CN102805754A - 一种小牛血清去蛋白提取物的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,提供了一种小牛血清去蛋白提取物的纯化方法。该方法包括:采幼牛静脉血,分离出血清,用乙醇去蛋白,减压去除乙醇,加入复合蛋白酶水解,水解之后离心分离留上清,上清液超滤;超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐,收集280nm处有特异吸收的洗脱部分;以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离,收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分;采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活;得到小牛血清去蛋白提取物。本发明除掉了很多非活性成份,降低产物的分子量范围和发生不良反应的几率,提高了产品的纯度、安全性和生物活性,具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法。
背景技术
小牛血清去蛋白提取物(protein-free calf blood extract)是1-6个月的幼牛血清经过除蛋白后得到的小分子生物活性物质,含有小分子多肽、氨基酸、酮酸等物质。其主要药理作用是增强细胞对氧和葡萄糖的摄取、利用,具有改善细胞代谢的生理作用,毒性很小,在临床上应用广泛。但是,小牛血清去蛋白提取物中含有的少量杂质,如微量蛋白甚至病毒等非活性成分还是会带来一些副作用,也使其应用范围缩小,因此,对小牛血清去蛋白提取物进一步提取纯化将提高其安全性,增强效果,拓展使用范围。
目前,常用小牛血清去蛋白提取物的提取方法主要包括酸解和酶解两种,其中酸解会严重破坏提取物的基本结构,使产品严重失活;酶解能保证生物活性,如中国发明专利(ZL 96120777.9)所公开的方法,该方法包括:采幼牛静脉血,分离出血清,用乙醇去蛋白,减压去除乙醇,加入复合蛋白酶水解,离心分离留上清,将上清液浓缩、除菌、冻干,即得到小牛血清去蛋白提取物。其中,用乙醇去蛋白时乙醇的用量为两倍于血清体积的96%乙醇;减压去除乙醇是利用真空旋转蒸发仪,37℃、1个大气压下减压除乙醇;复合蛋白酶水解的时间为24小时(水解一些核酸及蛋白质);水解之后的离心分离是在10000rpm、4℃下离心30分钟,留上清。但采用上述方法所提取到的产品纯度低、活性低,而且都没有进行病毒灭活,无法保证产品的生物安全性(如牛可能携带疯牛病、口蹄疫等多种病毒),带来临床应用的安全隐患。
发明内容
本发明的目地是提供一种小牛血清去蛋白提取物的进一步提纯方法。
本发明所提供的小牛血清区蛋白提取物的提纯方法,包括:采幼牛静脉血,分离出血清,用乙醇去蛋白,减压去除乙醇,加入复合蛋白酶水解,水解之后离心分离留上清,上清液超滤,其中,超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐,收集280nm处有特异吸收的洗脱部分;然后,以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离,收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分;然后,采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活;得到小牛血清去蛋白提取物。
在本发明中,葡聚糖G-15凝胶层析脱盐所用的洗脱液为Tris-Hcl缓冲液,pH为6.8-7.2,优选为7.0;以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离所用的洗脱液为Tris-Hcl缓冲液进行梯度洗脱,含NaCl的浓度为0.05mol/l,0.8mol/l,pH为8.0-8.5,优选为8.2,洗脱流速为3-5ml/min,层析柱的直径选择4cm-5cm,凝胶柱床高度与凝胶柱直径之比为20-50∶1。
在微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活时,是以0.02-0.024微米的微孔膜进行过滤,以强度为500-1500μw/cm2、波长为250-260nm的紫外线直接照射6-8秒。
为了能更好的进行提取物的分离纯化,减压去除乙醇以后还可以将除乙醇后的液体经过截留分子量为100000道尔顿的中空纤维柱粗滤。
在本发明中,用乙醇去蛋白时乙醇的用量可选用为两倍与血清体积的96%乙醇;减压去除乙醇是利用真空旋转蒸发仪,37℃、1个大气压下减压除乙醇;加入复合蛋白酶水解的时间为24小时;水解之后离心分离留上清是在10000rpm、4℃下离心30分钟;上清液超滤是以截留分子量为5000道尔顿的中空纤维柱超滤。
本发明纯化方法通过增加层析分离步骤,除掉了很多非活性成份,降低产物的分子量范围和发生不良反应的几率,并且使产品的生物活性刺激指数由原来的2.5以上提高到4.0左右,提高了产品的纯度和生物活性;通过增加病毒灭活步骤,能够有效杀灭小牛血清去蛋白提取物中的固有病毒,保证产品的安全性。本发明提取的产品可以做成水针、冻干分针、肠溶胶囊、肠溶片剂、凝胶剂等多种临床应用剂型,具有广阔的应用前景。
具体实施方式
实施例1、提取小牛血清去蛋白提取物
1、提取纯化方法
(1)采幼牛静脉血,分离出血清:
在无菌条件下采6个月以内小牛静脉血,放于4℃冰箱中过夜,使其自然分离出一部分血清,剩余部分在无菌条件下,4000rpm,4℃离心15分钟,分离出血清备用。
(2)乙醇除蛋白:
按照乙醇和血清体积比为2∶1的量向血清中加入96%乙醇,不断搅拌,静置60分钟,使蛋白质变性沉淀,离心(4000转/分,10分钟)后留上清弃沉淀。
(3)除乙醇:
利用真空旋转蒸发仪,37℃,1个大气压减压除乙醇。
(4)粗滤:
用截留分子量100000D的中空纤维柱粗滤,收集滤液。
(5)酶解:
在滤液中加入复合蛋白酶,每10升血清加入复合蛋白酶9.5mg,其中木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的比列为800∶1。
