CN101433553A - 小牛血去蛋白提取物制备方法及其冻干粉 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种小牛血去蛋白提取物制备方法及其冻干粉，该方法过程简便，易于大批量生产，得到的提取物生物活性高，产品纯度好，冻干粉采用梯度升温干燥，成品外观好，易于溶解。小牛血去蛋白提取物通过如下方法制得：将采集的血清加热除蛋白，过滤后滤液浓缩，乙醇除蛋白，然后加入活性炭和酸进行水解脱色，过滤后调节pH值至合适范围，冷冻除蛋白并反复操作，最后用纤维膜超滤除高分子物质，得到小牛血去蛋白提取物，然后加入赋形剂和注射用水，预冻，再梯度升温真空干燥，得到成品。
Description
技术领域
本发明涉及医学生化药物领域，具体地说为一种小牛血去蛋白提取物制备方法及其冻干粉。
背景技术
小牛血去蛋白提取物(血活素)自1955年由瑞士素高药厂开发研制成功五十年以来，已经在世界各国推广使用。它是1～18个月的幼牛血清经除蛋白后得到的小分子生物活性物质，其注射液每毫升含有40±5毫克小牛血去蛋白提取物的总固体，其中30％为氨基酸、糖类、酮酸、嘌呤、核苷酸及相对分子量为2500～3000的寡肽类物质，70％为无机物(K+、Na+、Cl-、Ca2+等)，它们能增加组织细胞对氧的摄入和利用，促进葡萄糖向脑组织运转，并能促进葡萄糖在脑内进行有氧代谢，尤其在缺血、缺氧的条件下，小牛血去蛋白提取物能使脑组织产生更多的高能化合物(ATP)，以维护脑组织的正常生理功能。它主要用于：1改善脑部血液循环和营养障碍性疾病引起的神经功能缺损，用于缺血缺氧脑血管疾病、颅脑外伤如脑梗塞、脑出血、脑炎、脑动脉硬化、老年痴呆、促复苏等；2作为能量合剂治疗心肌炎、冠心病等；3末梢动、静脉循环障碍及其引起的动脉血管病，腿部溃疡及周围神经病变；4消化性溃疡、萎缩性胃炎；5放射所致皮肤、粘膜损伤；6减轻肝细胞损伤，用于各种肝炎、肝硬化等。具有良好疗效且无毒耐受性好。
目前，本领域中常用的小牛血去蛋白提取技术主要为离心、乙醇除蛋白、酸解酶解除蛋白、超滤除大分子物质等过程。但目前公知技术中很难最大程度的去除蛋白和保留活性物质。例如在专利CN200410013643中采用将血清碱性、酸性(PH6.5～7.5，并70～90℃热处理)离心除蛋白，60～80℃减压浓缩，再超滤截留5000-10000道尔顿的分子，然后加入水、渗透压调节液和活性炭加热，过滤，最后加入水配得小牛血去蛋白提取物注射液。其技术难度小，易于生产，但很难将杂质，特别是蛋白完全去除，影响了产品纯度，从而危害患者健康甚至生命。
在申请专利CN200610080520中公开了另一种小牛血去蛋白提取技术：将小牛血清先用两倍体积的96％乙醇除蛋白，再在37℃、1个大气压下用真空旋转蒸发仪减压除乙醇，然后酶水解24小时，离心(1000rpm，4℃，30min)，再用葡聚糖G15凝胶层析脱盐和DEAE-Sephadex-50凝胶层析分离，最后膜滤除高分子物质并紫外线灭菌。该方法所用酶水解除蛋白条件剧烈，破坏了更多的活性物质，使得产品生物活性降低。
在专利CN200410062657中公开了一种制备小牛血去蛋白眼膏的技术，其中涉及一种小牛血去蛋白提取物的提取技术：将小牛血液离心(2000-4000rmp、10-20分钟)得到红细胞，加入2-6倍水在-20～-10℃下冻溶20-30小时，离心(10000-15000rmp、10-30分钟)，然后50-70℃下巴氏消毒6-15小时，再超滤除高分子物、脱盐，浓缩后用活性炭脱色(90-110℃，10-60分钟)。其采用从红细胞中提取，加大了制备难度，增加了成本，但效果并没有实质提高。另外他采用50-70℃温度下进行消毒，不能消灭大部分致病细菌，而他进行活性炭脱色时采用90-110℃高温又破坏了血液中的有效成分，所得产品效果低。
