CN104193813B - 一种蝎毒多肽的分离纯化方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蝎毒多肽的分离纯化方法及其用途，该方法通过对蝎毒溶液的预处理、蝎毒溶液分离纯化前的蛋白浓度、缓冲液和洗脱流速合理选择，获得条件简单可行，容易控制，易于工业化生产的一种蝎毒多肽的分离纯化方法。通过该方法获得了一种新的具镇痛作用的蝎毒多肽。

Description

一种蝎毒多肽的分离纯化方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及利用一种蝎毒多肽的分离纯化方法及其用途。

背景技术

蝎亦名全虫，为钳蝎科动物东亚钳蝎或称马氏钳蝎(Buthus martensii Karsch)的干燥全体，属名贵动物类药材。气微腥，味咸。全蝎性平，味辛，有小毒，具驱风镇惊之功效。主要用于坐骨神经痛、偏头痛、荨麻疹、百日咳、腮腺炎、小儿厌食症、化脓性中耳炎、急、慢性泪囊炎、淋巴结核、烧伤、肛门周围炎、乳腺疾病、骨关节结核等病症治疗，取得良好疗效。

现代研究表明蝎毒多肽具有明显的镇痛作用：蝎毒对内脏痛、皮肤灼痛有明显镇痛作用，效果随剂量增加而加强。临床应用表明，蝎毒注射液用于治疗神经痛、手术后疼痛、对于手术麻醉期过后出现中度疼痛患者和晚期肿瘤疼痛，疗效显著。身体依赖性研究结果表明，蝎毒对小鼠、大鼠以及猴均不具备阿片类的身体依赖特性。由于其镇痛作用的高效性，且不存在身体依赖性，因此，人们开始对蝎毒有效成分进行了大量的分析研究工作。

现今，已经从东亚钳蝎中分离并鉴定了20多种蝎毒毒素。王起振等采用离子交换层析和凝胶过滤法从粗制蝎毒中分离出一种镇痛活性肽，具有较强的镇痛作用[王起振，张景海，唐龙等.东亚钳蝎(Buthus marthensii Karscch)毒镇痛活性肽的分离纯化及其镇痛作用研究[J].沈阳药学院学报，1994，11(4)：273-276]。刘崇铭等从东亚钳蝎毒中经过Cm-Sephaden G-50柱层析提取,再用Sephaden G-50凝胶过滤纯化得到一种镇痛活性肽-蝎毒素-Ⅲ(TT-Ⅲ)，小鼠扭体实验表明TT-Ⅲ的镇痛作用较粗制蝎毒强2倍(刘崇铭，裴国强.东亚钳蝎毒的镇痛作用研究[J].沈阳药学院学报，1989，6(3)：176-178)。韩雪飞《蝎毒素Ⅳ分离纯化研究》等改进传统两步层析法，成功地从粗制蝎毒中分离纯化了镇痛活性肽Ⅳ(SVC-Ⅳ)，SVC-Ⅳ有很强的中枢镇痛作用，作用强于吗啡4倍以上，临床验证对多种急、慢性疼痛均有较强抑制作用，且具有较好的修复受损神经的功效(韩雪飞，徐霞，申庆红，等.蝎毒素Ⅳ分离纯化研究[J].河南医科大学报，1996，31(3)：1-4)。

然而，上述研究的多肽分子量多在6～8KD左右，对其他分子量段的成份的研究则未见报道。另外，由于生物制品需要的条件甚是苛刻，上述研究多数是在实验室完成的提取工艺且该提取工艺无法在工厂再现，故至今没有相关产品生产上市。

发明内容

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种易于控制的蝎毒多肽的分离纯化方法，获得一种新的具镇痛效果的蝎毒多肽。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

一种蝎毒多肽的分离纯化方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

A，样品的预处理

将蝎毒粉溶于适当的缓冲液中，接着在温度4℃条件下离心，得到的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到一种滤液；

B，分离纯化

将步骤A得到的滤液配制成蛋白浓度为0.5～100mg/ml的溶液，然后将该溶液加入SUPERDEX 75 10/300 GL预装柱的层析柱中，用洗脱液以流速0.1～50ml/min进行洗脱，并在UV280nm条件下检测，按时间顺序依次得到组分1、组分2、组分3、组分4和组分5的5个组分。

