JPH04507238A

JPH04507238A - プロテアーゼインヒビター

Info

Publication number: JPH04507238A
Application number: JP2506704A
Authority: JP
Inventors: アトキンソン　アントニイ; エレクトリクヴァラ　アスガー; ソイヤー　ロイ　トーマス; フォン　シィカード　ニイルズ; ヴェーマン　ゲラルド
Original assignee: メルック　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツンク
Priority date: 1989-04-14
Filing date: 1990-04-12
Publication date: 1992-12-17
Anticipated expiration: 2015-10-23
Also published as: DE69031424T2; CA2053242C; AU5549290A; EP0466833A1; KR920701247A; US5397694A; WO1990012808A1; DK0466833T3; CA2053242A1; NL8900943A; EP0466833B1; DE69031424D1; JP3101629B2; AU648252B2; KR0167344B1; ES2108694T3; ATE157989T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】プロテアーゼインヒビタ一本発明は、本発明者らがゲリン（Ｇｅｌｉｎ）と呼称する新規なプロテアーゼインヒビター及びこの新規な化合物を含有する医薬組成物及び化粧品組成物に関する。

ゲリンは人間ならびに豚の白血球エラスターゼ及びキモトリプシンのインヒビターであり、固有の抗生物質特性を有している。本発明はまた、別のキモトリプシンインヒビターであるニグリン（Ｅｇｌｉｎ）の化粧品組成物への新規な用途に関するものである。

肺気腫、関節炎、歯肉炎、歯周疾患や他の炎症性疾患のようないくつかの疾患は酵素エラスターゼによる組織破壊に起因して生じる。エラスターゼ類は、エラスチンやコラーゲンのような繊維状蛋白質を可溶化する二遍ができる唯一のセリンプロテアーゼであり、主として膵臓や好中球のアズール顆粒中に存在する。正常な生理条件下では、エラスターゼ類の蛋白質分解活性は血漿ならびに他の分泌液中に存在する過剰のインヒビターにより活性が抑制されている。しかしながら疾病状態では、インヒビターの局部的な不足により、平衡に異常を来し、結果として多様な炎症性疾患の原因である組織破壊が生じる。

この状況を歯肉炎を例として詳述する。好中球の作用の変調はその生体の異常や疾病、例えば糖尿病、ダウン症候群、盾形魚鱗癖、リューマチ性関節炎、環状好中球減少症、無顆粒球症、チェディアック東症候群等にしばしば関連している（文献ｌ、２）。多形核白血球（ＰＭＮ）由来中性プロテアーゼ及び／又は細菌性毒素は炎症状態を生じることにより歯肉領域の支持組織を直接的又は間接的に破壊する（文献３−７）。炎症を生じた歯肉組織から得られる歯肉間隙液は加水分解酵素を高レベルで含んでいる（文献８）。酸素遊離基は組織破壊活性とともに静菌作用を示しく文献９）、この組織破壊活性については詳述されている（文献４．５．１０）。塩素化オキシダントは強力な殺菌活性を示しく文献１１）、単純な試験管内緩衝系においてのみ人体組織に毒性を示す（文献１２．１３）。１９１７年にはすでに合成りロラミン類の使用が傷口の洗浄剤として推奨されていた。最終的な酸化媒体がＨＯＣＩか、あるいはクロラミン誘導体であるかは今でもなお未解決である（文献１４）。ＰＭＮ脱顆粒由来の加水分解酵素であるリソシーム酵素類は多様な組織構成物質にとっては脅威と考えられ（文献４．６）、一方天然血清プロテイナーゼーインヒビター（アルファ１プロテイナーゼインヒビター及びアルファ２マグログロブリン）はミエロペルオキシダーゼの酸化システムによって大半は不活化される（文献４．１５）。細菌由来の毒素類（低分子量代謝産物類、糖蛋白質類、リポ多糖類及びプロテアーゼ類〕は免疫細胞活性化と同時に生体組織及び細胞の破壊を開始すると報告されている（文献８．１６から１８）。いくつかの微生物は人間の血清ブロテイチーゼインヒビター類を不活化できる（文献１９．２０）。従ってエラスターゼに対する有効なインヒビターはこのような疾患と戦うための有用な治療手段六なることがわかる。

ヒルの唾液腺は酵素エラスターゼに対する有効なインヒビターを含有しているということが研究から判明している。又、ヒル類の“ヒルトメディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ）”ｌこおいて、トロンビンインヒビターであるヒルジン（ｈｉｔｕｄｉｎ）とは別に、酵素キモトリプシン及びエラスターゼに対するインヒビターも観察されている。これはニグリン（Ｅｇｌ’ｉｎ）と名付けられ、精製され、詳細に特徴づけられている（文献２１）。

ゴールドスティンら（Ｇｏｌｄｓｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ）（文献２２）は北アメリカの３種のヒルにニグリンが存在することを報告している。

しかしながら、我々の知る限りでは、今までに研究された他種のヒル由来のエラスターゼインヒビターは類似の生化学的性質を有する。

本研究において、本発明者らはヒル種ヒルジナリアマニレンシス（Ｈｉｒｕｄｉｎａｔｉａ　ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ）由来の抗トロンビンを精製しているうちに、思いがけなく強力な抗キモトリプシン及び抗エステラーゼ活性を有する新規なインヒビターを１＃離した。これまで得られた結果によると、このインヒビターはニグリンとは非常に異なっており、′ゲリン”と命名された。

ゲリンはヒル種ヒルジナリアマニレンシス由来の蛋白質を精製する実験を行っているうちに発見された。これらの蛋白質を精製しているうちに、キモトリプシン及びエラスターゼに対する阻害活性がいくつかの両分で観察され、これらの両分についてニグリン及びヒルジンとの比較研究を行った。

このヒル由来のエラスターゼ／キモトリプシンインヒビターは、本発明の一つの態様（及び、それから誘導される対応ＤＮＡ配列あるいはその対応ＤＮＡ配列から推定されうるアナログペプチド）を構成しており、既知のエラスターゼ／キモトリプシンインヒビターであるニグリンとは非同族である。

ニグリンについては薬効のあるヒルのヒルトメディシナリス（Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｃｌｉｃｉ’ｏａｌｉｓ）に存在することが知られており、それについてはシーミュラーら（Ｓｅｅｍｉｉｌｌｅｒ　ｅｌ　ａｌ）により詳述されている（Ｅｇｌｉｎ：”ｅｌａｓｔｘｓｅ−ｃｓｌｈｅｐｓｉｎ　Ｇ−ｉｎｈｉｂｉｔａｒ　ｆｔｏｍｌ＠ｅｃｈｅｓ”、、　１９８１：Ｍｅｔｈ、Ｅｎｌｙｍｏｌ、：８０：８０４−１１１６）更に、ヒルジン（Ｄｏｄｔ　ａｔ　ａｌ；ＦＥＢＳ　１６５，１８０−１８４）及び他の既知の構造のものとの比較により、ゲリンの構造はユニークかつニグリンの構造とは非常に異なるという結論に至った。

本発明の一つの態様によるエラスターゼ／キモトリプシンインヒビターは典型的には溶媒抽出技術によりヒル組織から単離され、あるいはヒルの分泌液（例えば唾液）からも単離できる。

本発明の他の態様は、特に、口腔洗浄、言磨ペースト剤及びスキンクリームのような化粧品組成物へのニグリンの新規な用途に関するものである。

璽ｌ− ７ｋｇのヒルジナリアマニレンシスを室温で９６％エタノール４゜０００ｍΩを４回換えて脱水した。脱水された体部を除去し、出発物質であるエタノール抽出物を濃ＨＣＩでＰＨ３，５に調整した。

得られた溶液を１．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清のｐＨを０゜ＩＭ　ＮａＯＨでｐＨ７，０に再調整した。該上清を蒸留水で５０％に稀釈し、次に公称分画分子量１０．０００のフィルターを用いるミリポアペリコンウルトラフィルターシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｔｅ　ｐｅｌｆｉｃｏｎ　Ｕｌｊｔｔａｆｉｌｔｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ）より８００ｍ　Ｑに濃縮した。

ＣＭ−に７７三二’Ｘ（郊ヨｖ■と土阻υ二鉦ゑり正コ！Ｌ乙之１Δ−濃縮された産物を５０ｍＭの酢酸ナトリウム１１８６．ｏで平衡化したＣＭセファロースカラムに通した。カラムを通過した液（カラムに結合しなかった物質）は一つの大きな両分として集められキモトリプシン及び抗エラスターゼ活性を分析した。

活性成分を含むカラム通過液は、分画分子量１０．０００のフィルターを用いる限外濾過により４００ｍ　Ｈに濃縮した。

ＤＥＡＥ−セファロース（ＤＥＡＥ−３ｅ　ｈａｒｏｓｅ）によるクロマトグラフィー生成物を濾過し、濾液をｐＨ５，５の２０ｍＭピペラジン−ＨＣ１緩衝液で前もって平衡化したＤＥＡＥ−セファロース高流速カラムに通した。カラムを１０ｍ Ω／分の流速で展開し、溶出液の吸光度、ｐＨ及び導電率を記録した。

