KR0137519B1 - 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로 부터 분리한 일래스테이즈 억제 단백질 및 그의 제조방법 - Google Patents

한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로 부터 분리한 일래스테이즈 억제 단백질 및 그의 제조방법

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KR0137519B1 KR1019950010206A KR19950010206A KR0137519B1 KR 0137519 B1 KR0137519 B1 KR 0137519B1 KR 1019950010206 A KR1019950010206 A KR 1019950010206A KR 19950010206 A KR19950010206 A KR 19950010206A KR 0137519 B1 KR0137519 B1 KR 0137519B1
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심상철
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Abstract

본 발명은 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로부터 분리한 일래스테이즈(elastase) 억제 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 일래스테이즈 억제 단백질은 총 57개의 아미노산 잔기로 이루어진 분자량 6,110Da의 단백질로서, 그의 활성부위는 36번 메치오닌(methionine)과 37번 이소루이신(isoleucine)이며, 일래스테이즈만을 특이적으로 억제하고, 열과 강산 및 강염기에도 안정하다. 본 발명의 일래스테이즈 억제 단백질은 과량의 일래스테이즈에 의해 야기되는 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 폐기종(emphysema) 및 건선(psoriasis) 등의 질환에 대하여 전기 일래스테이즈의 활성을 억제하므로 이들 질환의 치료에 이용되거나, 그의 아미노산 서열로부터 유전정보를 알 수 있으므로 유전공학적 기법을 통한 대량생산에 이용될 수 있을 것이다.

Description

한국산 흡혈종 거머리로부터 분리한 일래스테이즈 억제 단백질 및 그의 제조방법
제1a도는 거머리의 아세톤 추출물을 세파덱스 G-75 크로마토그래피한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
제1b도는 세파덱스 G-75 컬럼에서 수득한 용출액을 DEAE-세파로스 크로마토그래피한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
제1c도는 DEAE-세파로스 컬럼에서 수득한 용출액을 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatogrphy)한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
제2도는 본 발명의 일래스테이즈 억제 단백질의 분자량을 질량분석기로 측정한 결과를 나타내는 질량 스펙트럼이다.
제3도는 일래스테이즈 억제 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
제4도는 일래스테이즈 억제 단백질의 특이성을 나타내는 그래프이다.
제5도는 일래스테이즈 억제 단백질의 억제상수를 결정하는 그래프이다.
제6도는 일래스테이즈 억제 단백질의 열에 대한 안정성을 나타내는 그래프이다.
제7도는 일래스테이즈 억제 단백질의 다양한 산도(pH)에 대한 안정성을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로부터 분리한 일래스테이즈(elastase) 억제 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 흡혈종 거머리로부터 분리한 일래스테이즈만을 특이적으로 억제하는 일래스테이즈 억제 단백질 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로, 일래스테이즈는 세린(serine)계 단백질 분해효소로 분류되는데, 주로 일래스틴(elastin)이라는 구조단백질을 분해하며, 또한 코라젠(collagen), 연골(cartridge), 파이브로넥틴(fibronectin) 등과 같은 생체조직을 구성하는 중요한 구조단백질을 분해하기도 한다.
일래스테이즈는 사람의 경우 주로 중성구 세포(neutrophile)에 많이 저장되어 있다. 이 중성구 세포가 혈관속에서 외부로부터 감염된 병원균 혹은 항원과 접촉하면, 이 세포속에 저장되어 있던 일래스테이즈가 분비되어 이들 병원균이나 항원을 분해함으로써, 생명체를 병원균으로부터 보호하는 역할을 한다. 그러나, 세포의 노화, 유전적 질환 등의 원인으로 인체내에서 일래스테이즈의 분비가 정상적으로 조절되지 않아 조직으로 과량 분비되면, 일래스테이즈가 생체의 조직을 구성하는 중요한 구조단백질들을 무작위로 분해하여 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 폐기종(emphysema), 건선(psoriasis) 등의 질병을 유발하기도 한다.
