DK175408B1

DK175408B1 - Isohirudiner, fremgangsmåde til deres fremstilling, pharmaceutisk middel samt fremgangsmåde til dets fremstilling

Info

Publication number: DK175408B1
Application number: DK198905226A
Authority: DK
Inventors: Paul Habermann; Joachim Engels; Dominique Tripier; Peter Crause; Martin Kramer; Matthias Scharf
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1988-10-21
Filing date: 1989-10-20
Publication date: 2004-09-27
Also published as: US5322926A; DK522689D0; DK522689A; JPH02218695A; JP2833798B2; GR3015491T3; EP0364942A2; PT92043B; EP0364942A3; DE3835815A1; ES2068870T3; ATE118789T1; DE58909027D1; PT92043A; IE67041B1; IE893399L; EP0364942B1

Description

DK 175408 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte hirudiner, som er thrombininhibitorer, og som adskiller sig fra hidtil kendte hirudiner ved mutation i proteinkæden.

Hirudiner er f.eks. bekendt fra EP offéntliggørel-5 sesskrifter nr. 142.860, 158.564, 158.986, 168.342, 171.024, 193.175, 200.655, 209.061, samt Chang, FEBS, bind 164 (1983), 307, J. Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367 (1986), 803-811, og D. Tripier, Folia Haematol. Leipzig 115 (1988), 1-2, 30-35. Disse hirudiner kan dog være bundet delvist via 10 aktive centre på bærere eller via aminosyrer, som deltager i bindingen til thrombin. Endvidere har de kendte hirudinér ringe transdermale egenskaber og er meget kortlivede på grund af høje elimineringshastigheder, således at en stationær eller ambulant t hr ombos eprophylaxe er besværliggjort.

15 Der har derfor eksisteret den opgave at finde frem til hirudiner med høj specifik aktivitet, høj stabilitet og god pharmakokinetik. Endvidere bør disse hirudiner udmærke sig ved bedre kemisk håndterbarhed ved fikseringen på bærere.

Denne opgave er ifølge opfindelsen løst ved hjælp af 20 isohirudinerne ifølge opfindelsen, der ejendommelige ved, af de har formlen (A) 1 10 A - B- Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - Gly -25 15 20 C - E- Leu - Cys - Leu - Cys - F - G - Ser - I - Val -- 25 30

Cys - Gly - J - Gly - Asn - Lys - Cys - K - Leu - Gly - 35 40 30 Ser - L - Gly - Glu - M - Asn - N - Cys - Val - Thr - Gly 45 50

Glu - Gly - Thr - Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn-55 60

Asp - Gly - Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu-35 65

Tyr(R) - Leu - Gin (A)

I DK 175408 B1 I

I 2 I

I hvori I

I A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder I

I Asn, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I

I Lys, K betyder Ile, L betyder Asp, M betyder Lys, N betyder I

I 5 Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I

I A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder I

I Asn, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I

I Asn, K betyder Ile, L betyder Asp, M betyder Lys, N betyder I

I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I

I 10 A betyder Ile, B betyder Thr, C betyder Gin, E betyder ... I

I Asn, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I

I Asn, K betyder Lys, L betyder Asp, M betyder Glu, N betyder I

I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I

I A betyder Ile, B betyder Thr, C betyder Gin, E betyder I

I 15 Asp, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I

I Lys, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Glu, N betyder I

I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I

I A betyder Ile, B betyder Thr, C betyder Gin, E betyder I

I Asp, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asp, J betyder I

I 20 Lys, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Glu, N betyder I

I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I

I A betyder Ile, B betyder Thr, C betyder Gin, E betyder I

I Asn, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I

I Lys, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Glu, N betyder I

I 25 Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I

I A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder I

I Asn, F betyder Glu, G betyder Asp, I betyder Asn, J betyder „ I

I Glu, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Lys, N betyder I

I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I

I 30 A betyder Val, B betyder Val, C betyder Glu, E betyder I

I Asp, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I

I Glu, K betyder Ile, L betyder Asp, M betyder Lys, N betyder I

I Glu, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I

I A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder I

I 35 Asn, F betyder Glu, G betyder Asp, I betyder Asn, J betyder I

I Gin, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Lys, N betyder I

3 DK 175408 B1

Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder Asn, F betyder Gin, G betyder Asp, I betyder Asn, J betyder

Gin, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Lys, N betyder 5 Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder Asn, F betyder Gin, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder

Gin, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Lys, .N betyder

Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H.

10 Især skal der nævnes følgende isohirudiner, hvor R

betyder hydrogen eller SO3H:

Val - Val - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser -

Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Gly - 15 Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Lys - Gly - Asn - Lys -

Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asp - Gly - Glu - Lys -

Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr -

Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly -

Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) -20 Leu - Gin (la)

Val - Val - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser -

Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Gly - 25 Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Asn - Gly - Asn - Lys -

Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asp - Gly - Glu - Lys -

Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr -

Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly -

Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) -30 Leu - Gin (I) I DK 175408 B1

I Ile - Thr - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - I

Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Gly - I

Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Asn - Gly - Asn - Lys - I

I Cys - Lys - Leu - Gly - Ser - Asp - Gly - Glu - Glu - I

I 5 Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr - I

I Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly - I

I Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) - I

Leu - Gin I

I (Ila)

I 10 I

Ile - Thr - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - I

I Gly - Gin - Asp - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Gly - I

I Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Lys - Gly - Asn - Lys - I

I Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Glu - I

I 15 Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr - I

I Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly - I

I Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) - I

I Leu - Gin I

I (ii) I

I 20 i

I Ile - Thr - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - I

I Gly - Gin - Asp - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Gly - I

I Ser - Asp - Val - Cys - Gly - Lys - Gly - Asn - Lys - I

I Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Glu - I

I 25 Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr - I

I Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly - I

I Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) - I

Leu - Gin I

I (II') - I

I 30 I

5 DK 175408 B1

Ile - Thr - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser -

Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Gly -

Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Lys - Gly - Asn - Lys -

Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Glu - 5 Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr -

Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly -

Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) -Leu - Gin (Ilb) 10

Val - Val - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser -

Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Asp -

Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Glu - Gly - Asn - Lys -

Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Lys - 15 Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr -

Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly -

Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) -Leu - Gin (Illa) 20

Val - Val - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser -

Gly - Glu - Asp - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Gly -

Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Glu - Gly - Asn - Lys -

Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asp - Gly - Glu - Lys - 25 Asn - Glu - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr -

Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly -

Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) -Leu - Gin (Illa') 30

I DK 175408 B1 I

I I

I Val - Val - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - I

I Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Glu - Asp - I

I Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Gin - Gly - Asn - Lys - I

I Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Lys - I

I 5 Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr - I

I Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly - I

I Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) - I

I Leu - Gin I

I (iii> I

I 10 i

I Val - Val - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - I

I Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Gin - Asp - I

I Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Gin - Gly - Asn - Lys - I

Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Lys - I

I 15 Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr - I

I Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly - I

I Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) - I

I Leu - Gin I

I (Illb) I

I 20 I

I Val - Val - Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - I

I Gly - Gin - Asn - Leu - Cys - Leu - Cys - Gin - Gly - I

I Ser - Asn - Val - Cys - Gly - Gin - Gly - Asn - Lys - I

I Cys - Ile - Leu - Gly - Ser - Asn - Gly - Glu - Lys - I

I 25 Asn - Gin - Cys - Val - Thr - Gly - Glu - Gly - Thr - I

I Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn - Asp - Gly - I

I Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu - Tyr(R) - I

I Leu - Gin I

I {11Ib1) . I

30 I

Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til frem- I

stilling af isohirudiner, hvilken fremgangsmåde er ejendom- I

melig ved, at man isolerer og renser isohirudiner fra blod- I

igler ved hjælp af en kombination af ekstraktionsmetoder, I

35 fældningsmetoder og chromatografiske metoder, om ønsket I

fraspalter en eventuelt tilstedeværende phenolestergruppe R I

DK 175408 B1 7 hydrolytisk under dannelse af en phenolisk hydroxylgruppe og eventuelt overfører de opnåede polypeptider i deres fysiologisk acceptable salte.