水洗後、カラム結合物質は、平衡化に用いた緩衝液中に食塩を０．１Ｍから０．４Ｍの範囲で段階的に濃度を変えた溶解液で溶出し、各溶出液ピークを抗キモトリプシン及び抗エラスターゼ活性を測定する目的で別々の画分として採集した。

活性ピークは蒸留水に対し一晩透析して脱塩した。

Ｑ−セファロース（、−３ｅ　ｈａｒｏｓｅ）によるクロマトグラフィ一部分的に精製された生成物を、前もって２０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ緩衝液ＰＨ７，５の平衡化したＱ−セファロースを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーによって更に精製した。カラムを２００１１２／分の流速で展開し、結合物質を平衡化に用いた緩衝液中でＯＭからＩＭの食塩を直線濃度勾配になるように加えた溶液で溶出した。溶出液の吸光度、エラスターゼ阻害活性を記録した。活性画分をプールし分画分子量１０，０００のフィルターを用いる限外濾過により濃縮した。

スーパーデックス２００　（Ｓｕ　ｅｒｄｅｘ　２００）によるクロマトグラフィー濃縮された物質を、５０ｍＭ　）リス−ＭＣＩと０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液ｐＨ７，５に平衡化したスーパータックス２００カラムでゲル濾過を行なった。活性ピークをプールし、凍結乾燥した。

高速液体クロマトグラフィ一部分的に精製された試料に水を加えて、０．１％ＴＦＡで平衡化した逆相ミクロポアアクアポアＣ８カラム（ｒｅｖｅｒｅｄ　ｐｈａｓｅ　ｍ１ｃｒｏｂｏｒｅ　Ａｑｕａｐｏｒｅ　Ｃ８ｃｏｌｕｍｎ）に均等に分けた試料を別々に通した。

結合物質は０．０９％ＴＦＡに６０％ＣＨ３ＣＮを０から４０％の範囲で直線濃度勾配がつくようにした溶液で１０分以上溶出し、更に６０％Ｃ）１３ｃＮを４０〜１００％の範囲で濃度勾配をつけた溶液で２０分以上溶出した。各ピークを別々画分として採集し抗エラスターゼ活性を調べた（図２）。活性ピークは凍結乾燥し後の研究の為に使用した。

試料の純度を同様の条件下で）ＩＰＬＣを繰り返すこと、及びＮ末端配列分析により評価した（プリン精製のスキームＡを参照）膵臓エラスターゼによって触媒される合成基質Ｎ−スクシニル（アラニン）３−ｐ−ニトロアニリド（ＳＡＡＡＰ）からｐ−ニトロアニリン基の遊離の阻害を測定することによってプリンのエラスターゼ阻害活性を分光光度法的に測定した。活性の阻害単位（ＴＵ）はｐＨ８，３，２５℃で毎分１μモル５ＡＡＡＰの加水分解を阻害するのに必要なプリン量として定義した。

検定法は種々の異なる量のプリンを既知量の膵臓エラスターゼとＩＭＮａＣｌを含−むｐＨ８，３の０．１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液中で５分間２５℃でインキュベートすることからなる。色素性基質を添加して反応を開始させ、４０５ｎｍの吸光度を時間とともに測定する。プリンを除外したコントロール反応を同一条件下で行った。分当りの吸光度変化およびモル吸光係数Ｅ＝１０．５０００Ｍ　’ ｃｍ”−’を用いてプリンの活性を計算できる。

Ｉ迫」口４蚤精製されたプリンの蛋白質濃度をローリ−（Ｌｏｗｒｙ）法及びブラッドフォード（Ｂｔａｄｆｏｔｄ）法によって評価したところ、この２つの方法によって得られる値には大きな差があることがわかった。ある特別なバッチについて、ローリ−法では０．３８ｍｇ／ｍＱの値が得られたが、ブラットフォード法によると検出限界（（２μｇ／＋＋＋α）以下であった。しかしながら、ローリ−法で得られた値は１％溶液に対するＥ＝１０の値を用いて２８０ｎｍにおける吸光度から得られた値とよく一致している。ローリ−法によって評価された蛋白質の値を用いて、精製されたプリンの特異的な活性が約４０〜８０ｍ１Ｕ／■であることがわかった。

プリンの等電点（ｐりを、ファルマシアファスト　システム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓｔ　ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、ｐＨが３から９の範囲の等電点電気泳動ゲルを用いて製造者の使用説明書に従って測定した。プリンをゲルの中央に供した。同一条件下で使用される等電点電気泳動マーカーはアミログルコシダーゼ（ｐＴ＝３゜５）、トリプシンインヒビター（ｐｌ＝４．６）、Ｂ−ラクトグロブリン（ｐ＋＝５．１）、炭酸脱水酵素！及びＩＩ（ｐｌ＝５．９及び６．６）、ミオグロブプリン（ｐＩ＝６．７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＰＩ＝８．５）及びトリプシノーゲン（ｐｌ＝９．０）であった。フォーカシング（ｆｏｃｕｓ　ｉｎｇ）後、ゲルを展開し、生じたバンドは銀染色（図３）により可視化した。

プリンの等電点は、ニグリンＣが６．４５またニグリンＢが６．６という公開レポートと比較して、約４．６であることがわかった。（この２つのニグリンは１つのアミノ酸が異なり、ニグリンＢのヒスチジンがニグリンＣではチロシンになっている。）分立ｌプリンの分子量はレムリ（Ｌａｅｍｌｌｉ）（文献２３）による記載の通り５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定された。

１６％と２０％の同種ゲルにおいて、精製されたプリンは還元条件下で１４．４キロダルトンの丁度下部のバンドとして移動した（図４）。同一条件下で使用される、分子量マーカーはフォスフォリラーゼＢ（９４キロダルトン）、ウシの血清アルブミン（６７キロダルトン）、卵白アルブミン（４３キロダルトン）、炭酸脱水酵素（３０キロダルトン）、トリプシンインヒビター（２０キロダルトン）及びラクトアルブミン（１４，４キロダルトン）である。

しかしながら、プリンが８Ｍ尿素の存在下で５ＤＳ−ＰＡＧＥによりスウォンクとムンクレス（Ｓｔａｎｋ　＆　Ｍｕｎｋｒｅｓ）　（文献２４）の方法に従って分析された時、この試料をクーマシーブルー染色により可視化するのは難しいことがわかったが、銀染色すると、プリンは分子量が約２１から２５キロダルトンに相当する移動性を有することのある示唆が得られた。スウォンクとムンクレスの方法による低分子量蛋白質類およびペプチド類の分子量決定に適した低分子量試料“エレクトラン（ＥＩｅｃ＋ｒａｎ）”を図４に示すように引用した。これら２つの方法による分子量の差異は現在説明できない。（ニグリンの分子量は８．１キロダルト色素性基質を用いる分析方法により、プリンの阻害活性と、エラスターゼ、カテプシンＧ、キモトリプシン、トリプシン及びトロンビンのようなセリンプロテアーゼとの比較を行った。各酵素について用いられた詳細な分析条件を表１に示す。

要約すると酵素の一定量を５分間、３７℃で適切な緩衝液中で異なる濃度のプリンとインキュベートした。まず、色素性基質を加えて反応を開始し、４０５ｎｍでの吸光度増加を追跡した。

インヒビターを除いたコントロール分析の初期速度を各酵素について１００％とした。得られたデータから、各酵素の活性を５０％阻害するのに必要なプリンのモル濃度（ＩＣ”）を計算した。

この結果、プリンはキモトリプシン、カテプシンＧ及びエラスターゼに対して有効なインヒビターとなるが、トリプシンやトロンビンに対してはほとんど活性がないということがわかる。各酵素について計算されたＩＣ６０値は、キモトリプシン、カテプシンＧ、エラスターゼ及びトリプシンの１モル当り、それぞれプリン０．１３．０．２５．０．３２及び２０．４モルであった。

ＬｌＡ！凰広精製されたプリンをガス状のアリスター（ＡＲＩＳＴＡＲ）ＨＣＩで、減圧下１１０℃、２４時間と４８時間で加水分解した。加水分解された混合物はアミノ　クロムシステム（Ａｍｉｎｏ　Ｃｈｒｏｍｅ　Ｓｙｓｔｅｍ）でアミノ酸組成を分析した。ニグリンＣと比較して、遊離アミノ酸の定量分析を行うために８１００ダルトンの分子量をプリンに対して使用した。表２に示す結果から、２つのインヒビターのアミノ酸組成は全く違っていることがわかる。特に、プリンはニグリンＣと比較して、アスパラギン酸（＋アスパラギン）及びアラニンの量が非常に多く、ヒスチジンを含まず、イソロイシンを含む。

