CN1312176C

CN1312176C - 一种蝎毒多肽及其制备方法

Info

Publication number: CN1312176C
Application number: CNB2005100462586A
Authority: CN
Inventors: 孟祥军; 赵恩成; 顾孝先; 赵婧婷
Original assignee: 赵恩成; 康力
Current assignee: Shenyang Cheng Tai Industrial Co ltd
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2025-04-15
Also published as: CN1687126A

Abstract

本发明为一种蝎毒多肽及其制备方法，属于生物制药领域，利用高效液相色谱仪提取到的蝎毒多肽具有活性强、纯度高、质量稳定和组分可控的特点，通过药效学试验证明本品具有良好的镇痛、抗血小板凝聚和戒毒效果，本制备方法为利用高效液相色谱仪，经过梯度或等度洗脱，通过色谱工作站观察起峰收集馏分，经检测合格后进行冻干得到高浓度冻干制剂，本方法具有工艺简单，提纯速度快适于工业化生产的特点，可广泛用于生物制药企业，本品得到的高纯度产品更便于运输和储藏。

Description

一种蝎毒多肽及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物制药技术领域，特别是涉及一种蝎毒多肽及其制备方法。

背景技术

在传统中医药学中，全蝎具有悠久的药用历史，全蝎性味咸平，归足朔阴经，主要功能为去风止痛，通经解毒。近年来有关蝎毒的研究与应用愈来愈受到人们的重视。经研究认为，蝎毒素是全蝎药理作用的主要成分，具有抗癫、抗栓、抗炎、抗肿瘤、有很强的中枢镇痛作用。目前有的已用于疾病治疗。中国专利申请号93109133、97120965、98101335公开的专利申请文件中，公开了蝎毒注射液及其制取方法，有的采用利多卡因药物联合配用蝎毒注射液，有的采用不破坏蛋白质晶体蝎毒配制注射液，其不足之处在于其蝎毒注射液中蝎毒原料均以蝎毒蛋白质或多肽混合物存在，其纯度、质量不够稳定，直接影响使用效果；由于配置制剂的原料没有具体定性、定量指标，难于满足国家对药品原料质量的要求。现有的蝎毒多肽制备方法多采用凝胶色谱柱法，其缺点是分离速度缓慢，馏分的组成难以确定。

发明内容

针对当前蝎毒多肽制备方法中存在的不足，本发明的目的在于提供一种速度快、无污染，便于操作、适于工业化生产的蝎毒多肽制备方法，以及按照这种方法由蝎毒原料分离提取纯度较高的一种蝎毒多肽。以这种蝎毒多肽为主要原料可制取蝎毒多肽冻干粉制剂等，是一种纯度高、活性强、质量可控、性能稳定，疗效确切的药物。

本发明所使用的原料为东亚钳蝎蝎毒粉(白色或淡黄色粉末)，其拉丁文学名为Buthus Martensi Karsch，蝎毒液中的有效毒性成分是一组由20-80氨基酸组成的多肽和蛋白质，含有三甲胺、甜菜碱、牛磺酸、甘油酯、硬脂酸、铵盐等。

本发明使用的仪器：大连依利特分析仪器有限公司生产的高效液相色谱仪E-C2000色谱数据处理工作站，配有两台相同的P230高压恒流泵(该泵同为液相色谱仪配套仪器大连依利特生产)。

色谱柱根据进样量的多少分别使用制备柱或半制备柱，规格可以是：半制备柱尺寸：4.60mm(内径)×250mm(高度)；制备柱尺寸：20.0mm(内径)×200mm(高度)，色谱柱填料为瑞典Pharmcia公司生产的CM Sepharose系列。

粗品原料得到纯度相对较高的蝎毒多肽是通过如下步骤实现的：

1、采用高效液相色谱仪进行分离

(1)启动高效液相色谱仪，打开EC-2000色谱数据处理工作站，根据进样量设置色谱条件，其中色谱条件设置为：

流速：5～150ml/min；压力：3～5Mpa；

检测波长：uv～10、260或280nm；

流动相：本发明使用的流动相是，磷酸盐缓冲液加氯化钠(以下简称A液)与磷酸盐缓冲液，其PH＝6.4(以下简称B液)，其中磷酸盐缓冲液可由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠加去离子水定溶至PH值等于6.4制得。