Fortrinsvis ekstraheres isohirudinerne først som 5 beskrevet af F. Markwardt i Biomed. Biochem. Acta 44 (1985), 1007-1013, eller i EP offentliggørelsesskrifter nr. 158.986 og 209.061, hvorefter råisohirudinerne bringes til udfældning. Den yderligere isolering og rensning sker ved hjælp af en kombination af chromatografiske metoder, f.eks. som 10 beskrevet af P. Walsmann i Pharmazie 36 (1981), 860^-861.

Fortrinsvis anvendes der dog følgende kombination af chroma-tografimetoder: ionbytterchromatografi -· gelpermeeringschromatografi I -* affinitetschromatografi -» gelpermeeringschromatografi -+ I 15 ionbytterchromatografi -* "Micro-Bore® RP"-HPLC.

I De enkelte chromatografimetoder er hver især alment I kendte.

I Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udmærker sig ved I kombinationen af de forskellige chromatografimetoder, her- I 20 under den afsluttende "Micro-Bore® RP"-HPLC, ved hvilken I der anvendes søjler med en indvendig diameter på 1 mm. Be- I tinget af en lavere bundhøjde og den ringe diffusion i søjlen I er resultatet heraf en højere opløsning end ved gængse 4,6 I mm søjler (R.P.W. Scott, J. Chromatographie Science 23 I 25 (1986), 233-237, R. Gill, J. Chromatographie 16 (1986), 281).

I Det her anvendte "Micro-Bore® RP"-HPLC-anlæg består I af to "Beckman® 114 M" opløsningsmiddelafgivelsesmoduler, I som styres af en kontrolenhed 421 a. Pufferledningen til I hver pumpe - af passiveret 3,2 mm V8 stålrør - er via et ΤΙ 30 stykke forbundet med en dynamisk mikrogradientblander, som I homogeniserer pufferopløsningerne, hvor den resulterende I pulsering opfanges af en i ledningen indskudt pulseringsdæm- I per (Waters del nr. 98060), og pufferopløsningen ledes ind I i "Micro-Bore®"-søjlen over reodynventilen i en prøveafgiver I 35 ("Gilson Abimed" model 231, fortyndermodel 401). "Micro- I Bore®"-søjlen, som er fyldt med 7 μπι kugleformet siliciumoxid I DK 175408 B1 "Aquapore RP-300" {porestørrelse 300 A) (Applied Biosystems, kat. nr. 400.422 Rp) ligger i en ovn ("Sykam S 4110", tempe- ratur 40°C). Der påvises ved 205 nm i en UV-detektor ("Sykam S 3300"), som er udstyret og indstillet på 0,08 AUFS. Regi- 5 streringen sker ved hjælp af en kompensationsskriver (10 mv

FS), integrationen med LAS-systemet (Hewlett Packard) efter I

A/D-omdannelse (HP 18625 A A/D Converter). En lineær gradi- I

entdrift optimeres. I

Følgende blandinger A og B anvendes som puffer: I

10 A: 90 vægtprocent vand, 10 vægtprocent acetonitril (AcCN) I

+0,1 volumenprocent trifluoreddikesyre (TFA), I

Η B: 90 vægtprocent AcCN, 10 vægtprocent vand +0,1 volu- I

menprocent TFA. I

I 15 Derved anvendes der 3 forskellige gradienter til de I

I forskellige adskillelses- og rensningstrin: I

a) til adskillelsen af isohirudinerne fra hverandre ved I

I analytisk og præparativ drift: 0% B til 40% B (stejl- I

I hed 0,06% B/min.), I

I 20 b) til fornyet chromatografi og slutrensning: 0% B til I

I 35% B (stejlhed 0,4% B/min.), I

c) til peptidadskillelsen: 0% B til 30% B (stejlhed I

I 1,7% B/min.). I

9 DK 175408 B1 blevet medsekvenseret. Således er f.eks. isohirudinet II' blevet fundet ved analysen af isohirudin II i nedbrydningstrin 20.

De her beskrevne, hidtil ukendte isohirudiner renses 5 først ved metoder, som er kendt fra litteraturen, herunder af f initetschromatografi på thrombin-"Sepharose®"-søjler. Derefter opdeles den resulterende isohirudinblånding i sine komponenter ved hjælp af "Micro-Bore® RP"-HPLC. Ved svære adskillelsesproblemer chromatograferes de isolerede frak-10 tioner på ny under let ændrede betingelser. Hvert nyt isohi-rudin renses til homogenitet eller quasi-homogenitet og opklares fuldkommen i sin sekvens, idet der i nogle tilfælde ikke blot måles aminosyresekvensen ved sekvensanalyse, men desuden anvendes proteinkemiske metoder,. såsom specifikke 15 kemiske spaltninger, for at dokumentere de hidtil ukendte sekvenser.

Aminosyreanalysen gennemføres med en aminosyreanaly-sator "Beckmann® 6300" efter fabrikantens vejledning. Dertil tørres proteinerne (30-50 pmol) i forvejen i et 4 x 40 mm 20 kvarts-reagensglas og hydrolyseres derefter i dampfasen med azeotrop HCl/0,8% phenol under nitrogenatmosfære ved 110°C.

Til hver blanding medanalyseres 500 pmol insulinstandard.

Der integreres med LAS-systemet (Hewlett Packard).

Ved hjælp af automatiseret sekvensanalyse på nativt 25 protein bestemmes den N-terminale aminosyresekvens. Der arbejdes med en 477 A proteinsekvensator med pulseret væskefase (TM) fra firma Applied Biosystems efter fabrikantens vejledning, hvilken sekvensator er koblet on-line med en 120 A PTH-analysator med datavurderingssystem.

30 I nogle tilfælde, dvs. for isohirudinerne I, II, lib, III og Illa, gennemføres desuden en proteasespecifik peptidspaltning. Dertil oxideres først "disulfidbroerne" i de pågældende proteiner med permyresyre, hvorved cystin omdannes til cysteinsyre. Denne oxidation bevirker, at pro-35 teinerne mister deres rumlige konfiguration og danner en polymer (en klump) af aminosyrer uden fast definerbar kon-