(6)离心:
在4℃、10000rpm条件下离心30分钟,弃沉淀留上清。
(7)超滤:
用截留分子量5000D的中空纤维柱超滤,收集滤液。
(8)纯化:
用交联葡聚糖G-15凝胶层析脱盐(层析液为pH7.0的Tris-Hcl缓冲液),收集280nm波长紫外线有特异吸收的部分,调pH为8.2;然后选用DEAE-Sephadex-50凝胶层析(胶床高度和直径的比为20∶1,柱直径选用4.5cm),洗脱液为Tris-Hcl缓冲液,含NaCl的浓度为0.05mol/l,0.8mol/l,pH为8.2,流速为3-5ml/min,用280nm波长紫外线监控,弃去第一洗脱部分,收集第二洗脱部分,然后减压浓缩到相对密度为1.07。
(9)病毒灭活:
采用微孔滤膜滤过+短波紫外线照射进行病毒灭活:采用的微孔滤膜为Millipore公司的Viresolve70系列(膜孔径为0.02-0.024微米);短波紫外线照射法具体是指用波长为254nm的短波紫外线,强度为1000μw/cm2,直接照射时间为7秒;得到小牛血清去蛋白提取物产品。
2、产品检测
1)液相检测
将所得提取物样品,按照高效液相色谱法(《中国药典》二部附录V D),用十八院基键合胶为填充剂,以0.68%磷酸二氢梆溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(820∶180)为流动相,流速为每分钟0.75ml.,检验波长为293nm。本方法提取的产品能够得到稳定的指纹图谱,色谱图呈两主峰且两主峰面积之和应为总面积的75%以上,理论板数以第一峰计不低于4000。
作为对比,采用现有方法提取得到的产品,色谱图不稳定,图谱难以突现出主峰,且定义有效成份的峰面积占总面积的比例不超过50%;说明本发明方法能提高产品纯度。
2)产品的生物活性刺激指数测定SX
《照国家药品标准-化学药品地方标准上升国家标准》第十六册16-83呼吸活性测定法检测呼吸活性,计算刺激指数。
测得本发明所提取得到产品的生物活性刺激指数为4.0;
作为对比,采用现有方法提取得到的产品,其生物活性刺激指数为2.7-3.5;
这表明,本发明方法有效的提高了产品生物活性。
3)病毒灭活有效性测定
按照本发明提取方法,收集到经过5000D中空纤维柱超滤得到的超滤液后,向其中加入脑心肌炎病毒(EMCV)和牛腹泻病毒(BVDV)为指示病毒,经过微孔膜滤过后,用波长为254nm的短波紫外线照射,强度为1000μw/cm2,直接照射时间为7秒;通过病毒对照培养,结果显示,采用上述灭活方法可以使脑心肌炎病毒滴度下降≥5.00LgTCID50/0.1ml;可以使牛腹泻病毒滴度下降≥4.00LgTCID50/0.1ml。
结论:所采用的病毒灭活方法可以有效灭活非脂包膜病毒和脂包膜病毒,能保证产品的安全性。
Claims (8)
1.一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法,包括:采幼牛静脉血,分离出血清,用乙醇去蛋白,减压去除乙醇,加入复合蛋白酶水解,水解之后离心分离留上清,上清液超滤,其特征在于:超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐,收集280nm处有特异吸收的洗脱部分;然后,以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离,收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分;然后,采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活;得到小牛血清去蛋白提取物。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述葡聚糖G-15凝胶层析脱盐所用的洗脱液为pH为6.8-7.2的Tris-Hcl缓冲液;以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离所用的洗脱液为pH为8.0-8.5的Tris-Hcl缓冲液,进行梯度洗脱,含aCl的浓度为0.05mol/l,0.8mol/l,洗脱流速为3-5ml/min,层析柱直径为4-5cm,凝胶柱床高度与凝胶柱直径之比为20-50∶1。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述葡聚糖G-15凝胶层析脱盐所用的洗脱液pH为7.0;以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离所用的洗脱液pH为8.2.
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:所述层析柱直径为4cm,凝胶柱床高度与凝胶柱直径之比为35∶1。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活是以0.02-0.024微米的微孔膜进行过滤,以强度为500-1500μw/cm2、波长为250-260nm的紫外线直接照射6-8秒。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述紫外线直接照射时间为7秒。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:减压去除乙醇之后经过截留分子量为100000道尔顿的中空纤维柱粗滤。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法,其特征在于:所述用乙醇去蛋白时乙醇的用量为两倍于血清体积的96%乙醇;减压去除乙醇是利用真空旋转蒸发仪,37℃、1个大气压下减压除乙醇;加入复合蛋白酶水解的时间为24小时;水解之后离心分离留上清是在10000rpm、4℃下离心30分钟;上清液超滤是以截留分子量为5000道尔顿的中空纤维柱超滤。
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