(2)设置梯度程序：A泵运行流动相A液，B泵运行流动相B液。

梯度程序：A泵1～15min0％ 15～55min60％ 55～75min0％

B泵0～15min100％ 15～55min40％ 55～75min100％；

(3)称样：称取制备用蝎毒粉，溶于适量的流动相B液中，使其充分溶解，用滤纸过滤、准备进样。

(4)运行B泵(B液100％)，A泵停止状态，冲柱约20分钟，待仪器稳定后，加进制备好的蝎毒粉溶液，按启动键开始洗脱。

(5)馏分的收集：进样后，依照设置梯度程序运行A、B两泵，流速为5～150ml/min，最好为15ml/min，通过色谱工作站观察，起峰时开始收集直到峰落下处停止收集，收集到馏分液体为无色或淡黄色澄明液体，用紫外分光光度计检测A_{210、200、280}＝0.6～1.5；收集到的馏分通过电泳确定其分子量在5000～10000道尔顿之间。

上述步骤中，洗脱程序也可采用等度洗脱，与梯度洗脱区别在于单泵运行，流动相为PH＝6.4的磷酸盐缓冲液，进样以后步骤与梯度洗脱相同。梯度洗脱主要目的是将制备柱内的残留其它组分洗净，便于下一次分离。

此操作最好在无菌或半无菌、10～25℃恒温环境下进行。

2、使用高效液相色谱对馏分进行分析，其分析条件如下：

仪器：大连依利特分析仪器有限公司生产的高效液相色谱仪E-C2000色谱数据处理工作站，配有一台P230高压恒流泵。

色谱柱为：TSK柱尺寸：7.8mm×300mm，

TSK柱填料：GELG2000SWXL产地～日本TOSOH CORPORATION

色谱条件：

流速：0.50ml/min，压力：3Mpa，检测波长：uv～210nm

流动相：氯化钠与PH＝6.4的磷酸盐缓冲液柱温：35℃

取收集到的馏分用微量进样器进样20ul，得到如附图4的蝎毒多肽高效液相色谱图，为多组分多肽分布图，从附图2蝎毒多肽电泳图谱可知，该馏分分子量在5000～10000道尔顿之间，可确认按照上述方法由蝎毒毒粉分离得到的物质为蝎毒多肽。

所得馏分可以使用以下工艺进行低温冷冻干燥：将分离收集到的蝎毒多肽液体灌装2ml到容积为10ml已经加入5mg甘露醇的管制抗生素玻璃瓶中，振摇使甘露醇溶解后，启动冻干机，制冷温度达到-40℃后，保温2小时，抽真空至真空度达到10Pa以下，从-40℃升温到30℃，时间24～25小时，得到本品的冻干制剂为白色疏松的含水量小于3％的结晶性固体。压塞、上盖、包装。得到的制剂采用与液体相同的电泳与高效液相色谱条件进行分析，其电泳与色谱行为与原液体一致。

将所得到的蝎毒多肽冻干制剂进行急性毒理学实验：本产品静脉给药LD₅₀为0.8808mg/kg，95％可信限为0.7385～1.0505mg/kg；肌肉注射给药LD₅₀为1.5331mg/kg，95％可信限为1.4050～1.6612mg/kg。

一般药理学研究结论：一般药理试验结果表明，分别以40μg/kg、20μg/kg、10μg/kg对已注射对戊巴比妥钠得小鼠进行肌肉给药，对小鼠睡眠时间无明显影响；以40μg/kg、20μg/kg、10μg/kg对小鼠尾静脉注射，对小鼠在转杆上的停留时间无明显影响。8.15μg/kg、4.1μg/kg、2.0μg/kg肌肉给药，对猫的心血管系统、呼吸系统均无显著影响。肌肉给药对对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠时间无明显影响；尾静脉注射对小鼠转杆上停留时间无明显影响，肌肉给药对猫自主活动无明显影响。说明本品对中枢神经系统无明显的兴奋和抑制作用；对运动协调性无明显影响；分别以2.0μg/kg～8.15μg/kg肌肉给药，给药后15～90min与给药前比较，猫的心电图、QRS间期、心率、血压无明显改变，说明本品对呼吸系统无明显影响。

药效学试验结果表明，本产晶低剂量：10μg/kg以上剂量给药，对化学、物理、机械及电流等刺激产生的痛觉具有明显的镇痛效果。镇痛作用特点为起效慢于盐酸哌替啶，但作用时间长于盐酸哌替啶。

本产品对肌肉注射给药30min后，10μg/kg～80μg/kg剂量组对醋酸造成的小鼠扭体次数明显减少，与空白对照组比较差别有显著意义；对甲醛引起的小鼠疼痛试验中，肌肉注射给药30min后，各剂量小鼠疼痛反应程度明显减轻，与空白对照组比较差别有显著意义P＜0.01，其中5min、15min：40μg/kg剂量组P＜0.01＝各剂量组：本产品对小鼠热板作用的试验中，肌肉注射给药后，痛阈反应时间均增大，与自身给药前阈值比较差别有显著意义；本品对金属压片加压引起的大鼠疼痛、金属压片加压引起的小鼠疼痛试验，疼痛反应明显减轻，与本组给药前阈值比较差别有显著意义；对电刺激引起的大鼠尾尖疼痛反应试验中，肌肉注射给药后15min各剂量组疼痛嘶叫反应时间明显增加。