I DK 175408 B1 I

I io I

I figuration. Efter oxidationen frysetørres reaktionsblandin- I

I gen, det opnåede protein spaltes med trypsin i egnet puffer, I

peptidblandingen opdeles i de enkelte komponenter ved hjælp I

I af "Micro-Bore® RP"-HPLC og isoleres ved præparativ arbejds- I

I 5 måde. Derefter bestemmes den primære sekvens i disse peptider I

I ved aminosyreanalyse. Til den specifikke spaltning anvendes I

fortrinsvis trypsin, en serinprotease, som spalter efter en I

I basisk aminosyre, dvs. efter Arg eller Lys. I

I De hidtil ukendte isohirudiner med formel (A) kan I

I 10 desuden fremstilles analogt med den i EP offentliggørel- I

I sesskrift nr. 171.024 beskrevne metode. I

De her omhandlede isohirudiner er specifikke throm- I

I bininhibitorer. Den kvantitative thrombinhæmning ved hjælp I

af de her omhandlede inhibitorer har vist, at komplekset I

15 thrombininhibitor/thrombin praktisk taget ikke dissocierer. I

I Ved hjælp af den i det følgende beskrevne thrombin- I

I hæmningsprøve kan man under oparbejdningen og rensningen I

I bestemme aktiviteten og dermed renhedsgraden af de her om- I

I handlede isohirudiner. De på denne måde rensede isohirudiner I

I 20 med den almene formel (A) udviser derved en thrombinhæmning I

I på 12-16 AT-U/ptg (antithrombinenheder/^g) . I

I Thrombinhæmningsprøve til aktivitetsbestemmelse. I

I Prøven gennemføres ved stuetemperatur ved et samlet I

25 volumen på 200 μΐ i mikrotiterplader med 96 huller. Efter I

I en forinkubering af thrombinet (oksethrombin 50 NIH-U/mg I

I (Fa. Merck, art. nr. 12374), s tamopløsning: 40 NIH-U/ml i 20 I

I mM MES pH 6, 0,154 mM NaCl, 0,2% PEG 6000, 1% BSA) i et I

I slutvolumen på 100 μΐ med 1-50 μΐ isohirudin sker reaktions- I

I 30 starten ved tilsætning af substrat. Da aktiviteterne i prø- I

I vens måleområde ligger mellem 0,03 og 0,15 AT-U, skal de I

I prøver, som skal bestemmes, fortyndes tilsvarende med en I

I prøvepuffer. I

Den nødvendige mængde prøvepuffer (50 mM Tris/HCl, I

I 35 pH 8, 154 mM NaCl, 0,2% polyethylenglycol 6000) pr. mik- I

I rotiterpladehul ifyldes i forvejen. Derefter tilsættes til I

11 DK 175408 B1 hvert hul 50 μΐ 4 NIH-U/ml thrombinopløsning (se ovenfor) og prøven. Efter en inkubationstid på 10 minutter startes derefter reaktionen ved tilsætning af 100 μΐ ImM "Chromozym TH" (Fa. Boehringer, art. nr. 206.849, 10 mM i vand/HCl, pH 5 6, brugsopløsning: 1 mM fortyndet med prøvepuffer). Efter inkubering i 5-10 minutter af restthrombinet med chromogen-substratet bestemmes derefter det frigjorte nitroanilin fotometrisk ved 405 nm. En reaktionsstandsning er ikke nødvendig, hvis der er en "ELISA®"-aflæser ("Easy-Reader EAR 10 400", SLT-Labinstruments, AT) til rådighed til hurtig aflæs ning af mikrotiterpladehullerne· Heller ikke en hirudinstan-dard er principielt nødvendig, da en absolut bestemmelse af antithrombinenhederne er mulig ved anvendelsen af en defineret thrombinaktivitet. Dog fører den efterhånden indtræ-15 dende inaktivering af brugsopløsningen til en systematisk fejl, som kan elimineres, hvis man henfører måleværdierne til en defineret hirudinstandard. Dermed bliver prøven uafhængig af den absolutte thrombinkoncentration og tillader reproducerbare bestemmelser.

20 Der anvendes følgende kontroller: a) Blindprøve.

Thrombinopløsningen erstattes med en puffer (fotome-ternuludligning).

25 b) Thrombinværdi.

Et mikrotiterpladehul belastes uden inhibitor.

c) Hirudinstandard.

Til et mikrotiterpladehul sættes 0,07-0,1 AT-U af en 30 kendt hirudinstandard (Hirudin Pentapharm "purified by affinity Chromatography", specifik aktivitet: 10 AT-U/^g, koncentration: 0,1 AT-U/50 μΐ) .

For at fastslå koncentrationen af prøverne måles der 35 for "Micro-Bore®"-HPLC en justeringskurve for 1-20 μg isohi-rudin.

--- I DK 175408 B1 I 12

I nedenstående tabel I er de på "Micro-Bore®" -HPLC

H målte koncentrationsværdier stillet overfor værdierne ifølge thrombinhæmningsprøven.

5 Tabel I.

Isohirudin Koncentration tøg/ml] AT-U/jug _"Micro-Bore®” - HPLC Thrombinhæmningsprøve_ la 56 59 14 10 I 56 62 15

Ib 34 38 16

Ha 68 72 15 II 120 140 16 I Ilb 137 145 16 I 15 Illa 84 87 12 I III 397 533 16 H IHb 97 109 14

Isohirudinerne med formel (A) kan derfor også anvendes 20 som midler til hæmning af blodkoaguleringen til anvendelse ved prophylaxe og terapi af thromboemboliske processer samt deres anvendelse som diagnostika og reagenser. Endvidere kan de her omhandlede isohirudiner også kobles til en bærer, hvorved der opstår derivater med forsinket thrombininhibi- 25 torisk virkning, således som det er foreslået i DK patentan- I søgning nr. 2707/89.

H Opfindelsen angår desuden et pharmaceutisk middel, I som indeholder et isohirudin med formel (A) og et pharmaceu- tisk uskadeligt bærestof.

30 Disse præparater kan især finde anvendelse ved de I ovenfor angivne indikationer, når de indgives f.eks* paren- I teralt, såsom intravenøst, intracutant, intramuskulært eller I subcutant, oralt eller topisk. Doseringen afhænger i første I række af den specifikke indgivelsesform og af formålet med I 35 terapien eller prophylaxen. Størrelsen af de enkelte doser I samt indgivelsesskemaet kan bedst bestemmes ved hjælp af en I individuel bedømmelse af det pågældende sygdomstilfælde, og 13 DK 175408 B1 de dertil nødvendige metoder til bestemmelse af relevante blodfaktorer er kendte af en fagmand. I normal tilfælde ligger ved injektion den terapeutisk virksomme mængde af de her omhandlede isohirudiner i dosisområdet fra ca. 0,005 til 5 ca. 0,1 mg/kg legemsvægt. Foretrukket er området fra ca.

0,01 til ca. 0,05 mg/kg legemsvægt. Indgivelsen sker ved intravenøs, intramuskulær eller subcutan injektion. I overensstemmelse hermed indeholder pharmaceutiske præparater til parenteral indgivelse i enkeltdosisform i afhængighed af 10 indgivelsesmåden pr. dosis fra ca. 0,4 til ca. 7,5 mg af det her omhandlede isohirudin. Foruden det aktive stof indeholder disse pharmaceutiske præparater sædvanligvis desuden en puffer, f.eks. en phosphatpuffer, som skal holde pH-vær-dien mellem ca. 3,5 og ca. 7, og desuden natriumchlorid, 15 mannitol eller sorbitol til indstilling af isotonien. De kan foreligge i frysetørret eller opløst form, idet opløsninger med fordel kan indeholde et antibakterielt virkende konserveringsmiddel, f.eks. 0,2-0,3% 4-hydroxybenzoesyrerne-thylester eller -ethylester.

