CN104758919B - 一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：1)向小牛血清中加入活性炭，进行活性炭吸附，得到除杂后的混合液；2)将所述混合液和乙醇混合进行醇沉除杂，收集回收液；3)将所述回收液和复合蛋白酶混合进行酶解，得到酶解液；4)将所述酶解液和氧化剂混合进行氧化反应，即可得到所述小牛血清去蛋白注射液。制备得到的小牛血清去蛋白注射液富含小分子多肽的，其具有更高的生物活性和稳定性，并且本发明的生产工艺收率更高，成本更低，对工业化生产意义重大，对于缺血缺氧性疾病具有显著的疗效，应用前景广阔。

Description

一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法。

背景技术

小牛血清中含有很多生物活性物质，对缺血缺氧性疾病具有治疗作用。将小牛血清经过去除大分子物质而得到的小分子混合物在临床上用于疾病的治疗已经有多年的历史了，目前仍然是临床常用药物之一；而且对于该领域的研究也从未间断。本品为混合物，其作用机制甚为复杂，现有的研究结果证明其中的小分子多肽和多糖以及某些小分子生物素都具有生物活性。有研究表明，其中的活性小分子多肽为2肽到9肽，分子量为300D-1000D(虞维俊，小牛血及血清去蛋白提取物注射液的质量控制方法研究，硕士学位论文)；亦有研究表明，多肽含量不同的产品，其生物活性亦有差别(任淑萍，小牛血清去蛋白注射液与小牛血去蛋白注射液有效成分含量和生物活性的比较；中华神经医学杂志2006年8月第5卷第8期，767-769)。

发明内容

本发明的目的是提供一种小牛血清去蛋白注射液及其制备方法，该小牛血清去蛋白注射液富含小分子多肽的，具有更高的生物活性和稳定性。

本发明所提供的小牛血清去蛋白注射液的制备方法，包括如下步骤：

1)向小牛血清中加入活性炭，进行活性炭吸附，以除去小牛血清中的小分子有害物质(例如：组胺、尿酸、肌酐等)，得到除杂后的混合液；

2)将所述混合液和乙醇混合进行醇沉除杂，收集回收液；

3)将所述回收液和复合蛋白酶混合进行酶解，得到酶解液；

4)将所述酶解液和氧化剂混合进行氧化反应，即可得到所述小牛血清去蛋白注射液。

上述制备方法中，步骤1)中，所述小牛血清为出生1-6个月的新生小牛采血分离得到的。

所述活性炭的加入量为所述小牛血清质量的1.8％-2.2％，优选为2％。

所述活性炭吸附的时间为20-30min，优选为20min。

上述制备方法中，步骤2)中，所述混合液和所述乙醇的体积比为1：(3.4-3.6)，优选为1：3.5。

所述醇沉除杂的时间为1.8-2.2h，优选为2h。

所述乙醇是以乙醇水溶液的形式存在，所述乙醇水溶液的体积分数具体可为96％。

上述制备方法中，步骤2)中，还包括对醇沉除杂后所得液进行离心，弃去沉淀物，收集上清液，并对所述上清液减压蒸馏除去乙醇的步骤，所述离心具体可在3000r/min离心20分钟，所述加压蒸馏具体可在55℃和0.2Mpa条件下加压蒸馏。

上述制备方法中，步骤3)中，所述复合蛋白酶的加入量为所述回收液质量的1.8％-2.2％，优选为2％。

所述复合蛋白酶是由木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶组成，所述木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶的质量比为1：(0.9-1.1)：(0.55-0.65)，优选为1:1:0.6。