以上实验证明，本产品有较强的镇痛作用。对中枢疼痛、神经性疼痛有明显的疗效，同时对炎性疼痛和外周神经痛有一定作用，且用量小，作用时间长，效果明显。

本制备方法的优点在于为有效利用蝎毒提供了一种良好的制备方法，本方法可广泛用于生物制药企业，所得产品活性强、纯度高，通过药效学试验证明本品具有良好的镇痛、抗血小板凝聚和戒毒效果，得到的高纯度产品更便于运输和储藏，更加方便的制取其复合或单方制剂，本方法工艺简单，提纯速度快，质量可控无需特殊贮藏条件。

附图说明

附图1蝎毒多肽液相色谱图；

附图2蝎毒多肽电泳图；

附图3蝎毒多肽电泳图图解；

附图4高浓度蝎毒多肽高效液相色谱图。

具件实施方式

实施例1

仪器为大连依利特分析仪器有限公司生产的高效液相色谱仪E-C2000色谱数据处理工作站，配有两台相同的P230高压恒流泵(A泵和B泵)，为大连依利特分析仪器有限公司生产。检测用紫外分光光度计为：UV-2800型紫外可见分光光度计

色谱柱为半制备柱，规格：4.60mm(内径)×250mm(高度)；色谱柱填料为瑞典Pharmcia公司生产的CM Sepharose系列，步骤为：

(1)启动高效液相色谱仪，打开EC2000色谱数据处理工作站，设置色谱条件，其中色谱条件设置为：

流速：5～50ml/min；压力：3Mpa；检测波长：uv～210nm；

流动相：A泵流动相为氯化钠加由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠加去离子水定溶至PH值等于6.4制得的磷酸盐缓冲液，B泵流动相为由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠加去离子水定溶至PH值等于6.4制得的磷酸盐缓冲液；

(2)设置梯度程序：

梯度程序：A泵1-15min0％ 15-55min60％ 55-75min0％

B泵0-15min100％ 15-55min40％ 55-75min100％

(3)称样：称蝎毒粉400mg，溶于4ml流动相B液中，使其充分溶解用滤纸过滤、准备进样：

(4)运行B泵冲柱约20分钟，待仪器稳定后，加进制备好的蝎毒粉溶液，按启动键开始梯度洗脱。

(5)馏分的收集：进样后，依照设置梯度程序运行A、B两泵，流速15ml/min，通过色谱工作站观察约2分钟起峰时开始收集直到峰落下处停止收集(2～8/min)，见附图1蝎毒多肽液相色谱图，得到液体为无色或淡黄色澄明液体，收集到的馏分量约60～80ml，用紫外分光光度计检测A₂₈₀＝0.800～1.600左右；收集到的馏分通过电泳确定其分子量在5000～10000道尔顿之间见附图2蝎毒多肽的电泳图及图3蝎毒多肽电泳图图解；

用高效液相色谱对馏分进行分析，其分析条件如下：

仪器：大连依利特分析仪器有限公司生产的高效液相色谱仪E-C2000色谱数据处理工作站，配有一台P230高压恒流泵(大连依利特分析仪器有限公司)，

色谱柱为：TSK柱尺寸：7.8mm×300mm，

TSK柱填料：GELG2000SWXL产地～日本TOSOH CORPORATION

色谱条件：

流速：0.50ml/min，压力：3MPpa，检测波长：uv～210nm

流动相：氯化钠与PH＝6.4的磷酸盐缓冲液柱温：35℃

取收集到的馏分用微量进样器进样20ul，得到如附图4的高浓度蝎毒多肽高效液相色谱图，为多组分多肽分布图。

实施例2

所用仪器、色谱条件、梯度程序设置同实施例1，

称样100mg蝎毒粉，溶于1ml流动相B液中，溶解后进样，运行B泵冲柱约20分钟，待仪器稳定后，加进制备好的蝎毒粉溶液，按启动键开始梯度洗脱，馏分的收集：进样后，依照设置梯度程序运行A、B两泵，流速5ml/min，通过色谱工作站观察约5分钟起峰时开始收集，直到峰落下处停止收集，见附图1蝎毒多肽液相色谱图，得到液体为无色或淡黄色澄明液体，收集到的馏分量约40～50ml，用紫外分光光度计检测A₂₈₀＝0.600～0.700左右；收集到的馏分通过电泳确定其分子量在5000～10000道尔顿之间见附图2蝎毒多肽的电泳图及图3蝎毒多肽电泳图图解；