专利CN200410013509中公开了一种小牛血去蛋白提取物冻干粉的制备方法，先在-45～-40℃下预冻，然后抽真空至1～10帕，升温至-20～-5℃，再第二次升温至30～35℃，然后保温干燥至合格。该专利没有给出预冻和两个干燥阶段的具体时间，而我们知道对于冻干工艺来说，冻干时间是非常关键的，时间过短会干燥不彻底，造成外观塌陷、出泡坑，时间过长则会破坏细胞膜，灭活有效成份。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小牛血去蛋白提取物制备方法，该方法过程简便，易于大批量生产，得到的提取物生物活性高，产品纯度好。
为实现本发明目的，采取如下方法制备小牛血去蛋白提取物：
(1)将小牛血搅拌、离心得到血清；
(2)将离心得到的血清加热去除蛋白，过滤后浓缩滤液；
(3)向浓缩后的滤液中加入乙醇进行醇沉，过滤去除沉淀出的蛋白，滤液浓缩回收乙醇，得到醇沉后的滤液；
(4)向醇沉后的滤液中加入酸调节PH值为酸性，加入活性炭并加热进行脱色和水解，过滤收集滤液；
(5)将收集的滤液用碱调节PH至6.8～8，冷冻除蛋白，过滤得到滤液，再冷冻、
过滤，反复2～5次，所述冷冻温度为-50～0℃，时间为12～72小时；
(6)将冷冻除蛋白后得到的滤液用纤维膜超滤除高分子物质，得到小牛血去蛋白提取物，所述纤维膜为截留分子量5000～30000道尔顿。
上述制备方法中，步骤(1)中如果将血液只进行离心分离血清，会由于纤维蛋白原存在造成血浆凝固，使得提取的血清质量很差，严重影响后面提取过程，所以我们先将血液用搅拌器进行搅拌，搅拌速度60～200转/分钟，搅拌时间5～20分钟；其后进行离心，离心速度为800～2000转/分钟，时间为20～40分钟，这里我们将离心时间进行延长同样也可以提高所得血清质量。
上述制备方法中，步骤(2)中采取了先进行加热除蛋白的方法，通过高温使蛋白凝固变质来去除蛋白，同时较高温度又可以杀死血清中的各种细菌，提高了产品的安全性，所述加热温度为60～90℃，加热时间5～10分钟，其温度范围不会对血清中有效成分造成破坏；过滤掉沉淀后减压浓缩，至剩余原体积的1/4～1/12，如果剩余体积太小则浓度过大，降低了后面醇沉除蛋白的效果，如果剩余体积过大则使后面操作困难，并影响产品活力。
上述制备方法中，步骤(3)中所述乙醇加入量为所述浓缩后滤液体积的2～10倍，乙醇浓度为50～95％，醇沉时间为24～72小时，我们将醇沉时间延长，也可以提高蛋白的清除效果，同时不会影响有效成分。
上述制备方法中，步骤(4)中如果采用水解酶进行水解，势必会对血清有效成分造成破坏，为了得到更高效的提取物，我们采用了酸调解的方法，调解过程中同时加入活性炭脱色吸附杂质，减少了提取步骤，简化了工艺，其中所述酸为盐酸、硫酸、硝酸或磷酸；所述PH值为3.5～6.5；所述加热温度为60～90℃，时间10～60分钟；步骤(5)中根据蛋白和其他一些杂质在低温下会在溶液中析出的原理，我们用碱调节溶液PH值后采用了低温冷冻的新方法，很大效率的提高了蛋白等杂质的去除率，清除了其他现有技术无法清除的蛋白和细小杂质，其中所述碱为NaOH、KOH或碳酸氢钠；所述PH值7～7.5。
上述制备方法中，步骤(5)所述冷冻温度为-40～-10℃，时间为24～48小时。
上述制备方法中，步骤(5)所述冷冻温度为-30～-20℃，时间为30～40小时。
上述制备方法中，步骤(6)中我们用三种规格的中空纤维膜依次进行超滤，能够有效的将大分子物去除，避免了注射后大分子物引起的免疫反应。其中所述纤维膜超滤为顺序用30000、10000、5000道尔顿分子量的中空纤维膜超滤。
上述制备方法中，所述制备方法得到的小牛血去蛋白提取物呼吸活力8～10.1μlO2/(mg·h)，刺激指数3～5。
本发明另一目的在于提供一种含有上述方法制备的小牛血去蛋白提取物的注射用冻干粉，所述注射用冻干粉制备包括如下步骤。