류마티스 관절염은 사람의 무릎이나 손가락 등의 관절부위에 과량 분비된 일래스테이즈가 연골을 비정상적으로 분해시킴으로써 야기되는 염증성 질환이다. 폐기종은 폐의 조직 일부에 상처가 생기면 이 부분이 공기중의 산소에 노출되고, 이어 공기중에 있을지 모르는 병원균의 침입을 막기 위해 중성구 세포들이 전기 부위로 많이 모이면서 일래스테이즈가 과량 분비되어 폐조직을 분해시킴으로써 유발되는 염증성 질환이다. 건선은 일래스테이즈 때문에 생기는 대표적인 피부질환으로 붉은 반점과 함께 피부가 트는 질병이다.
의학계에서는 오래 전부터 이러한 질병의 치료를 위한 방안으로, 사람의 연골, 폐, 피부 등의 조직에 비정상적으로 분비된 일래스테이즈의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 의약용 단백질을 개발하고자 노력한 결과, 칠면조 및 오리 등의 조류, 유럽산 거머리, 사람의 피부 등 여러 종류의 생물로부터 일래스테이즈 억제 단백질을 분리하여, 이를 유효성분으로 함유하는 약제를 직접 환붕에 주사함으로써 치료에 효과를 보고 있는 것으로 알려져 있다.
그러나, 사람의 피부에서 분리한 일래스테이즈 억제 단백질을 제외한 나머지 전기 억제 단백질은 일래스테이즈에 대한 특이성이 떨어져서, 일래스테이즈 외에도 인간에게 중요한 여러종류의 단백질 분해효소를 억제하기 때문에, 의약용으로 사용하기에는 문제가 있었다. 또한, 사람의 피부에서 분리한 일래스테이즈 억제 단백질을 포함하여 기존에 분리된 일래스테이즈 억제 단백질은 분자량이 너무 크기 때문에, 약한 열에도 쉽게 변성이 초래되어 그 활성이 급격하게 감소한다는 문제점이 있었다.
이에, 본 발명자들은 상술한 문제점을 해결하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 한국산 흡혈종 거머리로부터 분리한 일래스테이즈 억제 단백질이 사람의 중성구 세포에 있는 일래스테이즈의 활성을 강하게 억제한다는 사실을 실험적으로 검증하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로부터의 신규한 일래스테이즈 억제 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 한국산 흡혈종 거머리로부터 전기 일래스테이즈 억제 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
대한민국에서 채집한 성숙한 흡혈종 거머리를 비이커에 모아 에틸 알콜을 첨가하여, 뱃속의 불순물과 핏덩이를 토해내도록 한 다음, 아세톤을 첨가하고 거머리를 파쇄하여 아세톤 추출물을 제조하였다. 이렇게 하여 제조된 아세톤 추출물을 농축시켜 젤 여과 컬럼에 주입하고 세척하여, 일래스테이즈 억제활성을 나타내는 분획을 모은 다음, 음이온 교환수지 컬럼에의 주입, 세척 및 용출과정을 거쳐 일래스테이즈 억제활성을 나타내는 분획을 모았다. 그런 다음, 전기의 활성분획을 농축시키고, 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatography : HPLC)을 수행하여 일래스테이즈 억제 단백질만을 순수분리하였다. HPLC용 컬럼으로는 컬럼내의 수지(resin)가 소수성(hydrophobic)을 띠고 있어 분리하고자 하는 소수성 단백질이 부착되고, 여기에 컬럼의 환경을 친수성(hydrophilic)으로 점차 바꾸어 주면, 부착되어 있던 단백질이 떨어짐으로써 소수성 단백질을 분리할 수 있는 컬럼을 사용하였다. 본 발명에서는 전기에서 순수분리한 일래스테이즈 억제 단백질을 '거머린(Guamerin)'이라 명명하였다.
