KR930000054B1 - 폴리펩타이드의 제조방법. - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

폴리펩타이드의 제조방법.
본 발명은 다음 일반식(I)의 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 이의 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Figure kpo00001
상기식에서, m은 0 내지 50이고 : n은 0 내지 100이며 : R은 페놀성수소 또는 페놀 에스테르 그룹이고 : X는 동일하거나 상이한 천연
Figure kpo00002
-아미노산의 잔기이며 : Y는 Val, Ile, Thr, Leu 또는 Phe이고 : 여기서 5, 13, 15, 21, 27 및 38위치에 있는 6개의 Cys잔기는 이황화물 브리지를 통해 짝지워 결합되고, 단, H-(X) m-Y가 H-Val-Val이고, n이 0인 일반식(Ⅰ)의 폴리펩타이드는 제외한다.
항응고제는 혈전색전 형성의 치료 및 예방에 사용되고 이에 관련하여 특히 정맥부분의 혈전색전증에 대해서 주로 사용된다. 또한 항응고제는 저장혈액을 제조하는데 필요하다. 예를들어 이러한 목적에 사용되는 4-하이드록시코우마린 유도체 또는 1,4-인단디온유도체는 대체로 적절하거나 여러가지 결점이 있다(참조 : 예를들어, Mutsch ler, Arzneimittelwirkungen (Drag Actions), 4th edition, Stuttgart 1981, pages 375et seg.
따라서, 특히 인체의학에 있어서, 독성이 낮고 부작용이 거의 없으며 병원체에 대한 신진대사로 스트레스를 주지 않는 유용한 항응고제를 제조하는 것이 바람직하다.
트롬빈억제제 Ⅲ과 같은 내인성 혈장 억제제 이외에 예를들어, 대두에서 수득되는 쿠니쯔(Kunitz) 억제제와 같은 여러가지 단백질도 역시 항응고활성을 가지고 있다.이러한 억제제는 활성인자 XA의 억제에 의한 응고 캐스케이드(cascade)를 차단하나 이 억제제의 특이성은 너무 낮아서 많은 부작용이 발생하므로, 즉 혈장 칼리크레인 (Kallikrein), 플라스민(plasmin) 및 트립신을 억제하므로, 치료의 목적으로 투여되지 않는다. 아스카리스(Ascalis) 또는 카잘스 (Kazals) 억제제와 같은 디른 활성 화합물 또한 특이성이 부족하므로 어떠힌 유의성도 얻을수 없다.
히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터 수득되는 폴리펩타이드인 히루딘(The Merck Index, 9th editidn. Rahway 1976, page 618 ; Pharmazie 36[1981]No.10)은 대조적으로 특이한 트롬빈 억제활성을 나타낸다. [참조 : 예를들어 Markwardt, Blutgerinnung-shemmende wirkstoffe aus blatsaugenden Tieren(흡혈동물로부터의 항응고 활성 화합물). jena 1963]. 분리 및 정제의 방법은 지금까지 실제로 그의 사용에 영향을 미쳤다.
놀랍게도, R이 수소 또는 SO3H인 일반식(Ⅱ)의 활성이 높은 폴리펩타이드는 거머리로부터 분리될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
Figure kpo00003
천연
Figure kpo00004
-아미노산은 특히 Gly, Ala, Ser, Thr, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met, Arg, Lys, Hyl, Orm, Cit, Tyr, Phe, Trp, His, Pro 및 Hyp이다.
R은 바람직하게는 수소, SO3H 또는 PO3H2이고, Y는 바람직하게는 Thr이며, m 및 n은 각각 바람직하게는 O이다.
X 및 Z 모두 바람직하게 Ala, Ile, Val, Tyr 또는 Phy이다.
특히 적절한 염은 알칼리 금속염, 알칼리 토금속염, 생리학적으로 허용되는 아민과의 염 및 Hcl, H2SO4, 말레산 또는 아세트산과 같은 생리학적으로 허용되는 산과의 염이다.
