CN101475624A

CN101475624A - 鼠妇镇痛肽的制备

Info

Publication number: CN101475624A
Application number: CNA2008100000487A
Authority: CN
Inventors: 张永和; 王茂功
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-01-04
Filing date: 2008-01-04
Publication date: 2009-07-08

Abstract

取一定量鼠妇，用预冷的缓冲液冲洗去除杂质和其他组织，压榨搅拌后，加入配置好的裂解液混匀，在冰面上用超声粉碎。冰冻高速离心，一定时间，取上清进行超率(截流率值大于等于5000)为待处理蛋白提取物，冻存于冰箱中。通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀分级析出。收集不同条件下沉淀出来的蛋白质组分。之后进行盐析、浓缩；选择具有镇痛作用的组分。或者在低温下用与水可混溶的有机溶剂使多数蛋白并分级析出。收集不同条件下沉淀出来的蛋白质组分。之后进行复性、浓缩；镇痛作用的组分。选择具有镇痛作用的组分，分别利用进行凝胶层析，收集具有镇痛功能的多肽。可以收集到1500～2000Da，3000～5000Da。两组具有镇痛作用的多肽。

Description

鼠妇镇痛肽的制备

【技术领域】

本发明涉及从鼠妇中分离活性成份。并将本工艺所获得的物质专门用于镇痛的治疗。

【背景技术】

鼠妇又称“潮虫”，在南方也叫“西瓜虫”、“团子虫”，属无脊椎动物节肢动物门甲壳纲潮虫亚目。鼠妇的种类较多，它们身体大多呈长卵形，成体长9—15毫米，背腹扁平十分显著，呈灰褐色、灰蓝色；常能卷曲成团，是草食的陆栖类群，口器是咀嚼式口器，为甲壳动物中唯一完全适应于陆地生活的动物，从海边一直到海拔5000米左右的高地都有它们的分布。第一触角短小，后7对胸肢变成步足。但它们都需生活在潮湿、温暖以及有遮蔽的场所，昼伏夜出，具负趋光性。不像昆虫和蜘蛛那样高度适应于陆地上生活，在我国大多数地区都有分布，在田间，主要为害黄瓜、西红柿、油菜等常见的种类有潮虫科、鼠妇科、球鼠妇科等代表动物。

【别名】潮湿虫、潮虫、地虱婆

【来源】为平甲虫科动物平甲虫Armadillidium vulgare(Latreille)或鼠妇Porcellio scaber Latreille的干燥虫体。春、夏、秋三季捕捉，用铁锅炒干，或开水烫死，晒干或焙干。

【性味归经】酸，温。

【功能主治】利咽止痛，破瘀利水。用于慢性气管炎，术后疼痛，牙痛，口腔炎，鹅口疮，咽喉肿痛，小便不利，闭经。

【用法用量】1.5～3分(0.5～1克)，研粉服。

【摘录】《全国中草药汇编》

【发明内容】

本发明的主要目的是提供一种从鼠妇中提取镇痛肽的方法。为实现以上目的，制备工艺可以概括为以下步骤：

(1)总蛋白的提取

取一定量鼠妇，用预冷的缓冲液冲洗去除杂质和其他组织，经过压榨搅拌后，加入配置好的3mL裂解液，混匀，在冰面上用超声粉碎.冰冻高速离心，一定时间，取上清进行超率(截流率值大于等于5000)为待处理蛋白提取物，冻存于冰箱中。

(2)蛋白质粗制品的获得

方法1、不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀分级析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。收集不同条件下沉淀出来的蛋白质组分。之后进行盐析、浓缩；选择具有镇痛作用的组分。

方法2、用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度分级降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。收集不同条件下沉淀出来的蛋白质组分。之后进行复性、浓缩；镇痛作用的组分。

(3)样品的进一步分离纯化

选择具有镇痛作用的组分，分别利用进行凝胶层析，收集具有镇痛功能的多肽。可以收集到1500～2000Da，3000～5000Da。两组具有镇痛作用的多肽。

本工艺所采用的缓冲溶液，是指缓冲范围包括pH值5～7的一切缓冲溶液，用量包括样品量的0.1倍到1000倍(体积比)，一般为PBS缓冲液。

工艺所采用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，分段盐析具体方法不限；利用有机溶剂进行沉淀时，所用溶剂主要为可以与水混溶的溶剂，包括但不限于甲醇，乙醇或丙酮。