20 Et præparat til topisk anvendelse kan foreligge som vandig opløsning, lotion eller gel, oliebaseret opløsning eller suspension eller fedtholdig salve eller især emulsionssalve. Et præparat i form af en vandig opløsning fås f.eks. ved, at de her omhandlede, aktive stoffer eller et 25 terapeutisk anvendeligt salt deraf opløses i en vandig pufferopløsning med pH-værdien 4-6,5, og der om ønsket tilføjes et yderligere, aktivt stof, f.eks. et antiinflammatorisk middel, og/eller et polymert klæbemiddel, f.eks. polyvinyl-pyrrolidon, og/eller et konserveringsmiddel. Koncentrationen 30 af det aktive stof andrager fra ca. 0,08 til ca. 1,5 mg, fortrinsvis 0,25 til 1,0 mg, i ca. 10 ml af en opløsning eller 10 g af en gel.

En oliebaseret anvendelsesform til topisk indgivelse fås f.eks. ved suspension af de her omhandlede, aktive stof-35 fer eller et terapeutisk anvendeligt salt deraf i en olie, eventuelt under tilsætning af opkvældningsmidler, såsom

I DK 175408 B1 I

I 14 I

I aluminiumstearat, og/eller grænsefladeaktive midler (ten- I

sider), hvis HLB-tal ("hydrophil-lipophil-balance") ligger I

I under 10, såsom fedtsyremonoestere af polyvalente alkoholer, I

I f.eks. glycerolmonostearat, sorbitanmonolaurat, sorbitan- I

I 5 monostearat eller sorbitanmonooleat. En fedtholdig salve I

I fås f.eks. ved suspension af de her omhandlede, aktive stof- I

fer eller deres salte i et udstrygeligt fedtgrundlag, even- I

I tuelt under tilsætning af et tensid med et HLB-tal på under I

I 10. En emulsionssalve fås ved udrivning af en vandig opløs- I

I 10 ning af de her omhandlede, aktive stoffer eller salte deraf I

I i et blødt, udstrygeligt fedtunderlag under tilsætning af I

I et tensid, hvis HLB-tal ligger under 10. Alle disse topiske I

I anvendelsesformer kan også indeholde konserveringsmidler. I

I Koncentrationen af det aktive stof andrager fra ca. 0,08 I

I 15 til ca. 1,5 mg, fortrinsvis 0,25 til 1,0 mg i ca. 10 g af I

I grundmassen. I

I Foruden de ovenfor beskrevne og deres analoge phar- I

maceutiske præparater, som er bestemt til en direkte medi- I

I cinsk anvendelse i kroppen hos mennesker eller pattedyr, I

I 20 angår den foreliggende opfindelse også pharmaceutiske sammen- I

I sætninger og præparater til medicinsk anvendelse uden for I

I det levende legeme hos mennesker eller pattedyr. Sådanne I

I sammensætninger og præparater anvendes i første række som I

I koaguleringshæmmende tilsætning til blod, som uden for lege- I

I 25 met underkastes en cirkulation eller behandling (f.eks. I

dialyse i en kunstig nyre), konservering eller modificering I

I (f.eks. hæmoadskillelse). I deres sammensætning ligner så- I

I danne præparater, såsom lageropløsninger eller præparater i I

I enkeltdosisform, de ovenfor beskrevne injektionspræparater, I

30 men hensigtsmæssigt er mængden eller koncentrationen af I

I aktivt stof baseret på volumen af det blod, som skal be- I

I handles, eller, mere nøjagtigt, på dets thrombinindhold. I

I Derved skal man tage hensyn til, at de her omhandlede, aktive I

I stoffer (i fri form) I

3 5 (a) fuldstændigt desaktiverer ca. den 5-dobbelte vægt- I

I mængde thrombin, I

15 DK 175408 B1 (b) er fysiologisk uskadelige også i større mængder, og (c) meget hurtigt udskilles fra cirkulerende blod, selv i høje koncentrationer, således at der ingen fare består 5 for en overdosering, f.eks. ved transfusioner. Alt efter det specifikke formål andrager den egnede dosis fra ca.

0,01 til ca. 1,0 mg aktiv stof/1 blod, idet den øvre grænse kan overstiges kraftigt uden fare.

Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde til frem-10 stilling af det pharmaceutiske middel, hvilken fremgagnsmåde er ejendommelig ved, at dette og en bærer bruges på en passende indgivelsesform.

De her omhandlede forbindelser og salte deraf samt de præparater, som indeholder de her omhandlede, aktive 15 stoffer, f.eks. faststofblandinger og først og fremmest opløsninger, især vandige opløsninger, kan også anvendes til bestemmelse af thrombin. Disse kan foruden en nøjagtig mængde eller koncentration af de her omhandlede, aktive stoffer {også i form af et salt) hensigtsmæssigt desuden 20 indeholde indifferente hjælpestoffer, f.eks. de ovenfor ved injektionspræparater omtalte, som f. eks. har en stabiliserende og/eller konserverende opgave. Disse præparater anvendes ved bioanalyser ligesom hirudinpræparaterne på analog, kendt måde, f.eks. til bestemmelse af thrombin.

25 Desuden er de her omhandlede forbindelser brugbare til blodkonservering. Til dette formål sættes de her omhandlede forbindelser med fordel til blodreserver i en mængde på 0,1-2 vægtprocent.

De efterfølgende eksempler tjener til belysning af 3 0 opfindelsen. Her er der i modsætning til ovenstående beskrivelse og til patentkravene anvendt koden på ét bogstav som kortbetegnelse for aminosyrer.

I DK 175408 B1 I

I 16 I

B Tre- og etbogstavkode for aminosyrer. I

Aminosyre Forkortelse Aminosyre Forkortelse I

B Alanin Ala (A) Prolin Pro {P) I

5 Arginin Arg (R) Serin Ser (S) I

I Cystein Cys (C) Threonin Thr (T) I

B Glycin Gly (G) Tryptophan Trp (W) I

I Histidin His (H) Tyrosin Tyr (Y) I

B Isoleucin Ile (I) Valin Val (V) I

B 10 Leucin Leu (L) Asparaginsyre Asp (D) I

B Lysin Lys (K) Asparagin Asn (N) B Methionin Met (M) Glutaminsyre Glu (E) B Phenylalanin Phe (F) Glutamin Gin (Q) B 15 Eksempel 1.

B Isolering af i sohi rudi nerne la. I. Ib. Ila. II, Ilb, Illa, B III, Illb. oxidation, tryptisk spaltning, sekvensanalvse oa B aminosvreanalyse.

B 20 a) Isolering.

