CN100374123C - 一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法 - Google Patents

一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法，包括：采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，水解之后离心分离留上清，上清液超滤，其中，超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐，收集280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活；得到小牛血清去蛋白提取物。本发明纯化方法通过增加层析分离步骤，提高了产品的纯度和和生物活性；通过增加病毒灭活步骤，保证产品的安全性。本发明提取的产品可以做成水针、冻干分针、肠溶胶囊、肠溶片剂、凝胶剂等多种临床应用剂型，具有广阔的应用前景。

Description

一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法
技术领域
本发明涉及一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法。
背景技术
小牛血清去蛋白提取物(protein-free calf blood extract)是1-6个月的幼牛血清经过除蛋白后得到的小分子生物活性物质，含有小分子多肽、氨基酸、酮酸等物质。其主要药理作用是增强细胞对氧和葡萄糖的摄取、利用，具有改善细胞代谢的生理作用，在临床上应用广泛。
目前，常用小牛血清去蛋白提取物的提取方法主要包括酸解和酶解两种，其中酸解会严重破坏提取物的基本结构，使产品严重失活；酶解能保证生物活性，如中国发明专利(ZL 96120777.9)所公开的方法，该方法包括：采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，离心分离留上清，将上清液浓缩、除菌、冻干，即得到小牛血清去蛋白提取物。其中，用乙醇去蛋白时乙醇的用量为两倍于血清体积的96％乙醇；减压去除乙醇是利用真空旋转蒸发仪，37℃、1个大气压下减压除乙醇；复合蛋白酶水解的时间为24小时(水解一些核酸及蛋白质)；水解之后的离心分离是在10000rpm、4℃下离心30分钟，留上清。但采用上述方法所提取得到的产品纯度低、活性低，而且都没有进行病毒灭活，无法保证产品的生物安全性(如牛可能携带疯牛病、口蹄疫等多种病毒)，带来临床应用的安全隐患。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法。
本发明所提供的提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法，包括：采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，水解之后离心分离留上清，上清液超滤，其中，超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐，收集280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活；得到小牛血清去蛋白提取物。
在本发明中，葡聚糖G-15凝胶层析脱盐所用的洗脱液为Tris-Hcl缓冲液，pH为6.8-7.2，优选为7.0；以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离所用的洗脱液为Tris-Hcl缓冲液进行梯度洗脱，含NaCl的浓度为0.05mol/l，0.8mol/l，pH为8.0-8.5，优选为8.2，洗脱流速为3-5ml/min，层析柱的直径选择4cm-5cm，凝胶柱床高度与凝胶柱直径之比为20-50∶1。
在微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活时，是以0.02-0.024微米的微孔膜进行过滤，以强度为500-1500μw/cm2、波长为250-260nm的紫外线直接照射6-8秒。
为了能更好的进行提取物的分离纯化，减压去除乙醇之后还可以将除乙醇后的液体经过截留分子量为100000道尔顿的中空纤维柱粗滤。
在本发明中，用乙醇去蛋白时乙醇的用量可选用为两倍于血清体积的96％乙醇；减压去除乙醇是利用真空旋转蒸发仪，37℃、1个大气压下减压除乙醇；加入复合蛋白酶水解的时间为24小时；水解之后离心分离留上清是在10000rpm、4℃下离心30分钟；上清液超滤是以截留分子量为5000道尔顿的中空纤维柱超滤。
本发明纯化方法通过增加层析分离步骤，除掉了很多非活性成分，降低产物的分子量范围和发生不良反应的几率，并且使产品的生物活性刺激指数由原来的2.5以上提高到3.0以上，提高了产品的纯度和和生物活性；通过增加病毒灭活步骤，能够有效杀灭小牛血清去蛋白提取物中的固有病毒，保证产品的安全性。本发明提取的产品可以做成水针、冻干分针、肠溶胶囊、肠溶片剂、凝胶剂等多种临床应用剂型，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为小牛血清去蛋白提取物的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1、提取小牛血清去蛋白提取物
1、提取纯化方法
(1)采幼牛静脉血，分离出血清：
在无菌条件下采6个月以内小牛静脉血，放于4℃冰箱中过夜，使其自然分离出一部分血清，剩余部分在无菌条件下，4000rpm，4℃离心15分钟，分离出血清备用。
(2)乙醇除蛋白：
按照乙醇和血清体积比为2∶1的量向血清中加入96％乙醇，不断搅拌，静置60分钟，使蛋白质变性沉淀，离心(4000转/分，10分钟)后留上清弃沉淀。
(3)除乙醇：
利用真空旋转蒸发仪，37℃，1个大气压减压除乙醇。
(4)粗滤：
用截留分子量100000D的中空纤维柱粗滤，收集滤液。
(5)酶解：
在滤液中加入复合蛋白酶，每10升血清加入复合蛋白酶9-10mg，其中木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的比例为800∶1。
(6)离心：
在4℃、10000rpm条件下离心30分钟，弃沉淀留上清。
(7)超滤：
用截留分子量5000D的中空纤维柱超滤，收集滤液。
(8)纯化：
用交联葡聚糖G-15凝胶层析脱盐(层析液为pH7.0的Tris-Hcl缓冲液)，收集280nm波长紫外线有特异吸收的部分，调pH为8.2；然后选用DEAE-Sephadex-50凝胶层析(胶床高度和直径的比为20∶1，柱直径选用4.5cm)，洗脱液为Tris-Hcl缓冲液，含NaCl的浓度为0.05mol/l，0.8mol/l，pH为8.2，流速为3-5ml/min，用280nm波长紫外线监控，弃去第一洗脱部分，收集第二洗脱部分，然后减压浓缩到相对密度为1.05-1.08。
(9)病毒灭活：
采用微孔滤膜滤过+短波紫外线照射进行病毒灭活；采用的微孔滤膜为Millipore公司的Viresolve70系列(膜孔径为0.02-0.024微米)；短波紫外线照射法具体是指用波长为254nm的短波紫外线，强度为1000μw/cm2，直接照射时间为6-8秒；得到小牛血清去蛋白提取物产品。
2、产品检测
1)液相检测
将所得提取物样品，按照高效液相色谱法(《中国药典》二部附录V D)，用十八烷基键合胶为填充剂，以0.68％磷酸二氢钾溶液(用磷酸调节pH至3.0)-甲醇(820∶180)为流动相，流速为每分钟0.75ml，检验波长为293nm。本方法提取的产品能够得到稳定的指纹图谱，色谱图呈两主峰且两主峰面积之和应为总面积的75％以上，理论板数以第一峰计不低于4000。如图1所示，第一峰理论板数为6015，两峰面积之合为84.31％。
作为对比，采用现有方法提取得到的产品，色谱图不稳定，图谱难以突现出主峰，且定义有效成分的峰面积占总面积的比例不超过50％；说明本发明方法能提高产品纯度。
2)产品的生物活性刺激指数测定SX
《照国家药品标准-化学药品地方标准上升国家标准》第十六册16-83呼吸活性测定法检测呼吸活性，计算刺激指数。
测得本发明所提取得到产品的生物活性刺激指数为3.8；
作为对比，采用现有方法提取得到的产品，其生物活性刺激指数为2.7；
表明，本发明方法有效的提高了产品生物活性。
3)病毒灭活有效性测定
按照本发明提取方法，收集到经过5000D中空纤维柱超滤得到的超滤液后，向其中加入脑心肌炎病毒(EMCV)和牛腹泻病毒(BVDV)为指示病毒，经过微孔膜滤过后，用波长为254nm的短波紫外线照射，强度为1000μw/cm2，直接照射时间为6-8秒；通过病毒对照培养，结果显示，采用上述灭活方法可以使脑心肌炎病毒滴度下降≥5.00LgTCID50/0.1ml；可以使牛腹泻病毒滴度下降≥4.00LgTCID50/0.1ml。
结论：所采用的病毒灭活方法可以有效灭活非脂包膜病毒和脂包膜病毒，能保证产品的安全性。

