KR19980020377A

KR19980020377A - 거머린(Guamerin)에서 유도된 단백질분해효소 억제활성을 지닌 펩타이드

Info

Publication number: KR19980020377A
Application number: KR1019960038844A
Authority: KR
Inventors: 강계원; 김동령
Original assignee: 윤덕용; 한국과학기술연구원
Priority date: 1996-09-09
Filing date: 1996-09-09
Publication date: 1998-06-25
Also published as: JPH11507082A; JP3393652B2; US6184346B1; AU2234497A; KR100224383B1; WO1998009993A1

Abstract

발명은 거머린(Guamerin)에서 유도된 단백질분해효소 억제활성을 지닌 펩타이드에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)에서 분리되 일라스테이즈 억제 단백질 거머린(Guamerin)에서 유도되었으며, 일라스테이즈(elastase)와 섶틸리신(subtilisin)의 억제활성(inhibitory activity)을 지닌 펩타이드와 그의 이량체에 관한 것이다. 본 발명의 단량체 펩타이드는 합성과 사용이 간편할 뿐만 아니라, 경제적으로 제공될 수 있는 일라스테이즈 및 섶틸리신 억제제이다. 또한, 본 발명의 이량체 펩타이드는 일라스테이즈 및 섶틸리신에 대한 강한 억제활성과 합성의 용이함으로 인하여, 일라스테이즈 또는 섶틸리신 관련 여러가지 질병의 치료제로서의 이용가능성이 자연산 거머린보다 높고, 또한 거머린에 비하여 그 분자량이 작으므로 약물로 사용되더라도 신체에 악영향을 미칠 가능성이 적다는 장점을 지니고 있다.

Description

거머린(Guamerin)에서 유도된 단백질분해효소 억제활성을 지닌 펩타이드

본 발병은 거머린(Guamerin)에서 유도된 단백질분해효소 억제활성을 지닌 펩타이드에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)에서 분리된 일라스테이즈 억제 단백질 거머린(Guamerin)에서 유도되었으며, 일라스테이즈(elastase)와 섶틸리신(subtilisin)의 억제활성(inhibitory activity)을 지닌 펩타이드에 관한 것이다.

일반적으로, 일라스테이즈는 세린(serine)계 단백질 분해효소로 분류되는데, 주로 일래스틴(elastin)이라는 구조단백질을 분해하며, 또한 콜라젠(collagen), 연골(cartridge), 파이브로넥틴(fibronectin)등과 같은 생체조직을 구성하는 중요한 구조단백질을 분해하기도 한다.

일라스테이즈는 사람의 경우 주로 중성구 세포(neutrophile)에 많이 저장되어 있다. 이 중성구 세포가 혈관속에서 외부로부터 감염된 병원균 혹은 항원과 접촉하면, 이 세포속에 저장되어 있던 일라스테이즈가 분비되어 이들 병원균이나 항원을 분해함으로써, 생명체를 병원균로부터 보호하는 역할을 한다. 그러나, 세포의 노화, 유전적 질환 등의 원인으로 인체내에서 일라스테이즈의 분비가 정상적으로 조절되지 않아 조직으로 과량 분비되면, 일라스테즈가 생체의 조직을 구성하는 중요한 구조단백질들을 무작위로 분해하여 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 폐기종(emphysema), 건선(psoriasis)등의 질병을 유발하기도 한다.

이에, 의학계에서는 오래 전부터 이러한 질병의 치료를 위한 방안으로, 사람의 연골, 폐, 피부등의 조직에 비정상적으로 분비된 일라스테이즈의 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 의약용 단백질을 개발하고자 노력한 결과, 칠면조 및 오리 등의 조류, 유럽산 거머리, 사람의 피부 등 여러 종류의 생물로 부터 일라스테이즈 억제 단백질을 분리하여, 이를 유효성분으로 함유하는 약제를 직접 환부에 주사함으로써 치료에 효과를 보고 있는 것으로 알려져 있다.