所述木瓜蛋白酶的活力为3500U/mg；所述胰蛋白酶的活力为3000U/mg；所述枯草蛋白酶的活力为4000U/mg。

所述酶解的酶解温度为38-42℃，优选为40℃。

所述酶解的酶解时间为22-26h，优选为24h。

所述酶解时的体系的pH值为7.8-8.2，优选为8。

上述制备方法中，步骤3)中，还包括对所述酶解液进行超滤截留的步骤，具体可用5K中空纤维柱进行超滤截留。

上述制备方法中，步骤4)中，所述氧化剂具体可为H₂O₂。

所述氧化剂的加入量为所述酶解液质量的0.18％-0.22％，优选为0.2％。

所述氧化反应的反应温度为36.5-37.5℃，反应时间为0.9-1.1h，优选为1h。

所述氧化反应时的反应体系的pH值为5.1-5.3，优选为5.2。

上述制备方法中，步骤4)中，还包括向所述氧化反应后所得物中加入MnO₂除去多余H₂O₂，并且过滤除去过量MnO₂的步骤，具体可按如下步骤：向所述氧化反应后所得物中加入过量的MnO₂，在60℃下保温10h，并且用0.22μm微孔滤膜过滤除去过量MnO₂即可。

上述制备方法中，步骤4)中，还包括对所述氧化反应后所得物进行病毒灭活和灌封的步骤，具体可灌注至安瓿中，冲入氮气后封口。

本发明由上述制备方法制备得到的小牛血清去蛋白注射液也属于本发明的保护范围。

所述小牛血清去蛋白注射液中小分子多肽的含量为7.0-8.0mg/ml，分子量<5000D。

小牛血清去蛋白注射液是小牛血清经过去除大分子物质(如蛋白质、核酸、脂多糖等)得到的小分子活性物质的混合物。

本发明通过复合蛋白酶水解增加多肽的含量，使微量呼吸活性刺激指数达到11.5以上，技术指标提升效果显著。既往的传统的纯化方法(例如醇沉、超滤)等只能除掉小分子物质，而血清中的小分子有害物质(例如：组胺、尿酸、肌酐等)无法通过过滤的方法去除，层析虽然可以，但是层析损耗太大。本发明在醇沉离心前加入活性炭，活性炭会选择性优先吸附高极性的小分子有害物，后吸附极性相对低的蛋白和多肽，这样适量的活性炭可以有效去除上述小分子有害物质而保留活性物质。在经过除蛋白得到的小分子多肽中，含有大量的胱氨酸和半胱氨酸，有大量的游离巯基，多肽的巯基会通过形成二硫键而发生聚合，进而重新生成蛋白，降低稳定性，增加过敏反应的几率。本发明中通过在酸性条件下加入H₂O₂而将游离巯基氧化成磺酸基，磺酸基可以保留一定的生物活性，又可以避免多肽聚合，再通过MnO₂催化使过量的H₂O₂分解，最后通过微孔膜滤过除去MnO₂。本发明显著提升了产品的生物活性，又进一步提高了产品的稳定性，具有显著的进步意义，对于缺血缺氧性疾病具有一定的疗效。

附图说明

图1为实施例2中酶解温度对3种蛋白酶水解度、呼吸活性的影响；柱形图为水解度，从左到右依次为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶；折线为呼吸活性，是木瓜蛋白酶，是胰蛋白酶，是枯草蛋白酶。

图2为实施例2中pH值对3种蛋白酶水解度、呼吸活性的影响；柱形图为水解度，从左到右依次为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶；折线为呼吸活性，是木瓜蛋白酶，是胰蛋白酶，是枯草蛋白酶。

图3为实施例2中加酶量对3种蛋白酶水解度、呼吸活性的影响；柱形图为水解度，从左到右依次为木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶；折线为呼吸活性，是木瓜蛋白酶，是胰蛋白酶，是枯草蛋白酶。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中所述胰蛋白酶活力为3000U/mg；所述木瓜蛋白酶活力为3500U/mg；所述枯草蛋白活力为4000U/mg；所述胃蛋白活力为12000U/mg；所述糜蛋白酶活力为1200U/mg；所述碱性蛋白酶活力为2000U/mg；上述各蛋白酶均购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1、复合蛋白酶筛选：