본 발명은 또한 이러한 폴리펩타이드를 화학적으로 분해시키거나 효소적으로 분해시켜 수득할 수 있는 생물학적으로 활성있는 펩타이드 분해 산물에 관한 것이다.
더우기 본 발명은 추출법, 침전법, 막여과 및/또는 크로마토그래피 공정을 병용하여 환형동물 문의 충(蟲)으로부터 폴리펩타이드를 분리하고 필요한 경우 생성된 펩타이드를 생리학적으로 허용되는 그의 염으로 전환시킴으로써 상술한 일반식의 정제된 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
폴리펩타이드는 바람직하게는 히루디네나(Hirudinea)강에 속하는 충의 목샘, 특히 그나톱델리다(Gnathobdellida)목의 샘으로부터 수득된다. 히루도(Hirudo)속 및 헤모딥사(Haemodipsa)속이 바람직하다.
히루도속이 특히 바람직하며 이중에서 특히 히루도 메디시날리스가 바람직하다. 거머리의 목샘이외에 거머리 몸체의 앞부분 또는 전체를 사용할 수도 있다.
거머리로부터 조 추출물을 수득하는 방법이 하기 문헌에 기록되어 있다. [참조 : Emzymology, Volume5“ Hirudin as an Inhibitor of Thrombin”]. 히루딘의 정제방법도 문헌에 기술되어 있다. [참조 : Bull. Soc. Chim. Biol. 45(1963) 55].
본 발명에 따른 방법에 있어서, 침전법 및 겔침투 크로마토그래피, 또는 한외여과, 및 “반전-상”물질에 대한 고-분리 분배 크로마토그래피 및 실리카겔 또는 알루미나상에서 크로마토그래피의 혼용이 특히 유용하다. 그러나 조 추출물의 특성에 따라 바람직하게 적용될 수 있는 다른 크로마토그래피(여기서, 상술한 방법과의 혼용도 적합하다. 예를들어, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 또는 비-특이성 흡착제(특히, 수산화 인회석)상에서의 크로마토그래피를 사용할 수도 있다.
크로마토그래피 하기에 적합한 조 추출물을 수득하기 위해, 예를들어 거머리의 두부를 내동상태로 잘게 빻아 수성 완충 용액(예. 인산염 완충액)을 사용하여 추출할 수 있다. 불응성 물질은 예를들어, 간이 (Blief) 원심분리 또는 가아제를 통한 여과로써 제거하고 폴리펩타이드를 수득된 추출물로부터 제거하여 분리시킨다. 이 추출물은 변성되고 대부분의 단백질 분해요소(이는 후에 예를들어 원심분리에 의해 제거될 수 있다.)가 침전으로, 70℃ 내지 90℃로 급가열하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 펩타이드를 함유하는 단백질 분획은 예를들어 추출물을 수혼화성 유기용매에 가하는 방법으로 침전시킴으로써 추출물로부터 분리된다.
예를들어 아세톤을 추출물 용적의 수배, 바람직하게는 약 10배가량으로 사용할수 있으며, 침전은 저온, 일반적으로는 0 내지 -40℃. 바람직하게는 약 -20℃에서 수행된다.
고 분자량의 단백질은 예를들어 한회여과 또는 갤 침투 크로마토그래피에 의해 조 추출물로부터 제거될 수 있다. 더 큰 배치의 한외여과를 예를들어 두단계로 수행할수 있다. 첫 단계에서는, 배출 한계 500,000달톤의 모세관막을 사용한 다음, 두번째 단계에서는 배출 한계 10,000달톤의 판막을 사용한다. 모세관 막을 사용하여, 선택적 작용하는 판막을 통한 유출을 방해하는 고분자량의 물질을 신속히 제거한다. 이는 소량으로 첫번째 단계의 한외 여과가 불필요하게 할 수도 있다.