円偏向二色性抗エラスターゼの円偏光二色性スペクトルを、０．１％ＴＦＡ中の０．０２ｏｎセル長のセルを使用して得た。このスペクトルをレフ−ニグリン（ｒｅｃ−ｅｇｌｔｎ）　（図８）を使用して得たスペクトルと比較した（図８）。レフ−ニグリンはベーゼルのチバガイギー社（Ｃｉｂａ　Ｇｅ１ｇ７．Ｂａ５ａｌ）からの提供品である。このデータをコンテイン（ＣＯＮＴＩＮ）分析法によって評価するとプリンの三次構造はへリックス構造を持たず、５８％はベータシートで４２％が無秩序な構造であり、これに比較してニグリンＣでは１９％がヘリックス構造であり、′５６％がベータシートであり２５％が無秩序な構造である。このように異なる二種のヒル由来のエラスターゼインヒビターは著しく異なり、Ｎ末端アミノ酸配列においても差異が見られる（以下参照）。

！圭丘旦笈精製された抗エラスターゼのＮ末端アミノ酸配列を決定し、この結果としてアミノ酸残基２９１１　目までの一本鎖配列を得た。

配列中にシスティン残基の存在を確認するため、精製された試料をジチオスレイトールにて還元し、そしてシスティンを４−ビニルピリジンと反応させてピリジルエチルシスティンへと誘導した。この誘導した試料のアミノ末端配列分析を繰り返し得られた結果を表３に示す。この部分配列とニグリンにがその一次構造において著しく異なることが認められる。

プリンの完全なＮ末端の配列をめるため、精製された物質を前と同様に還元し、誘導体化した後、次の条件下ＴＰＣＫ−トリプシン、ＴＬＣＫ−キモトリプシンあるいはｖ８プロテアーゼにて消化する。

プリンをＴＰＣＫ処理トリプシンにて、プリン：トリブシンが５０：１（ｗｔ／ｗｔ）の割合で消化した。反応は０．１ｍ１２の０．０５Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ８，０）中にて３７℃で４時間行った。反応は反応液を凍結乾燥することで停止し、トリプシンによるペプチドをＨＰＬＣにて分離したく図５）。

ＴＬＣＫ処理キモトリプシンによる消化を上記と同様の条件下実施した。生じたペプチド断片をＨＰＬＣにて分画した（図６）。

プロテアーゼｖ８での消化については、精製されたプリンを０゜０５Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ７，９）中にて５μｇの酵素と混合した。混合物を室温にて２４時間インキュベートした後生じた断片をＨＰＬＣにより分離した（図７）。

望邂１録ｊ慢１惟等量のプリンをシリカゲル共存減圧化にて脱水した。各試料を次いで酢酸、エタノール、ブタノール、アセトン［以上全てアナラー（Ａｎａｌａｒ）級試薬］のいずれか、あるいは蒸留水に溶解させ、１０分間室温にて撹拌する。次いで各試料から溶媒を傾斜法にて新しい別の容器に入れ、凍結乾燥する。色素を用いる分析によりプリンの全量を阻害単位（］Ｕ）にて決定した。

得られた結果からプリンは上記条件下検討した全ての溶媒中で安定であり、溶解性の順序は水〉酢酸〉エタノール〉アセトン〉ブタノールであることが示される。

１工叉ヱ惺別の実験において、プリンは１００℃の高温で３０分までは安定であり、阻害活性の損失は無視できる程度であることが判明した。

著者名　文献名１．　Ｌ、Ｊ、シ７ンシオラ　Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｏ１７ｍｏ＋ｐｂｏＩＩｏｅｌｅｉｒ　ｌ＊ａｅｏｃ７１ｓ（Ｌ、Ｊ、Ｃ１ａｎｃｉｏｌａ）　！ａＩＩｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｂａ＋ａａｎ　ｐｅ＋１ｏｄｏｌａｌ　ｄｉｓｅｘ＋ｓ。

ＮａＩｕｒｅ、　１９７７；２６５：４４５−４４７゜２、Ｄ、ワルター・コーヘン　Ｐｅ＋１ｏｄｏｎｌａｌ　ｅｕｎｉｆｓｔ＋ｔｔｉｏｎ＋　ｏｆ　ｃ７ｃｌｉｅ（Ｄ、１ａＨｅ＋　Ｃｏｈｅｎｌら　ｏｒａｌ＋口ｐｕ＋ｉｍ。

ｌ　Ｐ＠ｒｉｏｄ、　＋９６１；３２：１５９−１６８゜３、Ａ、ヤノフ（Ａ、Ｊａｎｏｌｌ）　Ｓｙ＋ａｐｏｓｔｏｍ　ｏｎ　ｎｅｕｌｒａｐｈｉｌ　ｐｒｏ＋＊＊ｓｅ　ａｘｍ＊ｄｉｓｌｏｒｔ　ｏｌ　＋ｉ■ｕｓ　１ｎｉＩＩｒ７゜Ｊ　Ａａ＋　Ｐａｔｈ、　＋９７２；６８：５３９−６２３゜４、Ｓ、Ｊ、ワイズ（Ｓ、ｊＪｅｔｇ）　Ｔｉ＋＋＋ｎ　ｄｕｔｒａｃ＋ｉｏｎ　Ｊ　ｎ５ａｕｏｐｈｉｌｓ。

Ｎ＠ｖ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ、　１９８９；３２０−６；３６５−３７６゜５、Ｐ、Ｍ、　ヘンソン　Ｔｉ５ｓｕｓ　１ｎｉｕｒｙ　ｉｎ　ｉｎｌｌｍｍｍｍｔｉｏｎ、　Ｊ　Ｃ１１ｎ（Ｐ、Ｍ、Ｔｏｎｓｏａｌら　Ｉｎｖ＠ｓｔ、　１９ ’８７；’７９°６６９−６７４゜６、Ｅ、１．力ンプベル　Ｐ＋ｏｔ−ｏ１７ｓｉｔ　ｂ７　ｎ５ａｕｏｐｈｉｌｓ。

（Ｅ、Ｊ、Ｃｓ＋ａＰｂｓｌｌ）ら　Ｊ　Ｃｌ１ｎ　ＩｎｖｓｓＬ、　＋９＋＋２；７０：８４５−８５２゜？、１．１．レイラー　Ｎ＠ａ＋ｎｐｂｉｌｓ　ａｎｄ　ｈｏｔｌ　ｄｅｆｅｎｃｅ、　ＵＣＬＡ　ｃｏｏｌｅｒ（Ｒ，１，Ｌ＊ｂ＋ｅ＋）ら　Ａ、、　ｉｎｔ　１ｉｅｄ、　１９＄９；１０９：１２７−１４２゜！、（Ｊ、シマジー二Ｃｒｅｖｉｃａｌｕ　Ｈａｉｄ　ａｙｄｓ＋ｅＬ（Ｇ、Ｃｉｍａｓｏ＋＋ｉ）ら　Ｍｏ＊ｏｇｒａｐｂｓ　Ｉｎ　ｏｐａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ　１２．　ｅｃ　Ｆｌ。

Ｍ、Ｍｒｅ＋ｓ、　ＰＪｌａｄ＊１Ｐｂｔｓ、　Ｐｅ、にｓｒｇ＠＋　１９８３゜９、Ｊ、スカルクラエイフ　Ｔｉｘｓ＋＋ｅ　ｄａＩＩＩａｇｅ　ｉｎ　＊ｔｉ＋＊ｒｉ＋ｎｅ＋＋ｕｌ　ｅｕｈ＋１ｔｉｓ：（ｊ、ｓｊｈａｌｋｗｉｉｋ）　ＩＭ　ｒｏｌａ　Ｏｆ　ｏｘｒｔ＠ｏ　ｍ＊１ｍｌ＋ｏｌｉｌｅｔ　ａｎｄ　ｎｅｕ＋ｎｌｐ＋ａ＋ｅｓｓ＊ｓ、　Ｔｈ＠ｓｉｓ、　Ｎｉｊｍ＠ｇｅｎ　Ｆｌｏｌｌａｏｄ　１９８６゜１０、　Ｈ，Ｄ、ダッキン（）１．Ｄ、Ｄｓｋｉｎ）　Ｏｎ　ｌｂｓ　＋＋ｓｓ　ｏｌ　ｃ＠ｒ＋５Ｉｆｉ＋ｎｔｉｓ＊ｐ＋ｉｃ＋ｕｌ＋１ｓｎｃ命５ｉｎＩｂ＊ｌ＋ｓａ１ｍ＊ｎ１ｏｆｉｎｌｓｃｌｅｄ曹ｏｕａｄ寥。

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Ｂ＋　Ｍａｄ　Ｊ、１９１６１１：８５２−８５４゜＋３．　Ｈ，Ｄ、ダッキン（Ｈ，Ｄ、Ｄｓｋｉｎ）　Ａ　＋ｅＰｏ＋Ｉ　ｏｎ　Ｉｈ＊　ａｔｅ　ｏｌ　ｄｉｅｈｌｏ＋５ｍ１Ｉｌｅ−！（ｊｏ１ｍｕ＋１　１ＩＩｔｈｅ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｌ　ｉｎｊ＠ｃｔｅｄ菅ｏａｎｄｓ。