取适量小牛血清，加入3.5倍体积的96％乙醇，混合搅拌2小时，3000r/min离心除沉淀，上清液减压除乙醇后，均分成6等份，分别加入2％的胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草蛋白酶和碱性蛋白酶，37℃酶解24小时，分别用截留5000D的中空纤维柱超滤截留，得到的滤液分别采用瓦氏微量呼吸减压法检测微量呼吸活性刺激指数(SI)，结果如下表1所示：

表1 不同蛋白酶的水解效果

加入酶	胰蛋白酶	木瓜蛋白酶	枯草蛋白酶	胃蛋白酶	糜蛋白酶	碱性蛋白酶
							SI	5.71	5.13	4.44	3.12	2.54	2.51

上述实验结果表明，水解效率最高的三种蛋白酶是胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草蛋白酶，因此采用这三者组成复合蛋白酶。

实施例2、酶解条件筛选：

1、实验材料：小牛血清、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶；

2、实验仪器：紫外线检测器、瓦氏微量呼吸减压仪；

3、实验方法：

1)材料准备：取适量小牛血清(pH值为7.2，血清总蛋白含量为4.4g/ml，血清白蛋白含量为2.5g/ml)，加入2％活性炭，搅拌20分钟，加入3.5倍于小牛血清体积的96％的乙醇，混合搅拌2小时，3000r/min离心除沉淀，上清液减压除乙醇后得到需要准备的材料。

2)指标测定：总蛋白含量测定：采用凯氏定氮法；可溶性蛋白的测定：采用双缩尿法；水解度测定：采用三氯乙酸(TCA)法；呼吸活性测定：瓦氏微量呼吸减压法。

3)蛋白酶选择：选用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶对小牛血清材料进行酶解，从呼吸活性、水解度和生产成本等方面综合筛选合适的水解蛋白酶。

4)单因素试验：根据三种蛋白酶的理化性质，以水解度为指标，分别对酶解温度、pH值和加酶量3个因素进行考察，酶解时间依据发明专利(专利号为ZL20070119155.7)及实际生产工艺及成本考虑，确定酶解时间为24小时。

5)正交试验：在单因素试验的基础上，以水解度、呼吸活性为指标，进一步选取酶解温度、加酶量和pH值3个因素，利用正交试验表L9(34)进行单酶、双酶水解正交试验，对每种试验用酶的最佳酶解条件进行优化。

6)三种酶混合比例确定：根据正交试验结果数据，确定三种酶混合比例。

7)多酶体系综合酶解试验(正交试验)：由于蛋白酶对肽键作用的专一性，采用单一酶水解时，只能对几个固定的氨基酸残基剂型水解，其水解程度受到限制，因此在单酶最佳酶解工艺基础上，选用双酶或三酶进行水解，综合考虑呼吸活性、水解度和生产成本等来确定最佳方案，并通过正交试验确定最佳酶解工艺条件。

8)数据统计及分析：采用WPS Office软件整理数据，SPSS软件进行统计分析。

4、实验结果：

4.1单因素试验结果

4.1.1酶解温度对蛋白酶水解度和呼吸活性的影响：图1为酶解温度对3种蛋白酶水解度和呼吸活性的影响，图1中所示柱形图表示水解度，折线图表示呼吸活性SI值。其中，(1)木瓜蛋白酶、胰蛋白酶的水解度、呼吸活性指数SI值分别在60℃、40℃时为最高，所以木瓜蛋白酶、胰蛋白酶最佳温度分别为60℃、40℃；(2)枯草杆菌蛋白酶的水解度在40℃时最高，SI值在50℃时最高，考虑到最终制备的小牛血清去蛋白提取液要具备高活性，所以枯草杆菌蛋白酶最佳温度控制在50℃左右。