침전시킬 수 있는 또 다른 방법은 에를들어 황산 암모늄과 같은 염을 가하는 것이다. 침전은 PH를 조절함으로써 특정 선택성을 성취할 수 있다. 등전점이 3.9인 본 발명에 따른 펩타이드는 황산암모늄을 가하면 PH 3 내지 5 바람직하게는 약 4에서 용액에 잔류하는 다수의 부수적인 단백질의 약 50% 농도까지 침전될 수 있다. 이러한 침전은 또한 약 -5 내지 ＋15℃, 바람직하게는 0 내지 ＋40℃에서 냉각되는 동안 수행된다. 지금까지 사용된 방법을 기초로하여 수득된 물질은 폴리펩타이드 혼합물을 함유한다.
R이 H이거나 SO3H인 일반식(Ⅱ)의 억제제를 수득하는 바람직한 방법은 하나 또는 여러가지의 고-분리 크로마토그래피 시스템에 의한 조 추출물의 분별을 포함한다. 이러한 분획을 차례로 두번째로 고-분리 크로마토그래피 시스템중의 각 성분으로 분리하여 일반식(Ⅱ)의 억제제를 분리한다.
예를들어, 유럽 특허 제 A-82359호에 기술되어 있는 바와같은 방법이 이러한 억제제를 수득하기 위한 첫번째 크로마토그래피 단계로 바람직함이 판명되었다.
이 방법은 단백질 혼합물을, 완충액 시스템을 사용하여 적절한 입자크기의 통상적인 실리카겔 칼럼(예. LobarR칼럼)상에서 분리시킴을 포함한다.
샘플을 예비평형화된 칼럼형태로 칼럼에 적용시킬 수 있다. 그러나 혼합물질을 역효과 없는 건조컬럼에 적용시킬 수도 있다.
단백질과 흡착제 혼합물의 비가 1 : 50 내지 1 : 200인 것이 바람직하다.
용출은 클로로포름, 메탄올, 빙초산, 물 및 트리에틸아민으로 구성된 완충액으로 수행할 수 있다.
이러한 목적으로 예를들어 70% 에탄올 30% 트리스완충액(0.05M, PH 8.0)과 같은 다른 완충용액을 사용할 수도 있다.
마지막 정제단계는 반전-상 물질에 대한 크로마토그래피 분리를 포함한다. HPLC 기술 [참조 : 예를들어 “High Performance Liquid Chromatography-Advances and Perspectives” Volume 3, Csaba Horvath, Academic Press, 198 3. pages 50-83, 또는 “ Methods of Enzymolgoy”, Volume 91. pages 137-190 및 352-359, 1983]의 높은 분리성 때문에, 부수적인 단백질로부터 일반식(Ⅱ)의 억제제를 분리할 수 있고 이를 순수하게 제조할 수 있다.
적절한 입자크기(예 : 3 내지 20㎛)의 유도화된 실리카겔은 정지상으로 바람직하다. 광범위하게 사용되는 옥타데실실란라디칼 이외에, 저급 알킬, 페닐알킬- 또는 아미노-치환된 알킬을 가진 실란 라디칼과 같은 다른 실란라디칼 또는 이의 혼합물이 실리카겔 유도체화에 적합하며, 다른 실란라디칼 또는 이의 혼합물에는 이온 교환 및 "반전-상"크로마토그래피를 혼용할 수 있다. 예를들어, 길이 5 내지 20cm, 직경 3 내지 10mm인 분리된 칼럼을 사용할 수 있다. 적절하게 완충된 용출제는 예를들어 저급 알킬, 케톤, 니트릴, 에테르, 산, 아민, 글리콜, 에테르, 아마드 및 유도체와 같은 적절한 친유성 유기용매와 물의 모든 2급 또는 3급 혼합물이다.
유기 및 무기염 또는 다른 형태의 첨가제를 완충물질로 사용할 수 있다. 용출은 바람직하게는 PH 2 내지 8에서 수행하다.
암모늄 아세테이트 또는 중탄산암모늄과 같은 휘발성 완충물질을 사용하면, 간단히 동결 건조시킴으로써 용출물로부터 억제제를 수득할 수 있다.
