CN107684562B - 一种去除小牛血清去蛋白提取物中糖肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种去除小牛血清去蛋白提取物中糖肽的方法。该方法包括下述步骤：1)降温：将小牛血清去蛋白提取液的温度降低到到‑7±0.5℃；2)向降温后的小牛血清去蛋白提取液中加入总质量0.2％‑0.25％的ZnS粉末，并搅拌均匀；3)速冻：将步骤2)得到的混合物放入‑40℃—‑45℃环境中速冻4‑4.5小时；4)退火：将步骤3)速冻后的混合物放入‑23℃的环境中静置6‑7小时；5)复融：将步骤4)退火后的混合物置于室温中，自然融化；6)过滤：将融化后的混合物过滤，除掉ZnS粉末，即可。本发明在不降低小牛血清去蛋白提取物的活性和疗效的基础上，特异性地去除小牛血清去蛋白提取物中的糖肽，降低产品诱发四型变态反应的几率。
Description
技术领域
本发明属于化学领域，具体涉及一种去除小牛血清去蛋白提取物中糖肽方法。
背景技术
蛋白质糖基化是重要的翻译后修饰之一,有数据显示50％以上的蛋白质发生过糖基化修饰。糖蛋白在生物体内参与了许多生理病理过程,很多于疾病的发生发展有关，是很多疾病的生物标记物，例如人体疾病中的肿瘤、风湿性关节炎、阻塞性肺病等。因此很多糖基化的蛋白质(多肽)具有先天的免疫原性，能够引起机体的免疫应答，也可能引起变态反应(超敏反应)，而其中的四型变态反应就是临床常说的过敏反应。
小牛血清去蛋白提取物是小牛血清经过除蛋白得到的分子量小于5000D的小分子混合物，主要包括无机盐、寡糖、胆碱、多肽、氨基酸、单磷酸腺苷等生物活性物质。其中的多肽成分比较复杂，其中也包括少量的糖基化多肽(糖肽)，这些糖肽增加了小牛血清去蛋白提取物筋脉注射引发过敏反应的风险。此前小牛血清去蛋白提取物的提取方法中，没有特异针对糖肽的方法。临床实践中也有同类产品也有偶发过敏反应的情况，这应该和存在的糖肽有关系。
基于此，开发一种去除小牛血清去蛋白提取物中糖肽的方法，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种去除小牛血清去蛋白提取物中糖肽的方法。
本发明所提供的去除小牛血清去蛋白提取物中糖肽的方法，包括下述步骤：
1、降温：将小牛血清去蛋白提取液的温度降低到到-7±0.5℃；
2、向降温后的小牛血清去蛋白提取液中加入总质量0.2％-0.25％的ZnS粉末，并搅拌均匀；
3、速冻：将上述混合物放入-40℃至-45℃环境中速冻4—4.5小时；
4、退火：将冷冻后的混合物放入-23℃的环境中静置6-7小时；
5、复融：将退火后的混合物置于室温中，自然融化；
6、过滤：将混合物过滤，除掉ZnS粉末，即可。
本发明中所述的ZnS粉末是粉碎后通过200目筛子的粉末。
本发明在不降低小牛血清去蛋白提取物的活性和疗效的基础上，特异性地去除小牛血清去蛋白提取物中的糖肽，降低产品诱发四型变态反应的几率。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的小牛血清去蛋白注射液是按照中国专利申请号为201510145515.5中记载的方法制备得到的。
实施例1小牛血清去蛋白注射液除糖肽的实施方法
1、按照中国专利申请201510145515.5的方法，提取小牛血清去蛋白注射液1000ml；
2、取上述小牛血清去蛋白注射液5份，每份100g，分别标记样品1—样品5；将5份样品的温度都降低到-7℃；
3、向降温后的样品1—样品5中分别加入0.05g、0.1g、0.15g、0.2g、0.25g的过200目筛子的ZnS粉末，并搅拌均匀；
4、将样品1—样品5放入-40℃环境中速冻4小时；
5、将速冻后的样品1—样品5放入-23℃的环境中静置6小时；
6、再将样品1—样品5置于室温中缓慢融化；
7、将各样品过滤，除去ZnS粉末即可。
实施例2本发明的方法除糖肽的效果
采用RBL－2H3细胞模型检测除糖肽的效果；通过细胞的脱颗粒率来判断作为过敏原的糖肽的含量。
取对数期生长的RBL－2H3细胞按2～3×105每孔接种于96孔板，每孔接种体积为100μl，设5组，每组设5个复孔，培养24h后，每组的5孔分别加入样品1—样品5各10μl，轻轻晃动混匀药物，于37℃将药物与细胞共同作用0.5h后，吸弃培养液，没孔加入200μl 0.5％的中性红染液，37℃染色3min。计数100个细胞中脱颗粒细胞的个数，计算脱颗粒百分率(5个复孔的平均值)。结果见表-1。