浓缩工艺：其特征在于使样品浓度提高，而不使样品活性受损，包括但不限于真空低温冻干、旋转蒸发、真空干燥等手段。

层析工艺：其特征在于使样品得到分离提纯，包括但不限于以下葡聚糖凝胶层析、离子交换层析、聚乙烯醇层析、聚乙烯酰胺层析、琼脂层析、琼脂糖层析、浮石层析等手段。

旋转蒸发工艺：其特征在于使样品浓度提高，而不使样品活性受损，蒸发温度低于100℃，旋转速度范围为0～100000转/分钟。

低温冻干工艺：其特征在于使样品浓度提高，而不使样品活性受损，蒸发温度包括-500℃～50℃，冻干时间包括0～15天。

葡聚糖凝胶层析层析工艺：其特征在于使样品得到分离提纯，所用凝胶为G-75、G-25；所用缓冲液为缓冲区间为Ph5.5～7的缓冲液，常用缓冲液为磷酸缓冲液。

真空浓缩方法：通过真空旋转蒸设备进行浓缩，控制温度在100℃以下。

【实施实例】

总蛋白的提取

取300克新鲜鼠妇，用预冷的1×PBS液冲洗去除杂质和其他组织，经过压榨搅拌后，加入配置好的3mL裂解液(裂解液：7mol/L尿素，2mol/L硫脲，5mL/L IPG buffer(pH 3～10)，65mmol/L DTT，40g/L CHAPS，5mg/L蛋白酶抑制剂)，混匀，在冰面上用超声粉碎.5000转/分钟，30分钟，取上清利用截流率值5000的超滤柱子进行超率，所得蛋白提取物，冻存于冰箱中。

蛋白质粗制品的获得

方法1、以1.0M，2.0M，3.0M，4.0M四个不同浓度的硫酸铵，进行盐析，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀分级析出，收集不同条件下沉淀出来的蛋白质组分。之后进行盐析、浓缩；收集具有镇痛作用的组分。

方法2、用与水可混溶的乙醇，加入到提取物中，使乙醇浓度达到40％、75％、95％，可使多数蛋白质溶解度分级降低并析出。收集不同条件下沉淀出来的蛋白质组分。之后进行复性、浓缩镇痛作用的组分。

样品的进一步分离纯化

选择具有镇痛作用的组分，分别利用G-25进行凝胶层析，所用洗脱缓冲液为0.01mol/L、pH 6.2磷酸缓冲液；收集具有镇痛功能的多肽。可以收集到1300～2000Da，3000～5000Da两组具有镇痛作用的多肽。

Claims

1、制备工艺包括以下步骤为：

总蛋白的提取

取一定量鼠妇用，用预冷的洗涤缓冲溶液洗去除杂质和其他组织，经过压榨搅拌后，加入配置好的适量裂解液，混匀，在冰面上用超声粉碎；冰冻离心，一定时间，取上清进行超率(截流率值大于等于5000)为待处理蛋白提取物，冻存于冰箱中；

蛋白质粗制品的获得

方法1、不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀分级析出；被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性；收集不同条件下沉淀出来的蛋白质组分；之后进行盐析、浓缩；选择具有镇痛作用的组分待用；

方法2、用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度分级降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行；收集不同条件下沉淀出来的蛋白质组分。之后进行复性、浓缩；镇痛作用的组分待用；

样品的进一步分离纯化

选择具有镇痛作用的组分，分别利用进行凝胶层析，用层析缓冲液洗脱，收集具有镇痛功能的多肽；可以收集到1500～2000Da，3000～5000Da；两组具有镇痛作用的多肽。

2、根据权利要求1所述的本工艺所采用的适量的缓冲溶液，包括洗涤缓冲液和层析缓冲液，是指缓冲范围包括pH值5～7的一切缓冲溶液。

3、根据权利要求1所述的本盐析工艺所采用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，分段盐析具体方法不限。

4、根据权利要求1所述的有机溶剂，主要为可以与水混溶的溶剂，包括但不限于甲醇，乙醇或丙酮。

5、根据权利要求1所述的浓缩工艺，其特征在于使样品浓度提高，而不使样品活性受损，包括但不限于真空低温冻干、旋转蒸发、真空干燥等手段。

6、根据权利要求1所述的层析工艺，其特征在于使样品得到分离提纯，包括但不限于以下葡聚糖凝胶层析、离子交换层析、聚乙烯醇层析、聚乙烯酰胺层析、琼脂层析、琼脂糖层析、浮石层析等手段；常用方法为葡聚糖凝胶层析和离子交换层析。

7、根据权利要求5所述的旋转蒸发工艺，其特征在于使样品浓度提高，而不使样品活性受损，蒸发温度低于100℃，旋转速度范围为0～100000转/分钟。

8、根据权利要求5所述的低温冻干工艺，其特征在于使样品浓度提高，而不使样品活性受损，蒸发温度包括-500℃～50℃，冻干时间包括0～15天。

9、根据权利要求6所述的葡聚糖凝胶层析层析工艺，其特征在于使样品得到分离提纯，所用凝胶为G-75、G-25。