본 발명에 따른 일반식(Ⅱ)의 폴리펩타이드는 무색이고 물 및 수성 완충액에 용해되며, 폴리아크릴아미드전기영동에 대해 균질하고 등전점이 3.9(등전 집중법으로 측정)이다. 아미노산 조성물을 무르 및 스타인법(the method of More and Stein : Methods of Enzymolgoy. Volume Vl. 819-831, Rolovick 및 kaplan이 발행, Acad emic Press, New York. London. 1963)으로 측정한 결과 다음과 같다 : 9 아스파르트산, 5 트레오닌, 4 세린, 13 글루탐산, 3 프롤린, 9 글리신, 2 발린, 6 시스테인, 2 이소로이신, 4 로이신, 2 티로신, 1 페닐알라닌, 3 라이신 및 1 히스티딘.
본 발명은 다음을 특징으로하여 상한 일반식(Ⅰ)의 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. a) 폴리펩타이드를 고체-상합성법으로 제조하거나, b) n이 0인 폴리펩타이드를 제조하기 위해, Ⅰ. 히루딘을 두번 에드만 분해반응시키고, Ⅱ. 수득된 펩타이드를 아미노산의 활성 에스테르 또는 식 U-(X)m-Y-OH(여기서, M, X 및 Y는 상술한 바와 같고, U는 산 또는 염기와 불안정한 우레탄 보호그룹이다)펩타이드의 활성에스테르와 반응시키고, Ⅲ. 히드라진을 사용하여 Lys의 ε-아미노 그룹상의 페닐티오카바모일그룹을 제거하고, Ⅳ. 산 또는 염기를 사용하여 우레탄 보호그룹 U를 제거하고, 필요한 경우 a) 또는 b)에서 수득된 폴리펩타이드를 생리학적으로 허용되는 이의 염으로 전환시킨다. 고체-상 합성법(참조 : Atherton, Sheppard Perspetives in Peptide chemistry, karger Basel 1981. pages 101-117)에 있어서는, 일반적으로 Thr에 대한 OH 보호그룹이 불필요할 수 있다.
일반식(Ⅰ)의 폴리펩타이드 합성은 예를들어 하이드록시메틸화된 폴리스티렌수지상에서 단계적으로 수행한다. 폴리스티렌은 수지상에서 단계적으로 수행한다. 폴리스티렌은 예를들어 1% 디비닐벤젠으로 가교 결합된다. 이는 통상적으로 구형의 구 형태이다.
아미노산은 N-말단보호되어 사용된다.
첫번째 N-보호된 아미노산은 에스테르 형성에 의해 지지체에 결합된다. 아미노보호그룹을 제거한 후 디시클로헥실카보디이미디와 같은 결합체를 사용하여 다음 N-보호된 아미노산을 결합시킨다. 목적하는 서열이 될 때가지 탈보호 및 아미노산 첨가를 계속한다.
보호그룹의 선택은 아미노산 및 결합방법에 따라 다르다.
적절한 아미노보호 그룹의 예로는 벤질옥시카보닐(Z), P-메톡시카보벤즈옥시, P-니트로카보벤즈옥시, t-부틸옥시카보닐(Boc). Fmoc 등과 같은 공지된 우레탄 보호그룹을 들 수 있다.
Boc 그룹은 비교적 약한 산(예. 트리-플루오르아세트산 또는 유기용매중의 Hcl)으로 제거될 수 있으므로 바람직하다.
트레오닌은 벤질 에테르로 차단될 수 있고 라이신의
Figure kpo00005
-아미노그룹은 또 유도체로 차단될 수 있다.이들 두보호그룹은 Boc 그룹을 제거하기 위한 시약에 대해 대체로 내성이 있으며, 이들은 수소화 촉매(pd/활성탄)를 사용하여 수소화분해시켜 제거하거나, 에를들어 액체 암모니아중의 나트륨으로 제거할 수 있다.