一种含有前面所述的小牛血去蛋白提取物的注射用冻干粉，所述注射用冻干粉制备步骤包含：称取小牛血去蛋白提取物溶液，加入可药用赋形剂，搅拌溶解，加入注射用水至规定体积，分别用0.45μm、0.22μm超滤膜过滤除菌，按一定规格灌装，压半盖，-60℃～-30℃下预冻2～5小时，然后抽真空，真空度3～9帕，缓慢升温至-10℃，升温时间8～16小时，保持-10℃真空干燥2～6小时，再缓慢升温至10℃，升温时间4～8小时，再升温至20～35℃干燥，升温时间3～6小时，最后保温干燥30～90分钟，压全盖，成品完成。本发明中，经过摸索采用了梯度升温方法，该方法更适合于小牛血去蛋白提取物的冻干干燥，可以更彻底的去除水分，所得产品形态饱满细腻，色泽均匀，结构牢固，溶解速度快，残余水分低，生物活性基本不变。
一种含有前面所述的小牛血去蛋白提取物的注射用冻干粉，所述注射用冻干粉制备步骤包含：称取小牛血去蛋白提取物溶液，加入甘露醇或右旋糖酐，搅拌溶解，加入注射用水至规定体积，分别用0.45μm、0.22μm超滤膜过滤除菌，按400mg/支或800mg/支规格灌装，压半盖，-50℃～-40℃下预冻3小时，然后抽真空，真空度5～7帕，缓慢升温至-10℃，升温时间12小时，保持-10℃真空干燥4小时，再缓慢升温至10℃，升温时间6小时，再升温至25～32℃干燥，升温时间5小时，最后保温干燥50～80分钟，压全盖，成品完成。
一种含有前面所述的小牛血去蛋白提取物的注射用冻干粉，所述注射用冻干粉制备步骤更具体为：将4000g小牛血去蛋白提取物，加入30～1500g甘露醇，搅拌溶解，加入30000ml注射用水，分别用0.45μm、0.22μm超滤膜过滤除菌，按400mg/支或800mg/支规格灌装，压半盖，-50℃～-40℃下预冻3小时，然后抽真空，真空度5～7帕，缓慢升温至-10℃，升温时间12小时，保持-10℃真空干燥4小时，再缓慢升温至10℃，升温时间6小时，再升温至25～32℃干燥，升温时间5小时，最后保温干燥50～80分钟，压全盖，成品完成。
本发明提供的小牛血去蛋白提取物及其制备方法优点在于：
(1)本发明提供的小牛血去蛋白提取液中每毫升含有游离氨基酸1～1.5mg，总固体含量160～170mg，pH6.5～7.5，呼吸活力为8～10μl O2/(mg·h)，刺激指数4～5。
(2)本发明过程简便易行，将水解和活性炭脱色两步操作合并为一步进行，提高了生产效率；本发明同样避免了复杂繁琐的柱层析技术，所使用各种材料均为廉价易得的工业产品，便于工业化生产，能够安全有效的生产出更强活性的小牛血去蛋白提取物。
(3)现有技术中单一的通过醇沉或加热、水解去除蛋白方法效率低下，得到产品往往杂质多，质量差，影响了临床用药效果。本发明通过加热、醇沉、酸水解的联合应用保证了对蛋白的彻底消除，提高了产品质量。廉价无机酸的应用避免了昂贵的水解酶，同时减少了对有效活性成分的破坏并提高了蛋白去除效果。
(4)牛血中含有多种致病菌，严重危害着患者用药安全。现有技术中要么步骤(2)中比其他现有技术更高温度的应用，确保了对产品中各种致病细菌的灭活，保证了患者的用药安全。同时该温度范围又不会对血清中的有效成分造成影响。
(5)步骤(6)中运用低温冷冻方法，使得经过醇沉、加热、水解后残存的蛋白和其他杂质在低温中析出，更进一步提高了产品质量，同时低温不会对产品的有效成分造成破坏。
(6)冻干干燥过程采取梯度升温过程，更有效的除去吸附水和结合水，且不对提取物有效成份造成破坏，
附图说明
图1为小牛血去蛋白提取物制备工艺流程图
图2为小牛血去蛋白提取物冻干粉制备工艺流程图
具体实施方式
下面的实施例将对本发明作更具体的解释，但本发明并不仅仅局限于这些实施例，同样这些实施例也不以任何方式限制本发明。
实施例1
小牛血采集
经检验健康的1.5岁以下小牛的血，用搅拌器以150转/分钟搅拌20分钟，去除血浆纤维蛋白原，然后用离心机以800转/分钟离心30分钟，取上清液，倒入清洁的桶内，-40℃速冻后于-20℃冷藏备用。
提取
将冷藏小牛血清取出，室温融化后放入减压浓缩罐，加热至60℃使蛋白质凝固、变性，过滤，滤液加热至70℃，减压浓缩至原体积1/4，冷却至室温，加入5倍体积55％乙醇，醇沉30小时，过滤，回收乙醇，得到半成品。