根据本发明的一个优选实施方式，所述的洗脱液选自Tris-Hcl缓冲液、PBS缓冲液或碳酸盐缓冲液。

根据所述分离纯化方法制备得到的5个组分，其中，组分1、组分2、组分3和组分4均为多种多肽成分的组合；组分5为单一成分的多肽；并且组分5的镇痛作用明显由于其它四个组分。

所述的组分5经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为单一条带，且它是分子量为10～11KD的蝎毒多肽。本发明将组分5命名为XDT。

所述的组分5用于制备治疗中枢性疼痛以及外周性疼痛的镇痛药物的应用。

所述的药物为注射剂、口服制剂或外用制剂。

根据本发明的一个优选实施方式，所述的注射剂包括静脉注射剂、肌肉注射剂或皮下注射剂。

根据本发明的另一个优选实施方式，所述的口服制剂包括片剂、口服液、胶囊或颗粒。

根据本发明的另一个优选实施方式，所述的外用制剂包括贴剂、膜剂或乳剂。

下面将详细地说明本发明。

一种蝎毒多肽的分离纯化方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

A，样品的预处理

将蝎毒粉溶于适当的缓冲液中，接着在温度4℃条件下离心，得到的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到一种滤液；

本发明中适当的缓冲液是指能溶解蛋白质，并稳定蛋白质作用的缓冲液。如Tris-Hcl缓冲液、PBS缓冲液、碳酸盐缓冲液等。

将蝎毒粉溶于缓冲液中后，接着立即离心并进行分离纯化的原因是蝎毒容易分解。

B，分离纯化

将步骤A得到的滤液配制成蛋白浓度为0.5～100mg/ml的溶液，然后将该溶液加入SUPERDEX 75 10/300 GL预装柱的层析柱中，用洗脱液以流速0.1～50ml/min进行洗脱，并在UV280nm条件下检测，按时间顺序依次得到组分1、组分2、组分3、组分4和组分5的5个组分。

将蝎毒前处理后，在AKTA Purifier UPC 100蛋白纯化系统中进行分离纯化并通过其配套的的UNICORN 5.20软件进行分析计算。

SUPERDEX 75 10/300 GL预装柱是目前分辨率和选择性最高的凝胶过滤层析柱。凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。小分子物质能进入其内部，留下时路程较长，而大分子物质却被排出在外部，下来的路程短，因此大分子先流出来，小分子后流出来。

因为蛋白质中的氨基酸有共轭的双键，会吸收280nm的紫外线(即UV280nm)，所以蛋白质在280nm的紫外线处，有特殊的吸收峰。因此，本发明中是在UV280nm下检测。

根据本发明的一个优选实施方式，在步骤B中将所述的滤液配制为蛋白浓度为5-20mg/ml的溶液。

根据本发明的一个优选实施方式，在步骤B中将所述的滤液配制为蛋白浓度为10mg/ml的溶液。

本发明实践证明，本发明步骤B中的蛋白浓度优选为10mg/ml。因为随着蛋白浓度的减小，蝎毒中蛋白多肽的分离度增大；但是，蛋白浓度过低，分离获得的各组分面积偏低，蛋白量少。综合考虑，样品蛋白浓度为10mg/ml更为合适。

通常，盐溶液用作洗脱液。任何合适的盐溶液都可以用于洗脱液。根据本发明的另一个优选实施方式，所述的洗脱液选自Tris-Hcl缓冲液、PBS缓冲液或碳酸盐缓冲液。

根据本发明的另一个优选实施方式方式，在步骤B中所述的洗脱液选自浓度为0.02M、PH值为6.8的Tris-Hcl缓冲液或浓度为0.05M、PH值为7.2的PBS缓冲液。

根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤B中将所述的洗脱液是浓度为0.05M、PH值为7.2的PBS缓冲液。

本发明实践证明，在步骤B中所述的洗脱液优选浓度为0.05M、PH值为7.2的PBS缓冲液。选择该洗脱液的原因是因为相较于浓度为0.02M、PH值为6.8的Tris-Hcl缓冲液，该洗脱液的分离效果更好、且更稳定。

根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤B中所述的洗脱液选择流速为1.0ml/min进行洗脱。

本发明实践证明，不同的流速分离出的基本相同，因此，本发明选择1.0ml/min的流速进行分离纯化。

根据所述分离纯化方法制备得到的5个组分，其中，组分1、组分2、组分3和组分4均为多种多肽成分的组合；组分5为单一成分的多肽；并且组分5的镇痛作用明显由于其它四个组分。