보호된 펩타이드는 예를들어 히드라진을 사용하여 수지로부터 제거헐 수 있다. 이렇게하면, 예를들어 참고문헌의 방법에 의해 N-브로모숙신 이미드를 사용하면 유리카복실산으로 전환될 수 있는 히드라지드가 생성된다[참조 : Int. J. Petp. Prtp. Research 17[1982] 6-11]. 필요한 경우, 이황화물 브리지를 산화시켜 끊어야 한다(참조 : konig. Geiger. Perspectives in Peptide Chemistry, Karger Basel. pages 31-44).
제조방법 b)에서, 히루딘을 피리딘/물 또는 디옥산/물과 같은 적절한 완충용액내에서, 필요한 경우 NaOH 또는 트리에틸아민과 같은 염기를 가하면서, 바람직하게는 약 40℃, pH 8 내지 9에서 이소티오-시아네이트, 바람직하게는 페닐이소티오시아네이트와 반응시키는 방법으로 두번 에드만 분해반응시킨다.
N-말단 발린을 산(예. 40℃로 가열된 다음 실온이 된 3N Hcl)으로 처리함으로써 페닐티아졸린온으로서 제거한다. N-말단의 두번째 발린이 제거되도록 이 반응과정을 반복한다.
상기의 방법으로 수득된 탈-(Val)2-히루딘 유도체를 아미노산의 활성 에스테르 또는 식 U-(x)m-Y-OH 펩타이드의 활성 에스테르와 반응시킨다. 적절한 에스테르의 예로는 p-니트로페닐, 시아노메틸, N-히드록시프탈아미도 또는, 특히, N-히드록시숙신아미도 에스테르가 있다. 적절한 우레탄 보호그룹 U는 산 또는 알칼리에 의해 제거될 수 있는 그룹(예. Boc 또는 Msc)이다. 필요한 경우, X 및 Y의 측쇄에 존재하는, 적절한 보호그룹에 의해 일시적으로 보호될 수도 있다.
이러한 방법으로 수득된 일반식(Ⅰ) (n=O) 폴리펩타이드의 보호된 전구물질을 저급 알콜 또는 이의 물과의 혼합물과 같은 적절한 용매중에서 히드라진 수화물로 처리하여 라이신상의 페닐티오카바모일 그룹을 제거한다.
이 폴리펩타이드 상에 잔류하는 보호그룹(들)을 적절한 방법(Boc는 예를들어 트리플루오로아세트산을 사용, Msc는 염기를 사용)으로 제거하여 본 발명에 따른 일반식(Ⅰ)의 폴리펩타이드를 수득한다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 트롬빈의 특이한 화학량론적 억제제이다. 본 발명의 억제제에 의한 트롬빈 억제를 정량적으로 측정한 결과 억제제-트롬빈 복합물이 실제적으로 분리되지 않는 것으로 나타났다. 마무리 처리하고 정제하는 동안 이러한 측정방법을 사용하여 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 활성 및 정제도를 측정할 수 있다. 이러한 방법으로 정제된 상술한 일반식(Ⅱ)의 폴리펩타이드는 10,000ATU/mg 이상의 트롬빈 억제활성을 나타내므로 통상적인 히루딘의 활성을 능가한다.
또한, 본 발명은 혈전색전 형성을 치료하기 위해 투여할 항응고제로서의 일반식(Ⅰ)의 폴리펩타이드(여기서, m, H, R, X, Y 및 Z는 상술한 바와 같고 또한 Y는 화학결합을 나타낼수도 있다)의 용도 및 진단 보조제 및 시약으로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 비히클중에 일반식(Ⅰ)의 폴리펩타이드를 함유시킨 제제에 관한 것이며, 이를 적절한 투여형태로 전환시킴을 특징으로 하여 제형화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 비경구적으로 또는 통상적으로는 적절한 약학제제로 투여할 수 있다.
피하 또는 정맥내로 투여하기 위해, 활성 화합물 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염을 용액, 현탁제 또는 유제로 전환시키는데, 필요한 경우, 이러한 목적으로 통상 사용되는 가용화재, 유화제, 등장화제, 방부제 또는 다른 보조제를 사용할 수 있다. 신규한 활성 화합물 및 생리학적으로 무독한 상응하는 염의 예로는 물, 생리학적 식염용액 또는 알콜(예. 에탄올, 프로판에디올 또는 글리세롤), 당용액(예. 글루코즈 또는 만니콜 용액). 또는 기술한 여러용매의 혼합물을 들 수 있다.