거머린의 분자량 및 아미노산 서열을 결정한 결과, 거머린은 총 57개의 아미노산 잔기로 이루어진 분자량 6,110Da의 단백질로서, 57개의 아미노산 잔기 중에서 단백질의 구조를 견고하게 만드는 이황화결합(disulfide bond)에 필요한 시스테인(cysteine) 잔기가 10개나 포함되어 있으므로, 열에 대한 안정성이 있을 것으로 예측할 수 있었다.
한편, 모든 단백질 분해효소의 억제 단백질은 표적효소(target enzyme)에 대하여 기질처럼(pseudosubstrate) 작용하여 효소의 활성을 감소시키므로, 반응기속에서 표적효소와 억제 단백질을 장시간 반응시키면 억제 단백질의 펩타이드 결합(peptide bond)이 표적효소에 의해 가수분해되는 것으로 널리 알려져 있는데, 이렇게 가수분해되는 부위를 억제 단백질의 활성 부위(active site)라 한다. 이 부위는 억제 단백질에게 표적효소에 대한 특이성(specificity)을 부여하므로, 전기 활성부위를 아는 것은 대단히 중요하다. 이러한 관점에서, 본 발명자들은 거머린의 활성부위를 결정한 결과, 활성부위는 36번 메치오닌(methionine)과 37번 이소루이신(isoleucine)으로 밝혀내었는데, 이러한 사실은 거머린과 팩터 Xa(factor Xa) 억제 단백질(참조 : Elka Nutt et al., J. Biol. Chem., 263 : 10162-10167(1988)) 및 트립신(trypsin) 억제 단백질(참조 : Christa Soellner et al., Eur. J. Biochem., 219 : 937-943(1994))이 아미노산 성열에 있어서는 서로 유사하지만, 그 활성부위가 각각 다르기 때문에 거머린만이 일래스테이즈를 특이적으로 억제한다는 점에서 매우 중요한 의마가 있다는 것을 알 수 있었다.
이어, 거머린이 일래스테이즈 외에 다른 종류의 단백질 분해효소도 억제하는지 알아본 결과, 거머린의 억제활성은 일래스테이즈 특이적이었다. 따라서, 거머린을 의약용으로 사용할 경우, 생체내에서 일래스테이즈외에 다른 종류의 단백질 분해효소에는 영향을 미치지 않으므로 부작용(side effects)을 줄일 수 있을 것으로 예상되었다.
한편, 억제상수(inhibition constant)의 값이 작으면 작을수록 거머린이 표적효소에 결합한 다음 떨어지는 속도가 그 만큼 느린 것을 의미하므로, 낮은 값의 억제상수는 효율적인 억제가 진행됨을 나타낸다. 이러한 관점에서, 거머린의 억제상수를 결정한 결과, 억제상수는 8.1×10-14M이었는데, 이는 공지된 일래스테이즈 억제 단백질의 억제상수보다 상당히 낮은 값이므로, 거머린은 기존의 일래스테이즈 억제 단백질보다 그 억제활성이 강하다는 것을 알 수 있었다. 아울러, 거머린의 일래스테이즈 억제기작(inhibition mechanism)은 경쟁적 억제(competitive inhibition)의 양상을 나타냄을 확인하였다.
거머린의 열 및 산도(pH)에 대한 안정성을 측정한 결과, 전기 거머린의 아미노산 잔기로부터 예측하였듯이, 거머린은 열에 대해서 상당히 안정하였고, 강산과 강염기에도 안정하였다. 따라서, 거머린은 열과 산도에 안정하므로, 대량생산, 저장, 운송 등의 과정에서 단백질의 변성으로 인한 손실이 극히 적어, 실제 산업화 추진에 매우 유리할 것이다.
