CN109021073B - 秦岭雨蛙镇痛肽ht2的改造体ht12及其应用 - Google Patents

Abstract

一种秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12，含有5个氨基酸残基，分子量674.86Da，理论等电点5.52，序列为YWPLL。改造体HT12经疼痛模型小鼠醋酸扭体疼痛模型和小鼠热板实验，对醋酸引起动物疼痛有镇痛效果，能够明显延长痛阈，减轻热板造成的疼痛，表现出良好的镇痛效果，经急性毒性试验，对小鼠无急性毒性作用，可在治疗疼痛药物中应用。该改造体HT12具有结构简单、人工合成方便、生成成本低等优点，具有重要的应用前景和实际意义。

Description

秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12及其应用

技术领域

本发明属于多肽技术领域，具体涉及到秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12。

背景技术

疼痛是一种多维度现象，包含了感觉、情绪、认知和评价等诸多方面。依据国际疼痛学会(International Association for the Study of Pain，IASP)的定义，“疼痛是一类与组织损伤或潜在的组织损伤相关的不愉快的主观感觉和情感体验”，是身体和内脏受到损伤的警告信号。目前的镇痛药主要是以吗啡为代表的麻醉性镇痛药物以及以阿司匹林为代表的解热镇痛和抗炎药物。虽然其效果较好，但有明显的易成瘾、过敏、对肝肾的损害较大等副作用。蛋白质、多肽类镇痛药物具有治疗效果好、活性高、使用量少以及毒副作用小等优势，因此多肽类镇痛药物的研究及开发是必然的趋势。

镇痛肽包括内源性药物和外源性药物两大类。内源性镇痛肽是以阿片肽为主的药物,而外源性镇痛肽则来源于各种生物。内源性镇痛药物中最常用的是内源性阿片肽(Endogenous Opioid Peptide)。这类肽物质主要包含5个类型，分别是脑啡肽(enkaphalin)、内啡肽(endorvhin)、强啡肽(dynorPhin)、孤啡肽(orphanin-FQ)和内吗啡肽(endomorphin)，内源性阿片肽通过阿片受体发挥作用，属于神经调节物质或者是神经递质，主要作用于中枢神经系统兴奋末梢的阿片受体，抑制p物质的释放，使得神经元接收到较少部分的冲动，从而减少痛觉。而在外源性肽类镇痛药物中，主要从动物中分离到了多种天然的具有镇痛活性的蛋白质类物质。目前国内外动物源性镇痛物质的研究主要集中在蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒等方面，如从虎纹捕鸟蛛蛛毒中分离出一种多肽神经毒素，它有很强的镇痛作用，命名为虎纹镇痛肽(HWAP-I)，可通过对Ca²⁺通道的阻断，抑制痛觉的传递，起到镇痛作用。从东亚钳蝎毒素分离到分子量分别为7214.36Da和7253.11Da的两种多肽，其N端封闭，可以通过干扰K⁺和Na⁺离子通道来起镇痛作用。

在医药技术领域，当前需迫切解决的一个技术问题是提供一种镇痛效果显著的药物。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种具有镇痛效果显著的秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12。

本发明所要解决的另一个技术问题在于为秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12提供一种新用途。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12，含有5个氨基酸残基，分子量674.86Da，理论等电点5.52，序列为YWPLL。

秦岭雨蛙镇痛肽HT2的序列为：FWPLL。

秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12的序列为：YWPLL。

其合成方法如下：

1、设计秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体序列

将秦岭雨蛙镇痛肽HT2的第一位氨基酸苯丙氨酸替换为酪氨酸，秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12，其序列为YWPLL。

2、合成秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12

采用固相合成法，用自动多肽合成仪合成其全序列，末端进行氨基化修饰，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化，得秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12，检测其纯度，应大于95％，用电喷雾质谱测其分子量，计算理论等电点。

上述的秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12在制备治疗镇痛药物中的用途。其使用方法如下：

有效成分秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12在制备治疗镇痛药物以常规药用制剂的形式来使用；所述的常规药物用制剂含作为活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适宜于胃肠内和胃肠外给药的有机或无机的固体或液体赋形剂混合，该药用制剂可以是固体形式如片剂、胶囊剂、颗粒剂，也可以是液体形式如注射剂、糖浆剂等。