对本发明步骤B得到的5个组分进行小鼠扭体实验和热板法实验，通过设置阳性对照组和阴性对照组实验，得到组分5为具有最好镇痛作用的单一多肽成分。

小鼠扭体实验是将实验小鼠分别经尾静脉注射5种组分0.6mg/kg后，立即以醋酸与小鼠0.1mg：10g的体重比腹腔注射醋酸，观察小鼠15min内的扭体次数。

热板法实验是首先用54.5-55.5℃的热板筛选出实验小鼠；然后将实验小鼠分别经尾静脉注射5种组分0.6mg/kg，测试给药前及给药后5min、60min各动物的痛阈值。

所述的组分5经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为单一条带，且它是分子量为10-11KD的蝎毒多肽。

聚丙烯酰胺凝胶电泳即PAGE，用于分离蛋白质和寡核苷酸。其为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白质或多肽与SDS结合，经热变性和二硫键的还原，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物，其泳动速度主要由分子量决定。

现有技术研究得到的具有镇痛作用的蝎毒多肽分子量多为6～8KD，对其他分子量段的成分的研究则未见报道。而本发明获得的组分5与现有技术的蝎毒多肽分子量不同。

所述的组分5用于制备治疗中枢性疼痛以及外周性疼痛的镇痛药物的应用。

所述的药物为注射剂、口服制剂或外用制剂。

根据本发明的一个优选实施方式，所述的注射剂包括静脉注射剂、肌肉注射剂或皮下注射剂。

根据本发明的另一个优选实施方式，所述的口服制剂包括片剂、口服液、胶囊或颗粒。

根据本发明的另一个优选实施方式，所述的外用制剂包括贴剂、膜剂或乳剂。

[有益效果]

本发明与现有技术相比，具有以下的有益效果：

1、本发明提供了一种蝎毒多肽的分离纯化方法；该方法通过对蝎毒溶液的预处理、蝎毒溶液滤液的蛋白浓度、缓冲液和洗脱流速合理选择，获得条件简单可行，容易控制，易于工业化生产的一种蝎毒多肽的分离纯化方法。

2、本发明提供的分离纯化方法获得了一种新的具镇痛作用的蝎毒多肽，该蝎毒多肽是分子量10～11KD。

3、本发明的分离纯化方法获得的蝎毒多肽，只需添加适当辅料，即可制成治疗中枢性疼痛以及外周性疼痛的镇痛药物。

附图说明

图1是本发明实施例1样品预处理方法一的分离结果图；

图2是本发明实施例1样品预处理方法二的分离结果图；

图3是本发明实施例2洗脱液以流速0.5ml/min洗脱样品的分离结果图；

图4是本发明实施例2洗脱液以流速1.0ml/min洗脱样品的分离结果图；

图5是本发明实施例3以水为洗脱液洗脱样品的分离结果图；

图6是本发明实施例3以浓度为0.02M、PH值为6.8的Tris-HCl缓冲液为洗脱液洗脱样品的分离结果图；

图7是本发明实施例3以浓度为0.05M、PH值为7.2的PBS缓冲液为洗脱液洗脱样品的分离结果图；

图8是本发明实施例4将溶液配制为上样浓度为20mg/ml的分离结果图；

图9是本发明实施例4将溶液配制为上样浓度为10mg/ml的分离结果图；

图10是本发明实施例4将溶液配制为上样浓度为5mg/ml的分离结果图；

其中，图1至图10的分离结果图中，横坐标是指洗脱液的用量；纵坐标为UV280nm检测的蛋白吸收峰值。

具体实施方式

下面结合本发明的实施例对本发明作进一步的阐述和说明。

实施例1

样品预处理方法的确定实验：

样品前处理方法一：精密称取100mg蝎毒冻干粉，溶于5ml的缓冲液中，冷藏过夜，4℃离心(15000g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

样品前处理方法二：精密称取100mg蝎毒冻干粉，溶于5ml的缓冲液中，4℃离心(15000g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，备用。