ＪＡＭＡ、１９Ｈ；６９：２７−３０゜＋４．　Ｓ、１．ウニイス　Ｌｏａｆ− １ｉｖ＠ｄ　ｏｘｉｄａｎｔｓ　（ｅｎ＊＋ｍ＋ｅｄ　ｂｙｈａ＋ｏｎ（Ｓ、Ｊ、Ｗ！１ｓｓ）ら　ｏ＠＋＋Ｈｏｐｈｉｌｓ：　ｃ１ｍｓｃ＋＠ｒｉｚａｔｉｏ＋＋　ｍａｄｋｉａ聰ｅｌｉｖｉ１７ＳｃｉｅｎｃＣ１９８３；Ｚ！２：６２５−６２８゜＋ｓ、　Ｊ、Ａ、クランプス　夏ａ＋ｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｍｏｎｇｓｔ　Ｎｉ＋ａａｌｓｌｅｄ　ｂ＋＋ｍａｎ（１，Ａ、に「ｍｍＰｓ）らＦ０１Ｆｍ０１ＦｂＯ１＋＋ｅｌｌ＊ｌ１ｓｃｋｏｃ７１ｓｓ、＋ｅｌｅ＊ｓ＊ｄ＊１ｍ５ｌａｓ＊　ｓ＋＋Ｉ　ｂ＋ｏｎｃｂｅｓｌ　ａｎｔｔ＋ｅｕＣｏｐ＋ｏ＋ｅａ＋ｅ。

Ｃｌ１ｏ　５Ｃｉｅｏｃｓ、１９８８；７５：５３−６２゜！６．ボンーフヌールロース　Ｄｉｒｅｃｔ　ａｎｄ　ｉｍ＋＋ｕｕｕ−ｃｅｌｌ−ａ＋＊ｄｉ＊ｌｓｄ　ｅｌｌｓｃ＋ｔ　ｏｌ（１１ｏｍ−ｗＮｏｏ＋１ｏｏｔ）ら　Ｂｍｅｌｅ＋ｏｉｄｅｓ　ｇｉａｇｉマ自ｌｉｔ　ｏｎ　ｂ＋ｏ＋ｓ　ｍＮａｔｏｌｉ＋ｍｉｎ　νｉＨｏ。

Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｐｅ＋１ｏｄｏｎｌａｌ、　１９８９；１６：４１２−４１８゜１７、１　Ａ、キエルテイス　’　Ｄ＠ｊ＠ｃｔｉｏＩＩＯｆ　ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ　５ｔｏｏｐｓ　Ｍａｄ（Ｍ、＾、Ｃ＋＋ｕｉｓ）ら　１ｏ４ｉｖｉｄ＋＋ａｌｔ　ｌｏｔ　ｐ＠ｒｉｏｄｏｎ＋鴫１　ｄｉｓｅａｓｅｓ。

Ｊ　Ｃｌ１ａ　Ｐｅｒｉｏｄｏｎｌａｌ、　１９８９；１６：１−１１゜ＩＩｌ、　Ａ；Ｂ、カーベンター　Ｔ−ｕｌｌ　ｏｍｉｓｓｉ＠ｎ　ｏｆ２ｏ１７ｅｌｏｏｓｌ　Ｂ−ｃｅｌｌ（Ａ、Ｂ、Ｃｓ＋ｐｒａｎ＋）らｓｃ＋１ｖａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｓｄｂｔｓｘｔｒｓｃｔｓｏｆｏｒａｌ　ｂｓｃｌ＠ｒｉａ　＊ｔ＋ｏｃｉｓ＋ｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒｉｏｄｏｎｎｌｄｉｓｅａｓｅ。

Ｉｎｌ　１ａＩＩＩｉｆｆｉ、１９８４；４３−１：３２６−３３６゜＋９．１．カールソン　Ｄｅｇｒｓｄｓｌｉｏａ　ｏｌ　ｌｂｓ　＆＋＋ｍａｎ　ｐ＋ｏ＋ｅｉ＋ｕ＊ｅ（１，ｃａｒｌ＋５ｏａｌら　ｉ＋＋ｈｉｂｉｌｏ＋ｓ　ｍ１Ｐｈｓ−１ｍ＋＋＋ｉｊ＋ＦＰｓｉｎ　ａｎｄ　５ｌｐｂｓ−２＋ｉａｃｒｏｇｌ＋ｂａｌｕ＋　ｂ７　Ｂａｃｕ＋ｏ＋ｄｕ　ＨＢ＋ｗａｌ＋ｓ夏ｏ１ｓｃ＋１ｍｍ＋＋ｏ、寛９８４；４３−２：６４４−６４８゜２０、に、モリハラ（Ｋ、Ｍｏ＋１ｈｕａｌら　Ｐ＋ｏｆｅａｓ＊　ｍｏｄ　ｅ１ｍｓｔ＊ｓｓ　ｏｆ　Ｐｓｅｕｄｏｗｏｎｔｓ■＋＋＋Ｈｕｏｓｓ：１ｕｃｔｉｎ＋ｉｏｎ　ｏｌ　ｈ＋＋ｍａｎ　ｐｌｕｓｅｓ＊１ｐｈｉ−１ｐ＋ｏｔｅｉｏ＊ｓ＊　１ｎｈｉｂｉｔｓ＋。

Ｉｎｊ＠ｃｔ　１ｍ＋ｎ＋＋、　１９７９：１４：１０−１９３゜Ｚ＋、　Ｕ、セーミエラー　Ｅｌｆｉｎ：　ｅｌ＊ｓ＋５ｓｅ−Ｃ＊＋ｈ＠Ｐｓｉａ　Ｇ　１ｎｈＨ＋Ｎｏ＋　Ｉ＋ｏｍ（Ｕ、ＳｓｅｍＶｌｌｓ＋）ら　ｌ５ｅｃｈｅ＊。

Ｔｏ＋ｈ　Ｅ＋ｓ７ｍｏ１．　１９８１，８０４−８１６゜２２、　Ａ、Ｍ、ゴールドスティン　５ｅｔｉＩＩ＠ｐｒｏｔｅｓｔｓ　１ｎｈｅｒｉｔｏｒｓ　ｏｌ　ｎｏｒｔｈ（＾、Ｉ１．Ｇｏｌｄｓｌｅｉｎｌら　＾ｍｕｉｃａｏ　ｌ・ｅｃｈ＠ｓ。

Ｃａ＠ｐ　Ｉｌｊｏｃｈｅｍ　ｐＤｔｉｅｌ、　１９８９；８４Ｂ：１１７−１２４゜２３、υ、に、レムリ　＋９７０．　Ｎ５ｌａ＋＊；２Ｚ７：６８０−６８４、（Ｕ、に、Ｌｓ＠＋５ｍ１ｉ）２４、　Ｒ，Ｔ、スワンク　１９７１．　Ａ＋＋ｓｌ　Ｂｉｏｃｈ＊ｍ；３！１４６２−４７７゜（Ｒ，Ｔ、５ｖａｎｋ）ら２５、　Ｅ、Ｂ、ショッツ　ｂ＋ｒｉｃ＊ｌ１ｕｌｕ　ｐ＋ｏ＋５ｏ１７目ｅ　５ｃｌｉｖｉｔ７　ｏｆｆＥ、Ｂ、Ｓｂｏｆｎ）ら　Ａｓ＋ｏ＋５ａｎａ＊　ｈ　ｄ＋ｏ　ｈｉｌｔ　ｅｏｍｐｌ＠ｘ。

Ｆｉｓｈ　Ｐｉｔｈａｌｏｇｙ、１９８５：２０：３７−４４゜標準操作法　コード　ページゲリン検定プリンはヒルに由来する新規なプロテアーゼインヒビターである。検定の原理は合成色素性基質Ｓ−２５８６に対するα−キモトリプシン活性の阻害を測定することである。α−キモトリプシン活性は基質の消化により遊離する着色性Ｐ−ニトロアニリン基を４０５ｕｍにおいて分光光度的に追跡することで測定できる。

プリンの存在に基づくα−キモトリプシン活性の低下が阻害活性に関連している。

ｌ血立皇簾 α−キモトリプシン活性（Ｕ）の１ユニツトはｐＨ８，３，２５℃にて基質Ｓ− ２５８６を毎分１ｕ　ｍｏｌｅの割合で加水分解する。

阻害活性（ＩＵ）のｌユニットはｐ）＋８．３．２５℃にて基質Ｓ−２５８６を毎分１ｕ　ｍｏｌｓの割合で、酵素触媒による加水分解反応を低下させる。

標準操作法　＝−ド　ベージゲリン検定韮！玉　史簾ヱニ左二 α−キモトリプシン　シグマ　ｃ２４１９Ｓ−２５８６カビヴイトラム　８２０ｇ９４氷酢酸　ＢＤＨ１０００１食塩　シグマ　３９６２５トリス　シグマ　Ｔ１５０３塩酸　Ｂ　Ｄ　Ｈ１０３０７ゲリン　自家調製９６“Ｕ°ウェルマイクロ　ミツドランドラボラトリーズタイタープレートタイターチック　フローラボラトリーズユニスカン！■ マイクロタイタープレートリーダー（４０５ｕｍのフィルターを装着）標準操作法　コード　ベージゲリン検定溶液の調製１、遺産１致ｉ地０、１Ｍ　）リス／塩酸ｐＨ８，３、ＩＭ食塩２、キモトリプシン溶液４ｕｇ／ｍ　Ｑ　α−奔モモトリプシン水溶液３負車速玉！１．０ｍＭ　Ｓ−２５８６水溶液４、廷ｙ粘直１氷酢酸を水と１：ｌに混合稀釈する標準操作法　コード　ページゲリン検定墓亙豊１、検定はマイクロタイタープレートのウェル中にて実施する。

