); y (c) un dominio de translocación de neurotoxina clostridial que transloca la proteasa desde dentro del endosoma, a través de la membrana endosomal y hasta el interior del citosol de dicha célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa; en donde el polipéptido carece del dominio de unión HCC nativo de una neurotoxina clostridial.

Description

d e s c r ip c ió n
Proteínas de fusión para uso en el tratamiento del cáncer
La presente descripción se refiere a la supresión del crecimiento, mantenimiento y progresión de cánceres comunes, en particular los cánceres colorrectal, de próstata, de mama y de pulmón.
El cáncer colorrectal es el tercer cáncer más común tanto en hombres como en mujeres en los Estados Unidos. Según el informe de abril de 2003 de la Organización Mundial de la Salud sobre las tasas globales de cáncer, cada año se diagnostican más de 940.000 casos y cada año se informa de prácticamente 500.000 muertes en todo el mundo. La tasa de supervivencia general de 5 años del cáncer de colon es de aproximadamente un 60% y prácticamente 60.000 personas mueren de la enfermedad cada año en los Estados Unidos.
Las terapias empleadas en la actualidad dependen principalmente de la ubicación del tumor en el colon o el recto y del estadio de la enfermedad, y pueden incluir a) cirugía, b) quimioterapia, c) terapia biológica o d) radioterapia. La cirugía para extirpar el tumor primario es el principal tratamiento de primera línea. Sin embargo, los efectos secundarios adversos comunes de la cirugía incluyen hemorragia por la cirugía, coágulos de sangre en las piernas y daño a los órganos cercanos durante la operación.
Las opciones quirúrgicas incluyen: (i) resección intestinal, que implica cortar el abdomen para llegar al área del colon o el recto que está afectada por el cáncer. El cirujano extirpa el cáncer, así como las partes del colon o recto cercanas al mismo. Luego se cosen entre sí Ios dos extremos sanos del colon o el recto; (ii) resección hepática, que implica la extirpación de la metástasis que se ha propagado desde un área colorrectal hasta el hígado, así como partes del hígado que están cerca del cáncer. Se puede extirpar hasta la mitad del hígado siempre que el resto esté sano. Otros dos métodos para destruir las células cancerosas en el hígado incluyen las ondas de radio (ablación por radiofrecuencia) y el calor (coagulación por microondas); y (iii) criocirugía (también llamada crioterapia) en la que se emplea nitrógeno líquido para congelar y destruir el cáncer colorrectal que se ha propagado al hígado. Se utiliza cuando Ios tumores en el hígado son de pequeño tamaño.
La quimioterapia se emplea normalmente como adyuvante de la cirugía en una minoría de pacientes, por regla general aquellos cuyo tumor se ha propagado a Ios ganglios linfáticos, para Ios que el beneficio de la quimioterapia está claramente establecido. Sin embargo, Ios efectos secundarios de la quimioterapia incluyen: náuseas, vómitos, pérdida de apetito, pérdida de cabello, llagas en la boca, erupción en las manos y Ios pies, y también: riesgo de infección, hemorragias o hematomas por lesiones leves, y fatiga relacionada con la anemia. La quimioterapia se puede administrar en diversas situaciones: (i) la quimioterapia primaria se usa normalmente cuando el cáncer colorrectal está avanzado y ya se ha propagado a otras partes del cuerpo. En este caso, la cirugía no puede eliminar el cáncer, por lo que en este momento el médico generalmente recomienda quimioterapia, que puede reducir Ios nódulos tumorales, aliviar Ios síntomas y prolongar la vida; (ii) la quimioterapia adyuvante se emplea cuando se administra quimioterapia después de la extirpación quirúrgica del cáncer. Es posible que la cirugía no elimine todo el cáncer, por lo que el tratamiento de quimioterapia adyuvante se usa con frecuencia para destruir cualquier célula cancerosa que pueda haberse omitido, como las células que se pueden haber metastatizado o propagado al hígado; y (iii) se puede emplear quimioterapia neoadyuvante antes de la cirugía para reducir el tamaño del tumor con el fin de que el cirujano pueda extirparlo por completo con menos complicaciones. Con frecuencia, la quimioterapia se administra con radiación para que la radiación sea más eficaz.
A las personas que tienen cáncer que ya se ha propagado se les puede prescribir terapia biológica. Las terapias actuales incluyen el uso de: (i) modificadores de la respuesta biológica, que no destruyen directamente el cáncer, sino que provocan que el sistema inmunitario reaccione contra Ios tumores. Los modificadores de la respuesta biológica incluyen citoquinas como Ios interferones y las interleucinas. Sin embargo, esta estrategia implica el uso de grandes dosis de administración mediante inyección o infusión con la esperanza de estimular las células del sistema inmunitario para que actúen de manera más eficaz. Además, el uso de modificadores de la respuesta biológica está asociado frecuentemente con síntomas similares a Ios de la gripe, incluyendo fiebre, escalofríos, náuseas y pérdida de apetito. Otros efectos secundarios no deseables incluyen: erupciones o hinchazón en el lugar de la inyección, una caída de la presión arterial como resultado del tratamiento, y fatiga; (ii) factores estimulantes de colonias, que estimulan la producción de células de la médula ósea tales como Ios glóbulos rojos y blancos y las plaquetas. Por lo tanto, Ios factores estimulantes de colonias no afectan directamente a Ios tumores, sino que, en lugar de ello, ayudan a mantener el sistema inmunitario durante el tratamiento del cáncer. Sin embargo, lamentablemente, el uso de factores estimulantes de colonias está asociado con efectos secundarios no deseables como dolor de huesos, fatiga, fiebre y pérdida de apetito; y (iii) vacunas antitumorales, que estimulan el sistema inmunitario para que reconozca las células cancerosas. Dichas vacunas se emplean normalmente después de la aparición del cáncer y, por lo tanto, son supresoras más que preventivas. La eficacia es deficiente y el uso de vacunas antitumorales está asociado con dolores musculares y fiebre baja.
Una dificultad importante en el tratamiento de Ios cánceres colorrectales consiste en que un 20-25% de Ios pacientes tiene metástasis hepática detectable en el momento del diagnóstico inicial y otro 40-50% de Ios pacientes desarrolla metástasis hepática en Ios tres años posteriores a la cirugía primaria, la enfermedad metastásica se desarrolla primero en el hígado.
El cáncer de mama es el tipo de cáncer más común en las mujeres, a excepción de Ios cánceres de piel no melanoma. Se estima que en 2007 se diagnosticarían prácticamente 180.000 nuevos casos de cáncer de mama invasivo entre mujeres en Ios Estados Unidos. Aproximadamente una de cada ocho mujeres (13%) tiene un riesgo de desarrollar cáncer de mama invasivo a lo largo de la vida.
Las terapias actuales incluyen: cirugía, radioterapia, quimioterapia, terapia hormonal y terapia biológica. La elección de una terapia en lugar de otra implica la consideración del tamaño y la ubicación del tumor, Ios factores histológicos como la invasión linfática y la determinación del subtipo histológico, el estadio o la extensión de la enfermedad, y la edad y la salud general de la paciente.
Las opciones quirúrgicas incluyen mastectomía o tumorectomía (también llamada terapia de conservación de la mama o mastectomía parcial), con o sin extirpación de ganglios linfáticos. Desafortunadamente, las pacientes que se han sometido a una mastectomía a menudo padecen uno o más de Ios siguientes efectos: infección y absceso de la herida, necrosis del colgajo, parestesia de la pared torácica, síndrome del seno fantasma, síndrome de dolor posoperatorio, seroma o linfedema. De modo similar, las complicaciones asociadas con la tumorectomía incluyen: lesión o trombosis de la vena axilar, formación de seroma, linfedema, discapacidad de Ios movimientos del hombro, daño al plexo braquial y dolor de la pared torácica.
La radioterapia está asociada con complicaciones como: necrosis del tejido blando de la mama, edema prolongado de la mama, fractura de costillas, disminución de la movilidad del hombro, plexopatía braquial con parestesia y dolor en el brazo, linfedema, angiosarcoma, cáncer de pulmón, enfermedad coronaria y neumonitis sintomática.
Sin embargo, las opciones de quimioterapia actuales van acompañadas de efectos secundarios no deseables, tales como: náuseas, pérdida de cabello, menopausia temprana, sofocos, fatiga y disminución temporal de Ios recuentos sanguíneos. Además, Ios efectos secundarios más graves incluyen: toxicidad hepática, cistitis hemorrágica, amenorrea, ataxia cerebelosa, disfunción miocárdica, neuropatía periférica, mielosupresión, neurotoxicidad, alopecia y derrame pleural.
Las terapias hormonales se han centrado hasta la fecha en el uso de Tamoxifen™ y/o en el uso de inhibidores de la aromatasa como Arimidex™, Aromasin™ y Femara™. Estas moléculas terapéuticas actúan suprimiendo la actividad de la hormona, en especial del estrógeno, y por lo tanto inhiben el crecimiento de las células de cáncer de mama que pueden quedar después de la cirugía de cáncer de mama. Sin embargo, lamentablemente, las terapias hormonales están asociadas con efectos secundarios no deseables, tales como sofocos y SECuedad vaginal. En particular, se ha demostrado que el tratamiento con Tamoxifen™ aumenta el riesgo de cáncer de endometrio, induce síntomas perimenopáusicos y aumenta el riesgo de desarrollar cataratas.
Las terapias biológicas se han centrado hasta la fecha en el uso de Herceptin™. Sin embargo, el uso de esta molécula terapéutica está asociado con efectos adversos, tales como: toxicidad cardíaca, fiebre, escalofríos, náuseas, vómitos y dolores, en especial después de la primera infusión.
El cáncer de próstata es la segunda mayor causa de muerte en Ios Estados Unidos en hombres que fallecen de cáncer y es el cáncer más común diagnosticado en Ios hombres estadounidenses. En Ios EE. UU. se estima que 1 de cada 10 hombres desarrollará cáncer de próstata a lo largo de su vida.
Al igual que con otros tipos de cáncer, Ios tratamientos disponibles dependen de diversos factores, como el grado y el estadio del cáncer, la edad y la salud general del paciente. Las terapias actuales incluyen: (i) espera vigilante basada en análisis de PSA en sangre, que se realizan regularmente para verificar que el estado de un paciente no se ha deteriorado. Esta estrategia se recomienda para Ios cánceres pequeños, de crecimiento lento y no agresivos que afectan a hombres de edad avanzada en Ios que el cáncer no afecta a su esperanza de vida; (ii) prostatectomía (es decir, extirpación de la próstata), aunque ésta está asociada con efectos secundarios tales como: problemas de control de la vejiga, escapes de orina, impotencia y estenosis de la anastomosis; (iii) radioterapia, como la radioterapia con haces externos (Eb RT), que emplea rayos X de alta potencia, aunque esta terapia está asociada con problemas rectales, hemorragia persistente, y úlcera rectal. Alternativamente se pueden emplear implantes de semillas radiactivas, que se implantan directamente dentro de la próstata. Esta terapia también se conoce como braquiterapia y administra una dosis de radiación más baja (aunque durante un período de tiempo más largo) que la que se alcanza normalmente mediante rayos externos. Desafortunadamente, este tipo de terapia está asociado con complicaciones tales como la micción lenta y dolorosa, e impotencia; (Iv) terapia hormonal, que está diseñada para prevenir que las hormonas sexuales masculinas estimulen el crecimiento de células cancerosas. Esto se logra normalmente mediante la inhibición química de la secreción de hormonas sexuales masculinas, o por medios quirúrgicos (extirpación de Ios testículos). Desafortunadamente, estas terapias están asociadas con efectos secundarlos tales como: aumento de tamaño de Ios pechos, reducción del deseo sexual, impotencia, sofocos, aumento de peso y reducción de Ios músculos y la masa ósea. Además se ha demostrado que algunos medicamentos de terapia hormonal provocan náuseas, diarrea, fatiga y daño hepático; (v) quimioterapia - empleando el mismo tipo de medicamentos arriba descrito en el contexto del cáncer colorrectal, de mama o de próstata; y (vi) crioterapia, que destruye las células cancerosas congelando el tejido afectado. Lamentablemente, esta terapia está limitada debido a las dificultades para controlar la extensión del proceso de congelación, que con frecuencia produce daños en tejidos alrededor de la vejiga y complicaciones a largo plazo (por ejemplo, lesión en el recto o Ios músculos que controlan la micción).
El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad en el mundo relacionada con el cáncer tanto en hombres como en mujeres. En todo el mundo, el cáncer de pulmón sigue siendo el tumor maligno más común, con una estimación de 1,04 millones de casos nuevos cada año representa el 12,8% de los casos nuevos de cáncer diagnosticados. El cáncer de pulmón es la causa de 921.000 muertes cada año en el mundo, lo que representa casi el 18% de las muertes relacionadas con el cáncer.
Las terapias actuales para el cáncer de pulmón incluyen cirugía, radioterapia y quimioterapia, ya sea por separado o en combinación. Cuando emplean dichas terapias, los médicos tienen en cuenta: el tipo de cáncer de pulmón (células pequeñas o células no pequeñas), el tamaño y la posición del tumor, el estadio del tumor (presencia de metástasis o no fuera del pulmón), y la salud general del paciente.
Para los cánceres de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), Ios tratamientos actualmente disponibles incluyen: (i) quimioterapia - desafortunadamente, el CPCNP soIo es moderadamente sensible a la quimioterapia. Las tasas de respuesta de la terapia con un solo agente están dentro del orden de un 15%, teniendo Ios agentes más recientes (por ejemplo, Gemcitabine™, Paclitaxel™, Docetaxel™, Vinorelbine™) tasas de respuesta ligeramente más altas (20-25%). Además, la quimioterapia está asociada con complicaciones tales como: una disminución en el número de células sanguíneas, náuseas, vómitos, diarrea, dolor de boca y úlceras bucales, pérdida de cabello, y fatiga; (ii) terapia biológica - Ios esfuerzos de investigación recientes se han centrado en gran medida en la identificación de dianas moleculares y el uso de este conocimiento para desarrollar terapias moleculares dirigidas. Mientras que actualmente se están desarrollando varias terapias moleculares dirigidas, que se están probando en CPCNP, estas terapias están asociadas con efectos secundarios no deseables que incluyen: síntomas similares a la gripe, como escalofríos, fiebre, dolores musculares, fatiga, pérdida de apetito, náuseas, vómitos y diarrea; (iii) radioterapia - este tipo de terapia se emplea normalmente como un adyuvante a la cirugía, o de forma individual cuando la resección quirúrgica no es posible debido a una reserva pulmonar limitada o a la presencia de condiciones comórbidas. La radioterapia por sí sola está asociada únicamente con un 12-16% de supervivencia después de 5 años en caso de CPCNP en estadio temprano. Lamentablemente, las complicaciones son comunes, e incluyen: náuseas, fatiga, reacción cutánea, pérdida de cabello, tos persistente, SECuedad o dolor de garganta, y dificultad para tragar; (Iv) quimioterapia y radioterapia combinadas - estudios recientes han demostrado una supervivencia limitada en pacientes con enfermedad en estadio III no resecable cuando son tratados con quimioterapia concurrente (en lugar de secuencial) a base de platino, y radioterapia. Sin embargo, al igual que con Ios tipos de cáncer arriba descritos, el uso de quimioterapia y radioterapia tiene una serie de efectos secundarlos no deseables; (v) cirugía - ésta se emplea generalmente cuando el tumor está en un estadio temprano y/o si el tumor no se ha propagado. Algunos ejemplos incluyen: resección en cuña, que implica la extirpación de una porción de tejido en forma de triángulo. La resección en cuña se usa para extirpar un tumor y una pequeña cantidad de tejido normal a su alrededor. Cuando se toma una cantidad ligeramente mayor de tejido, se llama resección segmentarla; lobectomía, que implica la extirpación de un lóbulo entero (sección) del pulmón; y neumonectomía, que implica la extirpación de un pulmón entero. Los efectos secundarlos encontrados después de estas intervenciones incluyen: dolor, Infección, pero también neumonía, hemorragia, coágulos de sangre y otras Infecciones. Además, la tasa de mortalidad perioperatoria es de un 6% en el caso de la neumonectomía, de un 3% en el caso de la lobectomía y de un 1 % en el caso de la segmentectomía.
Para el cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP), Ios tratamientos actualmente disponibles incluyen: (i) quimioterapia - la quimioterapia con un solo agente muestra una tasa de respuesta que varía entre un 17% y un 50%. La quimioterapia de combinación está asociada con tasas de respuesta y supervivencia superiores, aunque Ios principales efectos secundarlos incluyen: mielosupresión, nefrotoxicidad, síndrome de IIsIs tumoral (caracterizado por: hiperuricemia, hiperfosfatemia, hipocalcemia, deshidratación e hiperpotasemia), compresión de la médula espinal e hiponatremia; (ii) radioterapia - esta terapia solo se usa para pallar Ios síntomas y Ios pacientes recaen invariablemente; (iii) cirugía - la mayoría de Ios pacientes con CPCP se tratan de forma no quirúrgica. Las excepciones son un número relativamente pequeño de pacientes (< 5%) que presentan la enfermedad en un estadio muy temprano limitada al pulmón sin ninguna afectación de Ios ganglios linfáticos. Estos pacientes generalmente se someten a resección de tumores de pulmón como un procedimiento de diagnóstico inicial. Sin embargo, incluso para estos pacientes, la cirugía sola no se considera curativa.
Los pacientes con CPCP en recaída tienen un pronóstico sumamente malo, aproximadamente el 65-70% de Ios pacientes con CPCP tienen enfermedad propagada en la presentación. Los CPCP en estadio extenso son actualmente incurables, y Ios pacientes con enfermedad extensa tienen una supervivencia media de menos de 1 año. Incluso Ios pacientes con enfermedad localizada (es decir, estadio limitado) tienen una supervivencia media de menos de 2 años. La tasa de supervivencia de 5 años para el CPCP es inferior a un 20%.
Con referencia a todas las terapias actualmente disponibles arriba mencionadas (para cada uno de Ios tipos de cáncer analizados: cáncer colorrectal, de mama, de próstata y de pulmón), existe un problema adicional, en concreto el síndrome de IIsIs tumoral (SLT). El SLT es una complicación muy grave, y a veces potencialmente mortal, de la terapia del cáncer. Se puede definir como un cúmulo de anomalías metabólicas resultantes de necrosis tumoral espontánea o relacionada con el tratamiento, o de apoptosis fulminante. Las anomalías metabólicas observadas en pacientes con SLT incluyen: hiperpotasemia, hiperuricemia e hiperfosfatemia con hipocalcemia secundarla; y puede conducir a insuficiencia renal aguda (IRA).
El cáncer (en especial el cáncer colorrectal, el cáncer de mama, el cáncer de próstata y el cáncer de pulmón) sigue siendo un problema importante para la salud de los animales a escala mundial. Por consiguiente, en la técnica existe una necesidad de terapéuticas contra el cáncer alternativas y/o mejoradas y de terapias que aborden uno o más de los problemas arriba mencionados.
El documento WO 2006/026780 A l describe toxinas clostridiales degradables.
El documento WO 2006/099590 A2 describe toxinas clostridiales modificadas con capacidades de guía alteradas para células diana de toxina clostridial.
El documento WO 2004/076634 A2 describe la translocación de membrana celular de inhibidores SNARE regulados, composiciones para la misma, y métodos para el tratamiento de enfermedades.
Los documentos US 2005/031648 A l y WO 2006/025976 A l describen un método para tratar diversos cánceres mediante la administración local de una toxina botulínica en el cáncer o cerca del mismo.
Schally et al (2006), Current Topics in Medicinal Chemistry, 9, 3, 163-170, describen antagonistas de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento en oncología.
La presente invención está definida por las reivindicaciones y resuelve uno o más de dichos problemas, proporcionando una nueva categoría de agente anticancerígeno no citotóxico.
Más detalladamente, un primer aspecto de la presente invención proporciona un polipéptido para uso en la supresión de un cáncer mediante inhibición de la secreción de la hormona del crecimiento a partir de una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, comprendiendo dicho polipéptido:
(a) una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa,
comprendiendo la proteasa no citotóxica una endopeptidasa de neurotoxina clostridial o una proteasa contra IgA;
(b) una Fracción Guiada (Targeting Moiety, TM) que se une a un Sitio de Unión en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, Sitio de Unión que puede experimentar una endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa,
consistiendo la TM en un péptido de hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH);
y
(c) un dominio de translocación de neurotoxina clostridial que transloca la proteasa desde dentro del endosoma, a través de la membrana endosomal y hasta el interior del citosol de dicha célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa;
careciendo el polipéptido del dominio de unión Hcc nativo de una neurotoxina clostridial.
En el uso, un polipéptido descrito en la presente memoria se une a una célula secretora de la hormona del crecimiento. Posteriormente, el componente de translocación efectúa el transporte del componente de proteasa al interior del citosol de la célula secretora de la hormona del crecimiento. Finalmente, una vez dentro, la proteasa inhibe el proceso de fusión exocítica de la célula secretora de la hormona del crecimiento. De este modo, mediante la inactivación del aparato de fusión exocítica de la célula secretora de la hormona del crecimiento, el polipéptido de la invención inhibe la liberación/secreción de la hormona del crecimiento a partir de la misma.
El componente "bioactivo" de los polipéptidos descritos en la presente memoria es proporcionado por una proteasa no citotóxica. Este grupo distinto de proteasas actúa mediante proteínas de transporte intracelular que se escinden proteolíticamente, conocidas como proteínas SNARE (por ejemplo, SNAP-25, v A m P o sintaxina); véase Gerald K (2002) "Cell and Molecular Biology" (4a edición) John Wiley & Sons Inc. El acrónimo SNARE se deriva de la expresión Soluble NSF Attachment Receptor (Receptor de Fijación Soluble de NSF), donde NSF significa N-ethylmaleimide-Sensitive Factor (Factor Sensible a la N-etilmaleimida). Las proteínas SNARE son parte integral de la formación de vesículas intracelulares y, por lo tanto, de la secreción de moléculas a través del transporte de vesículas desde una célula. Por consiguiente, una vez administrada a una célula diana deseada, la proteasa no citotóxica es capaz de inhibir la secreción celular desde la célula diana.
Las principales células diana a las que se unen los polipéptidos descritos en la presente memoria son las células normales, sanas y no cancerosas, que segregan la hormona del crecimiento. Sin embargo, estas células son distintas de las células cancerosas "descendentes" finales que se tratan de acuerdo con la presente invención.
La presente invención está definida en las reivindicaciones 1 a 4. En la presente memoria se describen polipéptidos que son capaces de (y están previstos para utilizarlos para) reducir/minimizar los niveles sistémicos o séricos de la hormona del crecimiento y/o el factor de crecimiento de tipo insulínico (IGF-1). También se describen polipéptidos para su uso en la reducción/minimización del síndrome de lisis tumoral (SLT).
Los polipéptidos descritos en la presente memoria son particularmente adecuados para su uso en el tratamiento de uno o más de: cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata y/o cáncer de pulmón (por ejemplo, CPCP o CPCNP); incluyendo sus metástasis, condiciones precancerosas y síntomas de las mismas. A este respecto, "tratar" incluye reducir, prevenir o eliminar las células cancerosas o su propagación en la circulación local, regional o sistémica.
En la presente memoria se describe un método para tratar el cáncer en un paciente, comprendiendo dicho método administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido descrito en la presente memoria. En la presente memoria se describe un método para reducir los niveles de la hormona del crecimiento y/o del IGF-1 (preferiblemente niveles sistémicos y/o séricos) en un paciente, comprendiendo dicho método administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido descrito en la presente memoria. A modo de ejemplo se puede permitir el mantenimiento de un nivel basal de la hormona del crecimiento en un umbral de alrededor de 10 ng/ml, preferiblemente menos de 6 ng/ml, más preferiblemente menos de 4 o 5 ng/ml. En una persona normal, los niveles diarios de la hormona del crecimiento pueden alcanzar un valor máximo alrededor de una hora después del inicio del sueño en un nivel de aproximadamente 35 ng/ml. A este respecto, la presente descripción puede permitir controlar dicho valor máximo en un umbral de alrededor de 25 ng/ml, preferiblemente menos de 20 ng/ml, más preferiblemente menos de 15 ng/ml. También se describe un método para reducir/minimizar el síndrome de lisis tumoral (SLT).
Sin querer limitarse a ninguna teoría, los presentes inventores creen que un nivel sistémico elevado de la hormona del crecimiento provoca una elevación del nivel de IGF-1 sistémico, y que este último es responsable del aumento de la activación de IGF-1 R y de un aumento asociado en la activación de oncogenes, que a su vez conduce a un aumento de la proliferación celular y a la formación/crecimiento de tumores.
Después de la administración de un polipéptido descrito en la presente memoria, se observa una disminución en la secreción de la hormona del crecimiento (por ejemplo, GH humana) de la parte anterior de la hipófisis. De modo similar se observa una reducción del nivel de IGF-1 circulante. Dicha disminución en el nivel de GH/iGF-1 está en correlación con la contracción del tumor. Por lo tanto, el uso de los polipéptidos proporciona un entorno favorable para el tratamiento del cáncer eliminando una de las principales vías biológicas de acción contraria.
Después de la administración, la propagación regional y distante del cáncer se reduce o elimina. A este respecto, sin querer limitarse a ninguna teoría, los presentes inventores creen que los polipéptidos de la presente invención, que disminuyen la concentración circulatoria de IGF-1, inhiben la propagación de una metástasis.
Una ventaja de la presente invención consiste en que, después del tratamiento del cáncer, el funcionamiento hipofisario vuelve a la normalidad. En otras palabras, la presente invención proporciona una terapia de acción corta que, después de la terapia, tiene un efecto mínimo en la hipófisis. Por lo tanto, a diferencia de las terapias de hipofisecTomía actuales, la presente invención evita la necesidad de regímenes complejos y desagradables después del tratamiento (normalmente de por vida) para prevenir las complicaciones resultantes del tratamiento inicial del cáncer, tales como: osteoporosis, síndrome del intestino corto, pérdida de memoria que puede conducir a la enfermedad de Alzheimer, artritis, dolor de espalda, fibromialgia y fatiga crónica.
El componente biológicamente activo de los polipéptidos descritos en la presente memoria consiste en una proteasa no citotóxica. Las proteasas no citotóxicas son una clase específica de moléculas que no destruyen células; en lugar de ello, actúan inhibiendo procesos celulares distintos de la síntesis de proteínas. Las proteasas no citotóxicas son producidas como parte de una molécula de toxina más grande por diversas plantas, y por diversos microorganismos tales como Clostridium sp. y Neisseria sp.
Las neurotoxinas clostridiales representan un grupo principal de moléculas de toxina no citotóxicas y comprenden dos cadenas polipeptídicas unidas entre sí por un enlace disulfuro. Las dos cadenas se denominan cadena pesada (cadena H), que tiene una masa molecular de aproximadamente 100 kDa, y cadena ligera (cadena L), que tiene una masa molecular de aproximadamente 50 kDa. La cadena L es la que tiene una función de proteasa y muestra una alta especificidad de sustrato para las proteínas asociadas a la vesícula y/o la membrana plasmática (SNARE) que intervienen en el proceso exocítico (por ejemplo, sinaptobrevina, sintaxina o SNAP-25). Estos sustratos son componentes importantes de la maquinaria neurosecretora.