检测同实施例1，得到附图4的高浓度蝎毒多肽高效液相色谱图，为多组分多肽分布图。

实施例3

所用仪器、色谱条件、梯度程序设置同实施例1，

称样600mg蝎毒粉，溶于6ml流动相B液中，溶解后进样，运行B泵冲柱约20分钟，待仪器稳定后，加进制备好的蝎毒粉溶液，按启动键开始梯度洗脱，馏分的收集：进样后，依照设置梯度程序运行A、B两泵，流速50ml/min，通过色谱工作站观察约1分钟起峰时开始收集直到峰落下处停止收集，见附图1蝎毒多肽液相色谱图，得到液体为无色或淡黄色澄明液体，收集到的馏分量约160～250ml，用紫外分光光度计检测A₂₈₀＝1.050～1.550左右；收集到的馏分通过电泳确定其分子量在5000～10000道尔顿之间见附图2蝎毒多肽的电泳图及图3蝎毒多肽电泳图图解。

检验同实施例1，得到如附图4的高浓度蝎毒多肽高效液相色谱图，为多组分多肽分布图。

实施例4

使用仪器同实施例1，色谱条件为：

流速：5～50ml/min；压力：3Mpa；检测波长：uv～210nm；

单泵运行，流动相为由磷酸氢二钠与磷酸二氢钠加去离子水定溶至PH值等于6.4制得的磷酸盐缓冲液；

进样量400mg，流量15ml/min，收集馏分时间、收集量、馏分收集时间同实施例1。

Claims

1、一种蝎毒多肽，其特征在于蝎毒多肽由以下方法制备而成：

使用仪器为高效液相色谱仪，色谱数据处理工作站，配有两台高压恒流泵A泵和B泵，色谱柱使用制备柱或半制备柱，按以下步骤制备：

(1)启动高效液相色谱仪，色谱数据处理工作站，根据进样量选择制备柱、设置色谱条件，选择流动相；

(2)设置洗脱程序，设置为梯度洗脱或等度洗脱；

(3)称样：称取制备用蝎毒粉，溶于适量的流动相中，使其充分溶解，用滤纸过滤、准备进样；

(4)运行高压恒流泵冲柱，待仪器稳定后，加进制备好的蝎毒粉溶液，按启动键开始洗脱；

(5)馏分的收集：进样后运行高压恒流泵，通过色谱工作站观察，起峰时开始收集直到峰落下处停止收集；

所收集到的馏分即是制备成品。

2、如权利要求1所述的蝎毒多肽，其特征在于在其制备方法中，色谱条件设置为：

流速：5～150ml/分钟；压力：3～5Mpa；检测波长：210、260或280nm。

3、如权利要求1所述的蝎毒多肽，其特征在于在其制备方法中，流动相是磷酸盐缓冲液加氯化钠溶液与磷酸盐缓冲液，其PH＝6.4；

4、如权利要求3所述的蝎毒多肽，其特征在于在其制备方法中，设置梯度程序：A泵运行流动相磷酸盐缓冲液加氯化钠溶液，B泵运行流动相磷酸盐缓冲液，

梯度程序：A泵1～15分钟0％ 15～55分钟60％ 55～75分钟0％

B泵0～15分钟100％ 15～55分钟40％ 55～75分钟100％。

5、如权利要求1所述的蝎毒多肽，其特征在于在其制备方法中，进样后，流速设为5～150ml/分钟。

6、如权利要求1所述的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于制备步骤如下：

(2)设置洗脱程序，设置为梯度洗脱或等度洗脱；

(5)馏分的收集：进样后运行高压恒流泵流动相，通过色谱工作站观察，起峰时开始收集直到峰落下处停止收集；

所收集到的馏分即是制备成品。

7、如权利要求6所述的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于在其制备步骤中，色谱条件设置为：流速：5～150ml/分钟；压力：3～5Mpa；检测波长：10、260或280nm。

8、如权利要求6所述的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于在其制备步骤中，流动相是磷酸盐缓冲液加氯化钠溶液与磷酸盐缓冲液，其PH＝6.4；

9、如权利要求8所述的蝎毒多肽制备方法，其特征在于在其其制备步骤中，设置梯度程序：A泵运行流动相磷酸盐缓冲液加氯化钠溶液，B泵运行流动相磷酸盐缓冲液，

梯度程序：A泵1～15分钟0％ 15～55分钟60％ 55～75分钟0％

B泵0～15分钟100％ 15～55分钟40％ 55～75分钟100％。

10、如权利要求6所述的蝎毒多肽的制备方法，其特征在于在其制备步骤中，进样后，流速设为5～150ml/分钟。