4.1.2pH值对蛋白酶水解度和呼吸活性的影响：图2为pH值对3种蛋白酶水解度和呼吸活性的影响，图2中所示柱形图表示水解度，折线图表示呼吸活性SI值。其中，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶的水解度、SI值在pH值分别为7、8、7时达到最高。所以三种蛋白酶的最佳pH值在7-8左右。

4.1.3加酶量对蛋白酶水解度和呼吸活性的影响：图3为加酶量对3种蛋白酶水解度和呼吸活性的影响，图3中所示柱形图表示水解度，折线图表示呼吸活性SI值。(1)木瓜蛋白酶加酶量由0.5％-2.0％时，水解度、SI值增加，2.0％-4.0％时水解度增加缓慢，活性提高不明显，可能底物与酶反应接近饱和，考虑到提高酶量会增加生产成本，所以木瓜蛋白酶最佳加酶量控制在2.0％左右；(2)胰蛋白酶加酶量由0.5％-2.0％保持水解度、SI值增加，当加酶量为4.0％时，水解度、SI值都有所下降，所以胰蛋白酶最佳加酶量控制在2.0％左右；(3)枯草杆菌蛋白酶由0.5％-1.0％水解度增加，1％-3％水解度增加缓慢，SI值变化趋势不明显，所以枯草杆菌蛋白酶最佳加酶量控制在1.0％左右。

4.2正交试验结果

4.2.1木瓜蛋白酶正交试验：根据单因素试验所得结果，采用L(3)正交表来考察木瓜蛋白酶3个因素对水解度及呼吸活性的影响，正交试验结果及方差分析见表2、3。

表2 木瓜蛋白酶正交试验结果

表3 木瓜蛋白酶正交试验结果方差分析

注：＊，差异显著，置信水平为0.95，下同。

由表1和2可知，对木瓜蛋白酶水解度的影响主次顺序为酶解温度>pH值>加酶量，且酶解温度具有显著性影响，当酶解温度在55℃时，呼吸活性平均SI值高于其它组。考虑到具有高呼吸活性是我们要求达到的目的，因此，木瓜蛋白酶水解的最优条件：酶解温度55℃、加酶量2.5％、pH值7.2。

4.2.2胰蛋白酶正交试验：根据单因素试验所得结果，采用L(3)正交表来考察胰蛋白酶3个因素对水解度及呼吸活性的影响，正交试验结果及方差分析见表4、5。

表4 胰蛋白酶正交试验结果

表5 胰蛋白酶正交试验结果方差分析

由表3和4可知，对胰蛋白酶水解度影响主次顺序为加酶量>pH值>温度，且加酶量具有显著性影响，根据表4最高的水解度与活性SI值，得到胰蛋白酶水解的最优条件：酶解温度37℃、加酶量2.5％、pH值8.0。

4.2.3枯草杆菌蛋白酶正交试验：根据单因素试验所得结果，采用L(3)正交表来考察枯草杆菌蛋白酶3个因素对水解度及呼吸活性的影响，正交试验结果及方差分析见表6、7。

表6 枯草杆菌蛋白酶正交试验结果

表7 枯草杆菌蛋白酶正交试验结果方差分析

由表6和7可知，对枯草杆菌蛋白酶水解度影响主次顺次为温度>加酶量>pH值，各项因素均无显著性影响。根据表6显示的最高水解度与活性SI值，得到枯草杆菌蛋白酶水解的最优条件：酶解温度40℃、加酶量1.5％、pH值7.0。

4.3多酶体系综合酶解实验

4.3.1单酶与双酶水解实验比较：为了比较单酶与双酶分别对小牛血清水解度与呼吸活性SI值的影响，做了如下表8所示的15组实验。

表8 单酶与双酶水解度及呼吸活性SI值的比较

表8中I为单酶水解方式，II为双酶水解方式；A为木瓜蛋白酶，B为胰蛋白酶，C为枯草杆菌蛋白酶。根据表8中数据分析，双酶水解小牛血清后测定的呼吸活性指数SI值高于单酶，平均SI值>4.0，同时水解度均高于单酶，水解度均达到50％以上。其中，A&B组最高，水解度为55.01％，SI值为4.38。由此可以说明，双酶水解可以提高对小牛血清的水解度，并且有助于呼吸活性的提高。