La Neisseria sp., sobre todo de la especie N. gonorrhoeae, y el Streptococcus sp., sobre todo de la especie S. pneumoniae, producen moléculas de toxina no citotóxicas funcionalmente similares. Un ejemplo de una proteasa no citotóxica de este tipo es la proteasa contra IgA (véase el documento W099/58571).
Por lo tanto, la proteasa no citotóxica consiste preferiblemente en una endopeptidasa de neurotoxina clostridial o una proteasa contra IgA.
Volviendo ahora al componente de Fracción Guiada (TM), este componente es el que une el polipéptido descrito en la presente memoria a una célula secretora de la hormona del crecimiento, preferiblemente a una célula hipofisaria y/o a una célula extrahipofisaria. En una realización, la TM se puede unir a la región anterior de la hipófisis, por ejemplo a un somatotropo y/o a una célula de la adenohipófisis.
En la presente memoria se describen TM, incluyendo: ligandos para receptores de células secretoras de la hormona del crecimiento, tales como citoquinas, factores de crecimiento, neuropéptidos, lectinas y anticuerpos; este término incluye anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, F(ab)'2, Fv, ScFv, etc.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor en una célula secretora de la hormona del crecimiento, tal como una célula hipofisaria. A modo de ejemplo, la TM se puede unir a un receptor de leptina (OB) e isoformas del mismo, un receptor de ghrelina, un receptor de somatostatina (sst) (por ejemplo, ssti , sst2, sst3, sst4 y ssts y variantes de empalme del mismo), un receptor del factor de crecimiento de insulina (|Gf ) (por ejemplo, IGF-1 ), un receptor de erbB (por ejemplo, erbBI, erbB2, erbB3 y erbB4, y variantes de empalme del mismo), un receptor de la superfamilia VIP-glucagón-GRF-secretina (incluyendo variantes de empalme del mismo) como el receptor del péptido activador de la adenilato ciclasa hipofisaria (PACAP) (por ejemplo, PAC, VPACi y/o VPAC2), un receptor de orexina (OX) y variantes de empalme (por ejemplo, OXi y/o OX2), un receptor de interleucina (IL) (por ejemplo, receptor de IL-1, IL-2, IL-6 e IL-10), un receptor del factor de crecimiento del tejido nervioso (NTR) (por ejemplo, TrkA(NTR) y p75(NTR)), un receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (por ejemplo, VEGFR1, VEGFR2 y VEGFR3), un receptor de bombesina (por ejemplo, BRS-1, BRS-2 o BRS-3), un receptor de urotensina, un receptor 1 de hormona concentradora de melanina, un receptor de hormona liberadora de prolactina, un receptor de KiSS-1, un receptor 1 del factor liberador de corticotropina y un receptor de hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH).
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de leptina. Algunos ejemplos adecuados de dichas TM incluyen: péptidos de leptina tales como un péptido de leptina de longitud completa (por ejemplo, leptinaw) y truncamientos o análogos peptídicos del mismo, tales como leptina22-167, leptina7o-95 y leptinan6-122.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de ghrelina. Algunos ejemplos de TM adecuadas a este respecto incluyen: péptidos de ghrelina tales como ghrelina de longitud completa (por ejemplo, ghrelinan 7 ) y truncamientos o análogos peptídicos de la misma tales como ghrelina24-117 y ghrelina52-117; [Trp3, Arg5]-ghrelina (1-5), des-Gln-Ghrelina, cortistatina-8, His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH2, péptido liberador de la hormona del crecimiento (por ejemplo, GHRP-6), o hexarelina.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de somatostatina (SST). A modo de ejemplo, algunas TM adecuadas incluyen: péptidos de SST y péptidos de cortistatina (CST), así como análogos peptídicos de los mismos, tales como D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 (BIM 23052), D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-D-Nal-NH2 (BIM 23056) o c[Cys-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Cys]-NH2 (BIM-23268). Otros ejemplos incluyen los péptidos de SST SST-14 y SST-28; así como péptidos y análogos peptídicos tales como: octreotida, lanreotida, BlM23027, vapreotida, seglitida, y SOM230. Estas TM son TM preferentes para la unión a receptores de SST, en particular a receptores de sst1, sst2, sst3, sst4 y sst5.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor del factor de crecimiento de tipo insulínico (IGF). Algunos ejemplos adecuados incluyen, por ejemplo, péptidos de lGF-1 y péptidos de IGF-2.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de la superfamilia VIP-glucagón-GRF-secretina, tal como a un receptor de PAC (por ejemplo, PAC1) o a un receptor de VpAC (por ejemplo, VPAC-1 o VPAC-2). Algunos ejemplos adecuados de dichas TM incluyen péptidos activadores de la adenilato ciclasa hipofisiaria (PACAP), péptidos intestinales vasoactivos (VIP), así como truncamientos y análogos peptídicos de los mismos.
En la presente memoria se describe una TM de péptido VIP que incluye péptidos VIP-1 y VIP-2, por ejemplo VIP(1-28), o un truncamiento o un análogo peptídico de los mismos. Estas TM demuestran una unión selectiva a VPAC-1. Alternativamente, en la presente memoria se describe una TM que demuestra una unión selectiva a VPAC2, tal como, por ejemplo, mROM (véase Yu et al., Peptides 27 (6) p1359-66 (2006)). En la presente memoria se describe una TM que puede ser un péptido PACAP, por ejemplo PACAP(1-38) o PACAP(1-27), o un truncamiento o un análogo peptídico del mismo. Estas TM son t M preferentes para la unión a receptores de PAC (por ejemplo, PAC-1).
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de orexina (por ejemplo, receptores de OX1 u OX2). Algunos ejemplos de TM adecuadas incluyen: péptidos de orexina-A de longitud completa y truncamientos o análogos peptídicos de los mismos, y péptidos de orexina-B y truncamientos o análogos peptídicos de los mismos.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de interleucina. Algunos ejemplos de TM adecuadas incluyen: péptidos de IL-1 (por ejemplo péptidos de IL-1a, IL-p, IL-18) y truncamientos o análogos peptídicos de los mismos, péptidos de IL-2 (por ejemplo péptidos de IL-2, IL-3, IL-12, IL-23 péptidos) y truncamientos o análogos peptídicos de los mismos, y péptidos de IL-17 (por ejemplo péptidos de IL-17A, IL-17C) y truncamientos o análogos peptídicos de los mismos.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de NGF. Algunos ejemplos de TM adecuadas incluyen NGF de longitud completa y truncamientos o análogos peptídicos de los mismos.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor del factor de crecimiento epidérmico vasoactivo (VEGF). Algunos ejemplos de TM adecuadas incluyen: péptido de VEGF (por ejemplo, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o VEGF-E y variantes de empalme asociadas) y truncamientos o análogos peptídicos del mismo, y factor de crecimiento placentario (PIGF) y truncamientos o análogos peptídicos del mismo.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de ErbB. A modo de ejemplo, la TM se selecciona entre péptidos de EGF, péptidos del factor de crecimiento transformante a (péptidos de TGF-a , péptidos de quimeras de EGF y TGF -a anfirregulina, péptidos de betacelulina, péptidos de epigen, péptidos de epirregulina, péptidos de EGF de unión a heparina (HB-EGF), péptidos de neurregulina (NRG) como NRGIa , NRGip, NRG2a , NRG2p, NRG3, NRG4 y variantes de empalme de neurorregulina, péptidos de tomorregulina 1 y 2, péptidos de neuroglicano-C, péptidos de lin-3, péptidos venosos, péptidos de Spitz, o péptidos de Keren; así como truncamientos y análogos peptídicos de los mismos. Hay 4 clases de receptores de ErbB (denominados ErbBI, erbB2, erbB3 y erbB4), que también se designan como receptores de HER. Existen diversas variantes de estos receptores, que surgen de empalmes y/o escisiones alternativos del receptor de longitud completa (por ejemplo, la traducción de EGFR v1 comienza en aa543; deleción de EGFR v II de aa521-603; deleción de EGFr v III de aa 6-273; deleción de EGFRv III/A12-13 de aa 6-273 y 409-520; deleción de EGFR v IV de aa 959-1030; truncamiento de EGFR vV en el residuo 958; duplicación tándem EGFR TDM/2-7 de 6-273; duplicación tándem EGFR TDM/18-25 de 664-1030; duplicación tándem EGFR-TDM/18-26 de 664-1014). Además existen cuatro isoformas del receptor de ErbB4 llamadas erbB4 JM-a, erbB4 JM-b, erbB4 CYT-1 y erbB4 CYT-1.
En la presente memoria se describen TM que se unen a receptores de ErbB (por ejemplo ErbBI, ErbB2, ErbB3, ErbB4) y variantes de empalme de los mismos, en particular al receptor de ErbBI. Las TM de ErbB también pueden incluir proteínas que contienen motivos EGF con un sitio de empalme entre las cisternas cuarta y quinta dentro del módulo de EGF de seis cisternas, donde este módulo está situado muy cerca de la región transmembrana del ligando potencial. Por ejemplo, proteoglicano-2 de matriz de interfotorreceptor (IMP-2), meprina (MEP)la , M EPip, mucina (MUC)3, MUC4, MUC12 y MUC17, así como proteínas con un supercóntigo de nudo en T tal como el inhibidor de la carboxipeptidasa de patata, y anticuerpos contra receptores de ErbB tales como cetuximab, ABX-EGF, trastuzumab o EMD72000. Otros ejemplos incluyen quimeras generadas mediante el intercambio de dominios (secuencias de bucle y/o aminoácidos de conexión) de diferentes ligandos de ErbB, tal como un ligando de receptor de erbB de mamífero en el que la secuencia de bucle B ha sido reemplazada por las presentes en los ligandos de ErbB de insecto (Drosophila), un ligando de ErbB en el que la secuencia de bucle C de EGF ha sido reemplazada por la de TGFa44-50), ligandos de EGF en los cuales uno o más dominios han sido reemplazados por secuencias correspondientes en TGFa para crear quimeras de EGF/TGFa (por ejemplo E3T, T3E, E4T, T4E, T3E4T, T6E y E3T4E, y quimeras de EGF en las que se ha utilizado la secuencia TGFa N-terminal (WSHFND) o la secuencia de neurregulina (SHLVK) para reemplazar la secuencia C-terminal de EGF N-terminal del primer residuo de cisterna (NSDSE), T1E y Birregulina. Otras quimeras incluyen EGF en el que un dominio ha sido reemplazado por un dominio similar a EGF de otra proteína, como una proteína de coagulación sanguínea, desarrollo neural o adhesión celular (por ejemplo, receptores Notch 3, Delta 1, EMR1, F4/80, EMR3 y EMR4).
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor 1 de hormona concentradora de melanina. Algunos ejemplos de TM adecuadas a este respecto incluyen: péptidos de hormona concentradora de melanina (MCH) tales como MCH de longitud completa, truncamientos y análogos de los mismos.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de hormona liberadora de prolactina. Un ejemplo de una TM adecuada a este respecto incluye péptido liberador de prolactina, truncamientos y análogos del mismo.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor KiSS-1. Algunos ejemplos de TM adecuadas a este respecto incluyen péptidos de Kisspeptina-10, Kisspeptina-54, truncamientos y análogos de los mismos.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor 1 del factor liberador de corticotropina. Algunos ejemplos de una TM adecuada a este respecto incluyen la hormona liberadora de corticotropina, urocortina 1 y urocortina 2 , incluyendo truncamientos y análogos de los mismos.
En otra realización, una TM del polipéptido para su uso en la presente invención se une a un receptor de la hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH). La GHRH también se conoce como factor liberador de la hormona del crecimiento (GRF o GHRF) o somatocrinina. Algunos ejemplos de TM adecuadas de la presente invención incluyen el péptido de GHRH de longitud completa (1-44), y truncamientos o análogos peptídicos del mismo, tales como GHRH(1-29); GHRH(1-37); Ii GHRH(1-40)-OH; [MeTyr1,Ala15,22,Nle27]-hGHRH(1-29)-NH2;
[MeTyr1,Ala8,9,15,22,28,Nle 27]-Ii GHRH(1-29)-NH2; ciclo(25-29)[MeTyr1,Ala15,DAsp25,Nle27,Orn29+++]-Ii GHRH(1-29)-NH2; (D-Tyrl)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Asp3)-GHRH (1-29)-NH2 (D-Ala4)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Thr7)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Asn8)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Ser9)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Tyr10)-GHRH (1-29)-NH2; (Phe4)-GHRH (1-29)-NH2; (pCl-Phe6)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-Tyrl)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-Tyrl, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-D-Tyrl, D-Ala2)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-D-Tyrl, D-Ala2, D-Asp3)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; (H ís1, D-Ala2, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; (N-Ac-H ís1, D-Ala2, N-Leu27)-GHRH (1-29)-NH2; (H ís1, D-Ala2, D-Ala4, Nleu27)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Ala2, D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; (D-Asp3, D-Asn8, NLeu27)-GHRH (1-29)-NH2; [H ís1, NLeu27]-hGHRH(1-29)-NH2; [NLeu27]-Ii GHRH(1-29)-NH2; H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2; H-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-NH2; H-Tyr-D-Ala-Asp-Ala-Ne-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-Ne-Met-Ser-Arg-NH2; H-Tyr-AIa-Asp-AIa-lIe-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-lIe-Leu-GIy-GIn-Leu-Ser-AIa-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2; H-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala-Lys-Val-Arg-Leu-NH2; His-Val-Asp-AIa-lIe-Phe-Thr-GIn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg; e His-Val-Asp-AIa-lIe-Phe-Thr-GIn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Ala-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Asn-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Arg-Asn-Gln-Glu-Gln-Gly-Ala.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de bombesina (por ejemplo, BRS-1, BRS-2 o BRS-3). Las TM que se unen a un receptor de bombesina incluyen: bombesina - un péptido de 14 aminoácidos originalmente aislado de la piel de una rana (pGIu-GIn-Arg-Leu-GIy-Asn-GIn-Trp-AIa-VaI-GIy-His-Leu-Met-NH2); y los dos homólogos conocidos en mamíferos, en concreto la neuromedina B y el péptido liberador de gastrina (GRP), tal como el GRP porcino - Ala-Pro-Val-Ser-Val-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Ala-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2, y el GRP humano - Val-Pro-Leu-Pro-Ala-Gly-Gly-Gly-Thr-Val-Leu-Thr-Lys-Met-Tyr-Pro-Arg-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2. Algunas TM adicionales incluyen bombesina correspondiente, neuromedina B y truncamientos de GRP, así como análogos peptídicos de los mismos.
En la presente memoria se describe una TM que se une a un receptor de urotensina. Algunas TM adecuadas a este respecto incluyen péptidos de urotensina tales como Urotensina-ll (U-II), que es un neuropéptido cíclico, así como truncamientos y análogos peptídicos de los mismos. La región cíclica C-terminal de U-ll está muy conservada en diferentes especies e incluye los seis residuos de aminoácidos (-Cys Ple-Trp-Lys-Tyr-Cys-), que es estructuralmente similar a la región central de la somatostatina-14 (-Phe-Trp-Lys-Thr-). Los péptidos de urotensina pueden incluir los péptidos precursores de U-ll, tales como prepro-urotensina-11 (que incluyen las dos isoformas humanas 124 y 139 de los mismos), y truncamientos y análogos de los mismos, tales como la forma de péptido maduro de once residuos.
En la presente memoria se describe un polipéptido que comprende:
(a) una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa,
comprendiendo la proteasa no citotóxica una endopeptidasa de neurotoxina clostridial o una proteasa contra IgA;
(b) una Fracción Guiada (TM) que se une a un Sitio de Unión en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, Sitio de Unión que puede experimentar una endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa,
consistiendo la TM en un péptido de hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH); y
(c) un dominio de translocación de neurotoxina clostridial que transloca la proteasa desde dentro del endosoma, a través de la membrana endosomal y hasta el interior del citosol de dicha célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa;
careciendo el polipéptido del dominio de unión Hcc nativo de una neurotoxina clostridial; y
comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90-92%, o al menos un 95-97%, o al menos un 98-99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEC ID N0: 9, 23, 24, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, y 87.
Preparación de polipéptidos
Los polipéptidos para el uso según las reivindicaciones comprenden 3 componentes principales: un "bioactivo" (es decir, una proteasa no citotóxica); una TM; y un dominio de translocación. Con frecuencia, la tecnología general asociada con la preparación de dichas proteínas de fusión se designa como tecnología de toxina redirigida. A modo de ejemplificación, nos referimos a: W094/21300; W096/33273; WO98/07864; WOOO/10598; WOOI/21213; W006/059093; WOOO/62814; WOOO/04926; W093/15766; WOOO/61192; y W099/58571.
Más detalladamente, el componente de TM se puede fusionar con el componente de proteasa o con el componente de translocación de la presente invención. Dicha fusión tiene lugar preferiblemente por medio de un enlace covalente, por ejemplo un enlace covalente directo, o por medio de una molécula espaciadora/enlazadora. Preferiblemente, el componente de proteasa y el componente de translocación están unidos entre sí a través de un enlace covalente, por ejemplo un enlace covalente directo, o mediante una molécula espaciadora/enlazadora. Las moléculas espaciadoras/enlazadas adecuadas son muy conocidas en la técnica, y normalmente comprenden una secuencia basada en aminoácidos con una longitud entre 5 y 40, preferiblemente entre 10 y 30 residuos de aminoácidos.
En el uso, Ios polipéptidos tienen una conformación de cadena doble, en donde el componente de proteasa y el componente de translocación están unidos entre sí, preferiblemente a través de un enlace disulfuro.
Los polipéptidos se pueden preparar mediante técnicas de conjugación química convencionales, que son muy conocidas por los expertos. A modo de ejemplo, se hace referencia a Hermanson, GT (1996), Bioconjugate techniques, Academic Press, y a Wong, S. S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, Nagy et al., PNAS 95 p 1794-99 (1998). Por ejemplo, en el documento EP0257742 se proporcionan otras metodologías detalladas para unir Tm sintéticas a un polipéptido de la presente invención.
Alternativamente, los polipéptidos se pueden preparar mediante la preparación recombinante de una proteína de fusión polipeptídica simple (véase, por ejemplo, el documento WO98/07864). Esta técnica se basa en el mecanismo bacteriano in vivo mediante el cual se prepara la neurotoxina clostridial nativa (es decir, holotoxina), y da como resultado una proteína de fusión que tiene la siguiente disposición estructural "simplificada":
NH2 -[componente de proteasa] -[componente de translocación] -[TM] - COOH
De acuerdo con el documento WO98/07864, la TM se sitúa hacia el extremo C-terminal de la proteína de fusión. La proteína de fusión se activa después mediante tratamiento con una proteasa, que se escinde en un sitio entre el componente de proteasa y el componente de translocación. De este modo se produce una proteína de cadena doble, que comprende el componente de proteasa como una cadena polipeptídica simple unida de forma covalente (a través de un puente disulfuro) a otra cadena polipeptídica simple que contiene el componente de translocación más TM.
Alternativamente, de acuerdo con el documento W006/059093, el componente de TM de la proteína de fusión se sitúa hacia la mitad de la secuencia de la proteína de fusión lineal, entre el sitio de escisión de proteasa y el componente de translocación. De este modo se asegura que la TM está unida al dominio de translocación (es decir, como ocurre con la holotoxina clostridial nativa), aunque en este caso los dos componentes están en orden inverso con respecto a la holotoxina nativa. La escisión subsiguiente en el sitio de escisión de proteasa expone la porción N-terminal de la TM y proporciona la proteína de fusión del polipéptido de cadena doble.
La secuencia o las secuencias de escisión de proteasa arriba mencionadas se pueden introducir (y/o se puede eliminar cualquier secuencia de escisión inherente) a nivel de ADN por medios convencionales, como por ejemplo mutagénesis dirigida. El rastreo para confirmar la presencia de secuencias de escisión se puede realizar manualmente o con la ayuda de un software informático (por ejemplo, el programa MapDraw de DNASTAR, Inc.). Aunque se puede emplear cualquier sitio de escisión de proteasa (es decir, clostridial o no clostridial), son preferibles los siguientes:
Enteroquinasa (DDDDK|)
Factor Xa (IEGR|/IDGR|)
TEV (virus del Grabado del Tabaco) (ENLYFQ|G)
Trombina (LVPR|GS)
PreEscisión (LEVLFQ^GP).
Algunos sitios de escisión de proteasas adicionales incluyen secuencias de reconocimiento que son escindidas por una proteasa no citotóxica, por ejemplo, por una neurotoxina clostridial. Éstas incluyen las secuencias de reconocimiento de proteínas SNARE (por ejemplo, SNAP-25, sintaxina, VAMP) que son escindidas por proteasas no citotóxicas, tales como neurotoxinas clostridiales. En el documento US2007/Ol66332 se proporcionan ejemplos particulares.
El concepto "sitio de escisión de proteasa" también abarca una inteína, que es una secuencia de autoescisión. La reacción de auto-empalme se puede controlar, por ejemplo variando la concentración del agente reductor presente. Los sitios de escisión de "activación" arriba mencionados también se pueden emplear como un sitio de escisión "destructiva" (que se describe más abajo), si se incorpora uno a un polipéptido de la presente invención.
La proteína de fusión descrita en la presente memoria puede comprender una o más etiquetas de purificación situadas en posición N-terminal y/o C-terminal. Aunque se puede emplear cualquier etiqueta de purificación, son preferibles las siguientes:
Etiqueta His (por ejemplo, 6 x histidina), preferiblemente como una etiqueta C-terminal y/o N-terminal.
Etiqueta MBP (proteína de unión a maltosa), preferiblemente como una etiqueta N-terminal.
Etiqueta GST (glutatión-S-transferasa), preferiblemente como una etiqueta N-terminal.
Etiqueta Hís-MBP, preferiblemente como una etiqueta N-terminal.
Etiqueta GST-MBP, preferiblemente como una etiqueta N-terminal.
Etiqueta Tiorredoxina, preferiblemente como una etiqueta N-terminal.
Etiqueta CBD (Dominio de Unión de Quitina), preferiblemente como una etiqueta N-terminal.
En la proteína de fusión se pueden incluir una o más moléculas espaciadoras/enlazadoras peptídicas. Por ejemplo, se puede emplear un espaciador peptídico entre una etiqueta de purificación y el resto de la molécula de proteína de fusión.
En la presente memoria se describe una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo ADN) que codifica un polipéptido tal como se describe más arriba.
Dicho ácido nucleico se puede incluir en forma de un vector, tal como un plásmido, que puede incluir opcionalmente uno o más de los siguientes elementos: un origen de replicación, un sitio de integración de ácido nucleico, un promotor, un terminador y un sitio de unión de ribosoma.
En la presente memoria se describe un método para expresar la secuencia de ácido nucleico arriba descrita en una célula huésped, en particular en E. coIÍ o a través de un sistema de expresión de baculovirus.
En la presente memoria se describe un método para activar un polipéptido, comprendiendo dicho método la puesta en contacto del polipéptido con una proteasa que escinde el polipéptido en un sitio de reconocimiento (sitio de escisión) situado entre el componente de proteasa no citotóxica y el componente de translocación, convirtiendo así el polipéptido en un polipéptido de cadena doble en el que la proteasa no citotóxica y los componentes de translocación se unen entre sí mediante un enlace disulfuro. El sitio de reconocimiento puede no ser nativo de una neurotoxina clostridial natural y/o de una proteasa contra IgA natural.
Los polipéptidos se pueden modificar adicionalmente para reducir o prevenir efectos secundarios no deseados asociados con la dispersión en áreas no guiadas. El polipéptido puede comprender un sitio de escisión destructiva. El sitio de escisión destructiva es distinto del sitio de "activación" (es decir, formación de cadena doble), y es escindible por una segunda proteasa y no por la proteasa no citotóxica. Además, cuando se escinde así en el sitio de escisión destructiva por la segunda proteasa, el polipéptido tiene una potencia reducida (por ejemplo, una capacidad de unión reducida a la célula diana deseada, una actividad de translocación reducida y/o una actividad proteasa no citotóxica reducida). Para completar, cualquiera de los sitios de escisión "destructiva" se puede emplear por separado como un sitio de "activación" en un polipéptido descrito en la presente memoria.
En la presente memoria se describe un polipéptido que se puede inactivar y/o destruir de forma controlable en una ubicación externa.
El sitio de escisión destructiva puede ser reconocido y escindido por una segunda proteasa (es decir, una proteasa destructiva) seleccionada entre una proteasa circulante (por ejemplo una proteasa extracelular, tal como una proteasa sérica o una proteasa de la cascada de coagulación sanguínea), un proteasa asociada a tejido (por ejemplo, una metaloproteasa de matriz (MMP), como una MMP de músculo) y una proteasa intracelular (preferiblemente una proteasa que no está presente en la célula diana).
Por lo tanto, en el uso, si un polipéptido descrito en la presente memoria se dispersa lejos de su célula diana deseada y/o es absorbido por una célula no diana, el polipéptido será desactivado por escisión del sitio de escisión destructiva (por la segunda proteasa).
El sitio de escisión destructiva puede ser reconocido y escindido por una segunda proteasa que está presente dentro de un tipo de célula externa. La célula externa y la célula diana son preferiblemente tipos de células diferentes. Alternativamente (o adicionalmente), el sitio de escisión destructiva es reconocido y escindido por una segunda proteasa que está presente en una ubicación externa (por ejemplo, en posición distal con respecto a la célula diana). En consecuencia, cuando la escisión destructiva se produce extracelularmente, la célula diana y la célula externa pueden ser de tipos celulares iguales o diferentes. A este respecto, la célula diana y la célula externa pueden poseer cada una un receptor al que se une el mismo polipéptido.
El sitio de escisión destructiva descrito en la presente memoria proporciona la inactivación/destrucción del polipéptido cuando el polipéptido está en o junto a una ubicación externa. A este respecto, la escisión en el sitio de escisión destructiva minimiza la potencia del polipéptido (en comparación con un polipéptido idéntico que carezca del mismo sitio de escisión destructiva, o que posea el mismo sitio destructivo pero en una forma no escindida). A modo de ejemplo, la potencia reducida incluye: unión reducida (a un receptor de células de mamífero) y/o translocación reducida (a través de la membrana endosomal de una célula de mamífero en la dirección del citosol), y/o escisión reducida de la proteína SNARE.
Cuando se seleccionan uno o más sitios de escisión destructiva en el contexto descrito en la presente memoria, es preferible que el sitio o Ios sitios de escisión destructiva no sean sustratos para ninguna proteasa que pueda usarse por separado para la modificación postraduccional del polipéptido de la presente invención como parte de su proceso de fabricación. A este respecto, las proteasas no citotóxicas descritas en la presente memoria emplean normalmente un evento de activación de proteasa (a través de un sitio de escisión de proteasa de "'activación", que es estructuralmente diferente del sitio de escisión destructiva descrito en la presente memoria). El objetivo del sitio de escisión de activación consiste en escindir un enlace peptídico entre la proteasa no citotóxica y la translocación o Ios componentes de unión del polipéptido, proporcionando de este modo un polipéptido de cadena doble "activado" en el que dichos dos componentes están unidos entre sí a través de un enlace disulfuro.
Por lo tanto, para ayudar a asegurar que el sitio o Ios sitios de escisión destructiva de Ios polipéptidos no afecten de forma negativa al sitio de escisión de "activación" y a la posterior formación de enlaces disulfuro, Ios primeros se introducen preferiblemente en el polipéptido de la presente invención en una posición alejada del sitio de escisión de "activación" en al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, y más preferiblemente al menos 60, al menos 70, al menos 80 residuos de aminoácidos (contiguos).