各ウェルには次のものが含まれる。

１００ｕ　Ｑ　検定用緩衝液５０ｕΩ　被検プロテアーゼインヒビター５Ｑｕ　Ｑ　キモトリプシン溶液２、混合物を２５℃にて５分間インキュベートする。

３、反応はＺ５ｕ怠の色素性基質溶液（Ｓ−２８５６１ｍＭ）を加えることで開始する。反応開始時間（２）を記録し、反応混合物を２５℃にて５分間インキュベートする。この条件下で基質濃度に制限はない。

４、反応は５０％酢酸を２５ｕΩ加えて停止される。

５、遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度をマイクロプレートリーダー上で４０５ｎｏ＋にて測定する。

ノート４０１ｕｍに固有の後攻を示す試料に対しては対照ブランクを置き試料のみによる吸光度変化量を除外する必要がある。ブランクはＳ−２５８６の添加を除いて同一の検定条件下に反応を行ったものを用いる必要がある。

検定法を標準化する目的で、阻害活性既知の自家調製したプリン標準品を被検試料と同一条件下で用いることが必要である。

標準操作法　コード　ページゲリン検定１、被検試料の阻害活性は阻害活性度既知の自家調製プリン標準品との直接比較により測定される。活性の定量化は被検試料と標準品から得られる稀釈曲線のコンピューターによる投与量割合分析（ｄｏｓｅ　ｔａａａ　ａｎａｌｙｓｔｓ）により行う。

２、別に、被検試料の阻害活性は次式を用いて計算によりめられるＡ＝Ｅ　ｃ　Ｑ　Ａ＝吸光度Ｅ＝モル吸光係数（ｒ’ｃｍ″″ｌ）Ｃ；産生物濃度（Ｍ） Ω＝セル長（ｃｍ）着色産生物のモル吸光係数は含量既知の基質とα−キモトリプシンとの反応が完了するまで（即ち色の変化が見られなくなるまで）インキュベートすることで実験的にめられる。

このＥ値は４０５ｎｍの吸光度として１０．５００Ｍ−”、ａａ−”と決定された。

阻害条件及び非阻害条件下での毎分当り作られる産生物の濃度の差を測定することで被検試料の阻害活性がめられる。

標準操作法　コード　ページゲリン検定迭ヱ旦玉里プリンはヒルに由来する新規なプロテアーゼインヒビターである。検定の原理は合成色素性基質５ＡＡＡＰに対するエラスターゼ活性の阻害を測定することである。

エラスターゼ活性は基質の消化により遊離する着色性ｐ−ニドロアニシン基を４０５ｎｍにおいて分光光度的に追跡することで測定できる。プリンの存在に基づくエラスターゼ活性の低下が阻害活性に関連している。

至血二嵐暮エラスターゼ活性（Ｕ）の１ユニツトはＰＩ（８，３，２５℃にて基質５ＡＡＡＰを毎分１ｕ　ｍｏｌｅの割合で加水分解する。

阻害活性（ＩＵ）のＩユニットはＰＨ８，３，２５℃にて基質５ＡＡＡ？を毎分１ｕ　ｍｏｌｅの割合で、酵素触媒による加水分解反応を低下させる。

標準操作法　コード　ベージゲリン検定兜！！！！！ヱニ立二エラスターゼ　シグマ　Ｅ１２５０ＳＡＡＡＰ　：　Ｎ−サクシニル　カルバイオケム　５７３４５９−り一（アラニン）３ −Ｐ−ニトロアニリド氷酢酸　ＢＤＨ１０００１食塩　シグマ　３９６２５トリス　シグマ　Ｔ１５０３塩酸ＢＤＨ１０３０７ゲリン　自家調製 ■ ９６’Ｕ’ウエル　マイクロ−ミツドランド　ラボラトリーズタイタープレートタイターチック　フローラボラトリーズユニスカン１１マイクロタイタープレートリーダー（４０５ｎｍのフィルターを装着）標準操作法　コード　ページゲリン検定溶液の調製１、五主五星１区０．１Ｍトリス／塩酸ＰＨ８，３、ＩＭ食塩３、色素性基質１、ＯｍＭ　５ＡＡＡＰ水溶液４．５０％氷酢酸氷酢酸を水とｌ：ｌに混合稀釈する標準操作法　コード　ベージゲリン検定遺足茎１、検定はマイクロタイタープレートのウェル中にて実施する。

各ウェルには次のものが含まれる。

１００ｕ　Ｑ　検定用緩衝液５０ｕ　Ｑ　被検プロテアーゼインヒビター５０ｕ　Ｑ　エラスターゼ溶液２、混合物を２５℃にて５分間インキュベートする。

３、反応は２５ｕ　Ｑの色素性基質溶液（ＳＡＡＡＰ　１ｍＭ）を加えることで開始する。反応開始時間（【）を記録し、反応混合物を２５℃にて３０分間インキュベートする。この条件下で基質濃度に制限はない。

４、反応は５０％酢酸を２５ｕ　Ｑ加えて停止される。

５、遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度をマイクロプレートリーダー上で４０５ａｍにて測定する。

ノート４０５ｎｍに固有の吸吹を示す試料に対しては対照ブランクを置き試料のみによる吸光度変化量を除外する必要がある。プランクは５ＡＡＡＰの添加を除いて同一の検定条件下に反応を行ったものを用いる必要がある。

標準操作法　コード　ベージゲリン検定１、被検試料の阻害活性は阻害活性度既知の自家調製プリン標準品との直接比較により測定される。活性の定量化は被検試料と標準品から得られる稀釈曲線のコンピューターによる投与量割合分析（ｄ’ｏｓｅ　ｔａｔｉｏ　ａｎａ１７ｓｉｓ）により行う。

２、別に、被検試料の阻害活性は次式を用いて計算によりめられるＡ＝ＥｃＱ　Ａ＝吸光度Ｅ＝モル吸光係数（Ｍ″”ａｎ−”）Ｃ＝産生物濃度（Ｍ）Ｑ＝セル長（ａ＋ｉ）着色産生物のモル吸光係数は含量既知の基質とエラスターゼとの反応が完了するまで（即ち色の変化が見られなくなるまで）インキュベートすることで実験的にめられる。

このＥ値は４０５ｎｍの吸光度として１０，５００Ｍ″″”ｃｏｉ−”と決定された。

標準操作法　コード　ページゲリン検定豫２立工里プリンはヒルに由来する新規なプロテアーゼインヒビターである。検定の原理は合成色素性Ｓ−２２３８に対するトリプシン活性の阻害を測定することである。

トリプシン活性は基質の消化により遊離する着色性ｐ−ニトロアニリン基を４５０ｎｍにおいて分光光度的に追跡することで測定できる。プリンの存在に基づくトリプシン活性の低下が阻害活性に関連している。

星像二星暮トリプシン活性（Ｕ）の１ユニツトはｐＨ８，３，２５℃にて基質Ｓ−２２８３を毎分１ｕ　ｍｏｌｅの割合で加水分解する。

阻害活性（１０）の１ユニツトはｐＨ８，３，２５℃にて基質Ｓ−２２８３を毎分１ｕ　ｍｏｌｅの割合で、酸素触媒による加水分解反応を低下させる。

標準操作法　コード　ベージゲリン検定トリプシン　シグマ　Ｔ８２５３Ｓ−２２３８カビヴイトラム　８２０３２４氷酢酸　ＢＤＨ１０００１食塩　シグマ　３９６２５トリス　シグマ　Ｔ１５０３塩酸　ＢＤＨ１０３０７ゲリン　自家調製 ■ ９６　’Ｕ’ウェル　ミツドランドラボラトリーズマイクロタイタープレートタイターチック　フローラボラトリーズユニスカン■１マイクロタイタープレートリーダー（４０５ｎｍのフィルターを装着）標準操作法　コード　ページゲリン検定１、適産工致髪匡０、１Ｍ　トリス／塩酸ｐ［（８，３、ＩＭ食塩２、エラスターゼ溶液４０ｕｇ／ｍ　Ｑ　トリプシン水溶液３、色素性基質１．０ｔｏＭ　Ｓ−２２３８水溶液氷酢酸を水と１＝１に混合稀釈する標準操作法　コード　ページゲリン検定１足族１、検定はマイクロタイタープレートのウェル中にて実施する。

各ウェルには次のものが含まれる。

１００ｕ　Ｑ　検定用緩衝液５０ｕ　Ｑ　被検プロテアーゼインヒビター５０ｕｊ２　トリプシン溶液２、混合物を２５℃にて５分間インキュベートする。

３、反応は２５ｕ　Ｑの色素性基質溶液（Ｓ−２２３８１ｍＭ）を加えることで開始する。反応開始時間（１）を記録し、反応混合物を２５℃にて５分間インキュベートする。この条件下で基質濃度に制限はない。