본 발명의 거머린은 과량의 일래스테이즈에 의해 야기되는 류마티스 관절염, 폐기종 및 건선 등의 질환에 대하여 전기 일래스테이즈의 활성을 억제하므로 이들 질환의 치료에 이용되거나, 그의 아미노산 서열로부터 유전정보를 알 수 있으므로 유전공학적 기법을 통한 대량생산에 이용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
[거머린의 순수분리]
대한민국 전라북도 전주지방에서 채집한 성숙한 흡혈종 거머리를 크기에 관계없이 등무늬와 색깔이 동일하면 실험의 재료로 이용하였는데, 총 40g이 되도록 약 100마리의 거머리를 비이커에 모아 95%의 에틸알콜 100㎖(4℃)을 첨가하여, 마취와 동시에 뱃속의 불순물과 핏덩이를 토해내도록 하였다. 그런 다음, 거머리를 2차 증류수로 깨끗이 세척하고, 80% 아세톤 200㎖(-20℃)을 첨가하여 자동 믹서기로 거머리를 파쇄하였다. 이어, NaCl 및 TCA(trichloroacetic acid)를 최종농도가 각각 0.3M 및 0.2M이 되도록 첨가하여 다량의 단백질을 추출하였다.
이렇게 하여 제조된 아세톤 추출물을 농축시키기 위하여, 전기 아세톤 추출물에 100% 아세톤(-20℃)을 더 첨가하여 최종 부피가 5배로 증가되도록 하고, -20℃에서 1시간 동안 방치하여 회백색의 침전물이 형성되도록 한 다음, 이를 원심분리기로 수득하고 잔류하고 있는 아세톤을 증발시켜, 순수한 회백색의 분말을 얻었다.
전기 아세톤 추출물의 분말을 200mM NaCl을 함유한 트리스 완충용액(Tris-HCl buffer, pH 8.0, 이하 '완충용액 A'라 함)에 용해시키고, 이 용액을 완충용액 A로 평형이 유지된 세파덱스 G-75(Sigma, USA) 컬럼(100×2㎝)에 유속 1㎖/min의 속도로 주입한 다음, 일래스테이즈 억제활성을 나타내는 분획을 모았다(참조 : 제1a도).
전기의 활성분획을 트리스 완충용액(pH 8.0, 이하 '완충용액 B'라 함)에 대하여 투석하여 NaCl를 완전히 제거한 다음, 완충용액 B로 평형이 유지된 DEAE-세파로스(Sigma, USA) 컬럼(6×1.3㎝)에 유속 0.5㎖/min의 속도로 주입하였다. 그런 다음, 0mM 내지 400mM의 NaCl 직선 농도구배를 실시하여, 일래스테이즈 억제활성을 나타내는 거머린을 120mM 내지 150mM NaCl에서 용출시켰다(참조 : 제1b도).
전기 DEAE-세파로스 크로마토그래피로부터 얻은 활성분획을 모아 완충용액 B에 대하여 투석하여 NaCl를 완전히 제거하고 농축시킨 다음, 0.1% 트리플루오로 아세트산(trifluoroacetic acid)으로 평형이 유지된 HPLC 컬럼(30×0.39㎝, Delta-pak C18, Millipore, USA)에 유속 1㎖/min으로 주입하였다. 그런 다음, 25% 내지 60%의 아세토니트릴(acetonitrile) 직선 농도구배를 실시한 결과, 유지시간(retention time) 35분에서 순수한 거머린()이 용출되었다(참조 : 제1c도).
상기 정제과정에서 거머린의 활성은 다음과 같이 측정하였다 : 일래스테이즈 함유용액(0.37㎎/㎖) 50㎕와 1mM 파라-니트로아닐린(p-nitroaniline) 500㎕를 혼합하고, 각 정제과정에서 얻은 분획 50㎕를 첨가하여 37℃에서 50분간 반응시킨 다음, 400㎚에서의 흡광도(O.D.)를 측정하여 일래스테이즈에 의해 분해된 파라-니트로아닐린의 양을 결정하였다. 측정 O.D. 값을 전기 정제과정에서 얻은 분획을 첨가하지 않은 대조군의 O.D. 값과 비교할 때, 일래스테이즈의 파라-니트로아닐린 분해활성이 감소한 정도가 곧 거머린의 활성에 해당된다.