El sitio o Ios sitios de escisión destructiva y el sitio de escisión de activación son preferiblemente exógenos (es decir, diseñados/artificiales) con respecto a Ios componentes nativos del polipéptido. En otras palabras, dichos sitios de escisión preferiblemente no son inherentes a Ios componentes nativos correspondientes del polipéptido. A modo de ejemplo, un componente de proteasa o translocación basado en cadena L o cadena H (respectivamente) de BoNT/A se puede diseñar de acuerdo con la presente invención de modo que incluya un sitio de escisión. Sin embargo, dicho sitio de escisión no estaría presente en la cadena L nativa o cadena H correspondiente de BoNT. De modo similar, cuando el componente de Fracción Guiada del polipéptido está diseñado para incluir un sitio de escisión de proteasa, dicho sitio de escisión no estaría presente en la secuencia nativa correspondiente de la Fracción Guiada correspondiente.
En la presente memoria se describen uno o más sitios de escisión destructiva y un sitio de escisión de "activación" que no son escindidos por la misma proteasa. Los dos sitios de escisión se pueden diferenciar entre sí en que al menos uno, más preferiblemente al menos dos, de forma particularmente preferible al menos tres, y de forma totalmente preferible al menos cuatro de Ios aminoácidos tolerados dentro de las secuencias de reconocimiento respectivas es/son diferente(s).
A modo de ejemplo, en el caso de una quimera polipeptídica que contiene un sitio de "activación" de Factor Xa entre componentes de cadena L clostridial y Hn, es preferible emplear un sitio de escisión destructiva que no sea un sitio de Factor Xa, que se pueda insertar en cualquier lugar en el componente o Ios componentes de cadena L y/o Hn y/o TM. En este escenario, el polipéptido puede ser modificado para alojar un sitio de "activación" alternativo entre Ios componentes de cadena L y Hn (por ejemplo, un sitio de escisión de enteroquinasa), en cuyo caso se puede incorporar un sitio de escisión de Factor Xa independiente en otro lugar del polipéptido como el sitio de escisión destructiva. Alternativamente se puede mantener el sitio de "activación" de Factor Xa existente entre Ios componentes de cadena L y Hn e incorporar un sitio de escisión alternativo, tal como un sitio de escisión de trombina, como el sitio de escisión destructiva.
Cuando se identifican sitios adecuados dentro de la secuencia primaria de cualquiera de Ios componentes de la presente invención para la inclusión del sitio o Ios sitios de escisión, es preferible seleccionar una secuencia primaria que coincida estrechamente con el sitio de escisión propuesto que ha de ser insertado. De este modo se introducen cambios estructurales mínimos en el polipéptido. A modo de ejemplo, Ios sitios de escisión comprenden normalmente al menos 3 residuos de aminoácidos contiguos. Se puede seleccionar un sitio de escisión que ya posea (en la posición o las posiciones correctas) al menos uno, preferiblemente al menos dos de Ios residuos de aminoácidos que se requieren para introducir el nuevo sitio de escisión. A modo de ejemplo, se puede introducir el sitio de escisión de Caspasa 3 (DMQD). A este respecto, se identifica una posición de inserción preferente que ya incluya una secuencia primaria seleccionada, por ejemplo, entre Dxxx, xMxx, xxQx , xxxD, DMxx, DxQx , DxxD, xMQx , xMxD, xxQD, DMQx , xMQD, DxQD, y DMxD.
De modo similar, es preferible introducir Ios sitios de escisión en regiones expuestas a la superficie. Dentro de las regiones expuestas a la superficie, son preferibles las regiones de bucle existentes.
El sitio o Ios sitios de escisión destructiva se pueden introducir en una o más de las posiciones siguientes, que se basan en la secuencia de aminoácidos primaria de BoNT/A. Mientras que las posiciones de inserción se identifican (por conveniencia) con referencia a BoNT/A, las secuencias de aminoácidos primarias de dominios de proteasa alternativos y/o dominios de translocación se pueden alinear fácilmente con dichas posiciones de BoNT/A.
Para el componente de proteasa son preferibles una o más de las siguientes posiciones: 27-31, 56-63, 73-75, 78-81, 99-105, 120-124, 137-144, 161-165, 169-173, 187-194, 202-214, 237-241, 243-250, 300-304, 323-335, 375-382, 391­ 400 y 413-423. Esta numeración comienza preferiblemente desde el extremo N-terminal del componente de proteasa.
El sitio o Ios sitios de escisión destructiva pueden estar situados en una posición de más de 8 residuos de aminoácidos, preferiblemente de más de 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de más de 25 residuos de aminoácidos, de forma particularmente preferible de más de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo N-terminal del componente de proteasa. De modo similar, el sitio o Ios sitios de escisión destructiva pueden estar situados en una posición de más de 20 residuos de aminoácidos, preferiblemente de más de 30 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de más de 40 residuos de aminoácidos, de forma particularmente preferible de más de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo C-terminal del componente de proteasa.
Para el componente de translocación son preferibles una o más de las siguientes posiciones: 474-479, 483-495, 507­ 543, 557-567, 576-580, 618-631, 643-650, 669-677, 751-767, 823-834, 845-859. Esta numeración reconoce preferiblemente una posición inicial de 449 para el extremo N-terminal del componente del dominio de translocación, y una posición final de 871 para el extremo C-terminal del componente del dominio de translocación.
El sitio o Ios sitios de escisión destructiva pueden estar situados en una posición de más de 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente de más de 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de más de 40 residuos de aminoácidos, de forma particularmente preferible de más de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo N-terminal del componente de translocación. De modo similar, el sitio o Ios sitios de escisión destructiva pueden estar situados en una posición de más de 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente de más de 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de más de 40 residuos de aminoácidos, de forma particularmente preferible de más de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo C-terminal del componente de translocación.
El sitio o Ios sitios de escisión destructiva pueden estar situados en una posición de más de 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente de más de 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de más de 40 residuos de aminoácidos, de forma particularmente preferible de más de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo N-terminal del componente de TM. De modo similar, el sitio o Ios sitios de escisión destructiva pueden estar situados en una posición de más de 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente de más de 25 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de más de 40 residuos de aminoácidos, de forma particularmente preferible de más de 50 residuos de aminoácidos desde el extremo C-terminal del componente de t M.
El polipéptido descrito en la presente memoria puede incluir uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o más) sitios de escisión destructiva de proteasas. Cuando se incluye más de un sitio de escisión destructiva, cada sitio de escisión puede ser igual o diferente. A este respecto, el uso de más de un sitio de escisión destructiva proporciona una mejor inactivación externa. De modo similar, el uso de dos o más sitios de escisión destructiva diferentes proporciona una flexibilidad de diseño adicional.
El sitio o Ios sitios de escisión destructiva se pueden diseñar en cualquiera de Ios siguientes componentes del polipéptido: el componente de proteasa no citotóxica; el componente de translocación; la Fracción Guiada; o el péptido espaciador (si está presente). A este respecto, el sitio o Ios sitios de escisión destructiva se eligen para asegurar un efecto negativo mínimo en la potencia del polipéptido (por ejemplo, teniendo un efecto mínimo en las regiones de guía/unión y/o en el dominio de translocación, y/o en el dominio de proteasa no citotóxica), y al mismo tiempo asegurar que el polipéptido sea lábil lejos de su sitio diana/célula diana.
En la siguiente Tabla se enumeran sitios de escisión destructiva preferibles (más las segundas proteasas correspondientes). Los sitios de escisión enumerados son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000014_0001
Las metaloproteasas de matriz (MMP) son un grupo preferente de proteasas destructivas. Dentro de este grupo es preferible el ADAM17 (EC 3.4.24.86, también conocido como TACe ), que escinde una variedad de proteínas de superficie celular ancladas a la membrana para "deshacerse" de los dominios extracelulares. Otras MMp preferentes incluyen adamalisinas, serralisinas y astacinas.
Otro grupo de proteasas destructivas preferentes consiste en una proteasa de la sangre de mamíferos, como la trombina, el Factor de Coagulación Vlla, el Factor de Coagulación IXa, el Factor de Coagulación Xa, el Factor de Coagulación Xla, el Factor de Coagulación Xlla, la Calicreína, la Proteína C y la proteasa de serina asociada a MBP.
Dicho sitio de escisión destructiva puede comprender una secuencia de reconocimiento que tiene al menos 3 o 4, preferiblemente 5 o 6, más preferiblemente 6 o 7, y de forma particularmente preferible al menos 8 residuos de aminoácidos contiguos. A este respecto, cuanto más larga (en términos de residuos de aminoácidos contiguos) sea la secuencia de reconocimiento, menos probable será que se produzca una escisión no específica del sitio destructivo a través de una segunda proteasa accidental.
Es preferible que el sitio de escisión destructiva esté introducido en el componente de proteasa y/o la Fracción Guiada y/o en el componente de translocación y/o sobre el péptido espaciador. De estos cuatro componentes, es preferible el componente de proteasa. Por consiguiente, el polipéptido se puede inactivar rápidamente por destrucción directa de la proteasa no citotóxica y/o los componentes de unión y/o translocación.
Aporte de polipéptidos
En el uso, la presente invención emplea una composición farmacéutica que comprende un polipéptido, Junto con al menos un componente seleccionado entre un vehículo, excipiente, adyuvante, propelente y/o sal farmacéuticamente aceptable.
Los polipéptidos se pueden formular para administración oral, parenteral, por infusión continua, por inhalación o tópica. Las composiciones adecuadas para inyección pueden estar en forma de soluciones, suspensiones o emulsiones, o polvos secos que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de su uso.
Los medios de aporte local pueden incluir un aerosol u otro espray (por ejemplo, un nebulizador). A este respecto, una formulación en aerosol de un polipéptido permite el aporte a los pulmones y/u otros conductos nasales y/o bronquiales o de las vías respiratorias.
La vía de administración preferente se selecciona entre: inyección sistémica (por ejemplo intravenosa), laparoscópica y/o localizada (inyección transfenoidal directamente en la hipófisis).
En el caso de formulaciones para inyección se puede incluir opcionalmente una sustancia farmacéuticamente activa para ayudar a la retención del polipéptido en el sitio de administración o reducir su eliminación del mismo. Un ejemplo de una sustancia farmacéuticamente activa de este tipo consiste en un vasoconstrictor como la adrenalina. Dicha formulación confiere la ventaja de aumentar el tiempo de residencia del polipéptido después de la administración y, por lo tanto, aumentar y/o mejorar su efecto.
Los intervalos de dosificación para la administración de los polipéptidos son aquellos que producen el efecto terapéutico deseado. Se entenderá que el intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa del polipéptido o composición, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, el alcance o la gravedad del estado del paciente, las contraindicaciones, en su caso, y el juicio del médico a cargo. Las variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar utilizando rutinas empíricas estándar para la optimización.
Las dosis diarias adecuadas (por kg de peso del paciente) están en el intervalo de 0,0001-1 mg/kg, preferiblemente 0,0001-0,5 mg/kg, más preferiblemente 0,002-0,5 mg/kg, y de forma particularmente preferible 0,004-0,5 mg/kg. La dosis unitaria puede variar de menos de 1 microgramo a 30 mg, pero normalmente estará en el intervalo de 0,01 a 1 mg por dosis, que se puede administrar a diario o preferiblemente con menos frecuencia, como semanalmente o seis veces al mes.
Una pauta posológica particularmente preferente se basa en 2,5 ng de polipéptido como la dosis IX. A este respecto, las dosis preferentes están en el intervalo de 1X-100X (es decir, 2,5-250 ng).
Las formas de dosificación fluidas se preparan normalmente utilizando el polipéptido y un vehículo estéril libre de pirógenos. El polipéptido, dependiendo del vehículo y la concentración utilizados, se puede disolver o suspender en el vehículo. Al preparar las soluciones, el polipéptido se puede disolver en el vehículo, la solución se hace isotónica en caso necesario mediante la adición de cloruro de sodio y se esteriliza por filtración a través de un filtro estéril utilizando técnicas asépticas antes de llenar los viales o ampollas estériles adecuados y sellar los mismos. Alternativamente, si la estabilidad de la solución es adecuada, la solución en sus recipientes sellados se puede esterilizar mediante autoclave. Ventajosamente, en el vehículo se pueden disolver aditivos tales como tampones, solubilizantes, estabilizantes, conservantes o bactericidas, agentes de suspensión o emulsionantes y/o agentes anestésicos locales.
Los polvos secos, que se disuelven o suspenden en un vehículo adecuado antes de su uso, se pueden preparar cargando los ingredientes previamente esterilizados en un recipiente estéril usando una técnica aséptica en un área estéril. Alternativamente, los ingredientes se pueden disolver en recipientes adecuados utilizando una técnica aséptica en un área estéril. Después, el producto se liofiliza y los recipientes se sellan asépticamente.
Las suspensiones parenterales, adecuadas para inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica, se preparan sustancialmente del mismo modo, excepto que los componentes estériles se suspenden en el vehículo estéril en lugar de disolverlos, y que la esterilización no se puede realizar por filtración. Los componentes se pueden aislar en un estado estéril, o alternativamente se pueden esterilizar después del aislamiento, por ejemplo, mediante irradiación gamma.
Ventajosamente, en la composición o las composiciones se incluye un agente de suspensión, por ejemplo polivinilpirrolidona, para facilitar la distribución uniforme de los componentes.
Sección de definiciones
Fracción Guiada (TM) significa cualquier estructura química que interactúe funcionalmente con un Sitio de Unión para producir una asociación física entre el polipéptido y la superficie de una célula diana (normalmente una célula de mamífero, en especial una célula humana). El concepto TM abarca cualquier molécula (es decir, una molécula natural, o una variante de la misma modificada química/físicamente) que sea capaz de unirse a un Sitio de Unión en la célula diana, siendo dicho Sitio de Unión capaz de internalización (por ejemplo, formación de endosomas) - también conocida como endocitosis mediada por receptores. La TM puede tener una función de translocación de la membrana endosomal, en cuyo caso no es necesario que un agente descrito en la presente memoria presente componentes de TM y de Dominio de Translocación independientes. A lo largo de la descripción anterior, se han descrito TM específicas. La referencia a dichas TM es meramente ejemplar, y están incluidas todas las variantes y derivados de las mismas que tengan la capacidad de unirse (es decir, guiarse) a un Sitio de Unión en una célula liberadora de la hormona del crecimiento, siendo dicho Sitio de Unión capaz de internalización.
La TM es un péptido de GHRH de acuerdo con las reivindicaciones y se une (preferiblemente se une específicamente) a la célula diana en cuestión. La expresión "se une específicamente" significa preferiblemente que una TM dada se une a la célula diana con una afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o más, por ejemplo 107 M-1 o más, 108 M-1 o más, o 109 M-1 o más.
La referencia a TM en la presente memoria descriptiva abarca fragmentos y variantes de la misma, que conservan la capacidad de unirse a la célula diana en cuestión. A modo de ejemplo, una variante puede tener al menos un 80%, preferiblemente al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, y de forma totalmente preferible al menos 97 o al menos el 99% de homología de secuencia de aminoácidos con la TM de referencia. Por lo tanto, una variante puede incluir uno o más análogos de un aminoácido (por ejemplo, un aminoácido antinatural), o un enlace sustituido. Además, a modo de ejemplo, el término "fragmento", cuando se usa en relación con una TM, significa un péptido que tiene al menos diez, preferiblemente al menos veinte, más preferiblemente al menos treinta, y de forma totalmente preferible al menos cuarenta residuos de aminoácidos de la TM de referencia. El término "fragmento" también se refiere a las variantes arriba mencionadas. Así, a modo de ejemplo, un fragmento puede comprender una secuencia peptídica que tenga al menos 10, 20, 30 o 40 aminoácidos, teniendo la secuencia peptídica al menos un 80% de homología de secuencia con respecto a una secuencia peptídica correspondiente de aminoácidos (contiguos) del péptido de referencia.
A modo de ejemplo, las TM de péptidos ErbB se pueden modificar para generar ligandos de ErbB de muteína con propiedades alteradas tales como estabilidad aumentada. A modo de ejemplo, las muteínas de TM de ErbB incluyen péptidos ErbB que tienen modificaciones de aminoácidos tales como un residuo de valina en la posición 46 o 47 (EGFVal46 o 47), que confiere estabilidad a las proteasas celulares. Las TM de ErbB también pueden tener aminoácidos eliminados o aminoácidos adicionales insertados. Esto incluye, pero no se limita a, EGF que tiene una eliminación de los dos aminoácidos C-terminales y una sustitución de aminoácidos neutros en la posición 51 (en particular EGF51Gln51; véase US20020098178A1), y EGF con aminoácidos eliminados (por ejemplo rEGF2-48; rEGF3-48 y rEGF4-48). Los fragmentos de TM de ErbB pueden incluir fragmentos de TGFa que contienen regiones de giro p predichas (por ejemplo, un péptido de la secuencia Ac-C-H-S-G-Y-V-G-A-R-C-O-OMe), fragmentos de EGF tales como [AIa20]EGF(14-31), y el péptido YHWYGYTPQNVI o GE11.
A modo de ejemplo adicional, la somatostatina (SST) y la cortistatina (CST) tienen una alta homología estructural y se unen a todos Ios receptores de SST conocidos. La SST de longitud completa tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
MLSCRLQCALAALSIVLALGCVTGAPSDPRLRQFLQKSLAAAAGKQELAKYF
LAELLSEPNQTENDALEPEDLSQAAEQDEMRLELQRSANSNPAMAPRERKA
GCKNFFWKTFTSC
La CST de longitud completa tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:
MYRHKNSWRLGLKYPPSSKEETQVPKTLISGLPGRKSSSRVGEKLQSAHKM
PLSPGLLLLLLSGATATAALPLEGGPTGRDSEHMQEAAGIRKSSLLTFLAWW
FEWTSQASAGPLIGEEAREVARRQEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSS
CK
La referencia a estas TM incluye Ios siguientes fragmentos (y sus correspondientes variantes):
NFFWKTF;
(R o K)NFFWKTF;
C(R o K)NFFWKTF;
(P o G)C(R o K)NFFWKTF;
NFFWKTF(S o T);
NFFWKTF(S o T)S;
NFFWKTF(S o T)SC;
(R o K)NFFWKTF(S o T);
(R o K)NFFWKTF(S o T)S;
(R o K)NFFWKTF(S o T)SC;
C(R o K)NFFWKTF(S o T);
C(R o K)NFFWKTF(S o T)S;
C(R o K)NFFWKTF(S o T)SC;
(P o G)C(R o K)NFFWKTF(S o T);
(P o G)C(R o K)NFFWKTF(S o T)S; o
(P o G)C(R o K)NFFWKTF(S o T)C.
Con respecto a las secuencias anteriores, cuando se indica una alternativa (P o G), una P es preferible en el caso de una TM de CST, mientras que una G es preferible en el caso de una TM de SST. Cuando se indica una alternativa (R o K), una R es preferible en el caso de una RM de CST, mientras que una K es preferible en el caso de una TM de SST. Cuando se indica una alternativa (S o T), una S es preferible en el caso de una TM de CST, mientras que una T es preferible en el caso de una TM de SST.
En la presente memoria se describen fragmentos que comprenden al menos 7 o al menos 10 residuos de aminoácidos, preferiblemente al menos 14 o al menos 17 residuos de aminoácidos, y más preferiblemente al menos 28 o 29 residuos de aminoácidos. A modo de ejemplo, las secuencias preferibles pueden incluir:
SANSNPAMAPRERKAGCKNFFWKTFTSC (SST-28);
AGCKNFFWKTFTSC (SST-14):
QEGAPPQQSARRDRMPCRNFFWKTFSSCK (CST-29);
QERPPLQQPPHRDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29);
QERPPPQQPPHLDKKPCKNFFWKTFSSCK (CST-29)
DRMPCRNFFWKTFSSCK (CST-17);
-.vM M: y
PCKNFFWKTFSSCK (CST-14)
En la presente memoria se describe que una TM puede comprender una secuencia de aminoácidos más larga, por ejemplo, al menos 30 o 35 residuos de aminoácidos, o al menos 40 o 45 residuos de aminoácidos, siempre que la TM sea capaz de unirse a una célula secretora de GH normal, por ejemplo a un receptor de SST o de CST en una célula secretora de GH normal. A este respecto, en la presente memoria se describe una TM que consiste en un fragmento de SST o CST de longitud completa, aunque incluye al menos la secuencia central "NFFWKTF" o una de las secuencias de aminoácidos primarias arriba definidas.
A modo de ejemplo adicional, los péptidos de GHRH incluyen:
YADAIFTASYRKVLGQLSARKLLQDILSR; YADAIFTASYRN VLGQLSARKLLQDILSR;
YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIM; YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMS;
ADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSR;
YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL;
YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGA;
YADAIFTNAYRKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTNSYRKVLGQLSARKALQDIMSR;
YADAIFTASYKKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTASYKRVLGQLSARKLLQDIMSR;
YADAIFTASYNKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTASYRKVLGQLSAKKLLQDIMSR;
YADAIFTASYKKVLGQLSAKKLLQDIMSR; YADAIFTASYRKVLGQLSANKLLQDIMSR;
YADAIFTASYRNVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTASYRKVLGQLSARNLLQDIMSR;
YADAIFEASYRKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTASERKVLGQLSARKLLQDIMSR;
YADAIFTASYRKELGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFT ASYRKVLGQLSARKLLQDIMSR;
YADAIFTESYRKVLGQLSARKLLQDIMSR; YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDIM;
YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDIMSR; YADAI FTASYRKVLAQLSARKLLQDIMSR;
YADAIFTAAYRKVLAQLSARKALQDIASR; YADAI FTAAYRKVLAQLSARKALQDIMSR;
HVDAIFTQSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA;
HVDAIFTQSYRKVLAQLSARKALQDILSRQQG; HVDAIFTSSYRKVLAQLSARKLLQDILSR;
HVDAIFTTSYRKVLAQLSARKLLQDILSR; YADAI FTQSYRKVLAQLSARKALQDILNR;
YADAIFTQSYRKVLAQLSARKALQDILSR.
Es de rutina confirmar que una TM se une a la célula diana seleccionada. Por ejemplo, se puede emplear un experimento de desplazamiento radiactivo simple en el que un tejido o células representativas de una célula secretora de la hormona del crecimiento se exponen a TM marcada (por ejemplo tritiada) en presencia de un exceso de TM no marcada. En un experimento de este tipo se pueden evaluar las proporciones relativas de unión no específica y específica, lo que permite confirmar que la TM se une a la célula diana. Opcionalmente, el ensayo puede incluir uno o más antagonistas de unión, y el ensayo puede comprender además la observación de una pérdida de unión de TM. Se pueden encontrar ejemplos de este tipo de experimento en Hulme, E. C. (199o), Receptor-binding studies, a brief outline, pp. 303-311, en Receptor biochemistry, A Practical Approach, Editorial E. C. Hulme, Oxford University Press. En el contexto de la presente invención, la referencia a una TM de péptido abarca análogos peptídicos de la misma, siempre que el análogo se una al mismo receptor que la TM "de referencia" correspondiente. Dichos análogos pueden incluir residuos sintéticos tales como:
P-Nal = p-naftilalanina
P-Pal = p-piridilalanina
hArg(Bu) = N-guanidino-(butil)-homoarginina
hArg(Et)2 = N,N'-guanidino-(dimetil)-homoarginina
hArg(CH2CF3)2 = N,N-guanidino-bis-(2,2,2,-trifluoroetilo)-homoarginina
hArg(CH3, hexilo) = N,N-guanidino-(metil, hexil)-homoarginina
Lys(Me) = Ne-metil-lisina
Lys(iPr) = Ne-isopropil-lisina
AmPhe = aminometilfenilalanina
AChxAla = aminociclohexilalanina
Abu = ácido a-aminobutírico
Tpo = 4-tiaprolina
MeLeu = N-metil-leucina
Orn = ornitina
Nle - norleucina
Nva = norvalina
Trp(Br) = 5-bromo-triptófano
Trp(F) = 5-fluoro-triptófano
Trp (NO2) = 5-nitro-triptófano
Gaba = ácido y-aminobutírico
Bmp = J-mercaptopropionilo
Ac = acetilo
Pen - pencilamina
A modo de ejemplo, el anterior aspecto análogo de péptido se describe con más detalle con referencia a TM de péptidos específicos, tales como péptidos de SST, péptidos de GHRH, péptidos de bombesina, péptidos de ghrelina y péptidos de urotensina, aunque el mismo principio se aplica a todas las TM descritas en la presente memoria. Los análogos de la somatostatina incluyen, pero no se limitan a, los descritos en las siguientes publicaciones: Van Binst, G. et al. Peptide Research 5: 8 (1992); Horvath, A. et al. Abstract, "Conformations of Somatostatin Analogs Having Antitumor Activity", 22nd European Symposium, 13-19 de septiembre de 1992, Interlaken, Suiza; US5,506,339; EP0363589; US4,904,642; US4,871,717; US4,725,577; US4,684,620; US4,650,787; US4,585,755; US4,725,577; US4,522,813; US4,369,179; US4,360,516; US4,328,214; US4,316,890; US4,310,518; US4,291,022; US4,238,481; US4,235,886; US4,211,693; US4,190,648; US4,146,612; US4,133,782; US5,506,339; US4,261,885; US4,282,143; US4,190,575; US5,552,520; EP0389180; EP0505680; US4,603,120; EP0030920; US4,853,371; WO90/12811; WO97/01579; WO91/18016; WO98/08529 y WO98/08528; WO/0075186 y WOOO/06185; W099/56769; y FR 2,522,655.
Los métodos para sintetizar análogos están bien documentados, como se ilustra, por ejemplo, en las patentes arriba mencionadas. Por ejemplo, la síntesis de H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2 se puede lograr siguiendo el protocolo establecido en el Ejemplo 1 del documento EP0395417A1. De modo similar, los análogos de síntesis con un extremo N-terminal sustituido se pueden obtener, por ejemplo, siguiendo el protocolo establecido en los documentos WO88/02756, EP0329295 y US5,240,561.
En la presente memoria también se describe el uso de análogos de SST lineales, por ejemplo: H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-p-N02-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-*Nal-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; H-D-Phe-p-cloro-Phe-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Phe-Thr-NH2; y H-D-Phe-Ala-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Ala-D-beta-Nal-NH2.
Una o más fracciones químicas, por ejemplo un derivado de azúcar, grupos mono o poli-hidroxi (C2-12) alquilo, mono o poli-hidroxi (C2-12) acilo, o un derivado de piperazina, se pueden unir a un análogo de SST, por ejemplo al aminoácido N-terminal - véanse los documentos W o 88/02756, Ep 0329295 y US5,240,561.
Los análogos del péptido de GHRH se remontan a la década de 1990 e incluyen el "antagonista estándar" [Ac-Tyr', D-Arg2jhGH-RH (1-29) Nha. La Patente de EE. UU. 4,659,693 describe análogos antagonistas de GH-RH que contienen ciertos residuos de N,N'-dialquil-omega-guanidino alfa-aminoacilo en la posición 2 de la secuencia de GH-RH (1-29). En los documentos W091/16923, US5,550,212, US5,942,489, US6,057,422 US5,942,489, US6,057,422, WO96/032126, WO96/022782, W096/016707, WO94/011397, WO94/011396 se proporcionan ejemplos adicionales. Algunos ejemplos de análogos de bombesina incluyen TM que comprenden: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 (nombre de código BIM-26218), D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Leu-NH2 (nombre de código B iM-26187); D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-9 [CH2NH]-Phe-NH2 (nombre de código BIM-26159), y D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-9 [CH2NH]-CPA-NH2 (nombre código BIM-26189); D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-N-metil-D-Ala-His-Leu-metiléster, y D-Fg-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-D-Ala-His-Leu-metiléster.