４、反応は５０％酢酸を２５ｕ　４１加えて停止される。

５゜遊離したｐ−ニトロアニリンの吸光度をマイクロプレートリーダー上で４０５ｕｍにて測定する。

ノート４０５ｕｍに固有の後攻を示す試料に対しては対照ブランクを置き試料のみによる吸光度変化量を除外する必要がある。ブランクはＳ−２２３８の添加を除いて同一の検定条件下に反応を行ったものを用いる必要がある。

標準操作法　コード　ページゲリン検定１、被検試料の阻害活性は阻害活性度既知の自家調製プリン標準品との直接比較により測定される。活性の定量化は被検試料と標準品から得られる稀釈曲線のコンピューターによる投与量割合分析（ｄｏｓｅ　ｒａｔｉｏ　ａｎａｌｙｓｉｓ）により行う。

２、別に、被検試料の阻害活性は次式を用いて計算によりめられるＡ＝Ｅｃｆｉ　Ａ＝吸光度Ｅ＝モル吸光係数（Ｍ−”ｃｍ−”）Ｃ＝産生物濃度（Ｍ）Ｑ＝セル長（ａｍ）着色産生物のモル吸光係数は含量既知の基質とトリプシンとの反応が完了するまで・（即ち色の変化が見られなくなるまで）インキュベートする二七で実験的にめられる。

このＥ値は４０５ｕｍの吸光度として１０，５００Ｍ−”０１１−”と決定された。

肉′に　する予備試験的な研究本研究のために８名のボランティア患者を選別した。１別の基準は：文献（）に記載の標準法に基づき測定した場合、少くとも４本の歯に３〜５ｍｍの深さの小溝ポケットを有し、探針時出血し、開口した虫歯や著しい歯周疾患はなく、他の健康状態は良好で、最近治療歴のない目視で確認できる歯垢を蓄積している慢性歯肉炎患者である。被検患者は年齢２３〜４６歳の男性と女性であった。

実験は通常の治療法として行われる歯肉下の潅注を４本の被治療歯に６日間毎日行うことで実施した。各種測定を基準日及び６日日に行った。被検患者には彼らの通常の口腔清浄方法を変更しないよう注意を与えた。実施した測定項目として：ＰＩ　［シルネスと０−（ＳｉｌｎｅｓｓとＬｏｅ）（Ａｃｔａ−０ｄｏｎｔ、５ｃａｎｄ、１９６４；２２：　１２１）に基づく歯垢指数（Ｐｌａｑｕｅ　Ｉｎｄｅｘ）コとＰＢＩ［Ｈ，Ｒ，ムールマン（Ｈ，Ｒ，Ｍｕｈ　ｌｅｍａｎｎ、：Ｊ。

Ｐｒｅｖ、Ｄｅｎｔ、１９７７；４：６）に基づく乳頭出血指数（Ｐａｐｉｌｌａ、ｒｙ　Ｂｌｅｅｄｉｎｇ　Ｉｎｄｅｘ）コを採用した。全ての被検患者は同様な治療を受け、負のコントロール患者は置かず、６名には試験物質を、２名には偽薬を投与した。凍結乾燥した粉末状ボラン２０　ｍ　ｇを８ｍｌの標準溶液に溶解した。この標準溶液は２重量％のカルボキシメチルセルロースナトリウムを加え、ゲル化するまで撹拌した等張水／グリ七ロール（６０％：４０％）の滅菌混合物である。

次いでこのゲルを中空針を有する滅菌済マイクロ注射器に入れ、各被検患者に投与した。

各歯肉下潅注はボランを含有する標準ゲル化溶液のｏ、０５ｍ１を被検歯の肩囲の各歯周ポケット内へ注入することで基準日におけるボラン投与群のマＰＩ　：２．２＋０．７基準日におけるボラン投与群のマＰＢＩ　：　２．３＋０．８実験の終了時ｘＰＩは１．０±０，６へ、一方ＸＰＢＩは０．６±０．３へ減少した。

偽薬投与群のマＰＢＩは２．０±０．６、マＰＢＩは２゜４±１．０であった。

実験の終了時の偽薬投与群のマＰＩは１．７±０．７へ減少し、ＸＰＢＩは１．９±０．６であった。

ボラン投与群のＰＩ低下率は基準日の値と比べて５５％、偽薬投与群と比べて４２％であった。

ボラン投与群のＦＢＩ低下率は基準日の値と比べて７４％、偽薬投与群と比べて６５％であった。

考」レテスト結果に見られるように臨床上有意な著しいＰＢＩの低下はＰＭＮ由来中性プロテアーゼ（エラスターゼ、カテプシンＧ）を阻害することで歯肉基質を蛋白質分解することを抑制するプロテアーゼ阻害機構を示唆する。重要性は小さいが、有意な歯垢蓄積の低下は歓迎されるし、おどろくべきことである。この効果は支持組織の蛋白質分解の阻害により歯垢における歯周疾患微生物の生育に必要な栄養素量が減少するという事実に従うと考えられる。

プラスミンに対する　果ボランのプラスミン阻害活性の測定実験を実施した。プラスミン活性は色素性基質Ｓ−２２８８（Ｈ−Ｄ　Ｉ　Ｉ　１　ｅ−Ｐｒ　ｏ−Ａｒ　ｇ−ｐ’ＮＡ）の消化によるｐ−ニトロアニリドの放出を測定することで行った。プラスミン（５０μｍ、４０μｇ／ｍｌ）を種々の濃度のボラン（５０μｍ、１０μｇ／ｍ　１　、５　ｐ　ｇ　／　ｍ　１　、２　、５　ｐ　ｇ　／　ｍ　１と１．２５ｐｇ／ｍ１）とインキュベートした。結果としては、最高濃度のボラン（１０μｇ／ｍｌ）でもプラスミンの阻害は起こらないことが示されている。

ペプシンに対する効果酸性プロテアーゼ　ペプシンに対するボランの阻害活性の測定実験を実施した。

ペプシン活性はｐＨ２，０でのヘモグロビンの蛋白質分Ｍを測定することで行った。ペプシン（２５／Ｊ　１，８ｍｇ／ｍｌ脱ミネラル水）を６０分、３７℃にてボランインヒビターの存在または非存在下ヘモグロビン基質（１００μｌ、１０ｍｇ／ｍ１　２０％酢酸、ｐＨ２，０）とインキュベートした。未消化のヘモグロビンをトリクロロ酢酸（１００μｍｌ　１０％ｗ／ｖ）にて沈殿化し、上清の加水分解された蛋白質を２８０ｎｍにて測定した。結果からボランの最高濃度（７５μｓ／ｒｐｌ）においてさえペプシンの阻害は起こっていない。加えて、予備的な実験からボランはペプシンにより分解されないことが示唆されている。

グユＺ立分盪夏（１）ヒル種ヒルシナリア　マニレンシスを注意して３つ：頭部、体部と消化管内層部、に切断する。各部を蒸留水にて良く洗浄し、不純物（例“えば血液）を除去する。各部をエタノールで脱水し、抽出液をエラスターゼ阻害活性測定に供する。

大半の活性（７５％以上）は体部からの抽出液に存在した。

ヱｌとΩ立蔓匡（２）個々のヒルを８％エタノールに浸漬することで粘液を分泌せしめた。粘液を集め、５回蒸留水で抽出した。抽出物を合わせ標準検定法を用いて阻害活性を測定した。予備的な検討の結果、阻害活性は粘液抽出物に存在することが示されている。粘液分泌物に存在する全ボラン活性はボランの部分的精製のためにスキームで集めたエタノール抽出物について測定した値よりも小さい。

長期インキュベーションボランを等量ずつ、室温での長期間の安定性（即ちシェルフライフ）をめるため種々の口腔洗浄液や歯磨ペーストゲル剤に加えインキュベートした。１００日間にわたる温度の変動は１７℃〜３６℃の間であった。

キモトリプシンに対するプリンの阻害活性は全てのテストした口腔洗浄液やゲル剤中で保持された。スキームＢに０゜５ｇのプリン（１０μｇ　／　ｍ　１の５０μｌ）の存在及び非存在下におけるゲル剤と口腔洗浄液についての典型的な経時プロフィルを示す。

酸化に対する安定性プリンの酸化安定性をめるための２種の実験を実施した。

プリン（５０μＩ、１０μｇ　／　ｍ　１脱イオン水）を過酸化水素（３０％、５０μｌ脱イオン水）とラクトペルオキシダーゼ（５０μｌ、ｌμｇ／ｍｌ　５０ｐＭ酢酸ナトリウム溶液、ｐＨ６，０）とともに１時間、３７℃でインキュベートした。等量の検液（５０ｐｌ）を採取し、キモトリプシンに対する阻害活性を測定した。

結果を次表に示す。　− 結果：５０　１　プリン　＋　十−十−−＋−５０１ラクトペル　＋−−−−＋十十オキシターゼ５０　１　３０％Ｈ２Ｏ２＋　斗　−−＋−−十吸光度（４０５ｎｍ）　、０６３　．０６１　．６５８　．０５６　．５９６　．６１４　；０６７　．６２２（ｎ＝３）（＋ＩＩＩり　、００５　．００２　．００２　、ＱＯ５，０１３，０１２，００４，００５韮上記条件下ではプリンは酸化に対して安定であり阻害活性を保持する。