上述制剂中可含有辅助物质、稳定剂、润湿剂和其它常用的添加剂，如乳糖、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、硬脂酸镁、石膏粉、蔗糖、玉米淀粉、滑石粉、明胶、琼脂、果胶、花生油、橄榄油、可可脂、乙二醇、抗坏血酸、甘露醇等。

上述的制剂可按照各种制剂常规的制备方法制成。

本发明的积极效果在于：本发明采用替换方法设计HT2的改造体HT12，改造体HT12的镇痛效果优于HT2，效果良好，能够作为制备镇痛药物中的应用。且该改造体HT12具有结构简单、人工合成方便、生成成本低等有益特点。

以增强镇痛肽的镇痛效果为目的，对天然镇痛肽HT2的序列进行改造，通过一系列氨基酸替换，获得了改造体HT12，它是其中效果最好的镇痛肽。

发明人将本发明的秦岭雨蛙镇痛肽HT2改造体HT12全序列氨基酸结构经NCBI蛋白质数据库进行搜寻比对，未发现有任何相同多肽。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于下面的实施例。

实施例1

秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12，含有5个氨基酸残基，分子量732.87Da，理论等电点5.52，序列为YWPLL。

秦岭雨蛙镇痛肽HT2的序列为FWPLL。

上述秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12的合成方法如下：

1、设计秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体序列

将秦岭雨蛙HT2的第一位F苯丙氨酸替换为Y酪氨酸，设计秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12，其序列为YWPLL，是一种直链多肽，含有5个氨基酸残基。

2、合成秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12

采用固相合成法，用自动多肽合成仪合成其全序列，末端进行氨基化修饰，用反相高效液相层析检测纯度，A液为1％的三氟乙酸乙腈溶液，B液为1％的三氟乙酸水溶液，采用梯度洗脱，测得纯度为97.6％。

3、测试分子量、计算理论等电点

用电喷雾质谱测其分子量，分子量为674.86Da。

用网站http://web.expasy.org/protparam/计算理论等电点，测定结果为:理论等电点为5.52。

实施例2

实施例1制备的秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12在制备治疗疼痛病镇痛药物中的用途，所制备的药物剂型为注射剂。

药用制剂秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12制备成注射剂，以生产注射剂产品1000支为例所用原料和辅料及其重量配比如下：

秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12 9.90g

注射用甘露醇 加至20g

制备工艺按制剂学注射剂的常规工艺进行，每支重0.02g，含秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12 9.90mg。

用法用量：静脉滴注，每次1支，溶解在250mL注射用葡萄糖注射液中，一日1次，小儿酌减。该注射剂也可采用肌肉注射，使用方法按照常规的肌肉注射方法进行，每次1支，一日1次。

实施例3

实施例1制备的秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12在制备治疗疼痛病镇痛药物中的用途，所制备的药物剂型为片剂。

药用制剂秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12制备成片剂，以生产片剂产品1000片为例所用原料和辅料及其重量配比如下：

秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12 3.30g

淀粉 加至300g

制备工艺按制剂学片剂的常规工艺进行，每片重0.3g，含秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12 3.30mg。

用法用量：口服，每次1片，一日3次，小儿酌减。

为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12(实验时简称HT12)进行了药效试验，各种实验情况如下：

1、HT12对小鼠醋酸扭体疼痛模型的镇痛作用

实验动物采用昆明小鼠50只(体重18-22g)，雌雄各半。随机分为阴性对照组、2组阳性对照组和3组实验组，共6组，每组10只，雌雄各半。将阳性对照镇痛肽analgesin a1干粉溶解于生理盐水配制成浓度为0.15mg/mL的阳性对照试剂，给小鼠按1.50mg/kg剂量注射；将HT12干粉溶解于生理盐水配制成浓度分别为0.075mg/mL、0.15mg/mL、0.30mg/mL的实验试剂，实验的剂量为分别为0.75mg/kg、1.50mg/kg、3.00mg/kg，采用皮下注射方式，实验组给小鼠按0.10mL/10g剂量注射各浓度的实验试剂；阴性对照组按0.10mL/10g的剂量注射生理盐水。30分钟后，按0.10mL/10g剂量腹腔注射质量浓度为0.6％的醋酸水溶液，小鼠出现扭体反应，记录20分钟内各组小鼠的扭体次数，通过分析各组小鼠扭体次数的差别，计算各组小鼠的扭体抑制率。抑制率的计算公式为：