Algunos análogos de bombesina incluyen péptidos derivados de los péptidos naturales relacionados estructuralmente, en concreto bombesina, neuromedina B, neuromedina C, litorina y GRP. A continuación se enumeran las secuencias de aminoácidos relevantes de estos péptidos de TM naturales:
Bombesina (últimos 10 aa): Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
Neuromedina B: Gly-Asn-Leu-Trp-Ala-Thr-Gly-His-Phe-Met-NH2
Neuromedina C: Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
Litorina: pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Phe-Met NH2
GRP humano (últimos 10 aa): Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
Algunos análogos se describen en el documento de EE. UU. número de serie 502,438, presentado el 30 de marzo de 1990, el documento de EE. UU. número de serie 397,169, presentado el 21 de agosto de 1989, el documento de EE. UU. número de serie 376,555, presentado el 7 de Julio de 1989, el documento de EE. UU. número de serie 394,727, presentado el 16 de agosto de 1989, el documento de EE. UU. número de serie 317,941, presentado el 2 de marzo de 1989, el documento de EE. UU. número de serie 282,328, presentado el 9 de diciembre de 1988, el documento de EE. UU. número de serie 257,998, presentado el 14 de octubre de 1988, el documento de EE. UU. número de serie 248.771, presentado el 23 de septiembre de 1988, el documento de EE. UU. número de serie 207,759, presentado el 16 de Junio de 1988, el documento de EE. UU. número de serie 204,171, presentado el 8 de Junio de 1988, el documento de EE. UU. número de serie 173,311, presentado el 25 de marzo de 1988, el documento de EE. UU. número de serie 100,571, presentado el 24 de septiembre de 1987; y el documento de EE. UU. número de serie 520,225, presentado el 9 de mayo de 1990, el documento de EE. UU. número de serie 440,039, presentado el 21 de noviembre de 1989. También se describen análogos de bombesina en Zachary et al., Proc. Nat. Aca Scí. 82: 7616 (1985); Heimbrook et al. "Synthetic Peptides: Approaches to Biological Problems", UCLA Symposium on Mol. and Cell. Biol. New Series, VoI. 86, editores Tarn y Kaiser; Heinz-Erian et al., Am. J. Physiol. G439 (1986): Martínez en al., J. Med. Chem. 28: 1874 (1985); Gargosky et al., Biochem. J. 247: 427 (1987); Dubreuil et al. Drug Design and Delivery, VoI. 2:49, Harwood Academic Publishers, GB (1987); Heikkila et al., J. BíoI. Chem. 262: 16456 (1987); Caranikas at al., J. Med. Chem. 25: 1313 (1982); Saeed at al., Peptides 10: 597 (1989); Rosell et al., Trends in pharmacological Sciences 3: 211 (1982): Lundberg at al., Proc. Nat, Aca. Scí.80: 1120, (1983); Engberg et al., Nature 293: 222 (1984); Mizrahi et al., Euro. J. Pharma. 82: 101 (1982); Leander et al., Nature 294; 467 (1981); WoII et al., Biochem. Biophys Res. Comm. 155: 359 (1988); Rivier et al., Biochem, 17: 1766 (1978); Cuttitta et al., Cáncer Surveys 4: 707 ( i 985); Aumelas et al., Int. J. Peptide Res. 30: 596 (1987).
Los análogos se pueden preparar mediante técnicas convencionales, tales como las descritas en Ios documentos WO92/20363 y EP0737691. Por ejemplo, en Ios documentos WO89/02897, W091/17181, W090/03980 y WO91/02746 se describen análogos de bombesina adicionales.
Algunos ejemplos de análogos de ghrelina comprenden: Tyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, Tyr-DTrp-Lys-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DLys-Phe-DTrp-NH2, His-DTrp-DArg-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2, DesaminoTyr-DTrp-Ala-Trp-DPhe-NH2, DesaminoTyr-DTrp-DLys-Trp-DPhe-NH2, DesaminoTyr-DTrp-Ser-Trp-DPhe-Lys-NH2, DesaminoTyr-DTrp-Ser-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DTrp-Phe-Met-NH2, Tyr-DTrp-DTrp-Phe-Phe-NH2, GlyT [CH2NH]-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, GlyY [CH2 NH]-DbetaNal-DLyS-TrP-DPhe-Lys-NH2, DAla-DbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH2, His-DbetaNal-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2, Ala-His-DTrp-DLys-Trp-DPhe-Lys-NH2, Ala9[CH2NH]-DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-NH2, DAla-DciclohexilAla-Ala-Phe-DPhe-Nle-NH2, DciclohexilAla-Ala-Phe-DTrp-Lys-NH2, DAla-DbetaAla-Thr-DThr-Lys-NH2, DciclohexilAla-Ala-Trp-DPhe-NH2, DAla-DbetaNal-Ala-Ala-DAla-Lys-NH2, DbetaNal-Ala-Trp-DPhe-Leu-NH2, Hís-DTrp-Phe-Trp-DPhe-Lys-NH2, DAla-DbetaNal-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH2, pAla-Trp-DAla-DTrp-Phe-NH2, His-Trp-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH2, DLys-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, DAla-DbetaNal-DLys-DTrp-Phe-Lys-NH2, Tyr-DAla-Phe-Aib-NH2, Tyr-DAla-Sar-NMePhe-NH2, ayAbu-DTrp-DTrp-Ser-N^, ayAbu-DTrp-DTrp-Lys-N^, ayAbu-DTrp-DTrp-0 rn-NH2, aAbu-DTrp-DTrp-0 rn-NH2, DThr-Da Nal-DTrp-DPro-Arg-NH2, DAla-Ala-DAla-DTrp-Phe-Lys-NH2, AlaY [CH2NH]His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, Lys-DHis-DTrp-Phe-NH2, yAbu-DTrp-DTrp-0 rn-NH2, lníp-Trp-Trp-Phe-NH2, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Leu-NH2, Ac-DTrp-Phe-DTrp-Lys-NH2, Ac-DTrp-DTrp-Lys-NH2, DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-Lys-NH2, Ac-DbetaNal-Leu-Pro-NH2, pAla-Trp-DTrp-DTrp-0 rn-NH2, DVal-Da Nal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DLeu-Da Nal-DTrp-Phe-Arg-NH2, CicIohexilAla-Da Nal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DTp-Da Nal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DAla-DpNal-DPro-Phe-Arg-NH2, Ac-Da Nal-DTrp-Phe-Arg-NH2, DaNal-DTrp-Phe-Arg-NH2, His-DTrp-DTrp-Lys-NH2, Ac-DpNal-DTrp-NH2, aAib-DTrp-DciclohexilAla-NH2, aAib-DTrp-DAla-ciclohexilAla-NH2, DAla-DciclohexilAla-Ala-Ala-Phe-DPhe-Nle-NH2, DPhe-Ala-Phe-DPal-NH2, DPhe-Ala-Phe-DPhe-Lys-NH2, DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH2, Ac-DLys-Tyr-DTrp-DTrp-Phe-NH2, Arg-DTrp-Leu-Tyr-Trp-Pro(cíclico Arg-Pro), Ac-DpNal-PicLys-ILys-DPhe-NH2, DPal-Phe-DTrp-Phe-Met-NH2, DPbe-Trp-DPhe-Phe-Met-NH2, DPal-Trp-DPhe-Phe-Met-NH2, pAla-Pal-DTrp-DTrp-0 rn-NH2, ayAbu-Trp-DTrp-DTrp-0 rn-NH2, pAla-Trp-DTrp-DTrp-Lys-NH2, yAbu-Trp-DTrp-DTrp-0 rn-NH2, Ava-Trp-DTrp-DTrp-0 rn-NH2, DLys-Tyr-DTrp-Ala-Trp-DPhe-NH2, His-DTrp-DArg-Trp-DPhe-NH2, <Glu-His-Trp-DSer-DArg-NH2, DPhe-DPhe-DTrp-Met-DLys-N^, 0-(2-metilalil) benzofonona oxima, (R)-2-amino-3-(IH-indol-3-il)-l-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-1-ona, N-((R)-1-((R)-1-((S)-3-(IH-indol-3-il)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-ilamino)-6-amino-1-oxohexan-2-ilamino)-3-hidroxi-1-oxopropan-2-il)benzamida, (S)-N-((S)-3-(1H-indol-3-il)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)-6-acetamido-2-((S)-2-amino-3-(benciloxi)propanamido)hexanamida, (S)-N-((R)-3-(1H-indol-3-il)-1 -oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)-2-((S)-2-acetamido-3-(benciloxi)propanamido)-6-aminohexanamida, (R)-N-(3-(1H-indol-3-il)-1 -(4-(2-metoxifenil)piperidin-1-il)-1-oxopropan-2-il)-4-aminobutanamida, (R)-N-(3-(1H-indol-3-il)-1 -(4-(2-metoxifenil)piperidin-1-il)-1 -oxopropan-2-il)-2-amino-2-metilpropanamida, 3-(p-tolilcarbamoil)-2-naftoato de metilo, 3-(4-(2-metoxifenil)piperidina-1-carbonil)-2-naftoato de etilo, 3-(2-metoxifenilcarbamoil)-2-naftoato, (S)-2,4-diamino-N-((R)-3-(naftalen-2-ilmetoxi)-1-oxo-1-(4-fenilpiperidin-1-il)propan-2-il)butanamida, naftaleno-2,3-diilbis((4-(2-metoxifenil)piperazin-1-il)metanona), (R)-2 am¡no-N-(3-(benc¡lox¡)-1-oxo-1-(4-fenilp¡peraz¡n-1-¡l)propan-2-¡l)-2-met¡lpropanam¡da, o (R)-2-amino-3-(bencilox¡)-1-(4-fenilpiperaz¡n-1-¡l)propan-1-ona.
Algunos ejemplos de análogos de urotensina comprenden: Cpa-c [D-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys]-Val-NH2; y Aspc[Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys]-Val-OH.
Los polipéptidos carecen de un dominio de Hc funcional de una neurotoxina clostridial de acuerdo con las reivindicaciones. En consecuencia, dichos polipéptidos no son capaces de unirse a membranas sinaptosómicas de rata (a través de un componente Hc clostridial) en ensayos de unión tal como se describe en Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82. En la presente memoria se describen polipéptidos que preferiblemente carecen de los últimos 50 aminoácidos C-terminales de una holotoxina de neurotoxina clostridial. En la presente memoria se describen polipéptidos que preferiblemente carecen de los últimos 100, Ios últimos 150, Ios últimos 200, Ios últimos 250, o Ios últimos 300 residuos de aminoácidos C-terminales de una holotoxina de neurotoxina clostridial. En la presente memoria se describe que la actividad de unión de Hc se puede anular/reducir mediante mutagénesis; a modo de ejemplo, con referencia a BoNT/A por conveniencia, la modificación de una o dos mutaciones de residuos de aminoácidos (W1266 a L e Y1267 a F) en la bolsa de unión de gangliósidos hace que la región de Hc pierda su función de unión al receptor. Se pueden realizar mutaciones análogas en componentes del péptido clostridial no serotipo A, por ejemplo una construcción basada en botulinum B con mutaciones (W1262 a L e Y1263 a F) o botulinum E (W1224 a L e Y1225 a F). Otras mutaciones en el sitio activo logran la misma ablación de la actividad de unión al receptor de Hc , por ejemplo Y1267S en toxina botulínica de tipo A y el residuo altamente conservado correspondiente en las otras neurotoxinas clostridiales. En Rummel et al (2004) (Molecular Microbiol. 51: 631-634) se describen detalles de esta y otras mutaciones.
Los polipéptidos pueden carecer de un dominio de Hc funcional de una neurotoxina clostridial y también carecen de cualquier Tm funcionalmente equivalente. En consecuencia, dichos polipéptidos carecen de la función de unión natural de una neurotoxina clostridial y no son capaces de unirse a membranas sinaptosómicas de rata (a través de un componente de Hc clostridial, o a través de cualquier TM funcionalmente equivalente) en ensayos de unión, tal como se describe en Shone et al. (1985) Eur. J. Biochem. 151, 75-82.
El péptido de Hc de una neurotoxina clostridial nativa comprende aproximadamente 400-440 residuos de aminoácidos y consiste en dos dominios funcionalmente distintos de aproximadamente 25 kDa cada uno, en concreto la región N-terminal (comúnmente designada como el péptido o dominio de Hcn) y la región C-terminal (comúnmente designada como el péptido o dominio de Hc c ). Este hecho es confirmado por las siguientes publicaciones: Umland TC (1997) Nat. Struct. B¡oI.4: 788-792; Herreros J (2000) Biochem. J. 347: 199-204; Halpern J (1993) J. B¡oI. Chem. 268: 15, pp.
11188-11192; Rummel A (2007) PNAS 104: 359-364; Lacey DB (1998) Nat. Struct. B¡oI. 5: 898-902; Knapp (1998) Am. Cryst. Asoc. Abstract Papers 25: 90; Swaminathan y Eswaramoorthy (2000) Nat. Struct. B¡oI. 7: 1751-1759; y Rummel A (2004) MoI. Microbiol. 51 (3), 631-643. Además, está bien documentado que la región C-terminal (Hc c ), que constituye Ios 160-200 residuos de aminoácidos C-terminales, es responsable de la unión de una neurotoxina clostridial a sus receptores celulares naturales, en concreto a Ios terminales nerviosos en la unión neuromuscular -este hecho también se confirma en las publicaciones arriba indicadas. Por lo tanto, la referencia en toda esta memoria a una de cadena pesada clostridial que carece de un péptido (o dominio) de Hc de cadena pesada funcional, de tal modo que la cadena pesada es incapaz de unirse a receptores de superficie celular a Ios que se une una neurotoxina clostridial nativa, significa que la cadena pesada clostridial simplemente carece de un péptido de Hcc funcional. En otras palabras, en la presente memoria se describe que la región peptídica de Hcc se elimina parcial o totalmente, o se modifica de otro modo (por ejemplo, a través de un tratamiento químico o proteolítico convencional) para inactivar su capacidad de unión nativa para Ios terminales nerviosos en la unión neuromuscular.
En la presente memoria se describe un péptido de Hn clostridial que carece de parte de una porción de péptido C-terminal (Hc c ) de una neurotoxina clostridial y que, por lo tanto, carece de la función de unión de Hc de la neurotoxina clostridial nativa. A modo de ejemplo, el péptido de Hn clostridial prolongado en el extremo C-terminal carece de Ios 40 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 60 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 80 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 100 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 120 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 140 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 150 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 160 residuos de aminoácidos C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. El péptido de Hn clostridial puede carecer de toda la parte de péptido C-terminal (Hc c ) de una neurotoxina clostridial y, por lo tanto, carece de la función de unión de Hc de la neurotoxina clostridial nativa. El péptido de Hn clostridial puede carecer de Ios 165 residuos de aminoácidos C-terminales. o Ios 170 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 175 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 180 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 185 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 190 residuos de aminoácidos C-terminales, o Ios 195 residuos de aminoácidos C-terminales de una cadena pesada de neurotoxina clostridial. A modo de ejemplo adicional, el péptido de Hn clostridial carece de una secuencia de referencia de Hcc clostridial seleccionada entre el grupo que consiste en:
Neurotoxina botulínica de tipo A - residuos de aminoácidos (Y1111-L1296)
Neurotoxina botulínica de tipo B - residuos de aminoácidos (Y1098-E1291)
Neurotoxina botulínica de tipo C - residuos de aminoácidos (Y1112-E1291)
Neurotoxina botulínica de tipo D - residuos de aminoácidos (Y1099-E1276)
Neurotoxina botulínica de tipo E - residuos de aminoácidos (Y1086-K1252)
Neurotoxina botulínica de tipo F - residuos de aminoácidos (Y1106-E1274)
Neurotoxina botulínica de tipo G - residuos de aminoácidos (Y1106-E1297)
Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (Y1128-D1315).
Las secuencias de referencia arriba identificadas deben considerarse como una guía, ya que se pueden producir ligeras variaciones de acuerdo con los sub-serotipos.
En la presente memoria se describe una proteasa que abarca todas las proteasas no citotóxicas que son capaces de escindir una o más proteínas del aparato de fusión exocítica en células eucariotas.
En la presente memoria se describe una proteasa bacteriana (o fragmento de la misma). En la presente memoria se describe una proteasa bacteriana selecciona entre los géneros Clostrídium o Neisseria/ Streptococcus (por ejemplo, una cadena L clostridial, o una proteasa contra IgA neisserial preferiblemente de N. gonorrhoeae o S. pneumoniae).
La presente descripción también abarca variantes de proteasas no citotóxicas (es decir, variantes de moléculas de proteasas naturales), siempre que las variantes de proteasas sigan mostrando la actividad de proteasa requerida. A modo de ejemplo, una variante puede tener al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95 o al menos un 98% de homología de secuencia de aminoácidos con una secuencia de proteasa de referencia. Por lo tanto, el término "variante" incluye proteasas no cifóticas que tienen actividad de endopeptidasa aumentada (o disminuida) - aquí se hace mención particular al Kcat/Km aumentado de los mutantes de BoNT/A Q161A, E54A y K165L, véase Ahmed, S. a . (2008) Protein J. DOI 10.1007/s10930-007-9118-8.
El término "fragmento", cuando se utiliza en relación con una proteasa, significa normalmente un péptido que tiene al menos 150, preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 250, y de forma totalmente preferible al menos 300 residuos de aminoácidos de la proteasa de referencia. Al igual que en el caso del componente "fragmento" de TM (arriba descrito), los "fragmentos" de proteasa abarcan fragmentos de variantes de proteasas basadas en una secuencia de referencia.
En la presente memoria se describe una proteasa que muestra una actividad de serina o metaloproteasa (por ejemplo, actividad de endopeptidasa). La proteasa puede ser específica para una proteína SNARE (por ejemplo, SNAP-25, sinaptobrevina/VAMp, o sintaxina).
Se hace mención particular a los dominios de proteasa de neurotoxinas, por ejemplo, los dominios de proteasa de neurotoxinas bacterianas. Por lo tanto, la presente descripción abarca el uso de dominios de neurotoxinas que se producen en la naturaleza, así como de versiones de dichas neurotoxinas naturales preparadas de forma recombinante.
Algunas neurotoxinas ejemplares son producidas por clostridia, y el concepto "neurotoxina clostridial" abarca neurotoxinas producidas por C. tetani (TeNT), y por los serotipos A-G de C. botulinum (BoNT), así como las neurotoxinas similares a BoNT estrechamente relacionadas producidas por C. baratii y C. butyricum. Las abreviaturas arriba mencionadas se utilizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Por ejemplo, la nomenclatura BoNT/A denota la fuente de neurotoxina como BoNT (serotipo A). La nomenclatura correspondiente se aplica a otros serotipos de BoNT.
Las BoNT son las toxinas más potentes conocidas, con valores de dosis letal media (DL50) para ratones que varían de 0,5 a 5 ng/kg, según el serotipo. Las BoNT se adsorben en el tracto gastrointestinal y, después de entrar en la circulación general, se unen a la membrana presináptica de los terminales nerviosos colinérgicos e impiden la liberación de su neurotransmisor acetilcolina. BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G escinden sinaptobrevina/proteína de membrana asociada a vesícula (VAMP); BoNT/C, BoNT/A y BoNT/E escinden la proteína asociada a sinaptosomas de 25 kDa (SNAP-25); y BoNT/C escinde la sintaxina.
Las BoNT comparten una estructura común, siendo proteínas de cadena doble de -150 kDa, que consiste en una cadena pesada (cadena H) de -100 kDa unida de forma covalente por un enlace disulfuro simple a una cadena ligera (cadena L) de -50 kDa. La cadena H consta de dos dominios, cada uno de -50 kDa. El dominio C-terminal (Hc ) se requiere para la unión neuronal de alta afinidad, mientras que se plantea que el dominio N-terminal (Hn) interviene en la translocación de membrana. La cadena L consiste en una metaloproteasa dependiente de zinc responsable de la escisión de la proteína SNARE del sustrato.
El concepto "fragmento de cadena L" significa un componente de la cadena L de una neurotoxina, fragmento que demuestra una actividad de metaloproteasa y es capaz de escindir proteolíticamente una proteína asociada a membrana de vesícula y/o de plasma implicada en la exocitosis celular.
Algunos ejemplos de secuencias de proteasa (de referencia) adecuadas incluyen:
Neurotoxina botulínica de tipo A residuos de aminoácidos (1-448)
Neurotoxina botulínica de tipo B - residuos de aminoácidos (1-440)
Neurotoxina botulínica de tipo C - residuos de aminoácidos (1-441)
Neurotoxina botulínica de tipo D - residuos de aminoácidos (1-445)
Neurotoxina botulínica de tipo E - residuos de aminoácidos (1-422)
Neurotoxina botulínica de tipo F - residuos de aminoácidos (1-439)
Neurotoxina botulínica de tipo G - residuos de aminoácidos (1-441)
Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (1-457)
Proteasa contra IgA - residuos de aminoácidos (1-959)*
*Pohlner,, J. et al. (1987). Nature 325, pp. 458-462.
La secuencia de referencia arriba identificada debe considerarse como una guía, ya que se pueden producir ligeras variaciones de acuerdo con los subserotipos. A modo de ejemplo, el documento US 2o07/0166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes:
Neurotoxina botulínica de tipo A - residuos de aminoácidos (M1-K448)
Neurotoxina botulínica de tipo B - residuos de aminoácidos (M1-K441)
Neurotoxina botulínica de tipo C residuos de aminoácidos (M1-K449)
Neurotoxina botulínica de tipo D residuos de aminoácidos (M1-R445)
Neurotoxina botulínica de tipo E residuos de aminoácidos (M1-R422)
Neurotoxina botulínica de tipo F residuos de aminoácidos (M1-K439)
Neurotoxina botulínica de tipo G residuos de aminoácidos (M1-K446)
Neurotoxina tetánica residuos de aminoácidos (M1-A457)
Una variedad de fragmentos de toxina clostridial que comprenden la cadena ligera puede ser útil en aspectos de la presente descripción con la condición de que estos fragmentos de cadena ligera se puedan dirigir específicamente a los componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores y, por lo tanto, puedan participar en la ejecución del mecanismo celular global mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las cadenas ligeras de las toxinas clostridiales tienen una longitud de aproximadamente 420-460 aminoácidos y comprenden un dominio enzimático. La investigación ha demostrado que para la actividad enzimática del dominio enzimático no es necesaria la longitud completa de una cadena ligera de toxina clostridial. Como ejemplo no limitativo, los primeros ocho aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitativo, los primeros ocho aminoácidos de la cadena ligera de TeNT no son necesarios para la actividad enzimática. Del mismo modo, el terminal carboxilo de la cadena ligera no es necesario para la actividad. Como ejemplo no limitativo, los últimos 32 aminoácidos de la cadena ligera de BoNT/A (residuos 417-448) no son necesarios para la actividad enzimática. Como otro ejemplo no limitativo, los últimos 31 aminoácidos de la cadena ligera de TeNT (residuos 427-457) no son necesarios para la actividad enzimática. Por lo tanto, los aspectos de esta descripción pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, por ejemplo, al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos, al menos 425 aminoácidos y al menos 450 aminoácidos. Otros aspectos de esta realización pueden incluir cadenas ligeras de toxina clostridial que comprenden un dominio enzimático que tiene una longitud de, por ejemplo, a lo sumo 350 aminoácidos, a lo sumo 375 aminoácidos, a lo sumo 400 aminoácidos, a lo sumo 425 aminoácidos y a lo sumo 450 aminoácidos.
El componente de proteasa no citotóxica comprende preferiblemente una cadena L de serotipo BoNT/A, BoNT/B o BoNT/D (o un fragmento o variante de la misma).
Los polipéptidos, en especial su componente de proteasa, se pueden PEGilar, lo que puede ayudar a aumentar la estabilidad, por ejemplo la duración de acción del componente de proteasa. La PEGilación es particularmente preferible cuando la proteasa comprende una proteasa de BoNT/A, B o Ci . La PEGilación incluye preferiblemente la adición de PEG al extremo N-terminal del componente de proteasa. A modo de ejemplo, el extremo N-terminal de una proteasa se puede prolongar con uno o más residuos de aminoácidos (por ejemplo cisteína), que pueden ser iguales o diferentes. Uno o más de dichos residuos de aminoácidos pueden tener su propia molécula de PEG unida (por ejemplo, unida de forma covalente) al mismo. En el documento W02007/104567 se describe un ejemplo de esta tecnología.
Un Dominio de Translocación es una molécula que permite la translocación de una proteasa al interior de una célula diana, de modo que se produce una expresión funcional de la actividad de proteasa dentro del citosol de la célula diana. Mediante uno cualquiera de una serie de ensayos convencionales se puede confirmar si una molécula (por ejemplo, una proteína o un péptido) posee la función de translocación requerida de la presente invención.
Por ejemplo, Shone C. (1987) describe un ensayo in vitro que emplea liposomas, que se estimulan con una molécula de prueba. La presencia de la función de translocación requerida se confirma mediante la liberación desde los liposomas de K y/o NAD marcados, que se pueden controlar fácilmente [véase Shone C. (1987) Eur. J. Biochem; voI. 167 (1): pp. 175-180].
Blaustein R. (1987) proporciona otro ejemplo, que describe un ensayo in vitro simple que emplea membranas planas de bicapa fosfolipídica. Las membranas se estimulan con una molécula de prueba y la función de translocación necesaria se confirma mediante un aumento de la conductancia a través de dichas membranas [véase Blaustein (1987) FEBS Letts; voI.226, n01: pp. 115-120].
Method in Enzymology VoI.220 y 221, Membrane Fusión Techniques, Partes A y B, Academic Press 1993, proporciona una metodología adicional para permitir la evaluación de la fusión de membrana y, por lo tanto, la identificación de Dominios de Translocación adecuados.
La presente descripción también abarca variantes de dominios de translocación, siempre que las variantes de dominios sigan mostrando la actividad de translocación requerida. A modo de ejemplo, una variante puede tener al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 90%, y de forma totalmente preferible al menos un 95% o al menos un 98% de homología de secuencia de aminoácidos con un dominio de translocación de referencia. El término "fragmentó", cuando se usa en relación con un dominio de translocación, significa un péptido que tiene al menos 20, preferiblemente al menos 40, más preferiblemente al menos 80, y de forma totalmente preferible al menos 100 residuos de aminoácidos del dominio de translocación de referencia. En el caso de un dominio de translocación clostridial, el fragmento tiene preferiblemente al menos 100, preferiblemente al menos 150, más preferiblemente al menos 200, y de forma totalmente preferible al menos 250 residuos de aminoácidos del dominio de translocación de referencia (por ejemplo el dominio Hn). Al igual que en el caso del componente "fragmento" de TM (arriba descrito), Ios "fragmentos" de translocación abarcan fragmentos de variantes de dominios de translocación basados en las secuencias de referencia.
Preferiblemente, el Dominio de Translocación puede formar poros permeables a Ios iones en las membranas lipídicas en condiciones de pH bajó. Se ha comprobado que es preferible utilizar solo aquellas partes de la molécula de proteína capaces de formar poros dentro de la membrana endosomal.