4.3.2三酶水解实验：根据上述的实验结果，我们确定三种混合酶的比例为1:1:0.6。综合单酶水解和双酶水解实验结果，采用L(3)正交表考察三种酶混合后的酶解温度、pH值、加酶量对小牛血清水解度与呼吸活性的影响，实验设计及结果见表9、10。

表9 三种酶正交试验设计与结果

表10 三种酶正交试验结果方差分析表

由表9和10可知，对三种蛋白酶水解度及活性影响主次顺次为温度>pH值>加酶量，且温度和pH值均有显著性影响，所以确定三种酶水解工艺最优条件为酶解温度40℃、加酶量2％和pH值8.0，此时的水解度达到65.46％，呼吸活性SI值达到11.62，活性最高。

实施例3、制备小牛血清去蛋白注射液：

1)取1-6个月小牛血清10升，加入活性炭200g，搅拌20分钟后，加入96％的乙醇35升，搅拌2小时；

2)混合液经3000r/min离心20分钟，弃沉淀，留上清；

3)上清液在55℃、0.2Mpa条件下减压蒸馏回收乙醇，浓缩至体积5升。

3)回收液pH值调至8.0；加入200g复合蛋白酶，复合蛋白酶组成为木瓜蛋白酶：胰蛋白酶：枯草蛋白酶＝1:1:0.6(质量比)，40℃酶解24小时；

4)酶解液经5K中空纤维柱超滤截留后，将超滤液pH值调至5.2；

5)加入10ml的H₂O₂，缓慢滴加，滴入时间控制在20min，边加边搅拌，加完继续搅拌1小时，全程控制温度，如果温度超过50℃，加入适量冰块降温；

6)加入10g MnO₂粉末，加热至60℃，缓慢搅拌，保温10小时；

7)经0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液，加水稀释至含干物质45mg/ml的溶液，共得提取液约6.3升。

8)将上述提取液灌注至安瓿中，10ml/支，冲入氮气后封口，即得小牛血清去蛋白注射液630支。

实施例4、不同方法制得的小牛血清去蛋白注射液的比较：

重复专利200510084246.3实施例3所得的产品作为对照品，本发明实施例3所得产品为试验品。

1、稳定性比较：

取实验品和对照品各4支，将注射液分别倒入小烧杯中，将pH值调至8.0，向两个烧杯中分别滴加20％的DMSO溶液10毫升，滴加时间控制在10min；滴加后在室温中存放24小时。

24小时后观察可见，对照品溶液中出现肉眼可见的絮状沉淀，而实验品未见任何变化。

DMSO是一种温和的氧化剂，在弱碱性环境中能够促使游离巯基形成二硫键，多肽经过二硫键聚合成大分子蛋白，在空气中变性聚合，就形成了肉眼可见的絮状沉淀。而本发明所得产品经过H₂O₂氧化，巯基被氧化成磺酸基，因此不会发生聚合，稳定性更好。