将方法一和方法二的样品在AKTA Purifier UPC 100蛋白纯化系统中分离纯化，结果如图1和图2所示，从图2可见，蝎毒经缓冲液溶解后，在洗脱体积为10、15以及18ml时可得到3个峰面积较大的成分，以及在洗脱体积为23和28ml左右可得到两个峰面积相对较小的成分；从图1可见，蝎毒经缓冲液溶解后放置过夜进行分离纯化所得组分较多，与图2比较发现原洗脱体积为10、15ml时的峰面积变小，并在20～25ml之间增加了1～2个成分，以及在洗脱体积为23和28ml左右可得到两个峰面积相对较小的成分。

由此可知，蝎毒经缓冲液溶解后放置过夜进行分离纯化所得组分较多，说明蝎毒容易分解，所以蝎毒应在溶解后立即离心并进行分离纯化。

实施例2

样品分离纯化洗脱液流速的确定实验：

将样品按方法二进行前处理后，滤液配制成10mg/ml上样浓度，加入SUPERDEX 75预装柱的层析柱中，并用浓度为0.02M、PH值为6.8的Tris-HCl缓冲液分别以0.5ml/min和50.0ml/min进行洗脱，用UNICORN 5.20软件分析蛋白峰型。

从图3和图4可见，在0.5ml/min和50.0ml/min这两种流速下获得的蛋白峰型基本相同，分离出的组分也相同。因此，流速对蛋白质的分离没有什么影响。

实施例3

样品分离纯化洗脱液的确定实验：

按照方法二进行样品前处理后，滤液配制成10mg/ml上样浓度，加入SUPERDEX 75预装柱的层析柱中，并分别用水，浓度为0.02M、PH值为6.8的Tris-HCl缓冲液和浓度为0.05M、PH值为7.2的PBS缓冲液按流速1ml/min的洗脱流速，用UNICORN 5.20软件计算蛋白各峰面积。该实验的水作为空白对照实验，空白对照，即阴性对照，能明白地对比和衬托出实验的变化和结果，增强说服力。

结果如图5、图6和图7所示，以水为洗脱液，在10ml、18ml左右有2个成分，但峰面积均较小。洗脱体积为20ml之后还有多个未分开的成分；以浓度为0.02M、PH值为6.8的Tris-HCl缓冲液为洗脱液，在10ml、15ml以及18ml时可得到3个峰面积较大的成分，在23和28ml左右有2个峰面积较小的成分。与以水为洗脱液的实验结果比较发现，以浓度为0.02M、PH值为6.8的Tris-HCl缓冲液为洗脱液，洗脱体积为10ml时的峰面积变大，并在15-20ml之间多了1个成分，20-30ml之间的成分减少，但峰面积均较图5中相应位置的大，提示以水为洗脱液蝎毒不能达到分离效果；从图7可见，以浓度为0.05M、PH值为7.2的PBS缓冲液为洗脱液，在10-15ml之间、15-20ml之间各有两个峰面积较大的成分，并且较图6中相对应的峰面积高，以及在20ml以后只有一个成分，相对于图5和图6中显示的，小分子成分减少，并且分离度亦较高。

由此可见，用凝胶过滤层析分离蝎毒，应当以浓度为0.05M、PH值为7.2的PBS缓冲液为洗脱液，其分离效果更好，并且更稳定。

实施例4

分离纯化前滤液蛋白浓度的确定实验：

按照实施例1的方法二进行样品预处理后，滤液分别配制成20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml的蛋白浓度；加入SUPERDEX 75预装柱的层析柱中，并以浓度为0.05M、PH值为7.2的PBS缓冲液为洗脱液，在流速为1ml/min的条件下进行洗脱，用UNICORN 5.20软件计算蛋白各峰的面积和分离度，结果如下：

表1 以不同的样品蛋白浓度分离后各组分的分离度

表2 以不同的样品蛋白浓度分离后各组分的峰面积

如图8、图9和图10所示，各浓度的样品经分离后所得成分均为5个成分；从表1来看，样品蛋白浓度为20mg/ml时，各峰分离度均较低，并且随着浓度的减小，分离度增大；而表2中显示，样品蛋白浓度越高，各组分峰面积越大；样品浓度为5mg/ml时，分离度虽较其他浓度的分离度高，但各组分峰面积偏低。综合考虑，样品蛋白浓度配制为10mg/ml更为合适。

因此，由实施例1至实施例4得出，凝胶过滤层析分离纯化蝎毒的最佳条件：蝎毒样品溶于缓冲液后，接着立即进行低温离心、过滤除菌，再进行分离纯化工作；分离纯化的步骤为：将样品配制成上样浓度为10mg/ml的溶液，然后，将该溶液加入Superdex 75 10/300GL预装柱的层析柱中，接着以浓度为0.05M、pH为7.2的PBS缓冲液为洗脱液进行洗脱。