En la presente memoria se describe un Dominio de Translocación obtenido de una fuente de proteína microbiana, en particular de una fuente de proteína bacteriana o viral. Por lo tanto, en la presente memoria se describe un Dominio de Translocación que consiste en un dominio de translocación de una enzima, tal como una toxina bacteriana o una proteína viral.
Está bien documentado que determinados dominios de las moléculas de toxina bacteriana son capaces de formar dichos poros. También se sabe que determinados dominios de translocación de proteínas de fusión de membrana expresadas viralmente son capaces de formar dichos poros.
El Dominio de Translocación es un dominio de translocación de neurotoxina clostridial, tal como el dominio Hn (o un componente funcional del mismo). Hn significa una parte o fragmento de la cadena H de una neurotoxina clostridial aproximadamente equivalente a la mitad amino-terminal de la cadena H, o el dominio correspondiente a dicho fragmento en la cadena H intacta. La cadena H carece de la función de unión natural del componente Hc de la cadena H. A este respecto, la función de Hc puede ser eliminada por deleción de la secuencia de aminoácidos Hc (bien en el nivel de síntesis de ADN, bien en el nivel postsíntesis por tratamiento de nucleasa o proteasa). En la presente memoria se describe la función de Hc inactivada por tratamiento químico o biológico. Por lo tanto, la cadena H no se puede unir al Sitió de Unión en una célula diana en el que se une la neurotoxina clostridial nativa (es decir, la holotoxina).
Algunos ejemplos de Dominios de Translocación (de referencia) adecuados incluyen:
Neurotoxina botulínica de tipo A - residuos de aminoácidos (449-871)
Neurotoxina botulínica de tipo B - residuos de aminoácidos (441-858)
Neurotoxina botulínica de tipo C - residuos de aminoácidos (442-866)
Neurotoxina botulínica de tipo D - residuos de aminoácidos (446-862)
Neurotoxina botulínica de tipo E - residuos de aminoácidos (423-845)
Neurotoxina botulínica de tipo F residuos de aminoácidos (440-864)
Neurotoxina botulínica de tipo G residuos de aminoácidos (442-863)
Neurotoxina tetánica residuos de aminoácidos (458-879)
La secuencia de referencia arriba identificada debe considerarse como una guía, ya que se pueden producir ligeras variaciones de acuerdo con los subserotipos. A modo de ejemplo, el documento US 2o07/o166332 cita secuencias clostridiales ligeramente diferentes:
Neurotoxina botulínica de tipo A residuos de aminoácidos (A449-K871)
Neurotoxina botulínica de tipo B residuos de aminoácidos (A442-S858)
Neurotoxina botulínica de tipo C - residuos de aminoácidos (T450-N866)
Neurotoxina botulínica de tipo D - residuos de aminoácidos (D446-N862)
Neurotoxina botulínica de tipo E - residuos de aminoácidos (K423-K845)
Neurotoxina botulínica de tipo F - residuos de aminoácidos (A440-K864)
Neurotoxina botulínica de tipo G - residuos de aminoácidos (S447-S863)
Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (S458-V879)
En el contexto de la presente descripción, una variedad de regiones Hn de toxina Clostridial que comprenden un dominio de translocación puede ser útil en aspectos de la presente descripción con la condición de que estos fragmentos activos puedan facilitar la liberación de una proteasa no citotóxica (por ejemplo, una cadena L clostridial) de vesículas intracelulares al interior del citoplasma de la célula diana y, por lo tanto, participar en la ejecución del mecanismo celular general mediante el cual una toxina clostridial escinde proteolíticamente un sustrato. Las regiones de Hn de las cadenas pesadas de toxinas Clostridiales tienen una longitud de aproximadamente 410-430 aminoácidos y comprenden un dominio de translocación. La investigación ha demostrado que para la actividad de translocación del dominio de translocación no es necesaria la longitud completa de una región de Hn de una cadena pesada de toxina Clostridial. De este modo, algunos aspectos de esta descripción pueden incluir regiones de Hn de toxina clostridial que comprenden un dominio de translocación que tiene una longitud de, por ejemplo, al menos 350 aminoácidos, al menos 375 aminoácidos, al menos 400 aminoácidos y al menos 425 aminoácidos. otros aspectos de esta descripción pueden incluir regiones de Hn de toxina clostridial que comprenden un dominio de translocación que tiene una longitud de, por ejemplo, a lo sumo 350 aminoácidos, a lo sumo 375 aminoácidos, a lo sumo 400 aminoácidos y a lo sumo 425 aminoácidos.
Para más detalles sobre las bases genéticas de la producción de toxinas en Clostridium botulinum y C. tetani, se hace referencia a Henderson et al (1997) en The Clostridia: Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press.
En la presente memoria se describen partes de Hn de neurotoxina natural y partes de Hn modificadas que tienen secuencias de aminoácidos que no se producen en la naturaleza y/o residuos de aminoácidos sintéticos, en donde las partes de Hn modificadas siguen mostrando la función de translocación arriba mencionada.
En la presente memoria se describen Dominios de Translocación no clostridiales. Algunos ejemplos de orígenes de Dominios de Translocación no clostridiales (de referencia) incluyen, pero no se limitan a, el dominio de translocación de la toxina diftérica [O = Keefe et al., Proc. Nati. Acad. Scí. EE. UU. (1992) 89, 6202-6206; Silverman et al., J. Biol. Chem. (1993) 269, 22524-22532; y London, E. (1992) Biochem. Biophy.s Acta., 1112, pp. 25-51], el dominio de translocación de la exotoxina de Pseudomonas de tipo A [Prior et al. Biochemistry (1992) 31, 3555-3559], los dominios de translocación de la toxina del ántrax [Blanke et al. Proc. Nati. Acad. Scí. e E. UU. (1996) 93, 8437-8442], una variedad de péptidos fusogénicos o hidrófobos con función de translocación [Plank et al. J. Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924; y Wagner et al (1992) PNAS, 89, pp. 7934-7938], y péptidos anfifílicos [Murata et al (1992) Biochem., 31, pp. 1986-1992]. En la presente memoria se describe un Dominio de Translocación que refleja el Dominio de Translocación presente en una proteína natural, o que incluye variaciones de aminoácidos, en donde las variaciones no destruyen la capacidad de translocación del Dominio de Translocación.
Algunos ejemplos particulares de Dominios de Translocación virales (de referencia) incluyen determinados dominios de translocación de proteínas de fusión de membrana expresadas viralmente. Por ejemplo, Wagner et al. (1992) y Murata et al. (1992) describen la función de translocación (es decir, fusión de membrana y vesículación) de una serie de péptidos fusogénicos y anfifílicos derivados de la región N-terminal de la hemaglutinina del virus de la gripe. Otras proteínas de fusión de membrana expresadas de forma viral que se sabe tienen la actividad de translocación deseada consisten en un dominio de translocación de un péptido fusogénico del Virus del Bosque Semliki (SFV), un dominio de translocación de la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV), un dominio de translocación de la proteína F del virus SER y un dominio de translocación de la glicoproteína de la cubierta de espumavirus. En la presente memoria se describen proteínas Aspike codificadas viralmente, por ejemplo la proteína E l del SFV y la proteína G de la proteína G del VSV.
En la presente memoria se describe que el uso de los Dominios de Translocación (de referencia) enumerados en la Tabla (a continuación) incluye el uso de variantes de secuencia de los mismos. Una variante puede comprender una o más sustituciones de ácidos nucleicos y/o deleciones o inserciones de ácidos nucleicos conservativas, con la condición de que la variante posea la función de translocación necesaria. Una variante también puede comprender una o más sustituciones de aminoácidos y/o deleciones o inserciones de aminoácidos, siempre que la variante posea la función de translocación necesaria.
Figure imgf000026_0001
Los polipéptidos pueden comprender además un dominio que facilita la translocación. Dicho dominio facilita el suministro de la proteasa no citotóxica al interior del citosol de la célula diana y se describe, por ejemplo, en los documentos WO 08/008803 y WO 08/008805.
A modo de ejemplo, algunos dominios que facilitan la translocación incluyen un dominio peptídico fusogénico de virus con cubierta, por ejemplo, algunos dominios peptídicos fusogénicos adecuados incluyen el dominio peptídico fusogénico de virus de la gripe (por ejemplo, el dominio peptídico fusogénico del virus de la gripe A de 23 aminoácidos), el dominio peptídico fusogénico de alfavirus (por ejemplo, el dominio peptídico fusogénico del virus del Bosque Semliki de 26 aminoácidos), el dominio peptídico fusogénico de vesiculovirus (por ejemplo, el dominio peptídico fusogénico del virus de la estomatitis vesicular de 21 aminoácidos), el dominio peptídico fusogénico de respirovirus (por ejemplo, el respirovirus del virus de Sendai de 25 aminoácidos), el dominio peptídico fusogénico de morbillivirus (por ejemplo, el dominio peptídico fusogénico del virus del Moquillo de 25 aminoácidos), el dominio peptídico fusogénico de avulavirus (por ejemplo, el dominio peptídico fusogénico del virus de la enfermedad de Newcastle de 25 aminoácidos), el dominio peptídico fusogénico de henipavirus (por ejemplo, el dominio peptídico fusogénico del virus de Hendra de 25 aminoácidos), el dominio peptídico fusogénico de metapneumovirus (por ejemplo, el dominio peptídico fusogénico del metapneumovirus Humano de 25 aminoácidos), o el dominio peptídico fusogénico de espumavirus tal como dominio peptídico fusogénico del espumavirus del simio; o fragmentos o variantes de los mismos.
A modo de ejemplo adicional, un dominio que facilita la translocación puede comprender un dominio Hcn de toxina Clostridial o un fragmento o variante del mismo. Más detalladamente, un dominio que facilita la translocación de Hcn de toxina Clostridial puede tener una longitud de al menos 200 aminoácidos, al menos 225 aminoácidos, al menos 250 aminoácidos, al menos 275 aminoácidos. A este respecto, un dominio que facilita la translocación de Hcn de toxina Clostridial tiene preferiblemente una longitud de a lo sumo 200 aminoácidos, a lo sumo 225 aminoácidos, a lo sumo 250 aminoácidos, o a lo sumo 275 aminoácidos. Algunos ejemplos (de referencia) específicos incluyen:
Neurotoxina botulínica de tipo A residuos de aminoácidos (872-1110)
Neurotoxina botulínica de tipo B residuos de aminoácidos (859-1097)
Neurotoxina botulínica de tipo C residuos de aminoácidos (867-1111)
Neurotoxina botulínica de tipo D residuos de aminoácidos (863-1098)
Neurotoxina botulínica de tipo E residuos de aminoácidos (846-1085)
Neurotoxina botulínica de tipo F residuos de aminoácidos (865-1105)
Neurotoxina botulínica de tipo G residuos de aminoácidos (864-1105)
Neurotoxina tetánica residuos de aminoácidos (880-1127)
Las posiciones de secuencia arriba mostradas pueden variar un poco de acuerdo con el serotipo/subtipo, y otros ejemplos de dominios de Hcn de toxina Clostridial (de referencia) adecuados incluyen:
Neurotoxina botulínica de tipo A - residuos de aminoácidos (874-1110)
Neurotoxina botulínica de tipo B - residuos de aminoácidos (861-1097)
Neurotoxina botulínica de tipo C - residuos de aminoácidos (869-1111)
Neurotoxina botulínica de tipo D - residuos de aminoácidos (865-1098)
Neurotoxina botulínica de tipo E - residuos de aminoácidos (848-1085)
Neurotoxina botulínica de tipo F - residuos de aminoácidos (867-1105)
Neurotoxina botulínica de tipo G - residuos de aminoácidos (866-1105)
Neurotoxina tetánica - residuos de aminoácidos (882-1127)
En la presente memoria se describe que cualquiera de los dominios facilitadores arriba descritos se puede combinar con cualquiera de los péptidos del dominio de translocación anteriormente descritos. Por lo tanto, en la presente memoria se describe a modo de ejemplo un dominio facilitador no clostridial combinado con un péptido de dominio de translocación no clostridial o con un péptido de dominio de translocación clostridial. Alternativamente, en la presente memoria se describe un dominio facilitador de translocación de Hcn de toxina Clostridial combinado con un péptido de dominio de translocación no clostridal. Alternativamente, en la presente memoria se describe un dominio facilitador de Hcn de toxina Clostridial combinado o con un péptido del dominio de translocación clostridial, cuyos ejemplos incluyen:
Neurotoxina botulínica de tipo A residuos de aminoácidos (449-1110)
Neurotoxina botulínica de tipo B residuos de aminoácidos (442-1097)
Neurotoxina botulínica de tipo C residuos de aminoácidos (450-1111)
Neurotoxina botulínica de tipo D residuos de aminoácidos (446-1098)
Neurotoxina botulínica de tipo E residuos de aminoácidos (423-1085)
Neurotoxina botulínica de tipo F residuos de aminoácidos (440-1105)
Neurotoxina botulínica de tipo G residuos de aminoácidos (447-1105)
Neurotoxina tetánica residuos de aminoácidos (458-1127)
Homología de secuencia:
Para determinar el porcentaje de identidad se puede usar cualquiera de una variedad de métodos de alineación de secuencias, incluidos, sin limitación, métodos globales, métodos locales y métodos híbridos, tales como, por ejemplo, métodos de enfoque por segmentos. Los protocolos para determinar el porcentaje de identidad son procedimientos de rutina dentro del alcance de un experto en la técnica. Los métodos globales alinean las secuencias desde el principio hasta el final de la molécula y determinan la mejor alineación sumando puntuaciones de pares de residuos individuales e imponiendo penalizaciones por huecos. Los métodos no limitativos incluyen, por ejemplo, CLUSTAL W, véase, por ejemplo, Julie D. Thompson et al., CLUSTAL W: Improving the Sensitivity of Progressive Múltiple SECuence Alignment Through SECuence Weighting, Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice, 22(22) Nucleic Acids Research 4673-4680 (1994); y refinamiento iterativo, véase, por ejemplo, Osamu Gotoh, Significant Improvement in Accuracy of Múltiple Protein. SECuence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Structural Alignments, 264(4) J. MoI. BíoI. 823-838 (1996). Los métodos locales alinean secuencias Identificando uno o más motivos conservados compartidos por todas las secuencias de entrada. Los métodos no limitativos incluyen, por ejemplo, Match-box, véase, por ejemplo, Eric Depiereux y Ernest Feytmans, Match-Box: A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein SECuences, 8(5) CABIOS 501 -509 (1992); muestreo de Gibbs, véase, por ejemplo, C. E. Lawrence et al., Detecting Subtle SECuence Signáis: A Gibbs Sampling Strategy for Múltiple Alignment, 262(5131) Science 208-214 (1993); Alineación-M, véase, por ejemplo, Ivo Van Walle et al., Align-M - A New Algorithm for Múltiple Alignment of Highly Divergent SECuences, 20(9) Bioinformatics: 1428-1435 (2004). Por lo tanto, el porcentaje de identidad de secuencia se determina por métodos convencionales. Véase, por ejemplo, Altschúl et al., BuII. Math. BIo.48: 603-16, 1986 y Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. ScI. EE. UU. 89: 10915-19, 1992. En resumen, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar las puntuaciones de alineación utilizando úna penalización por abertura de hueco de 10, úna penalización por prolongación de hueco de 1 y la matriz de puntuación "blosum 62" de Henikoff y Henikoff (ibid.), tal como se muestra a continuación (los aminoácidos se indican mediante los códigos estándar de úna letra).
Puntuaciones de alineación para determinar la identidad de secuencia
A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V
A 4
R-1 5
N-2 0 6
D-2-2 1 6
C 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -35
E -1 0 0 2-4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4-3 2 4
K -1 2 0 -1 -31 1-2-1 -3 -2 5
M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2-1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3-3-1 0 0-3 0 6
P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0-1 0 0 0-1 -2-2 0-1 -2-1 4
y 0 -1 0 - 1-1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 - 2 - 115
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1-4-3-211
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3-3 3 1 -2 1 -1 -2 -20-3-1 4
El porcentaje de identidad se calcula entonces como:
Cantidad total de coincidencias idénticas
x 100
[longitud de la secuencia más larga más la cantidad de huecos introducidos
en la secuencia más larga para alinear las dos secuencias]
Los polipéptidos sustancialmente homólogos se caracterizan por tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferiblemente de una naturaleza menor, es decir, sustituciones conservativas de aminoácidos (véase más abajo) y otras sustituciones que no afectan significativamente al plegamiento o a la actividad del polipéptido; pequeñas deleciones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y pequeñas prolongaciones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal, un péptido enlazador pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una etiqueta de afinidad.
Sustituciones conservativas de aminoácidos
Básica: arginina
lisina
histidina
Ácida: ácido glutámico
ácido aspártico
Polar: glutamina
asparagina
Hidrófoba: leucina
isoleucina
valina
Aromática: fenilalanina
triptófano
tirosina
Pequeña: glicina
alanina
serina
treonina
metionina
Además de los 20 aminoácidos estándar, algunos aminoácidos no estándar (como 4-hidroxiprolina, 6-A/-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina y a-metil serina) se pueden sustituir por residuos de aminoácidos de los polipéptidos. Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, y aminoácidos antinaturales, se puede sustituir por residuos de aminoácidos de polipéptidos clostridiales. Los polipéptidos también pueden comprender residuos de aminoácidos no naturales.
Los aminoácidos no naturales incluyen, sin limitación, trans-3-metilprolina, 2,4-metano-prolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metil-treonina, hidroxi-etilcisteína, hidroxietilhomo-cisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. En la técnica se conocen diversos métodos para incorporar residuos de aminoácidos no naturales en proteínas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro en el que se suprimen mutaciones sin sentido utilizando ARNt supresores aminoacilados químicamente. Los métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt son conocidos en la técnica. La transcripción y traducción de plásmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas disponibles comercialmente y otros reactivos. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véase, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993; y Chung et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE. UU. 90: 10145-9, 1993). En un segundo método, la traducción se lleva a cabo en ovocitos de Xenopus mediante microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores aminoacilados químicamente (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). Dentro de un tercer método se cultivan células de E. coli en ausencia de un aminoácido natural que deba ser reemplazado (por ejemplo fenilalanina) y en presencia del aminoácido o Ios aminoácidos no naturales deseados (por ejemplo 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural se incorpora al polipéptido en lugar de su equivalente natural. Véase Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994. Los residuos de aminoácidos naturales se pueden convertir en especies no naturales mediante modificación química in vitro. La modificación química se puede combinar con la mutagénesis dirigida al sitio para ampliar aún más el rango de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sc¡.2: 395-403, 1993).
Un número limitado de aminoácidos no conservativos, aminoácidos que no están codificados por el código genético, aminoácidos no naturales y aminoácidos antinaturales se puede sustituir por residuos de aminoácidos de polipéptidos descritos en la presente memoria.
Los aminoácidos esenciales en los polipéptidos se pueden identificar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de barrido con alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Los sitios de interacción biológica también se pueden determinar mediante el análisis físico de la estructura, según lo determinado por técnicas tales como resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcado por fotoafinidad, Junto con la mutación de los aminoácidos del sitio de contacto supuesto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992; Smith et al., J. MoI. B¡oI.224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Las identidades de Ios aminoácidos esenciales también se pueden deducir a partir de análisis de homologías con componentes relacionados (por ejemplo, Ios componentes de translocación o de proteasa) de Ios polipéptidos.
Se pueden realizar y probar múltiples sustituciones de aminoácidos utilizando métodos conocidos de mutagénesis y rastreo, como Ios descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Nati. Acad. Sc¡. EE. UU. 86: 2152-6, 1989). En resumen, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando el polipéptido funcional y secuenciando después Ios polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. otros métodos que se pueden utilizar incluyen la visualización de fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., Patente de EE. UU. n05,223,409; Huse, publicación de la OMPI WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
Se pueden realizar y probar múltiples sustituciones de aminoácidos utilizando métodos conocidos de mutagénesis y rastreo, como Ios descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241: 53-7, 1988) o Bowie y Sauer (Proc. Nati. Acad. Sc¡. EE. UU. 86: 2152-6, 1989). En resumen, estos autores describen métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando el polipéptido funcional y secuenciando después Ios polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. otros métodos que se pueden utilizar incluyen la visualización de fagos (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., Patente de EE. UU. no 5.223.409; Huse, publicación de la OMPI WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
Ahora sigue una breve descripción de las Figuras.
Figura 1 - Purificación de una proteína de fusión de LHN/C-rata GHRP
Usando la metodología descrita en el Ejemplo 3, a partir de células de E. coIÍ BL21 (DE3) se purificó una proteína de fusión de LHn/C-rGHRP. En resumen, Ios productos solubles obtenidos después de la ruptura celular se aplicaron a una columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las proteínas unidas se eluyeron con imidazol 200 mM, se trataron con Factor Xa para activar la proteína de fusión y después se volvieron a aplicar a una segunda columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se evaluaron mediante SDS-PAGE. Pista 1: Marcadores de masa molecular (kDa), pista 2: Lisado de células en bruto clarificado, pistas 3­ 5: Primer eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel (0,1 mg/ml), pistas 6-8: Primer eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel (0,01 mg/ml), pista 9: proteína digerida con Factor Xa en condiciones no reductoras, pista 10 : LHn/C-rGHRP purificada en condiciones no reductoras, pista 11 : LHn/C-rGHRP purificada en condiciones reducidas.
Figura 2 - Purificación de proteína de fusión de LHN/C-rata LEP116-122
Usando la metodología descrita en el Ejemplo 3, a partir de células de E. coIÍ BL21 (DE3) se purificó una proteína de fusión de LHN/C-Rata LEP116-122. En resumen, Ios productos solubles obtenidos después de la ruptura celular se aplicaron a una columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las proteínas unidas se eluyeron con imidazol 200 mM, se trataron con Factor Xa para activar la proteína de fusión y después se volvieron a aplicar a una segunda columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se evaluaron mediante SDS-PAGE. Pista 1: Primer eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel, Pista 2: Primer eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel, tratado con Factor Xa en condiciones no reductoras, Pista 3: Primer eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel, tratado con Factor Xa en condiciones reductoras, pistas 4-6: Segundo eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones no reductoras, pistas 7-9: Segundo eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones reductoras, pista 10: Marcadores de masa molecular (kDa).
Figura 3 - Secreción de GH a partir de MtT/S diferenciadas tratadas con varios LHn
Utilizando la metodología descrita en la sección de datos experimentales: después de la diferenciación de las células MtT/S con 10's M de corticosterona, las células se trataron durante 48 h con una de las siguientes moléculas: LHnB (100 nM), LHnC (100 nM) o LHnD (100 nM). Las células se sometieron después a un ensayo de secreción utilizando un medio de Krebs que contenía KCl 40 mM durante 10 minutos.
Figura 4 - Purificación de proteína de fusión de LHn/A-GHRH
Usando la metodología descrita en el Ejemplo 3, a partir de células de E. coIÍ BL21 (DE3) se purificó una proteína de fusión de LHn/A-GHRP. En resumen, los productos solubles obtenidos después de la ruptura celular se aplicaron a una columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las proteínas unidas se eluyeron con imidazol 200 mM, se trataron con Factor Xa para activar la proteína de fusión y después se volvieron a aplicar a una segunda columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se evaluaron mediante SDS-PAGE. Pista 1: Marcadores de masa molecular (kDa), Pista 2: Fracción soluble, Pista 3: Primer eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel, tratado con Factor Xa en condiciones no reductoras, Pista 4: Segunda carga de columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones no reductoras, Pista 5: Segundo eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones no reductoras, Pista 6: Muestra final en condiciones no reductoras, Pista 7: Muestra final en condiciones reductoras.
Figura 5 - Purificación de proteína de fusión de LHn/C-GHRH
Usando la metodología descrita en el Ejemplo 3, a partir de células de E. coIÍ BL21 (DE3) se purificó una proteína de fusión de LHn/A-GHRP. En resumen, los productos solubles obtenidos después de la ruptura celular se aplicaron a una columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las proteínas unidas se eluyeron con imidazol 200 mM, se trataron con Factor Xa para activar la proteína de fusión y después se volvieron a aplicar a una segunda columna de captura por afinidad cargada con níquel. Las muestras del procedimiento de purificación se evaluaron mediante SDS-PAGE. Pista 1: Marcadores de masa molecular (kDa), Pista 2: Fracción soluble, Pista 3: Primer eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel, tratado con Factor Xa en condiciones no reductoras, Pista 4: Segunda carga de columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones no reductoras, Pista 5: Segundo eluyente de columna de Sefarosa quelante de níquel en condiciones no reductoras, Pista 6: Muestra final en condiciones no reductoras, Pista 7: Muestra final en condiciones reductoras.
Figura 6 - Producto final de LHn/A-GHRH y LHn/C-GHRH
Usando la metodología descrita en el Ejemplo 3, a partir de células de E. coIÍ BL21 (DE3) se purificaron proteínas de fusión de LHn/A-GHRH y LHn/C-GHRH. Las muestras del procedimiento de purificación se evaluaron mediante SDS-PAGE. Pista 1: Marcadores de masa molecular (kDa), Pista 2: Muestra final (LHn/A-GHRH) en condiciones no reductoras, Pista 3: Muestra final (LHn/A-GHRH) en condiciones reductoras, Pista 4: Muestra final (LHn/C-GHRH) en condiciones no reductoras, Pista 5: Muestra final (LHn/C-GHRH) en condiciones reductoras.
Figura 7 - Actividad de CP-GHRH-LHD en niveles de IGF-1 de rata in vivo
La Figura 7 muestra los efectos de la administración intravenosa de CP-GHRH-LHD (SXN101000) en los niveles de IGF-1 de rata 5 días después del tratamiento en comparación con un control solo con vehículo.
Figura 8 - Actividad de CP-GHRH-LHD en niveles de IGF-1 de rata in vivo
La Figura 8 muestra los efectos de la administración intravenosa de CP-GHRH-LHD (SXN101000) en los niveles de IGF-1 de rata 5 el día 1 hasta 8 días después del tratamiento en comparación con un control solo con vehículo. Debido al bloqueo de la cánula en los días 9 y 10, hay un número n demasiado pequeño para ser considerado. Figura 9 - Actividad de CP-GHRH-LHD en niveles de GH de rata in vivo
La Figura 9b muestra los efectos de la administración intravenosa de CP-GHRH-LHD (SXN101000) en los niveles de GH de rata 5 días después del tratamiento en comparación con un control solo con vehículo (Figura 9a) y con infusión de Octreotida (Figura 9c).