그러나, 사람의 피부에서 분리한 일라스테이즈 억제 단백질을 제외한 나머지 전기 억제 단백질은 일라스테이즈에 대한 특이성이 떨어져서, 일라스테이즈 외에도 인간에게 중요한 여러종류의 단백질 분해효소를 억제하기 때문에, 의학용으로 사용하기에는 문제가 있었다. 또한, 사라므이 피부에서 분리한 일라스테이즈 제 단백질을 포함하여 기존에 분리된 일라스테이즈 억제 단백질은 분자량이 너무 크기 때문에, 약한 열에도 쉽게 변성이 초래되어 그 활성이 급격하게 감소한다는 문제점이 있었다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로 부터 신규의 일라스테이즈 억제 단백질 거머린(Guamerin)을 분리하였는 바, 이는 일라스테이즈만을 특이적으로 억제하며 그의 억제활성이 종래의 일라스테이즈 억제 단백질보다 강하고, 또한 열 및 강산과 강염기에도 안정하여, 상술한 종래의 일라스테이즈 억제 단백질이 가지는 문제점을 적극적으로 해결하였다(참조: 대한민국 특허출원 제 95-10206호)

이와 관련하여, 본 발명자들은 거머린으로부터 일라스테이즈 억제활성을 나타내는 거머린의 활성부위를 포함하는 펩타이드를 찾아낸다면, 그가 거머린보다는 합성과 사용이 간편할 뿐만 아니라, 경제적으로 제공될 수 있는 일라스테이즈 억제제라는 사실에 착안하여, 이용개발가능성이 우수한 상기 펩타이드를 찾아내고자 연구노력한 결과, 거머린의 활성부위인 36번째 메티오닌을 중심으로하는 19개 아미노산으로 구성된 펩타이드가 일라스테이즈 억제활성을 나타냄을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 아울러, 상기 펩타이드는 일라스테이즈 억제활성외에, 자연산 거머린이 갖지 않는 섶틸리신 억제활성을 추가로 가짐을 발견하였다.

결국, 본 발명의 목적은 거머린에서 유도되었으며, 일라스테이즈와 섶틸리신의 억제활성을 지니는 펩타이드와 그의 이량체를 제공하는 것이다.

제 1도는 거머린(Guamerin)과 거머린에서 유도된 두 종류의 펩타이드 pM 및 pR의 아미노산 서열을 나타낸다.

제 2(a)도는 합성 펩타이드 pM을 산화환원반응시키고, 고속액체크로마토그래피(HPLC)한 결과를 나타내는 그림이다.

제 2(b)도는 합성 펩타이드 pR을 산화환원반응시키고, 고속액테크로마토그래피(HPLC)한 결과를 나타내는 그림이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

우선, 본 발명자들은 대한민국에서 채집한 성숙한 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로부터 아세톤 추출물 제조, 젤 여과, 음이온 교환수지 및 역상(reverse phase) 고속액체크로마토그래피(high performance liquid chromatograhpy: HPLC)를 일련의 과정으로 수행하여 일라스테이즈 억제 단백질 거머린(Guamerin)을 순수분리하였다. 이렇게 분리한 거머린은 총 57개의 아미노산 잔기로 이루어진 분자량 6,110Da의 단백질로서, 57개의 아미노산 잔기 중에서 단백질의 구조를 견고하게 만드는 이황화결합(disulfide bond)에 필요한 시스테인 잔기를 10개나 포함하고 있었고, 36번 메치오닌과 37번 이소루이신임이 거머린의 활성부위이며, 또한 종래의 일라스테이즈 억제 단백질보다 그 억제활성이 강할 뿐만 아니라, 일라스테이즈에 대해서만 특이적으로 억제활성을 나태내고, 열 및 강산과 강염기에도 안정하였다. 따라서, 거머린을 의약용으로 사용할 경우, 생체내에서 일라스테이즈외에 다른 종류의 단백질 분해효소에는 영향을 미치지 않으므로 부작용(side effects)을 줄일 수 있을 것이고, 또한 대량생산, 저장 및 운송 등의 과정에서 열과 산도(PH)에 의한 단백질의 변성으로 인한 손실이 극히 적어, 거머린의 실제 산업화 추진에 매우 유리함을 알 수 있었다(참조: 대한민국 특허출원 제 95-10206호).

이러한 배경하에서, 거머린의 활성을 나타내는 짧은 펩타이드가 합성과 사용이 간편하고 경제적이므로, 거머린의 활성부위인 36번째 메티오닌을 포함하는 19개 아미노산으로 구성된 짧은 펩타이드를 화학합성하였다. 또한, 이 짧은 펩타이드의 36번째 메티오닌이 다른 아미노산으로 치환된 펩타이드를 화학합성하기도 하였다. 이때, 펩타이드는 화학합성법 뿐만 아니라, 유전자조작에 의한 유전공학적 기법에 의해 합성될 수도 있다.