거머린의 정제과정은 하기 표 1에 나타내었다. 단백질의 양은 브래드포드(Bradford)의 방법(참조 : Bradford, M.M., Anal. Biochem., 72 : 248-254(1976))으로 측정하였으며, 활성단위 1unit은 1μmolar의 파라-니트로아닐린이 일래스테이즈에 의해 분해되는 것을 1분동안 저해시키는데 필요한 거머린의 양으로 정의하였다.
상기 표 1에서 보듯이, 정제된 거머린의 비활성도(specific activity)는 361units/㎎이며, 수율은 19%이었다.
[실시예 2]
[거머린의 분자량 결정]
실시예 1에서 제조된 거머린의 분자량을 질량 분석기(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, Kompact, MALDI Ⅱ, Kratos, UK)를 이용하여 결정한 결과, 거머린(스캔 작업)의 분자량은 6,110Da으로 확인되었다(참조 : 제2도).
[실시예 3]
[거머린의 아미노산 서열 및 활성부위 결정]
실시예 1에서 제조된 거머린의 아미노산 서열을 아미노산 서열 분석기(Applied Biosystems 476A protein sequencer, USA)를 이용하여 결정하였다(참조 : 제3도). 제3도에서 보듯이, 거머린은 총 57개의 아미노산 잔기로 이루어져 있으며, 그 중에서 시스테인 잔기가 10개나 포함되어 있는 특이한 단백질임을 알 수 있다. 또한, 전기 거머린의 아미노산 서열과 공지된 일래스테이즈 억제 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과, 본 발명의 거머린은 신규한 단백질임을 확인하였다.
한편, 거머린의 활성부위를 결정하기 위하여, 일래스테이즈와 거머린을 48시간 동안 반응시킨 다음, 아미노산 서열 분석기로 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 그 결과, 36번 메치오닌과 37번 이소루이신 사이의 펩티드 결합이 가수분해된 것으로 확인되었다. 따라서, 거머린의 활성부위는 36번 메치오닌과 37번 이소루이신임을 알 수 있었다.
[실시예 4]
[거머린의 일래스테이즈 억제활성 측정]
거머린의 일래스테이즈외에 다른 종류의 단백질 분해효소에 대한 특이성을 알아본 결과, 트롬빈(thrombin), 팩터 Xa(factor Xa), 파파인(papain), 펩신(pepsin)들은 전혀 억제하지 않는 반면, 트립신(trypsin), 카이모트립신(chymotrypsin), 섭틸리신(subtilisin)에 대해서는 약 15% 정도의 억제활성을 나타내었다. 이 값은 거머린이 일래스테이즈를 약 90% 정도 억제하는 것에 비하면 극히 미약한 값으로(참조 : 제4도), 거머린의 억제활성은 일래스테이즈에 특이적임을 알 수 있었다. 제4도에서, HL-일래스테이즈 및 PP-일래스테이즈는 각각 사람의 백혈구 일래스테이즈(human leukocyte elastase) 및 돼지의 췌장 일래스테이즈(porcine pancreatic elastase)를 나타낸다.
한편, 일래스테이즈를 기질로 하여 거머린의 억제상수를 결정한 결과, 억제상수는 8.1×10-14M이었다(참조 : 제5도). 이 값을 공지의 일래스테이즈 억제 단백질의 억제상수, 예를 들면 사람의 피부에서 분리된 엘라핀(elafin)의 억제상수 6×10-10M, 유럽산 거머리에서 분리한 에글린-씨(eglin-C)의 억제상수 10-10내지 10-11M과 비교해 보면, 거머린의 억제상수는 상당히 낮은 값이었다. 따라서, 거머린은 공지의 일래스테이즈 억제 단백질보다 그 활성이 강함을 알 수 있었다. 아울러, 제5도에서부터, 거머린의 일래스테이즈 억제 기작은 거머린이 표적효소인 일래스테이즈에의 결합에 일래스테이즈의 기질과 경쟁하므로, 경쟁적 억제의 양상을 나타냄을 알 수 있었다.