Ejemplos
Ejemplo 1 - Preparación de una construcción de esqueleto de LHn/C
Ejemplo 2 - Construcción de LHn/C-GHRP humano
Ejemplo 3 - Expresión y purificación de una fusión de LHn/C-GHRP humano
Ejemplo 4 - Construcción de una proteína de fusión de LHn/D-CP-qGHRH29
Ejemplo 5 - Expresión y purificación de una proteína de fusión de LHn/D-CP-qGHRH29
Ejemplo 6 - Conjugación química de LHn/TM A a SST
Ejemplo 7 - Método para tratar el cáncer colorrectal
Ejemplo 8 - Método para tratar el cáncer de mama
Ejemplo 9 - Método para tratar el cáncer de próstata
Ejemplo 10 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células pequeñas
Ejemplo 11 - Método para tratar el cáncer colorrectal
Ejemplo 12 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células pequeñas
Ejemplo 13 - Método para tratar el cáncer de próstata
Ejemplo 14 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células pequeñas
Ejemplo 15 - Método para tratar el cáncer de mama
Ejemplo 16 - Método para tratar el cáncer colorrectal
Ejemplo 17 - Método para tratar el cáncer de próstata
Ejemplo 18 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células pequeñas
Ejemplo 19 - Método para tratar el cáncer colorrectal
Ejemplo 20 - Método para tratar el cáncer de mama
Ejemplo 21 - Método para tratar el cáncer colorrectal
Ejemplo 22 - Método para tratar el cáncer de próstata
Ejemplo 23 - Método para tratar el cáncer de mama
Ejemplo 24 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células pequeñas
Ejemplo 25 - Método para tratar el cáncer colorrectal
Ejemplo 26 - Método para tratar el cáncer de próstata
Ejemplo 27 - Método para tratar el cáncer de mama
Ejemplo 28 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células pequeñas
Ejemplo 29 - Unión, secreción y ensayo in vivo
Ejemplo 30 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas
Ejemplo 31 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas
Ejemplo 32 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células no pequeñas
Ejemplo 33 - Método para tratar el cáncer de mama
Ejemplo 34 - Método para tratar el cáncer de pulmón de células pequeñas
Ejemplo 35 - Método para tratar el cáncer colorrectal
Ejemplo 36 - Método para tratar el cáncer de próstata
Ejemplo 37 - Actividad de CP-GHRH-LHD en niveles de IGF-1 de rata in vivo
Ejemplo 38 - Actividad de CP-GHRH-LHD en niveles de IGF-1 de rata in vivo
Ejemplo 39 - Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de la hormona del crecimiento de rata in vivo
s e c id n o
Cuando se indica un residuo de aminoácido Met inicial o un codón inicial correspondiente en cualquiera de las siguientes SEC ID No, dicho residuo/codón es opcional.
SEC ID1 Secuencia de ADN de LHn/A
SEC ID2 Secuencia de ADN de LHn/B
SEC ID3 S e c u e n c ia d e A D N d e L H n/C
SEC ID4 Secuencia de ADN de LHn/D
SEC ID5 Secuencia de ADN de IgA-HNtet
SEC ID6 Secuencia de ADN del enlazador GHRP humano
SEC ID7 Secuencia de ADN de la fusión de GHRP-C humano
SEC ID8 Secuencia de proteína de la fusión de GHRP-C humano
SEC ID9 Secuencia de proteína de la fusión de GHRH-D humano
SEC ID10 Secuencia de proteína de la fusión de EGF-D humano
SEC ID11 Secuencia de proteína de la fusión de NGF-D GS35 humano
SEC ID12 Secuencia de proteína de la fusión de LEP116-122-D humano
SEC ID13 Secuencia de proteína de la fusión de VIP-D humano
SEC ID14 Secuencia de proteína de la fusión de LEP116-122-C humano
SEC ID15 Secuencia de proteína de la fusión de IGF1-C humano
SEC ID16 Secuencia de proteína de la fusión de SST14-C GS35 humano
SEC ID17 Secuencia de proteína de la fusión de GHRP-D humano
SEC ID18 Secuencia de proteína de la fusión de IGF1-D humano
SEC ID19 Secuencia de proteína de la fusión de NGF-C humano
SEC ID20 Secuencia de proteína de la fusión de SST14-D GS20 humano
SEC ID21 Secuencia de proteína de la fusión de VIP-C humano
SEC ID22 Secuencia de proteína de
Figure imgf000033_0001
la fusión de ghrelina-A humana
SEC ID23 Secuencia de proteína de
Figure imgf000033_0002
la fusión de CP-hGHRH29 N8A K12N M27L-LHD SEC ID24 Secuencia de proteína de
Figure imgf000033_0003
la fusión de hGHRH29 N8A M27L-LHD N-terminal SEC ID25 Secuencia de proteína de
Figure imgf000033_0004
la fusión de lgA-HNtet-SST14
SEC ID26 Secuencia de proteínas de la fusión de IgA-HNtet-GHRP
SEC ID27 Secuencia de proteína de la fusión de ghrelina S3W-A humana
SEC ID28 Secuencia de proteína de la fusión de SST28-D
SEC ID29 Secuencia de proteína de la fusión de GRP-D
SEC ID30 Secuencia de proteína de la fusión de GRP-B
SEC ID31 Secuencia de ADN del enlazador CP-qGHRH29
SEC ID32 Secuencia de ADN de la fusión de CP-qGHRH29-D
SEC ID33 Secuencia de proteína de la fusión de CP-qGHRH29-D
SEC ID34 Secuencia de proteína de la fusión de CP-qGHRH-A
SEC ID35 Secuencia de proteína de la fusión de CP-qGHRH-C
SEC ID36 Secuencia de proteína de la fusión de CP-qGHRH-D
SEC ID37 Secuencia de proteína de la fusión de CP-qGHRH-D N10-PL5
SEC ID38 Secuencia de proteína de la fusión de CP-qGHRH-D N10-HX12
SEC ID39 S e c u e n c ia d e p ro te ín a d e la fu s ió n d e C P -S S T 28 -D
SEC ID40 Secuencia de proteína de la fusión de CP-SST14-D
SEC ID41 Secuencia de proteína de la fusión de lgA-CP-SST14-HNtet
SEC ID42 Secuencia de proteína de la fusión de CP-UTS-A
SEC ID43 Secuencia de proteína de la fusión de CP-hTGF-B GS10-NS
SEC ID44 Secuencia de proteína de la fusión de CP-hTGF-B GS10-GS20
SEC ID45 Secuencia de proteína de LHn/A
SEC ID46 Secuencia de proteína de LHn/B
SEC ID47 Secuencia de proteína de LHn/C
SEC ID48 Secuencia de proteína de LHn/D
SEC ID49 Secuencia de proteína de IgA-HNtet
SEC ID50 Péptido de Octreotida sintetizado
SEC ID51 Péptido agonista de GHRH sintetizado
SEC ID52 Péptido antagonista de GHRH sintetizado
SEC ID53 Secuencia de proteína de la fusión de CP-MCH-D
SEC ID54 Secuencia de proteína de la fusión de KISS-D
SEC ID55 Secuencia de proteína de la fusión de PrRP-A
SEC ID56 Secuencia de proteína de fusión de CP-CRH-C
SEC ID57 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_1-27-LHD
SEC ID58 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_1-28-LHD
SEC ID59 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_1-29-LHD
SEC ID60 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_1-44-LHD
SEC ID61 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_1-40-LHD
SEC ID62 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa9-LHD
SEC ID63 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa22-LHD
SEC ID64 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_Lys11_1-29-LHD SEC ID65 Proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_Ala8_Lys11_Arg12_1-29-LHD SEC ID66 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_Ala8_Asn11_1-29-LHD SEC ID67 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_Lys20_1-29-LHD SEC ID68 Proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_Ala8_Lys11_Lys20_1-29-LHD SEC ID69 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_Asn20_1-29-LHD SEC ID70 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_Asn12_1-29-LHD SEC ID71 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_Asn21_1-29-LHD SEC ID72 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_GIu_7_1-29-LHD SEC ID73 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_GIu_10_1-29LHD SEC ID74 Proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_GIu_13_1-29-LHD
SEC ID75 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8-LHD
SEC ID76 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_GIu8_1-29-LHD SEC ID77 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa15_1-27-LHD SEC ID78 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa15-LHD
SEC ID79 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_Ala8_Ala15_1-29-LHD SEC ID80 Proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_9_15_22_27-LHD
SEC ID81 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_AIa8_9_15_22-LHD
SEC ID82 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_HVQAL_1-32-LHD
SEC ID83 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_HVSAL_1-29-LHD
SEC ID84 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_HVTAL_1-29-LHD
SEC ID85 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_QALN-LHD
SEC ID86 Secuencia de proteína de la fusión de CP-HS_GHRH_QAL-LHD
SEC ID87 Secuencia de proteína de la fusión de CP-hGHRH29 N8A M27L-LHD
Ejemplo 1 - Preparación de una construcción de esqueleto de LHn/C
El siguiente procedimiento crea un clon para su uso como un esqueleto de expresión para la expresión de fusión multidominio. Este ejemplo se basa en la preparación de un clon basado en el serotipo C (SEC ID3), aunque Ios procedimientos y métodos son igualmente aplicables a todos Ios serotipos de LHn, como el serotipo A, B y D (Se C ID 1, 2 y 4) y otras proteasas o dominios de translocación tales como IgA y Tétano Hn (SEC ID 5) utilizando la secuencia publicada apropiada para la síntesis o molde de ADN si la creación tiene lugar mediante amplificación por PCR (SEC ID5).
Preparación de vectores de donación y expresión
El pCR 4 (Invitrogen) es el vector de clonación estándar elegido debido a la falta de secuencias de restricción dentro del vector y Ios sitios de cebadores de secuenciación adyacentes para facilitar la confirmación de la construcción. El vector de expresión se basa en el vector de expresión pET (Novagen), que se ha modificado para que contenga el sitio de clonación múltiple Ndel-BamHI-Sall-Pstl-Xbal-HindlU para la inserción de la construcción, se ha eliminado un fragmento del vector de expresión para crear un plásmido no movilizable, se han insertado diversas etiquetas de fusión diferentes para aumentar las opciones de purificación, y se ha eliminado un sitio Xbal existente en el esqueleto del vector para simplificar la subclonación.
Preparación de LC/C
La secuencia de ADN se diseña mediante la traducción inversa de la secuencia de aminoácidos LC/C (obtenida de fuentes de bases de datos libremente disponibles, como GenBank (número de acceso P18640), usando una de diversas herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Las secuencias de reconocimiento BamHI/Sall se incorporan en Ios extremos 5' y 3' respectivamente de la secuencia que mantiene el marco de lectura correcto. La secuencia de ADN se rastrea (utilizando un software como SECBuilder, DNASTAR Inc.) en busca de secuencias de escisión de enzimas de restricción incorporadas durante la traducción inversa. Cualquier secuencia de escisión que se encuentre común a las requeridas por el sistema de clonación se elimina mediante la herramienta Backtranslation de la secuencia de codificación propuesta, lo que garantiza que se mantiene el uso común del codón de E. coli. El uso del codón de E. coli se evalúa con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el porcentaje de contenido de GC y la relación de uso de codón se evalúan con referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada, que contiene el marco de lectura abierto (ORF) de LC/C, se sintetiza después comercialmente (por ejemplo, mediante Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Preparación de inserción de Hn/C
La secuencia de ADN se diseña mediante la traducción inversa de la secuencia de aminoácidos Hn/C (obtenida de fuentes de bases de datos libremente disponibles, como GenBank (número de acceso P18640), usando una de diversas herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, la herramienta Back translation v2.0 (Entelechon)). Una secuencia de restricción PsTI añadida al extremo N-terminal y Xbal-codón de terminación-HindlII al extremo C-terminal asegurando que se mantenga el marco de lectura correcto. La secuencia de ADN se rastrea (utilizando un software como SECBuilder, DNASTAR Inc.) en busca de secuencias de escisión de enzimas de restricción incorporadas durante la traducción inversa. Cualquier secuencia que se encuentre común a las requeridas por el sistema de clonación se eliminan mediante la herramienta Backtranslation de la secuencia de codificación propuesta, lo que garantiza que se mantiene el uso común del codón de E. coli. El uso del codón de E. coli se evalúa con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Genearf), y el porcentaje de contenido de GC y la relación de uso de codón se evalúan con referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza después comercialmente (por ejemplo, mediante Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Preparación del espaciador (enlazador LC-Hn)
El enlazador LC-Hn se puede diseñar desde el primer principio, utilizando como plantilla la información de secuencia existente para el enlazador. Por ejemplo, el enlazador C de serotipo (en este caso definido como la región polipeptídica interdominio que existe entre las cisternas del puente disulfuro entre LC y Hn) tiene la secuencia HKAIDGRSLYn KTLD, que contiene un sitio de escisión del Factor Xa nativo. Esta información de secuencia está disponible gratuitamente en las fuentes de bases de datos disponibles, como GenBank (número de acceso P18640) o Swissprot (lugar de acceso BXC1_CLOBO). Para la generación de un sitio de escisión de proteasa específico, la secuencia de reconocimiento nativo para el Factor Xa se puede usar en la secuencia modificada VDAIDg RSLYNKTLQ, o un sitio de activación de enterocinasa se puede insertar en el bucle de activación para generar la secuencia como VDGIITSKTKSDDDDKNKALNLQ. La secuencia de ADN que codifica la región del enlazador se determina utilizando una de diversas herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, EditSEC best E. coli reverse translation (DNASTAR Inc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Las secuencias de enzimas de restricción BamHl/Sall y Pstl/Xbal/codón de terminación/Hindlll se incorporan en cada extremo, en los marcos de lectura correctos. La secuencia de ADN se rastrea (utilizando un software como MapDraw, DNASTAR lnc.) para determinar las secuencias de escisión de enzimas de restricción incorporadas durante la traducción inversa. Cualquier secuencia que se encuentre común a las requeridas por el sistema de clonación se elimina manualmente de la secuencia de codificación propuesta asegurando que se mantiene el uso común del codón de E. coli. El uso del codón de E. coli se evalúa con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el porcentaje de contenido de GC y la relación de uso de codón se evalúan con referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza después comercialmente (por ejemplo, mediante Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Ensamblaje y confirmación del clon de esqueleto
Debido al tamaño pequeño, el enlazador de activación se ha de transferir mediante un proceso de dos etapas. El vector enlazador pCR-4 se escinde con las enzimas de restricción de combinación BamHl Salí y el vector enlazador escindido sirve entonces como receptor para el ADN de LC escindido con la enzima de restricción BamHl Salí. Una vez que el ADN codificador de LC se inserta en dirección 5' desde el ADN enlazador, el fragmento de ADN enlazador de lC completo se puede aislar y transferir al vector de expresión pET MCS. El enlazador LC se recorta del vector de clonación pCR 4 utilizando los digeridos de enzimas de restricción BamHl/PstI. El vector de expresión pET se digiere con las mismas enzimas, pero también se trata con fosfatasa antártica como precaución adicional para prevenir la recircularización. El enlazador LC y el esqueleto del vector pET se purifican en gel y la inserción purificada y el esqueleto del vector se ligan usando la ligasa de ADN T4. El producto se transforma con células TOPIO, que después se rastrean para determinar el enlazador LC utilizando digestión de restricción con BamHl/Pstl. Después se repite el proceso para la inserción de Hn en los sitios de restricción Pstl/Hindlll de la construcción pET-enlazador LC.
El rastreo con enzimas de restricción es suficiente para asegurar que el esqueleto final es correcto, dado que todos los componentes ya están confirmados en secuencia durante la síntesis. Sin embargo, durante la subclonación de algunos componentes en el esqueleto, donde se retiran e insertan fragmentos de tamaño similar, es necesario secuenciar una pequeña región para confirmar que la inserción es correcta.
Ejemplo 2 - Construcción de LHn/C-GHRP humano
El siguiente procedimiento crea un clon para su uso como una construcción de expresión para expresión de fusión multidominio en la que la fracción guiada (TM) se presenta C-terminal con respecto a los dominios de translocación. Este ejemplo se basa en la preparación de una fusión de GHRP-C humano (SEC lD7), aunque los procedimientos y métodos son igualmente aplicables para crear otras proteasas, translocaciones y fusiones de TM, donde la TM es C-terminal con respecto al dominio de translocación.
Preparación de inserción de espaciador-GHRP humano
Para la presentación de una secuencia de GHRP en el extremo C-terminal del dominio Hn se diseña una secuencia de ADN para flanquear las regiones de espaciador y fracción guiada (TM) que permiten la incorporación en el clon de esqueleto (SEC lD3). La secuencia de ADN se puede disponer como BamHl-Sall-Pstl-Xbal-espaciador-GHRP-codón de terminación-Hindlll (SEC lD6). La secuencia de ADN se puede diseñar utilizando una de diversas herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, EditSEC best E. coli reverse translation (DNASTAR lnc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Una vez que se ha diseñado el ADN de TM, el ADN adicional requerido para codificar el espaciador preferido se crea in silico. Es preferible asegurar que se mantiene el marco de lectura correcto para el espaciador, el Gh RP y las secuencias de restricción y que la secuencia Xbal no está precedida por las bases TC, lo que daría como resultado la metilación de DAM. La secuencia de ADN se rastrea en busca de secuencias de restricción incorporadas y cualquier secuencia adicional se elimina manualmente de la secuencia restante asegurando que se mantiene el uso común del codón de E. coIÍ. El uso del codón de E. coIÍ se evalúa con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el porcentaje de contenido de GC y la relación de uso de codón se evalúan con referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza después comercialmente (por ejemplo, mediante Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Inserción de espadador-GHRP humano en el esqueleto
Con el fin de crear una construcción LC-enlazador-HN-espaciador-GHRP (SEC ID7) utilizando la construcción de esqueleto (SEC ID3) y el vector pCR 4-espaciador-TM recién sintetizado que codifica la TM de GHRP (SEC ID6) se puede utilizar un método de una o dos etapas; por lo general, el método de dos etapas se emplea cuando el ADN de TM tiene menos de 100 pares de bases. Usando el método de una sola etapa, el GHRp se puede insertar directamente en la construcción de esqueleto cortando el vector pCR 4-espaciador-TM con enzimas de restricción Xbal y Hindlll e insertando el fragmento de ADN que codifica la TM en una construcción del esqueleto pET cortada de modo similar. Utilizando el método de dos etapas, el dominio de LHn se escinde del clon de esqueleto empleando enzimas de restricción BamHI y Xbal y se liga en un vector pCR 4-espaciador-GHRP digerido de modo similar. Esto crea un ORF de LHN-espaciador-GHRP en pCR 4 que se puede escindir del vector utilizando enzimas de restricción BamHI y Hindlll para ligarlo después en la construcción de expresión pET escindida de modo similar. La construcción final contiene el ADN de LC-enlazador-HN-espaciador-GHRP (SEC ID7), que resultará en una proteína de fusión que contiene la secuencia ilustrada en la SEC ID8.
El rastreo con enzimas de restricción es suficiente para asegurar que el esqueleto final es correcto, dado que todos los componentes ya están confirmados en secuencia durante la síntesis o después de la amplificación por PCR. Sin embargo, durante la subclonación de algunos componentes en el esqueleto, donde se retiran e insertan fragmentos de tamaño similar, es necesario secuenciar una pequeña región para confirmar que la inserción es correcta.
Ejemplo 3 - Expresión y purificación de una fusión de LHn/C-GHRP humano
Este ejemplo se basa en la preparación de una fusión de GHRP humano-C que contiene la secuencia mostrada en la SEC ID8, donde el ORF de vector de expresión de pET también codifica una etiqueta de purificación de histidina. Estos procedimientos y métodos son igualmente aplicables a cualquier proteína de fusión presentada en el extremo C-terminal de la presente descripción. Cuando sea apropiado, la enzima de activación se debe seleccionar de modo que sea compatible con el sitio de activación de la proteasa dentro de cada secuencia.
Expresión de la proteína de fusión de LHn/C-GHRP
La expresión de la proteína de fusión de LHn/C-GHRP se logra mediante el siguiente protocolo. Inocular 100 ml de TB modificada que contiene un 0,2% de glucosamina y 30 |ig/ml de kanamicina en un matraz de 250 ml con una sola colonia de la cepa de expresión LHn/C-GHRP. Cultivar el cultivo a 370C, 225 rpm, durante 16 horas. Inocular 1 litro de TB modificada que contiene un 0,2% de glucosamina y 30 |ig/ml de kanamicina en un matraz de 2 litros con 10 ml de cultivo a lo largo de la noche. Cultivar los cultivos a 37 oc hasta alcanzar una DOaoonm aproximada de 0,5, momento en el que la temperatura se reduce a 16 oc. Una hora después, inducir los cultivos con IPTG 1 mM y cultivar a 16 oc durante otras 16 horas.
Purificación de la proteína de fusión de LHn/C-GHRP
Descongelar un tubo de tipo falcon que contiene 35 ml de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCI 200 mM y aproximadamente 10 g de pasta celular de E. coli BL2l (DE3). Someter la pasta celular a sonicación en hielo durante 30 segundos de actividad, 30 segundos de inactividad durante 10 ciclos a una potencia de 22 micrones asegurando que la muestra se mantiene fría. Centrifugar las células lisadas a 18.000 rpm, 4 oc, durante 30 minutos. Cargar el sobrenadante en una columna quelante cargada con NÍSO40,1 M (20-30 ml de columna es suficiente) equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCI 200 mM. Usando un gradiente escalonado de 40 y 100 mM de imidazol, eliminar por lavado la proteína unida no específica y eluir la proteína de fusión con imidazol 200 mM. Dializar la proteína de fusión eluida contra 5 litros de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCI 200 mM a 4 oc a lo largo de la noche y medir la DO de la proteína de fusión dializada. Añadir 10 mg de Factor Xa por 1 mg de proteína de fusión e incubar a 25 oc en estático a lo largo de la noche. Cargar en una columna quelante cargada con NÍSO40,1 M (20-30 ml de columna es suficiente) equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCI 200 mM. Lavar la columna hasta la línea de base con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCI 200 mM. Usando un gradiente escalonado de imidazol 40 y 100 mM, eliminar por lavado la proteína unida no específica y eluir la proteína de fusión con imidazol 200 mM. Dializar la proteína de fusión eluida contra 5 litros de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCI 150 mM a lo largo de la noche y concentrar la fusión a aproximadamente 2 mg/ml, tomar muestras alícuotas y congelar a -20 oc. Examinar la proteína purificada utilizando análisis de DO, BCA y pureza. La Figura 1 demuestra la proteína purificada según el análisis mediante SDS-PAGE y las Figuras 2, 4, 5 y 6 demuestran otras construcciones purificadas utilizando esta metodología.
Ejemplo 4 - Construcción de una proteína de fusión de LHn/D-CP-qGHRH29
El siguiente procedimiento crea un clon para utilizarlo como una construcción de expresión para la expresión de fusión multidominio en la que la fracción guiada (TM) se presenta de manera central entre los dominios de proteasa y translocación. Este ejemplo se basa en la preparación de una fusión de CP-qGHRH29-D (SEC ID33), aunque Ios procedimientos y métodos son igualmente aplicables para crear cualquier otra fusión de CP de la presente descripción.
Preparación de la inserción del enlazador de CP-qGHRH29
Para la presentación de una secuencia qGHRH29 en el extremo N-terminal del dominio Hn, se diseña una secuencia de ADN para flanquear la TM con un sitio de proteasa de activación y regiones espadadoras que permiten la incorporación en el clon de esqueleto (SEC ID4). La secuencia de ADN se puede organizar como BamHI-SalI-espaciador-sitio de activación de proteasa-qGHRH29-espaciador-PstI-XbaI-codón de terminación-HindIII (SEC ID31). La secuencia de ADN se puede diseñar utilizando una de diversas herramientas de software de traducción inversa (por ejemplo, EditSEC best E. coli reverse translation (DNASTAR lnc.), o la herramienta Backtranslation v2.0 (Entelechon)). Una vez que se ha diseñado el ADN de TM, el ADN adicional requerido para codificar el espaciador preferido se crea in silico. Es preferible asegurar que se mantiene el marco de lectura correcto para Ios espaciadores, el sitio de activación de proteasa, el qGHRH29 y las secuencias de restricción y que la secuencia Xbal no está precedida por las bases TC, Io que daría como resultado la metilación de DAM. La secuencia de ADN se rastrea en busca de secuencias de restricción incorporadas y cualquier secuencia adicional se elimina manualmente de la secuencia restante asegurando que se mantiene el uso común del codón de E. coli. El uso del codón de E. coli se evalúa con referencia a programas de software como Graphical Codon Usage Analyser (Geneart), y el porcentaje de contenido de GC y la relación de uso de codón se evalúan con referencia a tablas de uso de codones publicadas (por ejemplo, GenBank Release 143, 13 de septiembre de 2004). Esta secuencia de ADN optimizada se sintetiza después comercialmente (por ejemplo, mediante Entelechon, Geneart o Sigma-Genosys) y se proporciona en el vector pCR 4.
Inserción del enlazador de CP-qGHRH29 en el esqueleto
Con el fin de crear una construcción LC-sitio de activación de espaciador-qGHRH29-espaciador-HN (SEC ID32) utilizando la construcción de esqueleto (SEC ID4) y el vector pCR 4-espaciador-sitio de activación-TM-espaciador recién sintetizado que codifica la TM de qGHRH29 humana (SEC ID31) se puede utilizar un método de una o dos etapas; por lo general, el método de dos etapas se emplea cuando el ADN de Tm tiene menos de 100 pares de bases. Usando el método de una sola etapa, la región de enlazador de qGHRH29 se puede insertar directamente en la construcción de esqueleto cortando el vector pCR 4-espaciador-sitio de activación-TM-espaciador con enzimas de restricción Sall y Pstl e insertando el fragmento de ADN que codifica la TM en una construcción del esqueleto pET cortada de modo similar. Utilizando el método de dos etapas, el dominio de LC se escinde del clon de esqueleto empleando enzimas de restricción BamHI y Sall y se liga en un vector pCR 4-espaciador-sitio de activación-TM-espaciador digerido de modo similar. Esto crea un ORF de LC-espaciador-sitio de activación-qGHRH29-espaciador en pCR 4 que se puede escindir del vector utilizando enzimas de restricción BamHI y HindIII para ligarlo después en la construcción de expresión pET de modo similar. La construcción final contiene el ADN de LC-espaciador-sitio de activación-qGHRH29-espaciador-HN (SEC ID32), que resultará en una proteína de fusión que contiene la secuencia ilustrada en la SEC ID33.
El rastreo con enzimas de restricción es suficiente para asegurar que el esqueleto final es correcto, dado que todos Ios componentes ya están confirmados en secuencia durante la síntesis o después de la amplificación por PCR. Sin embargo, durante la subclonación de algunos componentes en el esqueleto, donde se retiran e insertan fragmentos de tamaño similar, es necesario secuenciar una pequeña región para confirmar que la inserción es correcta.
Ejemplo 5 - Expresión/purificación de una proteína de fusión de LHn/D-CP-qGHRH29
Este ejemplo se basa en la preparación de una fusión de LHn/D-CP-qGHRH29 que contiene la secuencia mostrada en la SEC ID33, donde el o Rf del vector de expresión pET también codifica una etiqueta de purificación de histidina. Estos procedimientos y métodos son igualmente aplicables a cualquier proteína de fusión de CP de la presente descripción. Cuando sea apropiado, la enzima de activación se debe seleccionar para que sea compatible con el sitio de activación de proteasa dentro de cada secuencia.
Expresión de la proteína de fusión de LHn/D-CP-qGHRH29
La expresión de la proteína de fusión de LHn/D-CP-qGHRH29 se logra mediante el siguiente protocolo. Inocular 100 ml de TB modificada que contiene un 0,2% de glucosamina y 30 |ig/ml de kanamicina en un matraz de 250 ml con una sola colonia de la cepa de expresión LHn/D-CP-qGHRH29. Cultivar el cultivo a 37 0C, 225 rpm, durante 16 horas. Inocular 1 litro de TB modificada que contiene un 0,2% de glucosamina y 30 |ig/ml de kanamicina en un matraz de 2 litros con 10 ml de cultivo a lo largo de la noche. Cultivar Ios cultivos a 37 oc hasta alcanzar una DOaoonm aproximada de 0,5, momento en el que la temperatura se reduce a 16 oc. Una hora después, inducir Ios cultivos con IpTG 1 mM y cultivar a 16 oc durante otras 16 horas.