B Isoleringen af de hidtil ukendte isohirudiner sker B først ved den fra litteraturen kendte metode, se P. Walsmann, B Trombosis Research 40 (1985), 563-569. De vigtigste skridt B skal kun omtales her. Efter ekstraktionen af den forreste B 25 del af blodgelen med 40% acetone og udfældning af ballast- stoffer med iseddike udfældes den berigede hirudinekstrakt med acetone. Bundfaldet renses via ionbytning (f.eks. "DEAE- B Sephacel®") i tris/HCl-puffer (pH 7,4) ved hjælp af en kog- saltgradient. De ved antithrombinprøven aktive fraktioner I 30 renses og frysetørres. Derefter opdeles pufferbestanddelene I portionsvis over "Sephadex® G 25" i vand, de aktive frak- I tioner påføres i 0,1 M tris/HCl-puffer (pH 8,0) på en throm- I bin-"Sepharose®"-søjle og elueres efter vask med samme puffer I med 0,1 M natriumacetat/O, 5 M natriumchlorid (pH 5,0). Derved I 35 elueres også en del af hirudinet. Derefter elueres de rene

I hirudinfraktioner med 0,1 M tris/HCl/1,5 M benzamidin (pH

DK 175408 B1 I

17 I

8,0). Ved kobling af thrombin-"Sepharose®" på en "Sephadex® I

G-25"-søjle foretages der derefter ved reduceret strømning I

en eluering af hirudinet sammen med en adskillelse af throm- I

bininhibitoren benzamidin. Efter frysetørring renses de I

5 aktive fraktioner ved ionbytterchromatografi over "SE-Se- I

phadex®" i 0,01 M ammoniumacetatpuffer (pH 3,8) og eluering I

med en gradient af natriumchlorid. Der isoleres tre aktive I

I fraktioner. Fraktion II afsaltes over "Sephadex®" og fryse- I

I tørres. Den specifikke aktivitet ligger på 12 AT-U/Vg. I

I 10 Den ikke-ensartede fraktion II anvendes til "Micro- I

I Bore® RP"-HPLC. Ved anvendelse af en meget flad gradient I

I (0,06 B % pr. minut) opløses blandingen i tre hovedspidser I

I med meget forskellige retentionstider (RT) (spids I: RT ca. I

I 89 minutter, spids II: RT ca. 113 minutter, spids III: RT

I 15 ca. 134 minutter, se tegningen). Disse hovedspidser er led- I saget af mindre satellitspidser (a og b) . Spids Illa betegner I f.eks. satellitspidsen med RT ca. 130 minutter, som elueres I umiddelbart før hovedspidsen III. Tilsvarende anvendes satel- I litspidsen Hib (RT ca. 139 minutter), som elueres efter I 20 hovedspidsen III.

I Ved forsigtig forøgelse af den indsprøjtede mængde I og samling af fraktionerne (spidserne) anvendes "Micro-Bore® RP"-HPLC-anlægget til præparativ isolering af de forskellige I isohirudinvarianter. Op til 50 /zg indsprøjtes, og de forskel- I 25 lige fraktioner (spidser) samles, uden af der bemærkes tab I i opløsningen af spidserne. Til isolering af en tilstrækkelig I mængde gentages denne proces flere gange, og de identiske I fraktioner forenes og frysetørres. Derefters slutrenses de I forskellige, gentagne spidschromatografier ved "snævrere" I 30 fraktioneringer. På denne måde adskilles isohirudinerne la, I I, Ib, Ila, II, lib, Ilia, III og Hib.

I De rene stoffer oxideres efter behov og spaltes med I trypsin.

I 35 I DK 175408 B1 I 18 b) Oxidativ spaltning af disulfiderne.

Isohirudinerne blandes med 150 μΐ permyresyreopløs- ning (fremstillet ud fra 50 μΐ hydrogenper oxid og 950 μΐ H myresyre, henstand i 2,5 timer ved stuetemperatur). Efter 5 30 minutters forløb fortyndes med 200 μΐ vand og derefter frysetørres.

c) Trypsinspaltning.

De oxiderede isohirudiner optages i 50 μΐ NMM-puffer 10 (0,2 M N-methylmorpholin indstilles på pH 8 med iseddike).

Dertil sættes en opløsning af trypsin i NMM-puffer i forhol- det substrat/enzym = 1:100. Efter 30 minutter ved stuetem- peratur standses reaktionen ved tilsætning af 100 μΐ ised- dike. Den derved fremkomne blanding anvendes derefter yder- I 15 ligere til "Micro-Bore® RP"-HPLC.

d) Sekvensanalyse.

De isolerede og rensede isohirudiner sekvenseres med 477 A proteinsekvensator med pulseret væskefase (TM) fra

20 firma Applied Biosystems, som er koblet on-line med en 120A

PTH-analysator med datavurderingssystem. Der arbejdes efter fabrikantens angivelser. Resultaterne er vist i tabellerne I III-XV.

25 e) Aminosyreanalyse.

Aminosyresammensætningen af de enkelte isohirudiner er blevet målt med en aminosyreanalysator "Beckman 6300".

Derved er der arbejdet efter fabrikantens vejledning. Rea- genserne og skillesøjlen er ligeledes foreskrevet af fabri- 30 kanten. Den efterfølgende integration sker med LAS-systemet (Hewlett Packard). Proteinerne (ca. 30-50 pmol) tørres i et 4 x 40 mm kvart s-reagensgi as og hydrolyseres derefter i damp- fasen med azeotrop HCl/0,8% phenol under nitrogenatmosfære ved 110°C. Til hver blanding medanalyseres 500 pmol insulin- I 35 standard.

Nedenstående tabel II viser de målte resultater.

19 DK 175408 B1

Tabel II: Åminosvreanalvse.

Isohirudiner la I Ila II Ilb abababa ba b 5 Asx 9,6 9 9,8 10 9,9 10 9,1 9 9,2 9

Thr 3,8 4 3,7 4 4,7 5 4,5 5 4,6 5

Ser 3,4 4 3,4 4 3,6 4 5,6 4 3,7 4

Glx 12,2 12 13,3 12 13,2 13 13,9 13 13,2 13

Pro 2,3 3 2 3 2,2 3 2,1 3 2,1 3 10 Gly 9,3 9 9 9 9,6 9 10,1 9 9,1 9

Cys /2 4 6 4,5 6 3,9 6 3,6 6 4,5 6

Val 2,9 4 3,0 4 1,9 2 1,9 2 1,8 2

Ile 1,8 2 1,8 2 1,7 2 2,3 2 1,8 2

Leu 3,7 4 4,0 4 3,8 4 3,4 4 4 4 15 Tyr 1,9 2 1,9 2 1,8 2 0,6 2 1,9 2

Phe 0,9 1 0,0 11 1 0,9 1 0,9 1

His 1 1 0,9 1 0,9 1 1,3 1 0,1 1

Lys 2,8 4 2,9 3 3,1 3 2,5 3 2,8 3 I DK 175408 B1 I 20

I Isohirudiner Ilia III Hib I

a b a b a b I

I Asx 10 10 10 10 9,5 10 I

I Thr 3,943,843,74. I

I 5 Ser 3,744 43,24 I

I Glx 13,6 13 13,7 13 13,1 13 I

Pro 2,132,232,43 I

I Gly 9,4 9 9,4 9 9,1 9 I

Cys/2 4,863,964,16 I

10 Val 2,94 2,5 42,84 I

Ile 1,9 2 1,7 2 1,9 2 I

Leu 4,243,9444 I

Tyr '1,721,221,72 I

, Phe 111111 I

15 His 0,9 11 1 0,9 1 I

I Lys 332,932,73 I

a: Pundet I

b: Beregnet I

I 20 I

I de efterfølgende eksempler 2-9 er der arbejdet I

I analogt med den i eksempel 1 anførte fremgangsmåde. De til- I

svarende angivelser over den specifikke aktivitet og amino- I

syreanalyserne er vist i tabellerne I og II. I

25 I

Eksempel 2. I

Isohirudin I. I

Isohirudin I er isoleret fra spidsen I (RT ca. 89 I

minutter) og renset ved gentagen chromatografi. Den N-ter- I

30 minale sekvensanalyse har muliggjort en bestemmelse af struk- I

turen op til 30 aminosyrer (tabel III) . Efter oxidation og I

I tryptisk spaltning er fragmenterne T2 og T3 (C-terminalt I

I peptid) blevet isoleret, og sekvenserne er opklaret. Resul- I

I taterne er vist i tabel IV. I

I 35 I

Tabel III.