根据实施例1至实施例4的制备方法得到的最佳制备条件，进行了下述的实施例：

实施例5

市场购买蝎毒样品溶于缓冲液后应该低温离心，4℃离心(15000g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液配制为蛋白浓度10mg/ml，洗脱液是浓度为0.05 M、pH为7.2的PBS缓冲液，流速为1.0ml/min。在UV280nm下检测。获得XDT及另外四个组分。

实施例6

市场购买蝎毒样品溶于缓冲液后应该低温离心，4℃离心(15000g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液配制为蛋白浓度0.5mg/ml，洗脱液是浓度为0.05 M、pH为7.2的PBS缓冲液，流速为50.0ml/min。在UV280nm下检测。获得XDT。

实施例7

市场购买蝎毒样品溶于缓冲液后应该低温离心，4℃离心(15000g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液配制为蛋白浓度100.0mg/ml，洗脱液是浓度为0.05 M、pH为7.2的PBS缓冲液，流速为10.0ml/min。在UV280nm下检测。获得XDT。

实施例8

市场购买蝎毒样品溶于缓冲液后应该低温离心，4℃离心(15000g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液配制为蛋白浓度10.0mg/ml，洗脱液是浓度为0.05 M、pH为7.2的PBS缓冲液，流速为1.0ml/min。在UV280nm下检测。获得XDT。

实施例9

市场购买蝎毒样品溶于缓冲液后应该低温离心，4℃离心(15000g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液配制为蛋白浓度10.0mg/ml，洗脱液是浓度为0.05 M、pH为7.2的PBS缓冲液，流速为1.0ml/min。在UV280nm下检测。获得XDT。常规冷冻干燥制成冻干粉针。

实施例10

市场购买蝎毒样品溶于缓冲液后应该低温离心，4℃离心(15000g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液配制为蛋白浓度10.0mg/ml，洗脱液是浓度为0.05 M、pH为7.2的PBS缓冲液，流速为1.0ml/min。在UV280nm下检测。获得XDT。添加辅料，制成片剂。所述的辅料为填料、吸附剂、黏结剂、润滑剂、分散剂、润湿剂、崩解剂、香料、色料等。

实施例11

市场购买蝎毒样品溶于缓冲液后应该低温离心，4℃离心(15000g，20min)，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液配制为蛋白浓度10.0mg/ml，洗脱液是浓度为0.05 M、pH为7.2的PBS缓冲液，流速为1.0ml/min。在UV280nm下检测。获得XDT。常规添加辅料，制成膜剂等外用制剂。所述的辅料为防腐剂、分散剂、助悬剂、增稠剂、助溶剂、润湿剂、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、透皮促进剂等。

为阐明上述实施例所得样品的分离效果及药理作用，本发明在动物体内进行了相关研究，具体实施例如下：

实施例12

小鼠扭体实验：

取重约20g昆明小鼠79只，雌雄各半。空白对照组经尾静脉给予生理盐水，蝎毒组分1、蝎毒组分2、蝎毒组分3、蝎毒组分4、蝎毒组分5五组经尾静脉注射相应的蝎毒组分0.6mg/kg，阳性组经灌胃给予阿司匹林药剂量600mg/kg。阳性对照组和五个给药组经尾静脉给药后立即腹腔注射0.8％醋酸(0.1ml/10g)，观察小鼠15min内的扭体次数；阳性组经灌胃给药30min后，腹腔注射0.8％醋酸(0.1ml/10g)，观察小鼠15min内的扭体次数。并计算药物对小鼠扭体反应的抑制。实验重复10次，结果见表3。

表3 各组分对对醋酸致小鼠扭体反应的影响

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

阳对照性实验是一种干预方法，这种干预方法的有效性以前已经是明确的，只为了说明新疗法的有效性。与阴性对照相比，阳性对照是与要进行的实验内容很相似但不相同，而且其由经验可以预见其结果，即应该得出正面的结果。通过与阳性实验的比较，可以确定实验组的效果。