Purificación de la proteína de fusión de LHn/D-CP-qGHRH29
Descongelar un tubo de tipo falcon que contiene 35 ml de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCI 200 mM y aproximadamente 10 g de pasta celular de E. coli BL2l (DE3). Someter la pasta celular a sonicación en hielo durante 30 segundos de actividad, 30 segundos de inactividad durante 10 ciclos a una potencia de 22 micrones asegurando que la muestra se mantiene fría. Centrifugar las células lisadas a 18.000 rpm, 4 oc, durante 30 minutos. Cargar el sobrenadante en una columna quelante cargada con NÍS040,1 M (20-30 mi de columna es suficiente) equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCi 200 mM. Usando un gradiente escalonado de 40 y 100 mM de imidazol, eliminar por lavado la proteína unida no específica y eluir la proteína de fusión con imidazol 200 mM. Dializar la proteína de fusión eluida contra 5 litros de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCi 200 mM a 40C a lo largo de la noche y medir la DO de la proteína de fusión dializada. Añadir 3,2 |il de enteroquinasa (New England Biolabs) por mg de proteína de fusión e incubar a 25 oc en estático a lo largo de la noche. Cargar en una columna quelante cargada con NiS04 0,1 M (20-30 mi de columna es suficiente) equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCi 200 mM. Lavar la columna hasta la línea de base con HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCi 200 mM. Usando un gradiente escalonado de imidazol 40 y 100 mM, eliminar por lavado la proteína unida no específica y eluir la proteína de fusión con imidazol 200 mM. Dializar la proteína de fusión eluida contra 5 litros de HEPES 50 mM, pH 7,2, NaCi 150 mM a lo largo de la noche y concentrar la fusión a aproximadamente 2 mg/ml, tomar muestras alícuotas y congelar a -20 oc. Examinar la proteína purificada utilizando análisis de DO, BCA y pureza.
Ejemplo 6 - Conjugación química de LHn/TM A a SST
El siguiente procedimiento crea una molécula químicamente conjugada que contiene la secuencia de aminoácidos LHn/A (SEC ID45), preparada a partir de SEC iD l utilizando el método de producción descrito en el ejemplo 3, y un péptido de Octreotida SST que se ha sintetizado químicamente (SEC ID50). Sin embargo, los procedimientos y métodos son igualmente aplicables para la preparación por conjugación de cualquier polipéptido de la presente descripción, por ejemplo la conjugación de TM tales como SEC ID51 o SEC ID52 con un esqueleto de fusión de proteasa/translocación tal como aquellos que comprenden las secuencias de aminoácidos SEC ID45-49.
La proteína de LHn/A se intercambió con el tampón de Hepes 50 mM, sal 150 mM en PBSE (14,2 g de NA2HP04 100 mM, 5,85 g de NaCi 100 mM, EDTANa2 1 mM, pH 7,5, con HCl 1 M) usando la columna Bio-rad PD10. Esto se llevó a cabo lavando un volumen de columna de PBSE a través de la columna PD10, luego se añadió la proteína a la columna hasta que no salieron más gotas por el extremo de la columna PD10. Luego se añadieron 8 mi de PBSE y se recogieron fracciones de 0,5 mi. Las fracciones recogidas se miden utilizando la lectura de A280 y se combinan las fracciones que contienen proteínas. A partir de la etapa de intercambio de tampón se obtuvo una concentración de 1,55 mg/ml de LHn/A, que se usó para establecer las siguientes reacciones:
Figure imgf000039_0001
Se dejó que la muestra diera vueltas a temperatura ambiente durante 3 horas antes de pasar por otra columna PD10 para un intercambio de tampón en PBSE y las fracciones que contenían la proteína se agruparon. Luego se añadió una concentración final de DTT 25 Mm a la proteína derivada y las muestras se dejaron después a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación se tomaron lecturas A280 y A343 para calcular la relación de interacción SPDP:LHn/A y la reacción que dio lugar a una porción de derivación de entre 1 y 3 se usó para la conjugación peptídica. El reactivo SpDP se une a las aminas primarias de la LHn/A a través de un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), dejando la porción reactiva con sulfhidrilo para formar un enlace disulfuro con el grupo SH libre en la cisteína libre en el péptido sintetizado. En este caso, la secuencia peptídica es Octreotida que se ha sintetizado con una cisteína libre en el extremo N-terminal (SEC ID83). La LHn/A derivatizada con SPDP se mezcló con un exceso en un factor 4 del ligando de Octreotida y la reacción se dejó a temperatura ambiente durante 90 minutos mientras daba vueltas. Después se eliminó la octreotida en exceso utilizando una columna PD10 que dejaba la molécula conjugada de LHn/A-Octreotida.
Ejemplo 7 - Método de uso en el tratamiento del cáncer colorrectal
Un hombre de 59 años con diagnóstico de cáncer colorrectal en estadio II se trata con la quimioterapia habitual. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de un polipéptido de TM de péptido de GHRH para utilizarlo en la invención (por ejemplo, SEC ID 9, 23-24, 33-38, 57-87). En este caso, el polipéptido comprende un esqueleto de fusión proteasa-translocación de la invención (por ejemplo, BoNT/D proteasa y dominio de translocación) conjugado químicamente con un péptido de GHRH. En un plazo de 2 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar, y 4 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembrionario (ACE) ha vuelto a la normalidad.
Ejemplo 8 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de mama (no forma parte de la Invención)
Una mujer de 52 años con diagnóstico de cáncer de mama en estadio II se trata con la quimioterapia habitual. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de ghrelina de la descripción (por ejemplo, SEC ID 8, 17, 22, 26-37). En un plazo de 4 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 6 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (IRM, ecografía, tomografía por emisión de positrones específica de la mama, mamografía, gammagrafía, etc.).
Ejemplo 9 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de próstata
Un hombre de 71 años con diagnóstico de cáncer de próstata en estadio II se trata con terapia hormonal. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección intravenosa de una proteína de fusión de TM de péptido de GHRH para uso en la invención (por ejemplo, SEC ID 9, 23-24, 33-38, 57-87). En un plazo de 3 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 7 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, exploración ProstaScint, IRM, ecografía endorrectal, tomografía computarizada, etc.) y los niveles de PSA han vuelto a la normalidad.
Ejemplo 10 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (no forma parte de la invención)
Una mujer de 62 años con diagnóstico de cáncer de pulmón de células pequeñas en estadio II se trata con la quimioterapia habitual. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de IGF-1 de la descripción (por ejemplo, SEC ID 15, 18). En un plazo de 4 semanas se observa una disminución significativa del tamaño del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 4 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, tomografía computarizada, broncoscopia, etc.) o utilizando los análisis de sangre usuales recomendados para este tipo de cáncer.
Ejemplo 11 - Método de uso en el tratamiento del cáncer colorrectal (no forma parte de la invención)
Un hombre de 53 años con diagnóstico de cáncer colorrectal en estadio II se trata con la quimioterapia habitual. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de CST o Ss T de la descripción (por ejemplo, SEC ID 16, 20, 25, 28, 39-41). En un plazo de 2 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar, y 4 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembrionario (ACE) ha vuelto a la normalidad.
Ejemplo 12 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (no forma parte de la invención)
Un hombre de 59 años con diagnóstico de cáncer de pulmón de células pequeñas en estadio I se trata con la quimioterapia habitual. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de urotensina de la descripción (por ejemplo, SEC ID 42). En un plazo de 3 semanas se observa una disminución significativa del tamaño del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 5 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, tomografía computarizada, IRM, tomografía por emisión de positrones, imágenes de radionucleidos, broncoscopia, etc.) o utilizando los análisis de sangre usuales recomendados para este tipo de cáncer.
Ejemplo 13 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de próstata (no forma parte de la invención)
Un hombre de 66 años con diagnóstico de cáncer de próstata en estadio IIc se trata con tratamiento de privación de andrógenos. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección intravenosa de una proteína de fusión de TM de CST o SST de la descripción (por ejemplo, SEC ID 16, 20, 25, 28, 39-41). En un plazo de 10 días se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 2 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 5 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, exploración ProstaScint, IRM, ecografía endorrectal, tomografía computarizada, etc.) y los niveles de PSA han vuelto a la normalidad.
Ejemplo 14 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (no forma parte de la invención)
Una mujer de 60 años con diagnóstico de cáncer de pulmón de células pequeñas en un estadio limitado se trata con cirugía. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de leptina de la descripción (por ejemplo, SEC ID 12, 14). En un plazo de 6 semanas no se observa reaparición del tumor, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 8 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, tomografía computarizada, IRM, tomografía por emisión de positrones, imágenes de radionucleidos, broncoscopia, etc.) o utilizando los análisis de sangre usuales recomendados para este tipo de cáncer.
Ejemplo 15 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de mama (no forma parte de la invención)
Una mujer de 62 años con diagnóstico de cáncer de mama en estadio III se trata con radiación. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido VIP de la descripción (por ejemplo, SEC ID 13, 21). En un plazo de 10 días se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 2 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 3 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (IRM, ecografía, tomografía por emisión de positrones específica de la mama, mamografía, gammagrafía, etc.).
Ejemplo 16 - Método de uso en el tratamiento del cáncer colorrectal (no forma parte de la invención)
Una mujer de 50 años con diagnóstico de cáncer colorrectal en estadio III se trata con cirugía. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de péptido de ErbB de la descripción (por ejemplo, SEC ID 10). En un plazo de 8 semanas no se observa reaparición del tumor y no hay aparición de metástasis en ningún otro lugar, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 8 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, tomografía computarizada, tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembrionario (ACE) se mantiene normal.
Ejemplo 17 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de próstata (no forma parte de la invención)
Un hombre de 67 años con diagnóstico de cáncer de próstata en estadio III se trata con radiación con haces externos y terapia hormonal. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TP de péptido de ghrelina (GHRp ) de la descripción (por ejemplo, Se C ID 8, 17, 22, 26­ 37). En un plazo de 3 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 7 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, exploración ProstaScint, IRM, ecografía endorrectal, tomografía computarizada, etc.) y los niveles de PSA han vuelto a la normalidad.
Ejemplo 18 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas
Un hombre de 65 años con diagnóstico de un cáncer de pulmón de células pequeñas en estadio extenso se trata con quimioterapia habitual y radiación para tratar las metástasis cerebrales. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir una metástasis adicional, recibe una inyección intravenosa de una proteína de fusión de TM de péptido de GHRH para uso en la invención (por ejemplo, s Ec ID 9, 23-24, 33-38, 57-87). En un plazo de 4 semanas se observa una reducción significativa del tumor y la desaparición de la metástasis sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 8 semanas después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, tomografía computarizada, IRM, tomografía por emisión de positrones, imágenes de radionucleidos, broncoscopia, etc.) o utilizando los análisis de sangre usuales recomendados para este tipo de cáncer.
Ejemplo 19 - Método de uso en el tratamiento del cáncer colorrectal (no forma parte de la invención)
Un hombre de 66 años con diagnóstico de cáncer colorrectal en estadio II se trata con cirugía. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de IGF-1 de la descripción (por ejemplo, SEC ID 15, 18). En los tres meses siguientes no se observa ninguna reaparición del tumor y no se puede detectar metástasis en otros lugares, esto está en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 6 meses después no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembrionario (ACE) se mantiene normal.
Ejemplo 20 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de mama (no forma parte de la Invención)
Una mujer de 54 años con diagnóstico de cáncer de mama en estadio Mib se trata con quimioterapia neoadyuvante. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de ErbB de la descripción (por ejemplo, SEC ID 10). En un plazo de 2 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. Después es sometida a una mastectomía radical modificada con reconstrucción. Tres meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, se realiza una nueva inyección, y 8 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (iRM, ecografía, tomografía por emisión de positrones específica de la mama, mamografía, etc.).
Ejemplo 21 - Método de uso en el tratamiento del cáncer colorrectal (no forma parte de la invención)
Una mujer de 62 años con diagnóstico de cáncer colorrectal en estadio IV (3 metástasis observadas en el hígado) se trata con quimioterapia, mediante inyección en las arterias hepáticas. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis en otros lugares, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de bombesina (GRP) de la descripción (por ejemplo, SEC ID 29-30). En un plazo de 2 semanas se observa una reducción significativa del tumor y la metástasis sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. Después se realiza cirugía para extirpar el tumor y la metástasis, al mismo tiempo. El tratamiento con la proteína de fusión se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 9 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembrionario (ACE) se mantiene normal.
Ejemplo 22 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de próstata (no forma parte de la invención)
Un hombre de 73 años con diagnóstico de cáncer de próstata en estadio III se trata con terapia hormonal. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido VIP de la descripción (por ejemplo, SEC ID 13, 21). En un plazo de 6 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 5 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, exploración ProstaScint, IRM, ecografía endorrectal, tomografía computarizada, etc.) y los niveles de PSA han vuelto a la normalidad.
Ejemplo 23 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de mama (no forma parte de la invención)
Una mujer de 48 años con diagnóstico de cáncer de mama en estadio IIIa se trata con quimioterapia neoadyuvante. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de NGF de la descripción (por ejemplo, SEC ID 11, 19). En un plazo de 8 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. Después se realiza una mastectomía radical con reconstrucción. La inyección de la proteína de fusión se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 8 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (IRM, ecografía, tomografía por emisión de positrones específica de la mama, mamografía, etc.).
Ejemplo 24 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (no forma parte de la invención)
Un hombre de 58 años con diagnóstico de cáncer de pulmón de células pequeñas en estadio limitado se trata con quimioterapia y con radioterapia. Para mejorar los efectos de los tratamientos y evitar que aparezca metástasis en otros lugares, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de PST o SST de la descripción (por ejemplo, SEC ID 16, 20, 25, 28, 39-41). En un plazo de 3 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 7 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, tomografía computarizada, IRM, tomografía por emisión de positrones, imágenes de radionucleidos, broncoscopia, etc.) o utilizando los análisis de sangre usuales recomendados para este tipo de cáncer.
Ejemplo 25 - Método de uso en el tratamiento del cáncer colorrectal
Un hombre de 75 años con diagnóstico de un tumor colorrectal en estadio II recibe una inyección intravenosa de una proteína de fusión de TM de péptido de GHRH para uso en la invención (por ejemplo, SEC ID 9, 23-24, 33-38, 57-87). En un plazo de 2 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El paciente es sometido después a cirugía para extirpar el tumor. El tratamiento se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 8 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembrionario (ACE) se mantiene normal.
Ejemplo 26 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de próstata (no forma parte de la invención)
Un hombre de 66 años con diagnóstico de cáncer de próstata en estadio II se trata con braquiterapia combinada con radiación con haces externos. Para mejorar los efectos de los tratamientos y para prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de ErbB de la descripción (por ejemplo, SEC ID i 0). En un plazo de 5 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 6 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, exploración ProstaScint, IRM, ecografía endorrectal, tomografía computarizada, etc.) y los niveles de PSA han vuelto a la normalidad.
Ejemplo 27 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de mama (no forma parte de la invención)
Una mujer de 51 años con diagnóstico de cáncer de mama en estadio II se trata con terapias adyuvantes: terapia hormonal, quimioterapia y trastuzumab. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido VIP de la descripción (por ejemplo, SEC ID 13, 21). En un plazo de 2 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 2 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 6 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (IRM, ecografía, tomografía por emisión de positrones específica de la mama, mamografía, etc.).
Ejemplo 28 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (no forma parte de la invención)
Un hombre de 56 años con diagnóstico de cáncer de pulmón de células pequeñas en un estadio extenso se trata con quimioterapia y radioterapia. Para mejorar los efectos de los tratamientos y prevenir la metástasis en otros lugares, recibe una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de ghrelina de la descripción (por ejemplo, SEC ID 8, 17, 22, 26-37). En un plazo de 3 semanas se observa una reducción significativa del tumor y una disminución en el tamaño de la metástasis sin aparición de nueva metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite dos veces después de 2 meses y 5 meses, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo. Los pacientes murieron 11 meses después, 6 meses más tarde de lo esperado con este tipo de tratamiento y este estadio de la enfermedad.
Ejemplo 29 - Unión, secreción y ensayos in vivo
Para determinar la eficacia de las fusiones de polipéptidos, hemos confirmado su capacidad para unirse a receptores apropiados, disminuir la secreción de GH in vivo e in vitro y disminuir el crecimiento del tumor in vivo. Los siguientes ensayos se ejemplifican con proteínas de fusión de GHRH.
A) Ensavo de unión:
Los cultivos primarios de células hipofisiarias se establecen a partir de ratas wistar macho de 6-8 semanas de edad. Los lóbulos neurointermedios se diseccionan y el tejido restante se corta en trozos pequeños y se transfiere a un tampón de aislamiento. Las células se cultivan después en placas de 24 pocilios durante 48 horas antes de la preparación para el ensayo.
Usando un Ensayo de Proximidad de Centelleo (SPA) radiométrico rápido y sensible se evalúa la afinidad de unión de la proteína de fusión de GHRH. A este respecto, incubamos fracciones de membrana de GHRH de rata con perlas de SPA y GHRH marcada con 125í en tampón de ensayo. Después se lleva a cabo un ensayo de desplazamiento de IC50 utilizando diversas concentraciones de 10'12 a 10'6 M de la proteína de fusión de GHRH que ha de ser examinada.
B) Ensavo de secreción:
Utilizando células MtT/S conocidas por expresar el receptor de GHRH y segregar Hormona del Crecimiento, demostramos la potencia de las construcciones de GHRH sobre la secreción de GH. Después de 48 h con corticosterona 10'8 M para inducir la diferenciación de las células MtT/S, el medio de cultivo se reemplaza por un medio de cultivo que contiene 10 nM de la proteína de fusión de GHRH (LHnD y LHnD con inactivación doble como control). Después de 48 h, las células MtT/S se someten a un ensayo de secreción usando forskolina 10 |iM, o KCl 40 mM o GHRH 10'8 M. En la Figura 3 se presenta un ejemplo de este tipo de ensayo de secreción utilizando varios LHn para determinar su eficiencia para disminuir la Hormona del Crecimiento de las células MtT/S.
C) Ensavo in vivo:
Las proteínas de fusión GHRH (Figuras 4 y 5) se examinan en un modelo de cáncer de xenoinjerto utilizando líneas celulares colorrectales: Caco 2, HT 29, SW 837 o SW 480 trasplantados en ratones atímicos desnudos (Nu/Nu) de 46 semanas de edad. Los ratones reciben una inyección de 0,5 x 107 células. El tamaño del tumor se mide con un calibrador digital dos veces por semana y los volúmenes del tumor se estiman de acuerdo con la fórmula para una elipse (dimensión corta)2 x (dimensión larga)/2. Cuando los xenoinjertos alcanzan -70, -150 o -150 mm3, los ratones se aleatorizan para recibir (PBS) o las proteínas de fusión de GHRh (la versión activa o la versión con inactivación doble) y los tumores se recogen 4 días después del comienzo del tratamiento. Los ratones reciben una inyección de BrdU 2 horas antes de sacrificarlos. La BrdU solo se incorpora en el ADN de células en división cuando están en la fase S y entonces es un marcador específico de la proliferación celular. El nivel de IGF-1 se evalúa recolectando la sangre mediante punción cardíaca bajo anestesia con isoflurano, se deja coagular durante 1 hora a temperatura ambiente y se recoge el suero después de centrifugación. El IGF-1 se analiza mediante ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El tamaño final de los tumores se mide y se compara, por grupos (tratados con proteínas de fusión: activos o no, o no tratados) y se comparan con los niveles de IGF-1 medidos.
Conclusión:
Estos datos confirman que la guía al eje GH/IGF-1 es un enfoque válido para tratar el cáncer. Al disminuir el nivel de GH/IGF-1 es posible disminuir la proliferación de los tumores dependientes de IGF-1 y, por lo tanto, podemos reducir la velocidad la progresión de estos cánceres mortales.
Ejemplo 30 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas
A un hombre no fumador de 52 años con diagnóstico de un adenocarcinoma en estadio II, cáncer de pulmón de células no pequeñas y sometido a radioterapia posterior a la extirpación quirúrgica del tumor se le administra una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de GHRH para uso en la invención (por ejemplo SEC ID 9, 23-24, 33-38, 57-87). En un plazo de 4 semanas se observa una disminución significativa en el tamaño del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. La radioterapia se suspende en este punto y el tamaño del tumor no aumenta y no se observa metástasis. El tratamiento con la proteína de fusión se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y el tamaño del tumor permanece estable sin metástasis durante los 3 meses siguientes sin que sea necesaria ninguna intervención adicional.
Ejemplo 31 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (no forma parte de la invención)
A una mujer fumadora de 60 años con diagnóstico de carcinoma indiferenciado de células grandes en estadio IV, con metástasis en el hígado y en el hueso y sometida a quimioterapia y radioterapia, se le administra una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de IGF-1 de la descripción (por ejemplo, SEC ID 15, 18). En un plazo de 4 semanas, los análisis de sangre para fosfatasa alcalina y alanina aminotransferasa indican una reducción del daño tisular dentro del hueso y el hígado, lo que indica una reducción en el cáncer metastásico. Las exploraciones óseas también revelan una reducción en la metástasis ósea. La progresión de la enfermedad se ralentiza y, a los 4 meses de supervivencia, el paciente recibe un tratamiento adicional de la proteína de fusión.
Ejemplo 32 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas
A un hombre fumador de 54 años con diagnóstico de carcinoma de células escamosas en estadio I en los bronquios del área central del tórax se le administra una inyección transfenoidal de una proteína de fusión de TM de péptido de GHRH para uso en la invención (por ejemplo SEC ID 9, 23-24, 33-38, 57-87). En un plazo de 5 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 5 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 4 meses después no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, tomografía computarizada, IRM, tomografía por emisión de positrones, imágenes de radionucleidos, broncoscopia, etc.) o utilizando los análisis de sangre usuales recomendados para este tipo de cáncer.
Ejemplo 33 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de mama (no forma parte de la invención)
Una mujer de 50 años con diagnóstico de cáncer de mama en estadio Illa se trata con quimioterapia neoadyuvante. Para mejorar los efectos del tratamiento y prevenir la metástasis, recibe una fusión de TM de péptido de unión al receptor 1 del factor de liberación de corticotropina (por ejemplo, SEC ID 56). En un plazo de 8 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de lGF-1 en sangre. Después se realiza una mastectomía radical con reconstrucción. La inyección de la proteína de fusión se repite 3 meses después, cuando el nivel de lGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo y 8 meses después ya no se observa ningún tumor con las herramientas de detección habituales (IRM, ecografía, tomografía por emisión de positrones específica de la mama, mamografía, etc.).
Ejemplo 34 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de pulmón de células pequeñas (no forma parte de la invención)
Un hombre de 60 años con diagnóstico de cáncer de pulmón de células pequeñas en estadio limitado se trata con quimioterapia y con radioterapia. Para mejorar los efectos de los tratamientos y evitar que aparezca metástasis en otros lugares, recibe una inyección transfenoidal de una fusión de TM de péptido de KiSS-10 o KiSS-54 de la descripción (por ejemplo, SEC ID 54). En un plazo de 3 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 7 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, tomografía computarizada, IRM, tomografía por emisión de positrones, imágenes de radionucleidos, broncoscopia, etc.) o utilizando los análisis de sangre usuales recomendados para este tipo de cáncer.
Ejemplo 35 - Método de uso en el tratamiento del cáncer colorrectal (no forma parte de la invención)
Un hombre de 70 años con diagnóstico de tumor colorrectal en estadio II recibe una inyección intravenosa de una fusión de TM de péptido de hormona concentradora de melanina de la descripción (por ejemplo, SEC ID 53). En un plazo de 2 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El paciente es sometido después a cirugía para extirpar el tumor. El tratamiento se repite 4 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo, y 8 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (colonoscopia, tomografía computarizada, tomografía por emisión de positrones, etc.) y el nivel de antígeno carcinoembrionario (ACE) se mantiene normal.
Ejemplo 36 - Método de uso en el tratamiento del cáncer de próstata (no forma parte de la invención)
Un hombre de 40 años con diagnóstico de cáncer de próstata en estadio II se trata con braquiterapia combinada con radiación con haces externos. Para mejorar los efectos de los tratamientos y prevenir la metástasis, recibe una inyección transfenoidal de una fusión de Tm de péptido liberador de prolactina de la descripción (por ejemplo, SEC ID 55). En un plazo de 5 semanas se observa una reducción significativa del tumor sin aparición de metástasis en otros lugares, en correlación con una disminución significativa en el nivel de IGF-1 en sangre. El tratamiento se repite 3 meses después, cuando el nivel de IGF-1 en sangre comienza a aumentar de nuevo y 6 meses después ya no es observable ningún tumor con las herramientas de detección habituales (rayos X, exploración ProstaScint, IRM, ecografía endorrectal, tomografía computarizada, etc.) y los niveles de PSA han vuelto a la normalidad.
Ejemplo 37 - Actividad de CP-GHRH-LHD en los niveles de IGF-1 de rata in vivo
Objetivos - evaluar el impacto de la administración intravenosa de la fusión CP-GHRH-LHD en los niveles de IGF-1 en ratas cinco días después del tratamiento en comparación con el control tratado solo con vehículo.
Materiales y métodos
Animales: ratas Sprague-Dawley macho adultas mantenidas en condiciones de alojamiento estándar con las luces encendidas a las 05:00 h (14 luz : 10 oscuridad), alimentos y agua disponibles ad libitum, y habituadas a las condiciones de alojamiento durante al menos 1 semana antes de la cirugía.
Cirugía: El día 1 del estudio, las ratas del estudio (200-250 g) serán anestesiadas con una combinación de Hypnorm (0,32 mg/kg de citrato de fentanilo y 10 mg/kg de fluanisona, intramuscular) y diazepam (2,6 mg/kg intraperitoneal). Se expone la vena yugular derecha y se inserta una cánula de polietileno (Portex, Reino Unido) con punta de silastic (diámetro interior 0,50 mm, diámetro exterior 0,93 mm) en el vaso hasta situarla cerca de la entrada de la aurícula derecha. Las cánulas se llenarán previamente con solución salina isotónica heparinizada (101 U/ml). El extremo libre de las cánulas se exteriorizará a través de una incisión en el cuero cabelludo y luego se pasará a través de un muelle de protección anclado al cráneo con dos tornillos de acero inoxidable y acrílico dental autopolimerizable. Después de la recuperación, los animales se alojan en jaulas individuales en la sala de toma de muestras de sangre automatizada. El extremo del muelle de protección está unido a una rótula mecánica que permite al animal la máxima libertad de movimiento. Las cánulas se enjuagan diariamente con solución salina heparinizada para mantener la permeabilidad.
Tratamiento: a las 09:00 del día 2 del estudio, las ratas recibirán una inyección intravenosa de CP-GHRH-LHD o control solo con vehículo.
Toma de muestras: el sistema automatizado de toma de muestras de sangre (ABS) se ha descrito previamente (Clark et al., 1986; Windle et al., 1997). Tres o cuatro días después de la cirugía, la cánula de la vena yugular de cada animal se conectará al sistema automatizado de toma de muestras de sangre. A las 07:00 del día 6 comenzará la toma de muestras. Las muestras de sangre se recogerán a intervalos de 10 minutos utilizando el sistema automatizado durante un período de 24 horas. Se recogerá un total de 144 muestras de sangre, cada una de las cuales no contendrá más de 38 |il de sangre total.