脱色、除冷蛋白
取上步产品放入水解罐，加入HCl至PH为3.5，加热至70℃，用10％活性炭脱色50分钟，过滤，滤液放入罐中，用NaOH调节PH为6.9，水冷却，取样检测，总固体含量>130mg/ml，-80℃冷冻24小时，解冻，过滤，滤液再冷冻24小时，反复3次。
分子量筛选、细菌内毒素去除、除高分子物质
顺序使用30000、10000、5000道尔顿分子量的中空纤维膜超滤，得到精制小牛血去蛋白提取物，检测，总固体含量>140mg/ml，-20℃冷冻备用。
实施例2
小牛血采集
经检验健康的1.5岁以下小牛的血，用搅拌器以100转/分钟速度搅拌6分钟，去除血浆纤维蛋白原，然后用离心机以2000转/分钟速度离心30分钟，取上清液，倒入清洁的桶内，-40℃速冻后于-20℃冷藏备用。
提取
将冷藏小牛血清取出，室温融化后放入减压浓缩罐，加热至70℃使蛋白质凝固、变性，过滤，滤液加热至80℃，减压浓缩至原体积1/8，冷却至室温，加入2倍70％乙醇，醇沉24小时，过滤，回收乙醇，得到半成品。
脱色、除冷蛋白
取上步产品放入水解罐，加入HCl至PH为6.5，加热至60℃，用5％活性炭脱色15分钟，过滤，滤液放入罐中，用NaOH调节PH为8.0，水冷却，取样检测，总固体含量>130mg/ml，-20℃冷冻24小时，解冻，过滤，滤液再冷冻24小时，反复5次。
分子量筛选、细菌内毒素去除、除高分子物质
顺序使用30000、10000、5000道尔顿分子量的中空纤维膜超滤，得到精制小牛血去蛋白提取物，检测，总固体含量>140mg/ml，-20℃冷冻备用。
实施例3
小牛血采集
经检验健康的1.5岁以下小牛的血，用搅拌器以60转/分钟进行搅拌，搅拌12分钟，去除血浆纤维蛋白原，然后用离心机以1500转/分钟离心30分钟，取上清液，倒入清洁的桶内，-40℃速冻后于-20℃冷藏备用。
提取
将冷藏小牛血清取出，室温融化后放入减压浓缩罐，加热至90℃使蛋白质凝固、变性，过滤，滤液加热至90℃，减压浓缩至原体积1/11，冷却至室温，加入94％乙醇10倍，醇沉68小时，过滤，回收乙醇，得到半成品。
脱色、除冷蛋白
取上步产品放入水解罐，加入HCl至PH为5.5，加热至90℃，用1％活性炭脱色30分钟，过滤，滤液放入罐中，用NaOH调节PH为8.0，水冷却，取样检测，总固体含量>130mg/ml，-45℃冷冻24小时，解冻，过滤，滤液再冷冻24小时，反复2次。
分子量筛选、细菌内毒素去除、除高分子物质
顺序使用30000、10000、5000道尔顿分子量的中空纤维膜超滤，得到精制小牛血去蛋白提取物，检测，总固体含量>140mg/ml，-20℃冷冻备用。
本发明实施例所得产品参数见表1
表1.三批小牛血去蛋白提取物参数
| 批号 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 |
| 性状 | 浅黄色澄明液体 | 浅黄色澄明液体 | 浅黄色澄明液体 |
| 相对密度 | 1.0249 | 1.0250 | 1.0253 |
| 呼吸活性 | 10.0782 | 8.4266 | 9.5882 |
| 刺激指数 | 4.7017 | 3.1345 | 3.0682 |
| 游离氨基酸(mg/ml) | 1.15 | 1.19 | 1.35 |
| PH | 7.2 | 7.0 | 7.0 |
| 吸收度 | 0.06 | 0.07 | 0.06 |
| 高分子物质 | 未检出 | 未检出 | 未检出 |
| 总固体(mg/ml) | 167.9 | 169.0 | 164.0 |
| 过敏试验 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 |
| 细菌内毒素 | 符合规定 | 符合规定 | 符合规定 |
实施例4