表1各组样品致RBL－2H3细胞脱颗粒率
实验结果显示，加入0.2％和0.25％的ZnS粉末,RBL－2H3细胞脱颗粒率一致,且数值最低，表明这两个样品中含有的过敏原最低。因为加入0.2％和0.25％的ZnS粉末效果一致，所以选择0.2％为最佳比例。
实施例3本发明的方法对小牛血清去蛋白注射液的质量影响
选取小牛血清去蛋白注射液最核心的两个指标：多肽含量和微量呼吸活性刺激指数进行检测，判断本方法对产品质量的影响。多肽含量检测方法采用lowry测蛋白法检测，微量呼吸刺激指数采用微量呼吸检压法检测。取实施例1中未经处理的小牛血清去蛋白注射液作为空白对照。检测结果见表2。
表2本发明方法处理前后两指标的检测结果
| 组别 | 多肽含量(mg/ml) | 微量呼吸刺激指数(SI) |
| 样品1 | 7.56 | 11.6 |
| 样品2 | 7.43 | 11.7 |
| 样品3 | 7.31 | 11.6 |
| 样品4 | 7.20 | 11.5 |
| 样品5 | 7.16 | 11.5 |
| 对照 | 7.59 | 11.6 |
实验结果显示，本发明的方法对小牛血清去蛋白提取液的多肽含量有微小的影响，但是对主要的疗效指标微量呼吸活性几乎没有影响。因此判断该方法对小牛血清去蛋白注射液的质量疗效没有影响；却能进一步提高产品的安全性。
Claims (2)
1.一种去除小牛血清去蛋白提取物中糖肽的方法，包括下述步骤：
1)降温：将小牛血清去蛋白提取液的温度降低到到-7±0.5℃；
2)向降温后的小牛血清去蛋白提取液中加入总质量0.2％-0.25％的ZnS粉末，并搅拌均匀；
3)速冻：将步骤2)得到的混合物放入-40℃至-45环境中速冻4-4.5小时；
4)退火：将步骤3)速冻后的混合物放入-23℃的环境中静置6-7小时；
5)复融：将步骤4)退火后的混合物置于室温中，自然融化；
6)过滤：将融化后的混合物过滤，除掉ZnS粉末，即可；
所述小牛血清去蛋白提取液的制备方法，包括如下步骤：
1)向小牛血清中加入活性炭，进行活性炭吸附，得到除杂后的混合液；所述小牛血清为出生1-6个月的新生小牛采血分离得到的；所述活性炭的加入量为所述小牛血清质量的1.8％-2.2％；所述活性炭吸附的时间为20-30min；
2)将所述混合液和乙醇混合进行醇沉除杂，收集回收液；所述混合液和所述乙醇的体积比为1：(3.4-3.6)；所述醇沉除杂的时间为1.8-2.2h；所述乙醇是以乙醇水溶液的形式存在，所述乙醇水溶液的体积分数为96％；还包括对醇沉除杂后所得液进行离心，弃去沉淀物，收集上清液，并对所述上清液减压蒸馏除去乙醇的步骤；所述离心为在3000r/min离心20分钟；
3)将所述回收液和复合蛋白酶混合进行酶解，得到酶解液；所述复合蛋白酶的加入量为所述回收液质量的1.8％-2.2％；所述复合蛋白酶是由木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶组成，所述木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶的质量比为1：(0.9-1.1)：(0.55-0.65)；所述木瓜蛋白酶的活力为3500U/mg；所述胰蛋白酶的活力为3000U/mg；所述枯草蛋白酶的活力为4000U/mg；所述酶解的条件为：酶解温度为38-42℃，酶解时间为22-26h，pH值为7.8-8.2；还包括对所述酶解液进行超滤截留的步骤：用5K中空纤维柱进行超滤截留；
4)将所述酶解液和氧化剂混合进行氧化反应，即得到所述小牛血清去蛋白提取液；所述氧化剂为H2O2；所述氧化剂的加入量为所述酶解液质量的0.18％-0.22％；所述氧化反应的反应温度为36.5-37.5℃，反应时间为0.9-1.1h；所述氧化反应时的反应体系的pH值为5.1-5.3；还包括向所述氧化反应后所得物中加入MnO2除去多余H2O2，并且过滤除去过量MnO2的步骤：向所述氧化反应后所得物中加入过量的MnO2，在60℃下保温10h，并且用0.22μm微孔滤膜过滤除去过量MnO2即可；还包括对所述氧化反应后所得物进行病毒灭活和灌封的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述ZnS粉末是粉碎后通过200目筛子的粉末。
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