2、多肽含量比较：

采用“lowry测蛋白法”分别检测实验品和对照品中的多肽含量，对照品多肽含量为3.1mg/ml；实施例3所得产品多肽含量为7.6mg/ml，分子量<5000D。

实施例5、本发明小牛血清去蛋白注射液的疗效：

选择小白鼠常压耐缺氧能力实验考察本产品的疗效：

一、实验材料：

1、实验药品：实施例3所得的实验药品和实施例4所得的对照品；

2、动物：昆明种一级小白鼠(购于辽宁医学院实验动物中心)，体重18-22g，雌雄各半；

3、碱石灰及250ml广口瓶；

二、试验方法：

1、分组：选择健康的昆明种一级小白鼠60只，体重18-22g，雌雄各半，分成三组：即实验组、阳性对照组、空白对照组；

2、实验方法：各组每只小鼠一天给药一次，每次给药量为0.1ml，给药途径为静脉注射，实验组给予实验药品，阳性对照组给予对照品，空白对照组给予无菌生理盐水，连续给药11天后，于末次给药后30分钟将所有小白鼠放入装有10g碱石灰的250ml广口瓶中，密闭常压缺氧，观察小白鼠存活时间。

三、实验结果：

常压缺氧各组小白鼠存活时间结果见表11：

表1 常压缺氧小鼠存活时间

*P<0.05VS空白对照组；△P<0.05VS阳性对照组。

实验组和阳性对照组中小白鼠存活时间明显长于空白对照组；而实验组又明显长于阳性对照组。上述实验结果表明：本发明所得的小牛血清去蛋白注射液能够显著延长小白鼠在常压缺氧环境下的生存时间，能够显著提升小白鼠耐缺氧能力，而且效果优于现有技术。因此，本品对于缺血缺氧性疾病具有一定的疗效。

Claims (2)

1.一种小牛血清去蛋白注射液的制备方法，包括如下步骤：

1）向小牛血清中加入活性炭，进行活性炭吸附，得到除杂后的混合液；

所述小牛血清为出生1-6个月的新生小牛采血分离得到的；

所述活性炭的加入量为所述小牛血清质量的1.8%-2.2%；

所述活性炭吸附的时间为20-30min；

2）将所述混合液和乙醇混合进行醇沉除杂，收集回收液；

所述混合液和所述乙醇的体积比为1：（3.4-3.6）；

所述醇沉除杂的时间为1.8-2.2h；

所述乙醇是以乙醇水溶液的形式存在，所述乙醇水溶液的体积分数为96%；

还包括对醇沉除杂后所得液进行离心，弃去沉淀物，收集上清液，并对所述上清液减压蒸馏除去乙醇的步骤；

所述离心为在3000 r/min离心20分钟；

3）将所述回收液和复合蛋白酶混合进行酶解，得到酶解液；

所述复合蛋白酶的加入量为所述回收液质量的1.8%-2.2%；

所述复合蛋白酶是由木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶组成，所述木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和枯草蛋白酶的质量比为1：（0.9-1.1）：（0.55-0.65）；

所述木瓜蛋白酶的活力为3500U/mg；所述胰蛋白酶的活力为3000U/mg；所述枯草蛋白酶的活力为4000U/mg；

所述酶解的条件为：酶解温度为38-42℃，酶解时间为22-26h，pH值为7.8-8.2；

还包括对所述酶解液进行超滤截留的步骤：用5K中空纤维柱进行超滤截留；

4）将所述酶解液和氧化剂混合进行氧化反应，即可得到所述小牛血清去蛋白注射液；

所述氧化剂为H₂O₂；

所述氧化剂的加入量为所述酶解液质量的0.18%-0.22%；

所述氧化反应的反应温度为36.5-37.5℃，反应时间为0.9-1.1h；

所述氧化反应时的反应体系的pH值为5.1-5.3；

还包括向所述氧化反应后所得物中加入MnO₂除去多余H₂O₂，并且过滤除去过量MnO₂的步骤：向所述氧化反应后所得物中加入过量的MnO₂，在60℃下保温10h，并且用0.22μm微孔滤膜过滤除去过量MnO₂即可；

还包括对所述氧化反应后所得物进行病毒灭活和灌封的步骤。

2.权利要求1所述的制备方法而制备得到的小牛血清去蛋白注射液；

所述小牛血清去蛋白注射液中小分子多肽的含量为7.0-8.0mg/ml，分子量<5000D。