将4000g小牛血去蛋白提取物，加入30g甘露醇，搅拌溶解，加入30000ml注射用水，分别用0.45μm和0.22μm超滤膜超滤，按400mg/支规格灌装，压半盖，放入冻干柜，-60℃预冻2小时，抽真空，真空度9帕，缓慢升温至-10℃，升温时间16小时，保持-10℃真空干燥6小时，再缓慢升温至10℃，升温时间8小时，再升温至20℃，升温时间3小时，最后保持20℃真空干燥90分钟，压全盖，成品完成。
实施例5
将4000g小牛血去蛋白提取物，加入150g甘露醇，搅拌溶解，加入30000ml注射用水，分别用0.45μm和0.22μm超滤膜超滤，按400mg/支规格灌装，压半盖，放入冻干柜，-45℃预冻3小时，抽真空，真空度6帕，缓慢升温至-10℃，升温时间12小时，保持-10℃真空干燥4小时，再缓慢升温至10℃，升温时间6小时，再升温至29℃，升温时间5小时，最后保持29℃真空干燥65分钟，压全盖，成品完成。
实施例6
将4000g小牛血去蛋白提取物，加入300g甘露醇，搅拌溶解，加入30000ml注射用水，分别用0.45μm和0.22μm超滤膜超滤，按400mg/支规格灌装，压半盖，放入冻干柜，-30℃预冻5小时，抽真空，真空度3帕，缓慢升温至-10℃，升温时间8小时，保持-10℃真空干燥2小时，再缓慢升温至10℃，升温时间4小时，再升温至35℃，升温时间6小时，最后保持35℃真空干燥30分钟，压全盖，成品完成。
实施例7
将4000g小牛血去蛋白提取物，加入900g甘露醇，搅拌溶解，加入30000ml注射用水，分别用0.45μm和0.22μm超滤膜超滤，按400mg/支规格灌装，压半盖，放入冻干柜，-50℃预冻3小时，抽真空，真空度7帕，缓慢升温至-10℃，升温时间12小时，保持-10℃真空干燥4小时，再缓慢升温至10℃，升温时间6小时，再升温至25℃，升温时间5小时，最后保持25℃真空干燥80分钟，压全盖，成品完成。
实施例8
将4000g小牛血去蛋白提取物，加入1500g甘露醇，搅拌溶解，加入30000ml注射用水，分别用0.45μm和0.22μm超滤膜超滤，按400mg/支规格灌装，压半盖，放入冻干柜，-40℃预冻3小时，抽真空，真空度5帕，缓慢升温至-10℃，升温时间12小时，保持-10℃真空干燥4小时，再缓慢升温至10℃，升温时间6小时，再升温至32℃，升温时间5小时，最后保持32℃真空干燥50分钟，压全盖，成品完成。
试验例1
小牛血去蛋白提取物呼吸活性测定：
本法系用瓦氏呼吸检压仪测定豚鼠肝匀浆的呼吸活力，从测得的耗氧量计算出呼吸活力QO2[μIO2/(mg·h)]和刺激指数(SI)。
仪器：瓦氏呼吸检压仪，匀浆器，定时器。
试剂：
10％氢氧化钠溶液：取氢氧化钠10g，加水溶解并稀释至100ml。
Soerensen缓冲液(PH7.4)：取磷酸氢二钠(Na2HPO4)9.72g和磷酸二氢钾1.65g，加水溶解并稀释至1000ml。
Brodie测压液：取氯化钠23g，牛胆酸钠5g，伊文氏兰100mg，加水溶解并稀释至500ml。相对密度为1.033g/ml。
肝匀浆液：取体重200～300g的雄性豚鼠一只，颈部打击处死(处死前需禁食至少24小时)，立即切断颈动脉放血，打开腹腔取出肝脏，置冰水浴中的Soerensen缓冲液中(注意：不得损伤胆囊或胆管)。称取5.5g的肝脏，并切割为大小相同的7块，每块用7ml的Soerensen缓冲液匀浆(注意：以上操作必须在冰水浴中进行)。
测定法：
(1)预先把测压计反应瓶洗净并干燥，备用。
(2)装好测压液于测压管内，调节液面至150mm。
(3)反应瓶中先加入Soerensen缓冲液1.1ml，加供试品小牛血去蛋白提取物0.2ml，然后加肝匀浆液1.0ml。
(4)加10％氢氧化钠溶液0.2ml于具一小滤纸条的反应瓶中间小杯。
(5)由于肝匀浆本身有耗氧作用，故实验时以Soerensen缓冲液0.2ml代替供试品，其余试剂同样品管，作为空白管。