이러한 합성 펩타이드는 여러가지 단백질분해효호 중에서 일라스테이즈와 섶틸리신에 대하여만 억제활성을 나타내었다. 따라서, 36번째 메티오닌이 다른 아미노산으로 치환되더라도 짧은 펩타이드의 억제활성에는 변화가 초래되지 않음을 알 수 있었으며, 또한 전기 합성 펩타이드는 일라스테이즈와 섶틸리신의 억제제로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

한편, 시스테인이 상호결합하여 형성된 이황화결합은 활성에 매우 중요한 단백질의 구조에 영향을 준다는 사실에 입각하여, 상기에서 합성된 펩타이드를 산화환원반응(oxidoreductive reaction)시켜 이황화결합을 형성하도록 하였다. 그런 다음, 이황화결합이 유도된 펩타이드를 분리하여 단백질분해효소 억제활성 및 그의 분자량을 측정하였다. 그 결과, 단량체(monomer)펩타이드가 산화환원반응에 의하여 활성화되면 이량체를 형성하고, 이 이량체(dimer)는 단량체보다 일라스테이즈와섶틸리신의 효소활성을 강하게 억제함을 알 수 있었다. 특히, 이량체 펩타이드는 거머린과 거의 동일한 정도의 일라스테이즈 억제활성을 가지고, 자연산 거머린이 갖지 않는 섶틸리신 억제활성을 매우 높은 수준으로 가짐을 알 수 있었다.

결국, 본 발명의 이량체 합성 펩타이드는 일라스테이즈 및 섶틸리신에 대한 강한 억제활성과 합성의 용이함으로 인하여, 일라스테이즈 또는 섶틸리신 관련 여러가지 질병의 치료제로서의 이용가능성이 자연산 거머린보다 높고, 또한 거머린에 비하여 그 분자량이 작으므로 약물로 사용되더라도 신체에 악영향을 미칠 가능성이 적다는 장점을 가진다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 특히, 본 발명의 취지에 따르면, 하기 실시예에 기술된 일라스테이즈 및 섶틸리신 억제활성을 가지는 거머린 유도 펩타이드 pM 및 pR의 단량체와 이량체 뿐만 아니라, 거머린에서 유도되어 단백질분해효소의 활성을 억제하는 모든 펩타이드 및 그들의 이량체도 본 발명의 범주에 속한다고 보아야 할 것이다.

[실시예 1] 거머린의 분리 및 특성

대한민국에서 채집한 성숙한 흡혈종 거머리를 비이커에 모아 95% 에틸 알콜을 첨가하여, 뱃속의 불순물과 핏덩이를 토해내도록 한 다음, 80% 아세톤을 첨가하고 거머리를 파쇄하여 아세톤 추출물을 제조하였다. 이렇게 하여 제조된 아세톤 추출물을 농축시켜 세파덱스 G-75(Sigma, USA) 컬럼에 주입하고 세척하여, 일라스테이즈 억제활성을 나타내는 분획을 모은 다음, DEAE-세파로스(Sigma, USA)컬럼에의 주입, 세척 및 용출과정을 거쳐 일라스테이즈 억제활성을 나타내는 분획을 모았다. 그런 다음, 전기의 활성분획을 농축시키고, 역상 컬럼(Delta-pak C18, Millipore, USA)에 주입하고 고속액체크로마토그래피을 수행하여 일라스테이즈 억제 단백질 거머린만을 순수분리하였다.

이렇게 순 수분리한 거머린의 분자량 및 아미노산 서열을 결정한 결과, 거머린은 총 57개의 아미노산 잔기로 이루어진 분자량 6,110Da의 단백질로서, 57개의 아미노산 잔기 중에서 단백질의 구조를 견고하게 만드는 이황화결합에 필요한 시스테인 잔기가 10개나 포함되어 있었다. 또한, 거머린의 활성부위는 36번 메치오닌과 37번 이소루이신임을 밝혔고, 거머린이 일라스테이즈 외에 다른 종류의 단백질 분해효소도 억제하는지 알아본 결과, 거머린의 억제활성은 일라스테이즈 특이적이었다. 거머린은 열에 대해서 상당히 안정하였고, 강산과 강염기에도 안정하였다(참조: 대한민국 특허출원 제 95-10206호).