Kvantitativ sekvensanalyse af isohirudin I.

21 DK 175408 B1 15 10 5 Aminosyre VVY TDCTESGQN pmol 107 90 76 48 30 nb 21 29 13 30 19' 20 15 20

Aminosyre L CL CEGSNVCGN* pmol 18 nb 6 nb 11 16 12 17 15 nb 12 13 10 25 30 35

Aminosyre G NK CILGSDGEK

pmol 11 8 6 nb 5 5 40 45

Aminosyre N Q C VTGEGTPKP

15 pmol 50 55 60

Aminosyre Q SH NDGDFEEIP

pmol 65

20 Aminosyre E E Y L Q

pmol I * Aminosyreombytning i forhold til (1) I nb: kan ikke bestemmes I 25

I VVYTDCTESGQNLCLCEGSN

I VCGQGNKC ILGSDGEKNQCV

I TGEGTP KPQSHNDGDFEEIP

I E E Y* L Q

I 30 I Y* Sulfatotyrosin I 35 I DK 175408 B1

Tabel IV.

Kvantitativ sekvensanalyse af de tryptiske spalt- ningsprodukter af isohirudin I.

5 Peptid T2 I 28 30 35

I Aminosyre CILGSDGEK

I T2 I pmol nb 204 156 128 40 63 68 23 8 I 10 I Peptid T3 I 37 40 45

H Aminosyre NQCVTGEGTPKP

I T3 I 15 pmol 159 178 nb 105 89 122 89 86 63 57 58 25 I 50 55 60

I Aminosyre Q SH ND GDFEEIP

I T3 pmol 36 12 6 12 9 10 11 7 7 3 4 5 20 65

I Aminosyre E E Y L Q I

I 73

I pmol 4 4 113 I

25 nb: kan ikke bestemmes. I

Eksempel 3. I

Isohirudin la. I

30 Analogt med eksempel 1 isoleres Isohirudin la fra I

den proteinblanding, som er opnået før spidsen I (RT ca. 85 I

minutter). Produktet renses ved gentagen chromatografi. Den I

efterfølgende N-terminale sekvensanalyse har gjort det muligt I

at måle den samlede struktur (tabel V). I

35 I

Tabel V.

Kvantitativ sekvensanalyse af isohirudin la.

23 DK 175408 B1 1 5 10

5 Aminosyre V V Y TDCTESGQN

pmol 336 334 297 614 161 nb 339 114 241 185 196 181 15 20

Aminosyre L CL CEGSNVCGK* pmol 188 nb 173 nb 123 156 130 149 146 nb 132 118 10 25 30 35

Aminosyre G NK CILGSD GEK

pmol 122 118 78 nb 71 84 71 53 69 76 60 69 40 45

Aminosyre N Q C VTGEGTPKP

15 pmol 60 61 nb 46 39 43 37 39 24 16 28 19 50 55 60

Aminosyre Q SH NDGDFE EIP

pmol 17 11 6 16 12 9 11 13 6 5 5 3 65

20 Aminosyre E E Y L Q

pmol 4 43 32 * Aminosyreombytning i forhold til (1) nb: kan ikke bestemmes 25

Eksempel 4.

Isohirudin Ila.

Isohirudin Ila isoleres fra spidsen Ila (RT ca. 107 30 minutter) og renses ved gentagen chromatografi. Ved N-terminal sekvensanalyse er strukturen blevet opklaret (tabel VI) .

35 I DK 175408 B1 I 24

Tabel IV.

Kvantitativ sekvensanalyse af isohirudin Ila.

I 1 5 10 5 Aminosyre I* T* Y TDCTESGQN ' pmol 423 372 377 310 368 nb 392 274 295 261 287 271 I 15 20

Aminosyre L CL CEGSNVCGN* pmol 258 nb 241 nb 230 228 227 226 218 nb 223 210 H 10 25 30 35

Aminosyre G NK CK*LGSDGEE* pmol 191 149 200 nb 171 182 169 176 162 145 135 125

40 45 I

Aminosyre N QC VTGEGTPKP

I 15 pmol 115 126 nb 107 105 96 93 92 79 72 71 62 I 50 55 60

Aminosyre Q SHNDGDFEEIP

pmol 60 49 55 52 50 41 43 47 30 31 30 16 I 65

20 Aminosyre E E Y L Q

I pmol 15 15 17 12 12 * Aminosyreombytning i forhold til (1) I nb: kan ikke bestemmes I 25 I Eksempel 5.

I Isohirudiner II og II1.

Analogt med eksempel 1 isoleres isohirudinerne II

og II’ i en blanding fra fraktion II (spids II, RT ca. 113 30 minutter) og renses ved gentagen chromatografi. Ved N-ter- minal sekvensanalyse er sekvensen i isohirudinerne til ami- nosyrer 35 blevet opklaret. Det C-terminale peptid (28-65) I isoleres efter oxidation og tryptisk spaltning, og sekvensen måles (tabel VIII). Den samlede sekvensanalyse af isohiru- 35 dinerne II og II’ er vist i tabel VII. Isohirudin II' er der belyst som allerede ovenfor, medens sekvensanalysen 25 DK 175408 B1 karakteriserer isohirudinblandingen II og II'. Isohirudin II* adskiller sig fra isohirudin II ved ombytning af aspara-gin med asparaginsyre i stilling 20.

5 Tabel VII.

Kvantitativ sekvensanalyse af isohirudinerne II og II' .

15 10 10 Aminosyre I* T* γ T D C T E S - G Q D*

II

pmol 311 268 278 267 242 nb 169 175 165 144 165 163 15 20

Aminosyre L CL CEGSNVCGK*

15 II

pmol 150 nb 132 nb 124 109 116 124 110 nb 111 110

Aminosyre D** II' 20 pmol 4 25 30 35

Aminosyre G NK CILGSN*GE'E*

II

pmol 98 89 74 nb 66 55 43 70 49 51 45 28 25 40 45

Aminosyre N QC VTGEGTPKP

II

pmol 20 22 nb 17 12 13 10 3 15 50 55 60

30 Aminosyre Q SH NDGDFEEIP

II

pmol

Aminosyre E E Y L Q

35 II pmol 65 I DK 175408 B1 I 26 * Aminosyreombytning i forhold til (1)

** Aminosyreombytning i forhold til II

nb: kan ikke bestemmes.

5 I Tabel VIII.

Kvantitativ sekvensanalyse af de tryptiske spaltnings-

produkter af isohirudiner II og II'. I

10 28 30 35

I Aminosyre C I L GSN*GEE*NQC I

pmol nb 266 242- 250 223 217 184 178 178 169 145 nb I 40 45 50

I Aminosyre V TG EGTPK PQSH

I 15 pmol 144 125 138 126 125 137 118 112 102 125 91 113

55 60 I

I Aminosyre NDGDFEEIPEEY I

I pmol 117 100 106 97 99 83 79 80 68 59 63 41 I

I 65 I

I 20 Aminosyre L Q I

I pmol 38 16 I

I * Aminosyreombytning i forhold til (1) I

nb: kan ikke bestemmes I

I 25 I

Eksempel 6. I

I Isohirudin lib. I

I Analogt med eksempel 1 er isohirudin Ilb blevet iso- I

I 30 leret fra proteinblandingen efter spids II (RT ca. 115 minut' I

ter) og renset ved gentagen chromatografi. Ved N-terminal I

I sekvensanalyse er den samlede, i tabel IX viste sekvens I

I blevet målt. Desuden er der yderligere gennemført en tryp- I

I sinspaltning, som har ført til isolering af peptiderne 28- I

I 35 65 (tabel X). Den tilsvarende sekvens er blevet målt. I

Tabel IX.