(6)将装好的反应瓶按管号与测压计相连(注意密闭，勿使漏气)，置37℃恒温水浴中。
(7)开动振荡器振摇10分钟(75次/分)使反应瓶内外温度一致。将测压计右侧柱液面调至150mm，记下左侧液面初读数(A)，然后关闭三向活塞，开始计时，反应30分钟记后将测压计右侧柱液面再调至150mm，记下左侧液面初读数(B)。打开三向活塞，重复上述过程，进行下一个30分钟的反应并记下左侧液面初读数(C)及30分钟后的液面读数(D)。
(8)实验过程中必须附加一套供校正用的温压计，在反应瓶中加2.5ml的Soerensen缓冲液，使其在与试验管完全相同的条件下试验，观察其压力的变化(△C)，以消除试验过程中温度及大气压的影响。
(9)取2.0ml肝匀浆，置恒重的装有海沙的称量瓶中，110℃干燥至恒重，计算两次的重量差异△W(mg)。
按下式计算：QO2[μIO2/(mg·h)]＝[(A-B+C-D)×K1-△C×K2]/G×I式中：
K1—空白或样品的反应瓶常数；
K2—温压计的反应瓶常数；
G—每1ml肝匀浆的干重，mg·△G＝W/2-9.2，9.3为Soerensen缓冲液的干重，mg；
I—反应时间，小时。
刺激指数(SI)＝供试品QO2/空白QO2
试验结果应满足以下条件，否则无效：
1.对照品的QO2≥4.0μlO2/(mg·h)，并且SI≥QO2；
2.空白的QO2≥1.0μlO2/(mg·h)。
实验结果见表1
试验例2
小牛血去蛋白提取物过敏试验：
本法系将一定剂量的供试品小牛血去蛋白提取物溶液注入豚鼠腹腔和静脉，在规定的时间内观察动物的过敏反应情况，以判断供试品是否符合规定的一种方法。
供试动物：健康豚鼠，雌雄均可，体重250～350g，试验前及试验的观察期内，均应按正常饲养条件饲养，做过本试验的动物不得重复使用。
供试溶液的配制：除另有规定外，用氯化钠注射液按各药品项下规定浓度制成供试品溶液。
检查法：取上述豚鼠6只，间日腹腔注射供试品溶液0.5ml，连续3次，然后分成两组，每组3只，分别在第一次注射后第14日及第21日静脉注射供试品溶液1.0ml。
结果判断：静脉注射后15分钟内均不得出现过敏性反应，如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种以上者；或罗音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者应判为阳性。
取本品，用0.9％无菌氯化钠稀释成每1ml中含有总固体40mg的供试溶液，依法测定，应符合规定。
实验结果见表1。
试验例3
小牛血去蛋白提取物中游离氨基酸含量测定：
取本品及标准氨基酸适量，用氨基酸分析仪进行氨基酸分析，其游离氨基酸含量应为每400mg中含8.0～12.0mg。具体实验结果见表1
试验例4
小牛血去蛋白提取物中总固体含量测定：
精密量取本品1g，置称量瓶中在(53±2)℃下真空干燥至恒重(中国药典2000年版二部附录VIIIL)，计算，所得结果减去赋形剂量，赋形剂检测方法见药典附录三。具体实验结果见表1。
试验例5
小牛血去蛋白提取物中高分子物质测定：
照高效液相色谱法(中国药典2000年版二部附录V D)测定。用凝胶色谱柱(如：Pharmarcia Superdex Peptide或TSK-s2000swxl柱)，乙腈-三氟醋酸-水(40：0.1：60)为流动相，检测波长为214nm。
对照品溶液制备：称取胰岛素(分子量5800)适量，加流动相制成每1ml中含2.5mg的溶液，作为对照品溶液。
测定法：取对照溶液及供试品溶液(本品加水制成每1ml中含有总固体40mg的供试溶液)各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，将先于胰岛素峰保留时间的峰视为高分子量物质，按面积归一化法计算，含高分子量物质的量不得过2.0％。具体实验结果见表1。
试验例6
小牛血去蛋白提取物中细菌内毒素测定：