[실시예 2] 거머린에서 유도된 펩타이드의 화학합성

거머린의 활성을 가지는 짧은 펩타이드를 합성하기 위하여, 거머린의 아미노산 서열을 토대로, 거머린의 활성부위인 36번째 메테오닌을 중심으로하는 19개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 pM 및 pR을 화학합성하였다(참조: 제 1도). 제 1도에서, pM은 거머린의 31번째 트레오닌부터 49번째 글리신까지의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드이며, pR은 36번째 메티오닌이 아르기닌으로 치환된 점을 제외하고는 pM과 동일한 펩타이드이다. 이 두가지 펩타이드는 활성부위와 매우 가까이 위치하는 시스테인 2개를 그의 서열내에 포함하고 있다는 사실이 주목할 만하다. 왜냐하면, 시스테인이 상호결합아여 형성된 이황화결합은 일반적으로 단백질의 구조에 영향을 주며, 이 특정구조에 의해 안정화되어야만 활성을 나타내기 때문이다.

상기에서 화학합성된 펩타이드는 역상의 고속액체크로마토그래피(HPLC)에 주입하고, 0.1% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)이 함유된 아세토니트릴(acetonitrile)의 직선농도구배를 수행하여 순수분리하였다.

이렇게 분리된 합성 펩타이드의 활성은 기질인 아조카제인(azocasein)이 여러종류의 단백질분해효소, 즉 트립신(trypsin), 카이모트립신(chymotrypsin), 섶틸리신(subtilisin), 일라스테이즈(elastase)에 의한 분해가 억제되는 정도로서 결정하였다. 이때, 펩타이드와 단백질분해효소의 농도는 20:1(w/w)의 비율로 고정하여 펩타이드의 억제활성을 측정하였다. 아조카제인이 단백질분해효소에 의하여 분해되는 정도를 측정한 결과, 합성 펩타이드는 일라스테이즈와 섶틸리신에 대하여만 7 내지 9%의 최대억제%를 갖는 억제활성을 나타내었다(참조: 표 2).

[실시예 3] 이황화결합에 의해 형성된 펩타이드 이량체의 활성측정

합성 펩타이드의 시스테인 두개가 이 펩타이드의 활성에 영향을 주리라는 가능성을 예측하여, 합성 펩타이드 pM 및 pR내의 시스테인이 산화환원반응에 의하여 이황화결합을 형성하도록 하였다. 이때, 산화환원반응은 0.1M 구아니딘하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride)를 포함하는 0.1M 아세트산 완충용액(sodium acetate, pH 7.8)에 펩타이드와 함께 산화형 글루타티온(oxidized glutathione, GSSG)과 환원형 글루타티온(reduced glutathione, GSH)을 0.2mM과 1mM씩 각각 넣고, 37℃에서 2시간 동안 방치함으로써 이루어졌다.

상기의 산화환원반응이 유발된 펩타이드만을 상술한 고속액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하였다(참조: 제 2(a) 및 2(b)도) 제 2(a) 및 2(b)도는 합성 펩타이드 pM 및 pR에 산화환원반응을 유발시킨 다음, 각각 고속액체크로마토그래피(HPLC)한 결과를 나타내는 그림이다. 제 2(a) 및 2(b)도에서 보듯이, 합성 펩타이드 pM에서 유도된 펩타이드는 5가지이고 각 피크에 해당하는 펩타이드는 pM(1), pM(2), pM(3), pm(4) 및 pM(5)로 명명하였으며, 합성 펩타이드 pR에서 유도된 펩타이드는 7가지이고 각 피크에 해당하는 펩타이드는 pM(1), pM(2), pM(3), pm(4) ,pM(5) ,pM(6), 및 pM(7)로 명명하였다.

상기에서 분리한 각 유도 펩타이드의 일라스테이즈 억제활성 및 섶틸리신 억제활성을 측정하였고, 또한 그의 타입을 질량분석기(matrix-assisted laser desorption ionization(MALDI) mass spectrometry)로 결정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표 1에서 보듯이, 일라스테이즈와 섶틸리신의 효소활성을 강하게 억제하는 유도 펩타이드는 모두 pM 및 pR 펩타이드의 이량체임을 알 수 있었다. 따라서, 단량체 펩타이드 pM 및 pR이 산화환원반응에 의하여 활성화되면, 이량체를 형성하며, 이 이량체는 단량체보다 일라스테이즈와 섶틸리신의 억제활성이 매우 강함을 알 수 있었다.