Kvantitativ sekvensanalyse af isohirudin Ilb.

27 DK 175408 B1 15 10 5 Aminosyre I1T1Y TDCTESGQN pmol 378 502 244 465 445 nb 377 400 396 303 291 281 15 20

Aminosyre L CL CEGSNVCGK1 pmol 279 nb 269 nb 240 248 248 235 235 nb 259 231 10 25 30 35

Aminosyre G NK C ILGS N1 G E E1 pmol 215 230 219 nb 221 222 217 210 206 200 195 195 45 45

Aminosyre N QC VTGEGTPKP

15 pmol 185 174 nb 163 156 145 132 140 129 112 105 91 50 55 60

Aminosyre Q SH NDGDFEEIP

pmol 86 80 72 71 65 54 51 42 46 33 24 26 65

20 Aminosyre E E Y L Q

pmol 18 18 15 12 10

Aminosyreombytning i forhold til (1) I DK 175408 B1 I 28

Tabel X.

Kvantitativ sekvensanalyse af de tryptiske peptider I

i isohirudin lib. I

I 5 28 30 35

H Aminosyre C ILGSN*GEE*NQC I

pmol 300 379 381 368 347 337 332 316 305 293 271 nb I

I 40 45 50 I

I Aminosyre V TG E GTPKPQSH I

10 pmol 255 249 234 228 212 205 197 167 154 143 133 127 I

I 55 60 I

I Aminosyre N DG DFE EIPEEY I

I pmol 112 102 115 100 91 81 78 64 54 32 22 18 I

I 65 I

I 15 Aminosyre L Q I

I pmol 1412 I

* Aminosyreombytning i forhold til (1) I

H nb: kan ikke bestemmes I

20 I

I Eksempel 7. I

I Isohirudiner Illa og Ilia1. I

Isohirudinerne Illa og Illa' er blevet isoleret fra I

I spidsen med RT ca. 126 minutter og renset ved gentagen chro- I

I 25 matografi. N-Terminal sekvensanalyse har gjort det muligt I

at bestemme strukturen til carboxyterminus (tabel XI). Iso- I

hirudin Illa' er som ovenfor forklaret blevet karakteriseret I

I under sekvensanalysen. Isohirudin Ilia' adskiller sig fra I

I isohirudin Illa ved ombytning af glutaminsyre med glutamin I

I 30 i stilling 11, asparaginsyre med asparagin i stilling 12, I

I glycin med asparaginsyre i stilling 18 og asparaginsyre med I

I asparagin i stilling 33. I

Tabel XI.

Kvantitativ sekvensanalyse af isohirudinerne Illa og DK 175408 B1 29

Illa' .

15 10 5 Aminosyre V VY TDCTESGQN Illa pmol 660 675 666 477 407 nb 321 458 238 390 269 282

Aminosyre E** D**

Illa' 10 pmol 46 33 15 20

Aminosyre L CL CED*SNVCGE*

Illa pmol 318 nb 284 nb 269 247 239 227 218 nb 204 185 15 Aminosyre G** E*

Illa* pmol 11 25 30 35

Aminosyre G NK CILGSN*GEK

20 Illa pmol 178 169 161 nb 150 157 154 137 131 128 125 120

Aminosyre D**

Illa' pmol 4 25 40 45

Aminosyre N E* C VTGEGTPKP

Illa pmol 88 84 nb 73 62 69 63 59 51 45 53 38 50 55 60

30 Aminosyre Q SH NDGDFEEIP

Illa pmol 32 33 21 22 18 15 13 10 10 11 8 6 65

Aminosyre E E Y L Q

35 Illa pmol 6 55 43 I DK 175408 B1 I 30

* Aminosyreombytning i forhold til (1) I

** Aminosyreombytning i forhold til IIla I

nb: kan ikke bestemmes. I

5 Eksempel 8. I

I Isohirudin III. I

I Isohirudin isoleres fra spidsen med RT ca. 139 minut- I

ter og renses ved gentagen chromatografi. N-Terminal sekvens- I

analyse i kombination med sekvensanalysen af de tryptiske I

I 10 spaltningsprodukter . (peptid 28-65) har muliggjort struktur- I

bestemmelsen af det samlede protein (tabellerne XII og XIII) . I

H Sammenlignet med alle her beskrevne isohirudiner er I

isohirudin III isoleret i en større mængde, således at der I

med dette stof desuden er gennemført det proteinkemiske I

H 15 strukturbevis for mutationen asparaginsyre til asparagin. I

I Bornstein (Methods in Enzymol. 47 (1977), 132-145) I

I beskriver en selektiv spaltning af Asn-Gly-peptidbindinger I

I med det nukleophile agens hydroxylamin. I

I I overensstemmelse hermed er der først blevet frem- I

20 stillet en puffer, som indeholder 6 M guanidiniumhydrochlo- I

rid og 2 M hydroxylamin. Dertil bringes 23 g guanidinium- I

I hydrochlorid og 5,5 g hydroxylamin sammen i et isbad med I

noget vand og bringes under kraftig omrøring i opløsning I

I med 4,5 M LiOH, idet pH-værdien ikke overstiger 6,5. Derefter I

I 25 indstilles pH-værdien på 9, og der fyldes op med vand til I

I 50 ml. I

I Isohirudin III (ca. 2 nmol) lyophiliseres, optages I

I med 200 μΐ af den fremstillede puffer og inkuberes derefter I

I i 24 timer ved 45°C i et vandbad. Til afslutning af reak- I

I 30 tionen tilsættes 200 μΐ iseddike (pH 3), og prøven nedfry- I

ses. Derefter koncentreres prøven til 200 μΐ og afsaltes på I

I en søjle med omvendt fase (4,6 mm x 250 mm) fyldt med en C- I

I 18-modificeret kiselgel. Derved løber gradienten fra 0% til I

I 100% B i løbet af 30 minutter ved en strøm af 1 ml/min. I

I 35 (puffer A: 100% vand, 0,1% TFA, puffer B: 90% AcCN, 10% I

I vand, 0,1% TFA). Den opnåede hovedfraktion chromatograferes I

31 DK 175408 B1 derefter igen ved hjælp af "Micro-Bore®"-HPLC. Der isoleres en fraktion Fl, som ifølge karakteriseringen ved sekvensanalyse udviser to N-terminaler (tabel XIV), nemlig Val Val Tyr og Gly Glu Lys.

5 Ved hjælp af cysteinsammenknytningen (Cys6-Cysl4,

Cysl6-Cys28, Cys22-Cys39) holdes isohirudin III stadigvæk sammen også efter hydroxylspaltningen.

Tabel XII..