取本品，依法检查(中国药典2000年版二部附录XIE)，每1mg中含细菌内毒素应小于0.025EU)，具体实验结果见表1。
Claims (10)
1、一种小牛血去蛋白提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将小牛血搅拌、离心得到血清；
(2)将离心得到的血清加热去除蛋白，过滤后浓缩滤液；
(3)向浓缩后的滤液中加入乙醇进行醇沉，过滤去除沉淀出的蛋白，滤液浓缩回收乙醇，得到醇沉后的滤液；
(4)向醇沉后的滤液中加入酸调节PH值为酸性，加入活性炭并加热进行脱色和水解，过滤收集滤液；
(5)将收集的滤液用碱调节PH至6.8～8，冷冻除蛋白，过滤得到滤液，再冷冻、过滤，反复2～5次，所述冷冻温度为-50～0℃，时间为12～72小时；
(6)将冷冻除蛋白后得到的滤液用纤维膜超滤除高分子物质，得到小牛血去蛋白提取物，所述纤维膜为截留分子量5000～30000道尔顿。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述浓缩为浓缩至原体积的1/4～1/12；所述加热温度为60～90℃，加热时间5～10分钟。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述乙醇加入量为步骤(3)所述浓缩后的滤液的2～10倍，乙醇浓度为50～95％，醇沉时间为24～72小时。
4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述酸为盐酸、硫酸、硝酸、或磷酸；所述PH值为3.5～6.5；所述加热温度为60～90℃，时间10～60分钟；步骤(5)所述碱为NaOH、KOH、或碳酸氢钠；所述PH值7～7.5。
5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述冷冻温度为-40～-10℃，所述时间为24～48小时。
6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述冷冻温度为-30～-20℃，所述时间为30～40小时。
7、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)所述纤维膜超滤为顺序用30000、10000、5000道尔顿分子量的中空纤维膜超滤。
8、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法得到的小牛血去蛋白提取物呼吸活力8～10.1μl 02/(mg·h)，刺激指数3～5。
9、一种含有按权利要求1所述方法制备的小牛血去蛋白提取物的注射用冻干粉，其特征在于，所述的注射用冻干粉的制备步骤包括：称取小牛血去蛋白提取物溶液，加入可药用赋形剂，搅拌溶解，加入注射用水至规定体积，分别用0.45μm、0.22μm超滤膜过滤除菌，按一定规格灌装，压半盖，-60℃～-30℃下预冻2～5小时，然后抽真空，真空度3～9帕，缓慢升温至-10℃，升温时间8～16小时，保持-10℃真空干燥2～6小时，再缓慢升温至10℃，升温时间4～8小时，再升温至20～35℃干燥，升温时间3～6小时，最后保温干燥30～90分钟，压全盖，成品完成。
10、根据权利要求9所述注射用冻干粉，其特征在于，制备步骤包括：称取小牛血去蛋白提取物溶液，加入甘露醇或右旋糖酐，搅拌溶解，加入注射用水至规定体积，分别用0.45μm、0.22μm超滤膜过滤除菌，按400mg/支或800mg/支规格灌装，压半盖，-50℃～-40℃下预冻3小时，然后抽真空，真空度5～7帕，缓慢升温至-10℃，升温时间12小时，保持-10℃真空干燥4小时，再缓慢升温至10℃，升温时间6小时，再升温至25～32℃干燥，升温时间5小时，最后保温干燥50～80分钟，压全盖，成品完成。
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