结果由表3可见，从蝎毒中分离出的组分1、组分2、组分3、组分4、组分5各组分均可显著减少醋酸致小鼠的扭体数量，其中蝎毒组分1、蝎毒组分3、蝎毒组分4、蝎毒组分5与对照组比较差异具有统计学意义，表明上述蝎毒成分对醋酸引起的外周性疼痛均有一定的抑制作用，其中组分5的镇痛作用最强。

实施例13

热板法实验

实验前先用55±0.5℃的热板以小鼠舔后足时间为痛阈值筛选出平均正常痛阈值在5～30s的70只雌性小鼠，将小鼠随机分为七个组，每组10只，分别尾静脉注射蝎毒组分10.6mg/kg、蝎毒组分20.6mg/kg、蝎毒组分30.6mg/kg、蝎毒组分40.6mg/kg、蝎毒组分50.6mg/kg及等体积生理盐水(空白对照组)，阳性对照组则腹腔注射吗啡3mg/kg。分别测给药前及给药后5min、60min各动物的痛阈值。并计算给药后的可能最大镇痛百分率(PAMP)。PAMP＝(给药后痛阈-给药前痛阈)/(60s-给药前痛阈)×100％。比较各组小鼠的PAMP的差别。实验重复10次，结果见表4。

表4 各组分对热板法小鼠痛阈的影响

表中标注的“*”，表示与空白对照组有显著性差异，数量越多，表示与空白对照组差异越大。

结果由表4可见，组分2、组分4和组分5组分与对照组比较均有显著性差异，表明对中枢性疼痛有一定的镇痛效果，并且组分5的镇痛作用强持续时间长。

利用不同实施例得到的组分5即XDT，进行小鼠扭体实验，具体见实施例14。

实施例14

取体重为为18～22g的小鼠50只，雌雄各半，随机分为9组按表5所示给动物给与上述实施例所得样品，在给药后立即腹腔注射0.7％冰乙酸0.1ml/10g，观察腹腔给药第5～20min各小鼠的扭体次数，结果用t检验。结果见表5。

表5 蝎毒不同组分对热板法小鼠痛阈的影响

组别	剂量(mg/kg)	给药途径	扭体次数
				对照组		iv	31.2±4.6
实施例5	0.3	iv	21.5±5.7**
				实施例6	0..3	iv	22.4±4.5**
实施例7	0.3	iv	23.5±6.1**
				实施例8	0.3	iv	22.3±6.2***
实施例9	0.3	ip	24.7±6.8**

实施例10	0.3	ig	25.4±5.2***
				实施例11	0.3	皮肤粘贴	26.1±5.1**
吗啡	3	10	20.4±4.5**

T检验，亦称student t检验。其是用t分布理论推论差异发生的概率，从而比较两个平均数的差异是否显著。

结果由表5可见，不同实施例所得的XDT均可显著减少醋酸致小鼠的扭体次数，与对照组比较有统计学差异。

尽管这里参照本发明的解释性实施例对本发明进行了描述，上述实施例仅为本发明较佳的实施方式，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。

Claims (7)

1.一种蝎毒多肽的分离纯化方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

A，样品的预处理

将蝎毒粉溶于适当的缓冲液中，接着在温度4℃条件下离心，得到的上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得到一种滤液；

B，分离纯化

将步骤A得到的滤液配制成蛋白浓度为0.5～100mg/ml的溶液，然后将该溶液加入SUPERDEX 75 10/300GL预装柱的层析柱中，用洗脱液以流速0.1～50ml/min进行洗脱，并在UV280nm条件下检测，按时间顺序依次得到组分1、组分2、组分3、组分4和组分5的5个组分；

在步骤B中，所述的洗脱液是浓度为0.05M、PH值为7.2的PBS缓冲液；组分1、组分2、组分3和组分4均为多种多肽成分的组合；组分5为单一成分的多肽；并且组分5的镇痛作用优于其它四个组分；

在步骤A中，所述在温度4℃条件下离心是在转速为15000g下离心20min。

2.根据权利要求1所述的分离纯化方法制备得到的组分5，它经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳显示为单一条带，且它是分子量为10-11KD的蝎毒多肽。

3.根据权利要求2所述的组分5用于制备治疗中枢性疼痛以及外周性疼痛的镇痛药物的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的药物为注射剂、口服制剂或外用制剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的注射剂包括静脉注射剂、肌肉注射剂或皮下注射剂。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的口服制剂包括片剂、口服液、胶囊或颗粒。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的外用制剂包括贴剂、膜剂或乳剂。