통상적인 비히클은 유기 또는 무기화합물일 수 있다. 조제에 사용되는 통상적인 비히클은 예를들어 완충용액 시스템, 또는 예를들어 알콜 또는 아릴알콜, 오일, 폴리알킬렌 글리콜, 에틸셀룰로즈, 카복시메틸-셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈 또는 이소프로필미리스테이트와 같이 물과 혼화되는 용매와 물의 등장 혼합물인 수용액이다. 적절한 완충물질의 예로는 붕산나트륨, 인산아트륨, 나트륨 아세테이트 또는 글루코네이트 완충액이 있다.
통상적인 투여형태는 예를들어 유화 보존제, 수화제(예. 폴리에틸렌 글리콜)와 같은 비-독성 보조제 및 항균 화합물을 함유할 수도 있다.
[실시예 1]
트롬빈 적정에 의한 억제제 농도의 측정
중탄산 나트륨 용액(pH=7, 0.5M) 200μl를 단백질 함량을 미리 결정한 억제제 용액 10 내지 100μl에 가한다. 피브리노겐 용액(0.5 내지 1%)또는 희석된 시트르산 첨가 혈장 0.1ml를 가하고 트롬빈 용액(ml 당 약 100NIH 유닛)의 분취량(50 내지 100μl)을 실온에서 교반하면서 규칙적인 간격으로 가한다. 반-정량작업에 사용될 수 있는 종말점은 선택된 시간 간격내의 액체 응고점이며, 정량 측정의 종말점은 546mm에서 비탁측정하여 결정할 수 있다.
[실시예 2]
독일에서 수거되는 히루도 메디시날리스 속의 자 생 거머리(번식시키지 않은 동물)를 사용한다. 냉동된 거머리의 앞부분 약 150 내지 200g을 3분내에 혼합기내에서 빙-냉각된 0.09% 염화나트륨 용액 2ι및 옥탄올 10ml와 함께 균질화시킨다. 0℃에서 10,000rpm으로 30분간 원심분리시킨 후 상층액 2층의 가아제를 통과시켜 여과함으로써 정화시킨 다음 교반하면서 15분내에 80℃로 가열시킨다. 생성된 침전을 4층의 가아제를 통과시켜 제거한다. 여과액을 빙욕내에서 교반하면서 4℃로 신속히 냉각시키고, 미리 냉각시킨 아세톤(-20℃) 7.5
Figure kpo00006
에 가한다. 다른 침전물이 생성되면 5분 후에 유리 여과기를 통과시켜 흡인 여과하고 냉아세톤(-20℃)1
Figure kpo00007
세척한다. 진공중에서 건조시킨 후 단백질함량 62%(Lowry method로 측정)인 연황색 분말 520mg을 수득한다.트롬빈 억제활성은 mg당 약 400유닛이다.
[실시예 3]
실시예 1로부터의 분말 520mg을 물 75ml에 용해시킨 다음 5N 암모니아를 사용하여 pH 8.0으로 조정하고 혼합물을 1시간동안 0 내지 4℃에서 교반한다. 불용성 분획을, 컵 원심분리기를 사용하여 5,000rpm에서 30분내에 원심분리한다. 물을 가하여 단백질 함량을 25mg/ml(Lowry)로 조정한 후 포화 황산암모늄용액 35ml를 용액에 가한 다음 이를 4℃에서 1시간동안 교반한다. 첫번째 침전물을 원심분리(5,000rpm/30분)로써 신속히 제거한다. 황산 암모늄 26g을 다시 용액에 용해시키고 빙초산을 사용하여 pH 4로 조정한다. 5시간 방치한 후 전체 현탁액을 원심분리시키고 생성된 습한 침전물을 하기와 같이 더 가공한다.