[실시예 5]
[거머린의 안정성 측정]
거머린의 열에 대한 영향을 알아보기 위하여, 거머린을 40℃에서 100℃까지 10℃ 간격으로 15분 동안 가열한 다음, 그의 활성을 측정하였다.(참조 : 제6도). 그 결과, 거머린의 활성 변화가 없는 것으로 보아 거머린은 열에 대해서 안정함을 알 수 있었다.
한편, 거머린의 산 및 염기에 대한 영향을 알아보기 위하여, pH 1에서 pH 11까지 pH 2의 간격이 되도록 거머린에 산 혹은 염기를 처리하여 15분 동안 방치한 다음, 그의 활성을 측정하였다(참조 : 제7도). 그 결과, 거머린의 활성 변화가 없는 것으로 보아, 거머린은 강산과 강염기에도 안정함을 알 수 있었다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 한국산 흡혈종 거머리로부터 분리한 일래스테이즈 억제 단백질인 거머린 및 그의 제조방법을 제공한다. 거머린은 총 57개의 아미노산 잔기로 이루어진 분자량 6,110Da의 단백질로서, 그의 활성부위는 36번 메치오닌과 37번 이소루이신이며, 일래스테이즈만을 특이적으로 억제하고, 열과 강산 및 강염기에도 안정하다. 본 발명의 거머린은 과량의 일래스테이즈에 의해 야기되는 류마티스 관절염, 폐기종 및 건선 등의 질환에 대하여 전기 일래스테이즈의 활성을 억제하므로 이들 질환의 치료에 이용되거나, 그의 아미노산 서열로부터 유전정보를 알 수 있으므로 유전공학적 기법을 통한 대량생산에 이용될 수 있을 것이다.

Claims (4)

  1. 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로부터 분리한 하기와 같은 아미노산 서열을 가지는 일래스테이즈(elastase) 억제 단백질.
    NH2-Val-Asp-Glu-Asn-Ala-Glu-Asp-Thr-His-Gly-Leu-Cys-Gly- 13
    Glu-Lys-The-Cys-Ser-Pro-Ala-Gln-Val-Cys-Leu-Asn-Asn- 26
    Glu-Cys-Ala-Cys-Thr-Ala-Ile-Arg-Cys-Met-Ile-Phe-Cys- 39
    Pro-Asn-Gly-Phe-Lys-Val-Asp-Glu-Asn-Gly-Cys-Glu-Tyr- 52
    Pro-Cys-Thr-Cys-Ala-COOH 57
  2. 제1항에 있어서, 36번 메치오닌(methionine)과 37번 이소루이신(isoleucine)이 활성부위임을 특징으로 하는 일래스테이즈(elastase) 억제 단백질.
  3. 제1항의 아미노산 서열로부터 유추되는 뉴클레오티드 서열.
  4. (ⅰ) 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)에 아세톤을 첨가하고 파쇄하여 아세톤 추출물을 제조하는 공정 : (ⅱ) 전기 추출물을 젤 여과 크로마토그래피하는 공정 : (ⅲ) 전기에서 수득한 활성분획을 옴이온 교환수지 크로마토그래피하는 공정 : 및, (ⅳ) 전기에서 수득한 활성분획을 소수성 수지(hydrophobic resin)로 충진된 컬럼을 이용하여 고속액체크로마트그래피(HPLC)하는 공정을 포함하는 제1항의 일래스테이즈(elastase) 억제 단백질을 제조하는 방법.
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