10 Kvantitativ sekvensanalyse af isohirudin III.

1 5 .10

Aminosyre V VY TDCTESG QN

III

15 pmol 615 569 468 377 265 nb 178 250 108 214 147 195 15 20

Aminosyre L CL CED*SNVCGQ

III

pmol 158 nb 83 nb 102 88 72 64 54 nb 50 48 20 25 30 35

Aminosyre G NK CILGSN*GEK

III

pmol 32 37 29 nb 28 30 23 19 14 17 16 12 40 45

25 Aminosyre N QC VTGEGTPKP

III

pmol 10 9 nb 53 564 2 1 13 50 55 60

Aminosyre QSHNDGDFEEIP 30 III

pmol 1 0,51 1 5 1,50,30,82 2 1,51 65

Aminosyre E E Y L Q

III

35 pmol 1 0,40,6 0,80,6 I DK 175408 B1 I 32 * Aminosyreombytning i forhold til (1) H nb: kan ikke bestemmes I Tabel XIII.

I 5 Kvantitativ sekvensanalyse af de tryptiske peptider I

I i isohirudin III. I

I 28 30 35

I Aminosyre C IL GSN*GEKNQC

I 10 pmol nb 301 295 285 234 273 246 242 219 194 139 nb I 40 45 50

Aminosyre V TG EGTPKPQSH

pmol 151 136 141 149 117 99 82 87 71 68 64 58 I 55 60

15 Aminosyre N DG DFEEI PEEY I

I pmol 51 41 36 30 25 24 27 21 12 16 15 12 I 65

Aminosyre L Q I

I pmol 0,7 2 I

I 20

I * Aminosyreombytning i forhold til (1) I

nb: kan ikke bestemmes I

I Tabel XIV.

25 Kvantitativ sekvensanalyse af fraktion FI fra hydro- I

xylaminspaltningen. I

Nedbrydnings trin_ l_2 _3 4 I

30 Sekvensposition 1234 I

Aminosyre: N-terminal V V γ τ I pmol 17 17 24 22

Sekvensposition 34 35 36 37

I 35 Aminosyre: Spaltested G E K N

I pmol 41 50 37 34

DK 175408 B1 I

33 I

Påvisningen af to N-terminaler for F1 er det entydige I

bevis for hydroxylaminspaltning i sekvensen i isohirudin I

III ved peptidbindingen N-G. I

5 Eksempel 9. I

Isohirudiner Hib og Hib' . I

Isohirudinerne 11 Ib og 11Ib' isoleres analogt med I

eksempel 1 fra spidsen med RT ca. 134 minutter og renses I

ved gentagen chromatografi. Ved N-terminal sekvensanalyse I

10 er strukturen af Isohirudin Hib karakteriseret til car- I

boxylenden (tabel XV). Også strukturen af Isohirudin Hib’, I

som ligeledes er blevet målt ved sekvensanalysen, er vist i I

tabel XV. I

I DK 175408 B1 Η H Tabel XV.

Η Kvantitativ sekvensanalyse af isohirudinerne Hib og I Hib'.

H 5 1 5 10

H Aminosyre V VY TDCTESGQN

I Hib pmol 530 511 499 433 460 nb 395 332 339 326 321 278 I 15 20

10 Aminosyre L CL CED*SNVCGQ

I Illb pmol 264 nb 258 nb 246 240 221 224 195 nb 185 175 H Aminosyre G** 15 Illb’ H pmol 56 25 30 35

I Aminosyre G NK CILGSN*GEK

H Illb 20 pmol 168 154 154 nb 131 134 128 126 118 106 102 106 40 45

I Aminosyre N Q C VTGEGTPKP

Illb I pmol 106 95 nb 87 82 80 74 75 71 61 55 52 25 50 55 60

I Aminosyre Q SH NDGDFEEIP

I Illb pmol 48 12 36 31 30 24 21 23 18 16 18 12 I 65

30 Aminosyre E E Y L Q

I Illb I pmol 11 11 8 5 3 I * Aminosyreombytning i forhold til (1) 35 ** Aminosyreombytning i forhold til Illb nb: kan ikke bestemmes.

Claims

35 DK 175408 B1 I PATENTKRAV· I

1. Isohirudin, kendetegnet ved, at det har formlen A I 51 5 10 I A - B- Tyr - Thr - Asp - Cys - Thr - Glu - Ser - Gly - 15 20 I C - E- Leu - Cys - Leu - Cys - F - G - Ser - I - Val - I 25 30

10 Cys - Gly - J - Gly - Asn - Lys - Cys - K - Leu - Gly - 35 40 Ser - L - Gly - Glu - M - Asn - N - Cys - Val - Thr - Gly 45 50 Glu - Gly - Thr - Pro - Lys - Pro - Gin - Ser - His - Asn-15 55 60 Asp - Gly - Asp - Phe - Glu - Glu - Ile - Pro - Glu - Glu-65 Tyr(R) - Leu - Gin (A) I 20 hvori I A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder I Asn, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I Lys, K betyder Ile, L betyder Asp, M betyder Lys, N betyder I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I 25 A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder I Asn, F betyder Glu, G. betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I Asn, K betyder Ile, L betyder Asp, M betyder Lys, N betyder I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I A betyder Ile, B betyder Thr, C betyder Gin, E betyder I 30 Asn, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I Asn, K betyder Lys, L betyder Asp, M betyder Glu, N betyder I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller I A betyder Ile, B betyder Thr, C betyder Gin, E betyder I Asp, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder I 35 Lys, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Glu, N betyder I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller DK 175408 B1 A betyder Ile, B betyder Thr, C betyder Gin, E betyder Asp, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asp, J betyder Lys, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Glu, N betyder H Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller 5. betyder Ile, B betyder Thr, C betyder Gin, E betyder Asn, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder Lys, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Glu, N betyder H Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder H 10 Asn, F betyder Glu, G betyder Asp, I betyder Asn, J betyder H Glu, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Lys, N betyder Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller A betyder Val, B betyder Val, C betyder Glu, E betyder H Asp, F betyder Glu, G betyder Gly, I betyder Asn, J betyder

15 Glu, K betyder Ile, L betyder Asp, M betyder Lys, N betyder Glu, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder > Asn, F betyder Glu, G betyder Asp, I betyder Asn, J betyder Gin, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Lys, N betyder

20 Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H, eller Η A betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder Asn, F betyder Gin, G betyder Asp, I betyder Asn, J betyder Gin, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Lys, N betyder Gin, og R betyder hydrogen eller S.O3H, eller 25. betyder Val, B betyder Val, C betyder Gin, E betyder Asn, F betyder Gin, G betyder Gly,. I betyder Asn, J betyder Gin, K betyder Ile, L betyder Asn, M betyder Lys, N betyder I Gin, og R betyder hydrogen eller SO3H.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af isohirudin ifølge 30 krav 1, kendetegnet ved, at man isolerer og renser I isohirudiner fra blodigler ved hjælp af en kombination af ekstraktionsmetoder, fældningsmetoder og chromatografiske I metoder, om ønsket fraspalter en eventuelt tilstedeværende phenolestergruppe R hydrolytisk under dannelse af en pheno- I 35 lisk hydroxylgruppe og eventuelt overfører de opnåede poly- peptider i deres fysiologisk acceptable salte. DK 175408 B1 37

3. Isohirudin ifølge krav 1 til anvendelse som lægemiddel .

4. Isohirudin ifølge krav 1 til anvendelse som throm-bininhibitor.

5. Pharmaceutisk middel, kendetegnet ved, at det indeholder et isohirudin ifølge krav 1 og et pharmaceutisk uskadeligt bærestof.

6. Fremgangsmåde til fremstilling af et pharmaceutisk middel ifølge krav 5, kendetegnet ved, at dette 10 og en bærer bringes på en passende indgivelsesform.