抑制率(％)＝(对照组平均扭体次数-用药组平均扭体次数)/对照组平均扭体次数×100％。结果如表1所示。

表1 HT12对小鼠醋酸扭体疼痛的镇痛作用

实验结果表明：HT12能减少小鼠醋酸扭体次数，表明改造体HT12对醋酸引起动物疼痛有镇痛效果。其中剂量为3.00mg/kg时镇痛效果最好，考虑到药剂制备成本选用1.50mg/kg的剂量，相当于成人每天用量9.90mg。

2、HT12对小鼠热板致痛模型的镇痛作用

实验动物采用昆明雌性小鼠(体重18-22g)，将小鼠放在55±1℃的热板上，记录其足底接触热板到出现舔后足、踢后足或跳跃时间，作为小鼠的基础痛阈指标，共测两次。将上述测定过基础痛阈(正常值应当在5-20s)的小鼠中，痛阈小于5s或大于20s者剔除。将阳性对照镇痛肽analgesin a1干粉溶解于生理盐水配制成浓度为0.15mg/mL的阳性对照试剂，实验的剂量为1.50mg/kg。将HT12干粉溶解于生理盐水，配制成浓度分别为0.075mg/mL、0.15mg/mL、0.30mg/mL的实验试剂，实验的剂量分别为0.75mg/kg、1.50mg/kg、3.00mg/kg。采用皮下注射的方式，给小鼠注射镇痛肽药物，分别测定小鼠注射药物后15、30、60、120分钟时的痛阈值，用药后痛阈值达到60秒者停止实验并以60秒计，计算每个时间点痛阈值的平均值并与基础痛阈值比较，计算给药后痛阈提高百分率。痛阈提高百分率＝(给药后痛阈-基础痛阈)/基础痛阈×100％。结果见表2。

表2 HT12对小鼠热板致痛模型的镇痛作用

由表2可知，与基础痛阈相比，小鼠注射HT12后，能够明显延长痛阈，说明HT12能够减轻热板造成的疼痛。其中剂量为1.50mg/kg时镇痛效果最好，相当于成人每天用量9.90mg。

3、HT12对小鼠急性毒性试验

预试验动物在实验室饲喂1周，选择健康雌性C57小鼠进行实验。取体重为19-21g小鼠3只，随机分为实验组、溶剂对照组、空白对照组。将HT12干粉溶解于二甲基甲酰胺，浓度为800mg/mL，实验组小鼠皮下注射HT12溶液0.05mL,实验剂量为2000mg/kg；溶剂对照组小鼠皮下注射等剂量溶剂二甲基甲酰胺；空白对照组小鼠皮下注射等量生理盐水。给药前小鼠禁食8小时，不禁水，给药后3小时恢复进食。注射一次，观察期为十四天，症状恢复后，结束实验。观察期内小鼠全部健存，无异常反应，到期时每只小鼠体重增加(表3)。大体解剖，实验组小鼠心、肝、脾、肾无明显器质性变化。

根据预试验结果选择正式试验药物剂量为2000mg/kg。试验动物在实验室饲喂1周，选择健康C57小鼠体重为19-21g小鼠30只，随机分为实验组、溶剂对照组、空白对照组，每组各10只，雌雄各半。将HT12干粉溶解于二甲基甲酰胺，浓度为800mg/mL，实验组10只小鼠皮下注射HT12溶液0.05mL,剂量为2000mg/kg(成人用量50倍为8.25mg/kg)；溶剂对照组小鼠皮下注射等剂量溶剂二甲基甲酰胺；空白对照组小鼠皮下注射等量生理盐水。给药前小鼠禁食8小时，不禁水，给药后3小时恢复进食。注射一次，观察期为14天，症状恢复后，结束实验。观察期内小鼠全部健存，无异常反应，到期时每只小鼠体重增加。大体解剖，实验组小鼠心、肝、脾、肾无明显器质性变化。实验结果表明HT12对小鼠无急性毒性作用。

表3小鼠体重变化表(单位：g)

Claims (2)

1.一种秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12，其特征在于：它含有5个氨基酸残基，分子量674.86 Da，理论等电点5.52，序列为YWPLL。

2.权利要求1所述的秦岭雨蛙镇痛肽HT2的改造体HT12在制备镇痛药物中的用途。