아울러, 상기에서 형성된 이량체의 여러가지 단백질분해효소에 대한 억제활성을 거머린, 단량체 펩타이드 pM 및 pR의 억제활성과 비교하기 위하여, 실시예 1에서와 마찬가지로 트립신, 카이모트립신, 섶틸리신 및 일라스테이즈의 활성이 억제되는 정도를 측정하였다(참조: 표 2). 표 2에서 pM-D 및 pR-D는 펩타이드 pM 및 pR의 이량체를 각각 나타내고, pM-PE는 pM 펩타이드에 존재하는 시스테인의 -SH기를 피리딜에틸화(pyridylethylation)시킨 펩타이드를 나타낸다.

상기 표 2에서 보듯이, 이량체 펩타이드는 단량체보다 일라스케이즈와 섶틸리신의 억제활성이 매우 강하여 최대억제%(maximum percent inhibition)가 82 내지 97%이며, 특히 이량체 펩타이드는 거머린과 거의 동일한 정도의 일라스테이즈 억제활성을 가지고, 자연산 거머린이 갖지 않는 섶틸리신 억제활성을 매우 높은 수준으로 가짐을 할 수 있었다.

아울러, 이량체의 일라스테이즈에 대한 억제상수(inhibitory constant)를 구하기 위하여, 발색체 펩타이드 기질(chromogenic peptide substrate) N-석시닐-L-Ala-Ala-p-니트로아닐리드(N-succinyl-L-Ala-Ala-p-nitroanilide)의 일라스테이즈에 의한 분해 억제정도로서 이량체의 활성을 츠ㄱ정하였는 바, 이량체 pM-D의 억제상수는 49nM이고, pR-D의 억제상수는 54nM이었다(참조: 표2). 또한, 이량체의 섶틸리신에 대한 억제상수를 N-석시닐-L-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐리드(N-succinyl-L-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)를 발색체로 사용하여 상기와 같은 방법으로 결정한 결과, 이량체 pM-D의 억제상수는 31nM이고, pR-D의 억제상수는 38nM이었다(참조: 표2). 이와 같은 일라스테이즈 및 섶틸리신에 대한 이량체의 억제상수는 거머린의 일라스테이즈에 대한 억제상수(0.81fM)보다 큰 값이었지만, 종래의 자연산 억제제의 억제상수와 비교한다면 매우 유의할만한 값이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로부터 분리된 거머린에서 유도되었으며, 일라스테이즈와 섶틸리신의 억제활성을 지닌 펩타이드와 그의 이량체를 제공하낟. 본 발명의 단량체 펩타이드는 합성과 사용이 간편할 뿐만 아니라, 경제적으로 제공될 수 있는 일라스테이즈 및 섶틸리신 억제제이다. 또한, 본 발명의 이량체 펩타이드는 일라스테이즈 및 섶틸리신에 대한 강한 억제활성과 합성의 용이함으로 인하여, 일라스테이즈 또는 섶틸리신 관련 여러가지 질병의 치료제로서의 이용가능성이 자연산 거머린보다 높고, 또한 거머린에 비하여 그 분자량이 작으므로 약물로 사용되더라도 신체에 악영향을 미칠 가능성이 적다는 장점을 지니고 있다.

Claims

한국산 흡혈종 거머리(Hirudo nipponia)로부터 분리된 일라스테이즈 억제 단백질 거머린(Guamerin)에서 유도되었으며, 단백질분해효소의 활성을 억제하는 펩타이드.
제 1항에 있어서,

단백질분해효소는 일라스테이즈(elastase) 또는 섶틸리신(subtilosin)인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1항 펩타이드 분자간의 이황화결합(intermolecular disulfide bond)에 의해 형성된 이량체가 단백질분해효소의 억제활성을 증진시키는 것을 특징으로 이량체 펩타이드.
일라스테이즈 억제 단백질 거머린(Guamerin)의 31번째 트레오닌부터 49번째 글리신까지의 아미노산 서열로 구성되었으며, 일라스테이즈와 섶틸리신의 활성을 억제하는 펩타이드.
제 4항에 있어서,

거머린의 활성부위인 36번째 메티오닌이 다른 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 4항 펩타이드 분자간의 이황화결합(intermolecular disulfide bond)에 의해 형성된 이량체가 일라스테이즈와 섶틸리신의 억제활성을 증진시키는 것을 특징으로 이량체 펩타이드.