！艶主プリンまたはニグリン（５０μｍ、１０μｇ／ｍＩ脱イオン水）を過酸化水素（３０％、５０μｍ脱イオン水）とともに５分間３７℃にてインキュベートする。

等量の検液（５０μｍ）を採取し、キモトリプシンに対する阻害活性を測定した。

結果を次表に示す。

結果：５０　！　プリン　＋　＋　−−−−−−＝−−−一−＝＝、−５０＋　ニグリン　−−＝−−−十＋　−−−５０１Ｈ，０２＋　−＋　−＋　−十　−＋吸光度　、０８５　．０６０　、．１ｉ４０　．６５６　．０６０　．０５９　．５６３　．６１１　．０５５（４０５ｎｍ）（ｎ＝３）（士標準幅差）　、００６　．００１　．０１９　．０Ｇ７　．００３　．００２　．０３１　．０１０　．０５７記載した条件下、ニグリンの阻害活性は影響されない。プリンに対しては阻害活性は最小限度（８％に相当）にて影響されていると考えられる（チューブ１と２を比較せよ）。

抗菌活性に対する予備的実験アエロモナス　ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）の分離物をエサを充分食べたヒルから回収した。プロテアーゼプロフィルを次に同定することで、回収物がショックらにより記載されている検定法［５ｈｏｔｔｓ　ｅｔ　ａｌ、　１９８５年、　（２５）］にてエラスターゼ陽性であることが判明した。容器内のプリン１ｍｇを１ｍｌにもどし、次いで１０−１〜１０″ ″６の範囲で希釈した。

Ａ、ハイドロフィラの選別した培養物を前記した検定培地に接種して「場所（ｌａｗｎ）Ｊを作る。「ペニシリン」用検定シリンダーをプレートの中央に置く。

希釈したプリンの１０分の１　ｍ　ｌ　（０、１ｍ　ｌ　）をそれぞれのシリンダー中に入れ、プレートを２５℃にて１０日間インキュベートする。実験結果からプリンの拡散ゾーン内ではエラスターゼ活性は阻害されており、エラスターゼ活性の見られるゾーンはわずかであることがわかる。：・のことは未希釈、１ｏ −１，１０″″２．１０−３希釈のもので起こることが判明した。

１０−１．１０″″２．１０−３の上記希釈の結果がら抗エラスターゼ阻害単位（ＩＵ）、はそれぞれ２ＩＵ、　０．２ＩＵ、及び０．０２ＩＵと計算される。

プリン活性図を参照。

組成物の例プリンを添加した次ノ酋磨ペーストを調製した。

例１ニリン酸二カルシ９ムをベースとする活性歯磨ペーストの組成グリセロール　８６％　２０ｇソルビトール　７０％　ＬｏｇＮａ−ＣＭＣ２ｇ脱イオン水　２７．５ｇリン酸二カルシウム　３５ｇドデシル硫酸ナトリウム　２ｇサッカリンナトリウム　、２ｇモノフルオロリン酸す、トリウム　、２ｇ安息香酸メチルエステル　、１ｇ安息香酸プロピルエステル　、２ｇ００ｇ歯磨ペーストの調製中、プリン溶液はフレーバーを除く他の全ての添加剤を混合した後に加えるのが好ましく、フレーバーはその後に加える。

例２ニジリカをベースとする活性歯磨ペーストの組成シリカ、研磨用　８ｇシリカ、増粘用　１０ｇソルビトール　７０％　６８ｇ８ｇフットリウム　、２ｇラウリル硫酸ナトリウム　１ｇＣＭＣ，４ｇポリエチレングリコール　４ｇゲリン溶液　１・　７ｇ保存剤、フレーバー　微量水　１００％にする量口腔洗浄液の例エチルアルコール　４ｇ７　Ｌ／−ｔ＜　−−２ｇプリン溶液　２．５ｇ脱イオン水　１００％にする量潅注溶液の例エチルアルコール　５ｇゲリン溶液　３ｇ陰イオン界面活性剤　１ｇ新たに煮沸した水　１００％にする量ここに述べた用途例の溶液は凍結靴燥した乾燥プリンをｐＨ５〜８．５の緩衝水溶液中に溶解することで得られる。０゜１重量％の量のｐ−安息香酸メチルエステル又はプロピルエステルは保存用として添加することができる。

溶液中のプリン濃度は１０ｍ１の溶液当り０．２〜５　ｍ　ｇの間であり、好ましくは１０ｍ１の溶液当り０．２〜２　ｍ　ｇの間である。

プリンを　する水溶液の形の医・組　物の例１、プリンをｐＨ５〜８．５の緩衝水溶液に溶解し、ｏ、５　ｍ　ｇ　／　１０　ｍ　ｌの濃度にする。

２．０．１重量％のｐパラ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステルを加える。

この組成物は限外濾過法による滅菌を行った後に、ａ、静脈注射；ｂ、吸入噴霧に用いることができる。

プリンを　る油脂性軟　としての　組成物の例１、プリンを適切な油脂性剤に懸濁し、２、グリセロールモノステアレートのような界面活性剤な加３．０．１重量％バラ−ヒドロキシ安息香酸メチルエステルを加える。

医薬組成物の両方の例は基本組成物の安定化用として更に他の添加剤を加えることができる。

ヒ粧品組成物及び他の歯磨ペーストへのニグリンの利用口腔用組成物と同じく両方の歯磨ペースト組成物に対して述べた例はプリンをニグリンで代替しても同様である。

化粧品クリームへのニグリンの化粧品的な応用は、プリンをニグリンへ置き換えれば医薬組成物の調製の記述と同様である。更にニグリンは現行法規のもと化粧品用途に特別に利用される。

表１種々のセリンプロテアーゼに対するプリンの阻害能を測定する為に用いた検定条件！！　緩衝液　ＮＸ　豊！皇皮玉！１文カテプシンＧ　Ｏ，ＩＭＨｅｐｅｓ　５ｕｅｃ−Ａｌａ−Ａｌａ　１６ｎＭ　２．０！ＩＩＭｐＨ７，４−Ｐｒｏ−Ｐｂｅ−ｐＮＡトリプシン　０．ＩＭ　Ｔｔｉｓ／ＨＣＩ　Ｂｘ−Ａｔｇ−ｐＮＡ　５０ｎＭ　Ｏ，８ｍＭｐＨ８，０キモトリプシン　０．ＩＭＴｒｉｓ／ＨＣＩ　ＭｅＯ−５ｕｃ−Ａｒｇ　１６ｎＭ　２．４ｍＭ＋　０．９６Ｍ　ＮａＣ１−Ｐｔｏ−Ｔｙｒ−ｐＮａｐＨ８゜３エラスターゼ　０．１！ＩＩ　Ｔｔｉｓ／ＨＣＩ　５ｕｃｃ−Ａｌａ−Ａｔｇ　３３０ｎＭ　Ｏ，５５ｍＭ＋Ｏ，ＯＳ％Ｔｔｉｔｏｎ　−Ａｌａ−ｐＮＡＸ−１００，ｐＨ８，３トロンビン　０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣＩ　Ｐｈｅ−ｒｉｐ−Ａｔｇ　５ａＭ　Ｏ，０８ｍＭ＋０．３Ｍ　ＮａＣｌ　−ｐＮＡｐＨ８，４表２プリンとニグリンのアミノ酸組成の比較プリン　ニグリンＣ本アミノ酸　２４時間　４８時間ｍｏｌｅ’ｓ／ｍｏｌｅ　ｍｏｌｅｓ／ｍｏｌｅＡｓｐ（＋Ａｓｎ）　１４−１５　１９　７Ｇｌｕ（＋Ｇｌｎ）　６　９　７Ｓｅｒ　４　３−４　３Ｔｈ　ｒ　２−３　３　５ＧＩ７　８−９　７　５ＡＩａ７−８７１Ａｔｇ　２　２　４Ｐｒｏ　６　４−５　６Ｖａｔ　１１−１２　８　１１Ｍｅｔ　１　２１１ｅ　２−３　２　０Ｌｅｕ　４−５　３−４　５Ｐｈｅ　２−　２　５ｙｓＬｙｓ　５−６　５　２Ｈｉｓ　０　０　３Ｔ７ｒ　１　０　５−６Ｔｒｐ　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、０．　０−１Ｎ−末端　Ｖａｌ　Ｖａｔ　ＴｈｒＴｏｔａｌ　７５−８３　７６−７９　６９−７１＊引例（１）からの数値Ｎ、Ｄ、　＝検知せず特表平４−５０７２３８　（１５）表　３プリンとニグリンのＮ末端配列の比較ニグリン　Ｔｈｔ　Ｇｌｕ　Ｐｂｅ　ＧＩＹ　Ｓｅｔ　Ａｓｎ　［、ｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅゲリン　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｂｔ　Ａｓｐ　Ｇａｙｌｌ　１５　２０ニグリン　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｂｒ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ａｓｎゲリン　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａニグリン　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｐｂｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｐｒ。