Resultados
Los niveles de IGF-1 se midieron utilizando un kit ELISA de IGF-1. La Figura 7 ilustra una reducción estadísticamente significativa en los niveles de IGF-1 en las ratas tratadas con fusión en comparación con el control solo con vehículo con un valor P en la prueba t = 0,0416 después de solo cinco días.
Ejemplo 38 - Actividad de CP-GHRH-LHD en Ios niveles de IGF-1 de rata in vivo
Objetivos - investigar el curso del tiempo de actividad para la fusión CP-GHRH-LHD identificando el tiempo de retraso entre la administración y el efecto inicial del compuesto en Ios niveles de IGF-1.
Materiales y métodos
Animales: ratas Sprague-Dawley macho adultas mantenidas en condiciones de alojamiento estándar con las luces encendidas a las 05:00 h (14 Iuz:10 oscuridad), alimentos y agua disponibles adlibitum, y habituadas a las condiciones de alojamiento durante al menos 1 semana antes de la cirugía.
Cirugía: El día 1 del estudio, las ratas del estudio (260-280 g) serán anestesiadas con una combinación de Hypnorm y diazepam. Después se expone la vena yugular derecha y se inserta una cánula de polietileno (Portex, Reino Unido) con punta de silastic (diámetro interior 0,50 mm, diámetro exterior 0,93 mm) en el vaso hasta situarla cerca de la entrada de la derecha. Las cánulas se llenarán previamente con solución salina isotónica heparinizada (10 Ul/ml). El extremo libre de las cánulas se exteriorizará a través de una incisión en el cuero cabelludo y luego se pasará a través de un muelle anclado al cráneo con tornillos de acero inoxidable y cemento dental. Después de la recuperación, Ios animales se alojan en jaulas individuales en la sala de ABS. El muelle se unirá a una rótula que permite al animal la máxima libertad de movimiento. Las cánulas se enjuagarán diariamente con solución salina heparinizada para mantener la permeabilidad.
Tratamiento: a las 10:00 del día 5 del estudio, las ratas recibirán una inyección intravenosa de CP-GHRH-LHD o vehículo (solución salina estéril).
Toma de muestras de sangre: Después de enjuagar las cánulas, se tomará una única muestra de sangre manual (100 |il) de cada rata a las 09:30 h. Las muestras se tomarán desde el día 5 hasta el día 18 del experimento (o hasta el bloqueo de las cánulas). El plasma de las muestras de sangre se almacenará a -20C para un análisis posterior del contenido de lGF-1 mediante un kit ELISA.
Resultados
La Figura 8 ilustra una reducción estadísticamente significativa en Ios niveles de lGF-1 en las ratas tratadas con fusión en comparación con el control del vehículo solo desde el día cuatro después del tratamiento.
Ejemplo 39 - Actividad de CP-GHRH-LHD en Ios niveles de GH de rata in vivo
Objetivos - evaluar el impacto de la administración intravenosa de la fusión de CP-GHRH-LHD en Ios niveles de hormona del crecimiento en ratas cinco días después del tratamiento en comparación con controles tratados con vehículo solo y con infusión de Octreotida.
Materiales y métodos
Animales: ratas Sprague-Dawley macho adultas mantenidas en condiciones de alojamiento estándar con las luces encendidas a las 05:00 h (14 Iuz:10 oscuridad), alimentos y agua disponibles ad libitum, y habituadas a las condiciones de alojamiento durante al menos 1 semana antes de la cirugía.
Cirugía: El día 1 del estudio, las ratas del estudio (200-250 g) serán anestesiadas con una combinación de Hypnorm (0,32 mg/kg de citrato de fentanilo y 10 mg/kg de fluanisona, intramuscular) y diazepam (2,6 mg/kg intraperitoneal). Se expone la vena yugular derecha y se inserta una cánula de polietileno (Portex, Reino Unido) con punta de silastic (diámetro interior 0,50 mm, diámetro exterior 0,93 mm) en el vaso hasta situarla cerca de la entrada de la aurícula derecha. Las cánulas se llenarán previamente con solución salina isotónica heparinizada (10 Ul/ml). El extremo libre de las cánulas se exteriorizará a través de una incisión en el cuero cabelludo y luego se pasará a través de un muelle de protección anclado al cráneo con dos tornillos de acero inoxidable y acrílico dental autopolimerizable. Después de la recuperación, Ios animales se alojan en jaulas individuales en la sala de toma de muestras de sangre automatizada. El extremo del muelle de protección está unido a una rótula mecánica que permite al animal la máxima libertad de movimiento. Las cánulas se enjuagan diariamente con solución salina heparinizada para mantener la permeabilidad.
Tratamiento: a las 09:00 del día 2 del estudio, las ratas recibirán una inyección intravenosa del compuesto activo Sintaxina o de vehículo. Seis horas después del inicio de la toma de muestras comenzará una infusión de 12 horas de somatostatina (o un análogo) (administrada a través de una de las líneas de cánula doble) y continuará durante 12 horas solamente. [Este tiempo de infusión debería ser un excelente control del ensayo de g H, ya que se debería ver la secreción de línea de base, luego la inhibición completa y después la recuperación/rebote rápido].
Toma de muestras: el sistema automatizado de toma de muestras de sangre (ABS) se ha descrito previamente (Clark et al., 1986; Windle et al., 1997). Tres o cuatro días después de la cirugía, la cánula de la vena yugular de cada animal se conectará al sistema automatizado de toma de muestras de sangre. A las 07:00 del día 6 comenzará la toma de muestras. Las muestras de sangre se recogerán a intervalos de 10 minutos utilizando el sistema automatizado durante

Claims (4)

r e iv in d ic a c io n e s
1. Un polipéptido para uso en la supresión de un cáncer mediante inhibición de la secreción de la hormona del crecimiento a partir de una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, comprendiendo dicho polipéptido:
(a) una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa,
comprendiendo la proteasa no citotóxica una endopeptidasa de neurotoxina clostridial o una proteasa contra IgA; (b) una Fracción Guiada (Targeting Moiety, TM) que se une a un Sitio de Unión en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, Sitio de Unión que puede experimentar una endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa,
consistiendo la TM en un péptido de hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH); y
(c) un dominio de translocación de neurotoxina clostridial que transloca la proteasa desde dentro del endosoma, a través de la membrana endosomal y hasta el interior del citosol de dicha célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa;
en donde el polipéptido carece del dominio de unión Hcc nativo de una neurotoxina clostridial.
2. Un polipéptido para uso según la reivindicación 1, uniéndose la TM a un receptor de hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH).
3. Un polipéptido para uso según la reivindicación 1 o 2, comprendiendo el polipéptido:
(a) una proteasa no citotóxica, proteasa que es capaz de escindir una proteína del aparato de fusión exocítica en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa,
comprendiendo la proteasa no citotóxica una endopeptidasa de neurotoxina clostridial o una proteasa contra IgA; (b) una Fracción Guiada (TM) que se une a un Sitio de Unión en una célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa, Sitio de Unión que puede experimentar una endocitosis para incorporarse en un endosoma dentro de la célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa,
consistiendo la TM en un péptido de hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH); y
(c) un dominio de translocación de neurotoxina clostridial que transloca la proteasa desde dentro del endosoma, a través de la membrana endosomal y hasta el interior del citosol de dicha célula hipofisaria normal, sana y no cancerosa;
en donde el polipéptido carece del dominio de unión Hcc nativo de una neurotoxina clostridial; y
en donde dicho polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90-92%o, o al menos un 95-97%, o al menos un 98-99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEC ID N0: 9, 23, 24, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, y 87.
4. Un polipéptido para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, seleccionándose dicho cáncer entre cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de mama y/o cáncer colorrectal.
ES09762019T 2008-06-12 2009-06-11 Proteínas de fusión para uso en el tratamiento del cáncer Active ES2732205T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB0810782.3A GB0810782D0 (en) 2008-06-12 2008-06-12 Suppression of cancers
GB0820965A GB0820965D0 (en) 2008-11-17 2008-11-17 Suppression of cancers
PCT/GB2009/050666 WO2009150470A2 (en) 2008-06-12 2009-06-11 Suppression of cancers

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2732205T3 true ES2732205T3 (es) 2019-11-21

Family

ID=41417178

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES09762019T Active ES2732205T3 (es) 2008-06-12 2009-06-11 Proteínas de fusión para uso en el tratamiento del cáncer

Country Status (13)

Country Link
US (2) US10240138B2 (es)
EP (2) EP2310029B1 (es)
JP (1) JP5799397B2 (es)
KR (1) KR101731655B1 (es)
CN (2) CN102083451A (es)
AU (1) AU2009259034B2 (es)
BR (1) BRPI0915142A8 (es)
CA (1) CA2726092A1 (es)
ES (1) ES2732205T3 (es)
HK (1) HK1246809A1 (es)
IL (1) IL209854A (es)
WO (1) WO2009150470A2 (es)
ZA (1) ZA201008425B (es)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101525754B1 (ko) 2007-03-28 2015-06-09 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 스티칭된 폴리펩티드
GB0803068D0 (en) 2008-02-20 2008-03-26 Health Prot Agency Cross-linked biological indicator
US10466245B2 (en) 2008-02-20 2019-11-05 The Secretary Of State For Health Covalently linked thermostable kinase for decontamination process validation
US8796216B2 (en) 2008-06-12 2014-08-05 Syntaxin Limited Suppression of neuroendocrine diseases
EP3590956A1 (en) * 2008-06-12 2020-01-08 Ipsen Bioinnovation Limited Suppression of neuroendocrine diseases
GB0820970D0 (en) 2008-11-17 2008-12-24 Syntaxin Ltd Suppression of cancer
AU2015268754B2 (en) * 2008-11-17 2018-01-18 Ipsen Bioinnovation Limited Suppression of cancer
GB0903006D0 (en) 2009-02-23 2009-04-08 Syntaxin Ltd Modified non-cytotoxic proteases
SI2603600T1 (sl) 2010-08-13 2019-04-30 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetični makrocikli
GB201108108D0 (en) 2011-05-16 2011-06-29 Syntaxin Ltd Therapeutic fusion proteins
KR20140100937A (ko) 2011-10-18 2014-08-18 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티도미메틱 거대고리
CN104159595A (zh) 2012-02-15 2014-11-19 爱勒让治疗公司 拟肽大环化合物
WO2013123267A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Aileron Therapeutics, Inc. Triazole-crosslinked and thioether-crosslinked peptidomimetic macrocycles
BR112015009470A2 (pt) 2012-11-01 2019-12-17 Aileron Therapeutics Inc aminoácidos dissubstituídos e seus métodos de preparação e uso
CN105518143B (zh) * 2013-03-15 2020-02-21 北京凯得尔森生物技术有限公司 融合蛋白分子和它的使用方法
US9216210B2 (en) * 2013-12-23 2015-12-22 Dublin City University Multiprotease therapeutics for chronic pain
KR20170058424A (ko) 2014-09-24 2017-05-26 에일러론 테라퓨틱스 인코포레이티드 펩티드모방 거대고리 및 이의 용도
AU2016235424A1 (en) 2015-03-20 2017-10-05 Aileron Therapeutics, Inc. Peptidomimetic macrocycles and uses thereof
MX2018012716A (es) 2016-04-19 2019-02-11 Griffon Pharmaceuticals Inc Peptidos bioactivos pegilados y usos de los mismos.
TW201814045A (zh) 2016-09-16 2018-04-16 英商艾普森生物製藥有限公司 製造雙鏈梭狀芽孢桿菌神經毒素之方法
CN109790204A (zh) 2016-09-29 2019-05-21 益普生生物制药有限公司 杂合神经毒素
EP3312290A1 (en) 2016-10-18 2018-04-25 Ipsen Biopharm Limited Cellular vamp cleavage assay
WO2019145577A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Ipsen Biopharm Limited Non-neuronal snare-cleaving botulinum neurotoxins
GB201900621D0 (en) * 2019-01-16 2019-03-06 Ipsen Biopharm Ltd Labelled polypeptides
CN114933657B (zh) * 2021-08-25 2024-02-02 上海交通大学医学院 神经生长因子突变体重组蛋白及其应用

Family Cites Families (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8057A (en) 1851-04-22 Cofkee-roasteb
US248771A (en) 1881-10-25 Lap-ring
US261885A (en) 1882-08-01 Ornamental glass and process of etching the same
US520225A (en) 1894-05-22 Skirt-protecting garment
US376555A (en) 1888-01-17 Banana-carrier
US317941A (en) 1885-05-12 Half to theodoee f
US502438A (en) 1893-08-01 Apparatus for producing cold and ice
US207759A (en) 1878-09-03 Improvement in accordions
US100571A (en) 1870-03-08 Improved stove-shelf and drier
US422A (en) 1837-10-06 Galley ob cooking-stove for ships of wab
US204171A (en) 1878-05-28 Improvement in rings for preventing hogs from rooting
US257998A (en) 1882-05-16 Harrow
US440039A (en) 1890-11-04 Cough remedy
US394727A (en) 1888-12-18 scully
US397169A (en) 1889-02-05 campbell
US173311A (en) 1876-02-08 Improvement in stone-gleaners
US282328A (en) 1883-07-31 eager
US4291022A (en) 1975-03-11 1981-09-22 Sandoz Ltd. Organic compounds
US4133782A (en) 1976-06-07 1979-01-09 The Salk Institute For Biological Studies Somatostatin analogs with dissociated biological activities
US4190575A (en) 1977-12-27 1980-02-26 American Home Products Corporation Polypeptides related to somatostatin
EP0000053B1 (en) 1977-06-08 1981-05-27 Merck & Co. Inc. Somatostatin analogs, process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US4211693A (en) 1977-09-20 1980-07-08 The Salk Institute For Biological Studies Peptides with para-substituted phenylalanine
LU78191A1 (de) 1977-09-28 1979-05-25 Ciba Geigy Ag Verfahren zur herstellung von neuen cyclopeptiden
US4190648A (en) 1979-03-13 1980-02-26 Merck & Co., Inc. Peptides having somatostatin activity
US4316890A (en) 1979-03-16 1982-02-23 Ciba-Geigy Corporation Peptides and processes for the manufacture thereof
US4328214A (en) 1979-07-04 1982-05-04 Ciba-Geigy Corporation Cyclopeptides and pharmaceutical preparations thereof and also processes for their manufacture
US4310518A (en) 1979-10-31 1982-01-12 Merck & Co., Inc. Cyclic hexapeptide somatostatin analogs
US4235886A (en) 1979-10-31 1980-11-25 Merck & Co., Inc. Cyclic hexapeptide somatostatin analogs
US4369179A (en) 1979-12-14 1983-01-18 Ciba-Geigy Corporation Acylpeptides
US4282143A (en) 1980-06-13 1981-08-04 American Home Products Corporation Octapeptides lowering growth hormone
US4360516A (en) 1981-04-13 1982-11-23 Merck & Co., Inc. Modified D-retro cyclic hexapeptide somatostatin analogs
EP0083305B1 (de) 1981-12-24 1985-07-10 Ciba-Geigy Ag Cyclische Octapeptide und pharmazeutische Präparate davon, sowie Verfahren zur Herstellung derselben und ihre Anwendung
FR2522655B1 (fr) 1982-03-05 1987-03-06 Sanofi Sa Analogues de la somatostatine possedant une liaison du type hydrazide et medicaments en contenant
US4522813A (en) 1983-10-27 1985-06-11 Merck & Co., Inc. Cyclic hexapeptide somatostatin analogs
US4659693A (en) 1984-04-30 1987-04-21 Syntex (U.S.A.) Inc. N,N'-dialkyl substituted guanidino amino acyl residue substituted GRF-analog peptides
US4684620A (en) 1984-09-04 1987-08-04 Gibson-Stephens Neuropharmaceuticals, Inc. Cyclic polypeptides having mu-receptor specificity
US4650787A (en) 1985-04-25 1987-03-17 Schally Andrew Victor Biologically active octapeptides
US4725577A (en) 1985-04-25 1988-02-16 Administrators Of The Tulane Educational Fund Biologically active lysine containing octapeptides
US4585755A (en) 1985-04-29 1986-04-29 Merck & Co., Inc. Cyclic and bridged cyclic somatostatin analogs useful as local anti-inflammatory agents
US4904642A (en) 1985-09-12 1990-02-27 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Therapeutic somatostatin analogs
US4853371A (en) 1986-06-17 1989-08-01 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Therapeutic somatostatin analogs
US4803261A (en) 1986-06-27 1989-02-07 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Method for synthesizing a peptide containing a non-peptide
HU906340D0 (en) 1986-10-13 1991-04-29 Sandoz Ag Synthesis in solid phase for producing peptonic alcohols
US4871717A (en) 1987-01-07 1989-10-03 Administrators Of The Tulane Educational Fund Peptides
US5084555A (en) 1989-08-21 1992-01-28 The Administrators Of The Tulane Educational Fund An octapeptide bombesin analog
WO1989002897A1 (en) 1987-09-24 1989-04-06 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Therapeutic peptides
EP0397779A1 (en) 1988-02-01 1990-11-22 The Upjohn Company Renin inhibiting peptides with polar end groups
DK375789A (da) 1988-08-18 1990-02-19 Syntex Inc Peptidderivater
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
HU208439B (en) 1988-10-14 1993-10-28 Univ Tulane Process for producing pharmaceutical peptides
CA2012115C (en) 1989-03-15 2001-07-03 Biomeasure, Inc. Iodinated somatostatins
WO1990012811A1 (en) 1989-04-26 1990-11-01 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Linear somatostatin analogs
DK0457888T3 (da) 1989-12-08 1996-08-12 Univ Tulane Octapeptidanaloger af somatostatin med threonin i 6-stillingen
JPH06502618A (ja) 1990-05-04 1994-03-24 ジ・アドミニストレイターズ・オブ・ザ・テュレイン・エデュケイショナル・ファンド 新規な合成ｇｒｆ類似物
HUT62604A (en) 1990-05-09 1993-05-28 Univ Tulane Process for producing peptides for treating tissue proliferation and pharmaceutical compositions comprising same
IT1240643B (it) 1990-05-11 1993-12-17 Mediolanum Farmaceutici Spa Peptidi biologicamente attivi contenenti in catena 2-alchiltriptofano
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
HU207104B (en) 1991-01-25 1993-03-01 Biosignal Kutato Fejlesztoe Kf Process for producing new somatostatin analogs inhibiting tumour growth and pharmaceutical compositions comprising such compounds
JPH05507939A (ja) 1991-04-09 1993-11-11 エフ・ホフマン―ラ　ロシユ　アーゲー 成長ホルモン放出因子の類似体
US6083915A (en) 1991-05-10 2000-07-04 Biomeasure, Inc. Method for treating liver cancer
WO1993015766A1 (en) 1992-02-10 1993-08-19 Seragen, Inc. Desensitization to specific allergens
US5240561A (en) 1992-02-10 1993-08-31 Industrial Progress, Inc. Acid-to-alkaline papermaking process
WO1994011397A1 (en) 1992-11-13 1994-05-26 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Ghrh agonists
WO1994011396A1 (en) 1992-11-13 1994-05-26 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Ghrh agonists
GB9305735D0 (en) 1993-03-19 1993-05-05 North John R Novel agent for controlling cell activity
ES2229045T3 (es) 1993-08-09 2005-04-16 Sod Conseils Rech Applic Derivados de peptidos terapeuticos.
US5550212A (en) 1993-12-17 1996-08-27 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Analogues of hGH-RH(1-29)NH2 having antagonistic activity
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
SI0737691T1 (en) 1995-03-13 1998-12-31 Biomeasure, Inc. Bombesin analogs
AU5441096A (en) 1995-04-14 1996-10-30 The Administrators Of The Tulane Eductional Fund Analogs of growth hormone-releasing factor
GB9508204D0 (en) 1995-04-21 1995-06-07 Speywood Lab Ltd A novel agent able to modify peripheral afferent function
MY147327A (en) 1995-06-29 2012-11-30 Novartis Ag Somatostatin peptides
US5942489A (en) 1996-05-03 1999-08-24 The Administrators Of The Tulane Educational Fund HGH-RH(1-29)NH2 analogues having antagonistic activity
GB9617671D0 (en) 1996-08-23 1996-10-02 Microbiological Res Authority Recombinant toxin fragments
AU3215597A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Biomeasure Incorporated Method of inhibiting fibrosis with a somatostatin agonist
SE507528C2 (sv) 1996-10-16 1998-06-15 Teknoskand Invent Ab Låsanordning
US5968903A (en) 1998-05-07 1999-10-19 Biomeasure, Incorporated Inhibition of H. pylori proliferation
WO1999058571A2 (de) 1998-05-13 1999-11-18 BioteCon Gesellschaft für Biotechnologische Entwicklung und Consulting mbH Hybridprotein zur hemmung der mastzelldegranulation und dessen verwendung
US6380265B1 (en) 1998-07-09 2002-04-30 W. R. Grace & Co.-Conn. Dispersion of fine porous inorganic oxide particles and processes for preparing same
JP4454152B2 (ja) 1998-07-22 2010-04-21 オスプレイ・ファーマシューティカルズ・ユーエスエイ・インコーポレイテッド 二次的組織損傷ならびにその他の炎症症状および疾患を治療する方法および組成物
AU770193B2 (en) 1998-07-30 2004-02-12 Ipsen Pharma S.A.S. Methods of using a somatostatin analogue
US8790897B2 (en) * 1998-08-25 2014-07-29 Syntaxin Ltd. Treatment of mucus hypersecretion
GB9818548D0 (en) 1998-08-25 1998-10-21 Microbiological Res Authority Treatment of mucas hypersecretion
US6057422A (en) 1998-11-25 2000-05-02 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Antagonistic analogs of GH-RH inhibiting IGF-I and -II
US6776990B2 (en) 1999-04-08 2004-08-17 Allergan, Inc. Methods and compositions for the treatment of pancreatitis
RU2263680C2 (ru) 1999-06-04 2005-11-10 Сосьете Де Консей Де Решерш Э Д`Аппликасьон Сьентифик Сас Агонисты рецепторов нейромедина в и соматостатина
US20080032931A1 (en) * 1999-08-25 2008-02-07 Steward Lance E Activatable clostridial toxins
US20030180289A1 (en) 1999-09-23 2003-09-25 Foster Keith Alan Inhibition of secretion from non-neuronal cells
GB9922554D0 (en) 1999-09-23 1999-11-24 Microbiological Res Authority Inhibition of secretion from non-neuronal cells
US7838008B2 (en) 1999-12-07 2010-11-23 Allergan, Inc. Methods for treating diverse cancers
US7138127B1 (en) 2000-01-19 2006-11-21 Allergan, Inc. Clostridial toxin derivatives and methods for treating pain
US7369973B2 (en) * 2000-06-29 2008-05-06 Object Reservoir, Inc. Method and system for representing reservoir systems
US6827931B1 (en) * 2000-10-20 2004-12-07 Allergan, Inc. Method for treating endocrine disorders
WO2002055152A2 (en) 2001-01-12 2002-07-18 Waratah Pharmaceuticals, Inc. Composition for inducing islet neogenesis, containing gastrin/cck receptor ligands and egf receptor ligands
EP1599213A4 (en) * 2003-02-24 2009-07-15 Ira Sanders CELL MEMBRANE TRANSLOCATION OF SNARE R GUL S INHIBITORS, ASSOCIATED COMPOSITIONS AND PATHOLOGY TREATMENT PROCESSES
TW200517400A (en) * 2003-08-05 2005-06-01 Univ Tulane Antagonistic analogs of GH-RH (2003)
GB0321344D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Health Prot Agency Re-targeted toxin conjugates
US7514088B2 (en) 2005-03-15 2009-04-07 Allergan, Inc. Multivalent Clostridial toxin derivatives and methods of their use
DE602005011458D1 (de) 2004-09-01 2009-01-15 Allergan Inc Abbaubare clostridientoxine
US8512984B2 (en) 2004-12-01 2013-08-20 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
US8603779B2 (en) 2004-12-01 2013-12-10 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
GB0426394D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
WO2006059093A2 (en) * 2004-12-01 2006-06-08 Health Protection Agency Fusion proteins
US8778634B2 (en) 2004-12-01 2014-07-15 Syntaxin, Ltd. Non-cytotoxic protein conjugates
GB0426397D0 (en) 2004-12-01 2005-01-05 Health Prot Agency Fusion proteins
JP2008532549A (ja) 2005-03-15 2008-08-21 アラーガン、インコーポレイテッド 内因性クロストリジウム毒素受容体系に対する増大した標的能力を有する修飾クロストリジウム毒素
EP1926744B2 (en) 2005-09-19 2018-10-24 Allergan, Inc. Clostridial toxin activatable clostridial toxins
WO2007106115A1 (en) 2006-03-14 2007-09-20 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with altered targeting capabilities for clostridial toxin target cells
EP1834962A1 (de) 2006-03-15 2007-09-19 Biotecon Therapeutics GmbH PEGyliertes mutiertes Clostridium botulinum Toxin
GB0610867D0 (en) 2006-06-01 2006-07-12 Syntaxin Ltd Treatment of pain
EP2038298A2 (en) * 2006-07-11 2009-03-25 Allergan, Inc. Modified clostridial toxins with enhanced translocation capabilities and altered targeting activity for clostridial toxin target cells
JP2009543558A (ja) 2006-07-11 2009-12-10 アラーガン、インコーポレイテッド 増強した転位置能力および増強したターゲティング活性を有する改変クロストリジウム毒素
US8796216B2 (en) 2008-06-12 2014-08-05 Syntaxin Limited Suppression of neuroendocrine diseases
GB0815264D0 (en) 2008-08-21 2008-09-24 Syntaxin Ltd Non-cytotoxic proteins
CA2771298A1 (en) * 2009-08-14 2011-02-17 Allergan, Inc. Methods of treating cancer using glucagon-like hormone retargeted endopeptidases
GB201108108D0 (en) 2011-05-16 2011-06-29 Syntaxin Ltd Therapeutic fusion proteins

Also Published As

Publication number Publication date
CN102083451A (zh) 2011-06-01
US10550377B2 (en) 2020-02-04
US10240138B2 (en) 2019-03-26
WO2009150470A3 (en) 2010-07-15
JP5799397B2 (ja) 2015-10-28
BRPI0915142A2 (pt) 2016-02-16
IL209854A0 (en) 2011-02-28
US20110165137A1 (en) 2011-07-07
KR101731655B1 (ko) 2017-05-11
KR20110028492A (ko) 2011-03-18
BRPI0915142A8 (pt) 2018-01-02
WO2009150470A2 (en) 2009-12-17
CA2726092A1 (en) 2009-12-17
US20140219983A1 (en) 2014-08-07
ZA201008425B (en) 2012-04-25
CN107446053A (zh) 2017-12-08
EP3473643A1 (en) 2019-04-24
EP2310029A2 (en) 2011-04-20
JP2011523859A (ja) 2011-08-25
AU2009259034A1 (en) 2009-12-17
EP2310029B1 (en) 2019-04-03
IL209854A (en) 2013-09-30
HK1246809A1 (zh) 2018-09-14
AU2009259034B2 (en) 2013-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2732205T3 (es) Proteínas de fusión para uso en el tratamiento del cáncer
US20110158973A1 (en) Suppression of cancers
JP5891258B2 (ja) 神経内分泌疾患の抑制
ES2630080T5 (es) Supresión del cáncer
US8796216B2 (en) Suppression of neuroendocrine diseases
AU2011203062A1 (en) Suppression of cancers
AU2015268754A1 (en) Suppression of cancer