Claims (6)

1.一种提取纯化小牛血清去蛋白提取物的方法，包括：采幼牛静脉血，分离出血清，用乙醇去蛋白，减压去除乙醇，加入复合蛋白酶水解，水解之后离心分离留上清，上清液超滤，其特征在于：超滤液先以葡聚糖G-15凝胶层析脱盐，收集280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，收集第二个280nm处有特异吸收的洗脱部分；然后，采用微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活；得到小牛血清去蛋白提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述葡聚糖G-15凝胶层析脱盐所用的洗脱液为pH 6.8-7.2的Tris-HCl缓冲液；以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离所用的洗脱液为pH 8.0-8.5的Tris-HCl缓冲液，进行梯度洗脱，含NaCl的浓度为0.05mol/l，0.8mol/l，洗脱流速为3-5ml/min，层析柱直径为4-5cm，凝胶柱床高度与凝胶柱直径之比为20-50∶1。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述葡聚糖G-15凝胶层析脱盐所用的洗脱液pH为7.0；以DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离所用的洗脱液pH为8.2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：微孔膜过滤和紫外线照射进行病毒灭活是以0.02-0.024微米的微孔膜进行过滤，以强度为500-1500μw/cm2、波长为250-260nm的紫外线直接照射6-8秒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：减压去除乙醇之后经过截留分子量为100000道尔顿的中空纤维柱粗滤。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述用乙醇去蛋白时乙醇的用量为两倍于血清体积的96％乙醇；减压去除乙醇是利用真空旋转蒸发仪，37℃、1个大气压下减压除乙醇；加入复合蛋白酶水解的时间为24小时；水解之后离心分离留上清是在10000rpm、4℃下离心30分钟；上清液超滤是以截留分子量为5000道尔顿的中空纤维柱超滤。
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