プリン　Ｇｌｏ　Ｖａｌ　Ｘ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ表　４＝ペプチド断片の配列プリンのＶ８プロテアーゼあるいはトリプシンによる分解で産生するペプチド断片の配列ｖ８断片二図７の分離図からのピークピーク　２：　Ａｓｎ−Ａｓｐ／Ｇｌｙ／Ｖａｌ−Ａｓｎ／５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｔ−Ａｓｐ−Ｘ　−Ｘ−Ａｌａピーク　５：　Ｇｌｕ−Ｖｉｌ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｕビーク　１１：　Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−３ｅｔ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｍｅｔピーク　１３：　Ａｓｎ／５ｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｖａｌ　−３ｅｒ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ｔｂｔトリプシン断片、図５の分離図からピーク　２：　Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｔｂｔ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｔｈｔ−Ａｓｐゲリン活性図表プリンの部分精製のためのスキームＡ傘スーパーデックス２００にて分画精製される前の物質を集めることを示す。

スキームＢ時間（日）吸光度（２３４ｎｍ）吸光度（２１５ｎｍ、）プリンの等電点電気泳動レーン　１　＝等電点電気泳動マーカー吸光度（２１５ｎｍ）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動レムリ法　スウオンクとムンクレス法図４吸光度（２１５ｎｍ）吸光度（２１５ｎｍ）特表平４−５０７２３８　（１９）ニグリン１　＝　１．９５　＋ｎｇ／ｍｌエク’）ン２ｗ　０．６５　ｍｇ／ｍｌニグリン３１ＩＯ，３２１ＩＩ９１１Ｉ＋１図８補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成３年１０月１４日１　特許出願の表示　ＰＣＴ／ＮＬ　９０１０　ＯＯ４６２発明　の名　称　プロテアーゼインヒビタ−３特許出願人代表者　ゲラルドヴ工−マン４代　理　人電話（０３）　（３５８６）　８６７０６　添付書類の目録補正書の写しく翻訳文）　１通請求の範囲Ｍａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｔ　Ａｓｐ　Ｇｌｙｌｌ　１５　２０Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｔｂ＋　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ＡｌａＧｌｎ　Ｖａｔ　Ｘａａ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｍａｌで表わされるアミノ酸配列をＮ末端主構造として有するヒル種ヒルジナリアマニレンシス（Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ　ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ）由来のプリン（ＧＥＬＩＮ）と呼称するポリペプチド。

２、分子量が８．１キロダルトンであるとして計算したアミノ酸組成が次の組成：Ｓｅｔ　：　３−４　Ｌｅｕ　：３−４Ｔｈｒ　：　３　Ｐｈｅ　：　２Ｎ端　：　Ｍａｌを有する請求項１に記載のポリペプチド。

３、主構造に次のペプチド断片：（ａ）Ａｓｎ　Ａｓｐ／Ｇ１７／Ｖａｌ　Ａｓｎ／Ｔｂｒ　Ｇ１７　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ａｌａ（ｂ）Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｌａ／Ａｓｐ　Ｇｌｕ（ｃ）Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ（ｄ）Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｙｓｌ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ（ｅ）Ａｓｎ／Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔ７ｒ　Ｋａｍ　Ｖａｔ　Ｓｅｔ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｔｈ＋（ｆ）Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐを有する請求項１又は２に記載のポリペプチド。

４、抗エラスターゼ活性および抗キモトリプシン活性を有する請求項１．２．３のいずれかに記載のポリペプチド。

５、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量と、医薬的に許容される担体とを、包含してなる医薬組成物。

６、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量と、化粧品的に許容される担体とを包含してなる化粧品組成物。

７、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を包含してなり、歯周疾患の治療及び防止に活性な組成物。

８、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を包含してなる歯磨ペースト組成物。

９、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を包含してなる口腔洗浄組成物。

１０、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を包含してなる歯科用洗浄液体。

１１、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を包含してなり、穀物およびその他の種子類の発芽阻害に活性な組成物。

１２、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を投与することを包含する、哺乳類、特にヒトの疾病をプリン（ＧＥＬＩＮ）に応答して治療する方法。

１３、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を包含してなり、肺気腫の治療に活性な組成物。

１４、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を投与することを包含する、哺乳類、特にヒトの肺気腫をプリン（ＧＥＬＩＮ）に応答して治療する方法。

１５、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を包含してなり、皮膚紅斑の治療に活性な組成物。

１６、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を投与することを包含する、哺乳類、特にヒトの皮膚紅斑をプリン（ＧＥＬＩＮ）に応答して治療する方法１７、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量をプロテアーゼを含有する対象に適用または投与して該プロテアーゼの酵素活性を減少又は阻害することよりなるプロテアーゼの作用を阻害する方法。

１８、亜科ヒルジナリネ［Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉｎａｅ　（バッフアロ　ヒル類 ”ｔｈｅ　Ｂｕｆｆａｌｏ　１ｅｅｃｈｅｓ”）コ又はそれに近接して関連する亜科に属するヒル類に由来する請求項４に記載のポリペプチド。

１９、請求項１及び３のいずれかに記載の化合物のアミノ酸配列から誘導され得るＤＮＡ配列。

２０、請求項１に記載の化合物のアミノ酸配列または請求項３に記載の１つ以上の断片から推定されるアナログペプチド。

２１．請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を包含してなり、微生物類に対する抗生物質として活性な組成物。

２２、請求項１．２．３．４のいずれかに記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を投与することを包含する、哺乳類、特にヒトを、細菌に由来する疾病に対して、プリン（ＧＥＬ　ｒＮ）に応答して治療する方法。

国際調査報告闇肯Ｉｌ噛闘−マ＾紳１ｔＩＩ−１−ＰＣＴ／Ｎｕ　９０１０００４ｇ国際調査報告ＮＬ　９００００４６Ｓ＾　３６３２７

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｎ末端より始まる次式：【配列があります】等で表わされる主構造を有するヒル種ヒルジナリアマニレンシス（Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉａ　ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ）由来のゲリン（ＧＥＬＩＮ）と呼称するポリペプチド。
２．分子量８１００ダルトンであるとして、次のアミノ酸組成：▲数式、化学式、表等があります▼ 検知せずを有する請求項１に記載のポリペプチド。
３．主構造に次のペプチド断片：（ａ）【配列があります】（ｂ）【配列があります】（ｃ）【配列があります】（ｄ）【配列があります】（ｅ）【配列があります】（ｆ）【配列があります】を有する請求項１及び／又は２に記載のポリペプチド。
４．強い抗エラスターゼ活性および抗キモトリプシン活性を有する請求項１、２及び／又は３に記載のポリペプチド。
５．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量と、医薬的に許容される担体とを含有してなる医薬組成物。
６．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量と、化粧品的に許容される担体とを含有してなる化粧品組成物。
７．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を含有し、歯周疾患の治療及び防止に活性な組成物。
８．ヒル由来のエラスターゼインヒビターのプロテアーゼ阻害量を含有し、歯周疾患の治療及び防止に活性な化粧品組成物。
９．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を含有する歯磨ペースト組成物。
１０．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を含有する口腔洗浄組成物。
１１．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を含有する歯科用洗浄組成物。
１２．ヒル由来のエラスターゼインヒビターのプロテアーゼ阻害量を含有し、歯周疾患の治療及び防止に活性な歯磨剤、口腔洗浄及び／又は歯科用洗浄組成物。
１３．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を含有し、殻物およびその他の種子類の発芽阻害に活性な組成物。
１４．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を投与することを包含する、哺乳類、特にヒトの疾病をゲリン（ＧＥＬＩＮ）に応答して治療する方法。
１５．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を含有し、肺気腫の治療に活性な組成物。
１６．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を投与することを包含する、哺乳類、特にヒトの肺気腫をゲリン（ＧＥＬＩＮ）に応答して治療する方法。
１７．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を含有し、皮膚紅斑の治療に活性な組成物。
１８．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を投与することを包含する、哺乳類、特にヒトの皮層紅斑をゲリン（ＧＥＬＩＮ）に応答して治療する方法。
１９．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量をプロテアーゼを含有する対象に適用または投与して該プロテアーゼの酵素活性を減少又は阻害することよりなるプロテアーゼの作用を阻害する方法。
２０．亜科ヒルジナリネ［Ｈｉｒｕｄｉｎａｒｉｎａｅ（バッファロヒル類”ｔｈｅ　Ｂｕｆｆａｌｏ　Ｉｅｅｃｈｅｓ”）］又はそれに近接して関連する亜科に属するヒル類に由来する請求項４に記載のポリペプチド。
２１．請求項１及び／又は３の化合物のアミノ酸配列から誘導され得るＤＮＡ配列。
２２．請求項１の化合物のアミノ酸配列または請求項３の１つ以上の断片から推定されるアナログペプチド。
２３．請求項１、２、３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を含有し、微生物類に対する抗生物質として活性な組成物。
２４．請求項１、２．３及び／又は４に記載の化合物のプロテアーゼ阻害量を投与することを包含する、哺乳類、特にヒトを、細菌に由来する疾病に対して、ゲリン（ＧＥＬＩＮ）に応答して治療する方法。