[실시예 4]
실시예 3에서 수득한 침전물을 pH 8의 0.1M 중탄산암모늄 용액 200ml에 용해시키고 5pm의 10개 팜막(배출한계 10,000달론)을 가진 아미콘R셀(AmicoRcell)내에서 한외여과시킨다. 그동안 용액은 약 40ml로 농축되며 pH 8.0의 물질 0.1M 중탄산암모늄용액 150ml로 최종적으로 두번 보충한다. 잔사를 냉동-건조시키면 단백질 함량 89%의 물질 약 350mg이 수득된다.
C칼럼 (Merck)을 교반하면서 (vibromixer) 실리카겔 50㎛ 100Å (Grace)으로 충진시킨다. 실싱예 4의 추출물 500mg을 0.2% 암모늄 아세테이트와 클로로포름, 메탄올, 빙초산, 물 및 트리에틸아민 혼합물(부피비 1,200 : 1,200 : 4 : 400 : 12)5ml에 용해시키고 칼럼에 적응시킨다. 칼럼을 동일한 혼합물을 사용하여 약 4ml/분의 속도로 용출하고 5내지 10ml분획을 취한다. 용출물을 건조시킨 후 억제제를 함유하는 분획을 중탄산 나트륨(pH=7.0, 0.5M)에 용해시키고 수거한다. 수율은 약 50mg이며 활성운 4000 ATU/mg이다.
[실시예 5]
실시예 3의 억제제 20mg을 pH 2.16(트리플루오르 아세트산＋5% 아세토니트릴로 조정)의 물 20μl에 용해시키고 옥타데실실란-실리카겔(5㎛)로 충진된 강철 칼럼(ShondonRODS)에 주입시킨다. 칼럼을 출발완충액(물, pH=2.16, ＋5% 아세토니트릴)과 최종완충액(아세토니릴/물, pH=2.16, 80/20)사이의 구배최대 2%/분으로 용출한다. 분획이 수거된다. 건조시키면, 본 발명에 따른 일반식(Ⅱ)의 억제제(R=M 또는 SO3H)는 트롬빈과의 1 : 1 혼합물의 화학량톤과 일치하는 특이 활성을 가진다.

Claims (4)

  1. 폴리펩타이드를 추출법, 침전법, 막 여과법 및/또는 크로마토그래피법을 혼용하여 그나톱델리다(Gnathobdellida)목의 충(蟲)으로부터 분리함을 특징으로 하여, 다음 일반식(Ⅰ)의 폴리펩타이드 및 생리학적으로 허용되는 이의 염을 정제된 형태로 수득하는 방법 :
    Figure kpo00008
    상기식에서, m은 0이고, n은 0이고, R은 수소, SO3H 또는 PO3H2그룹이고, Y는 Thr이고, 5, 13, 15, 21, 27 및 38위치에 있는 6개의 Cys 잔기는 이황화물 브리지를 통해 짝지위 결합된다.
  2. 폴리펩타이드를 추출법, 침전법, 막여과법 및/또는 크로마토그래피법을 혼용하여 그나톱델리다(Gnathobdellide)목의 층으로부터 분리하고 생성된 펩타이드를 이의 생리학적으로 무독한 염을 전환시킴을 특징으로 하여, 9아스파르트 산, 5 트레오닌, 4 세린, 13 글루탐산, 3 프롤린, 9 글리산, 2 발린, 6 시스테인, 2 이소로이산, 4 로이신, 2 티로신, 1 페닐알라닌, 3 라이신 및 1 히스티딘(여기서, 티로신 잔기중 하나의 OH 그룹은 황산으로 에스테르화될 수 있다)으로 된 아미노산 조성(Moore 및 Stein법)을 가진, 거머리로부터 수득된 폴리펩타이드를 정제된 형태로 수득하는 방법.
  3. 제 7항에 있어서, 히루도(Hirudo)속의 층으로부터 분리하는 방법
  4. 제 8항에 있어서, 히루도 속의 층으로부터 분리하는 방법.
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