CN100473387C

CN100473387C - 一种小牛血清去蛋白注射液及其生产方法

Info

Publication number: CN100473387C
Application number: CNB2008100944864A
Authority: CN
Inventors: 于洪儒; 王洪新; 杨菁; 修元澎
Original assignee: AOHONG PHARMACEUTICAL Co Ltd JINZHOU
Current assignee: Aohong Pharmaceutical Co., Ltd., Jinzhou
Priority date: 2008-05-04
Filing date: 2008-05-04
Publication date: 2009-04-01
Anticipated expiration: 2028-05-04
Also published as: CN101264104A

Abstract

本发明公开了一种小牛血清去蛋白注射液及其生产方法。该注射液是按照如下方法制备的：1)去除小牛血清中的蛋白，然后进行粗滤，收集滤液；2)对所述滤液依次用甲苯、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，每次萃取中弃去有机相保留水相；3)对所述水相采用BIO-GEL-P2凝胶进行层析，得到小牛血清去蛋白注射液。所述小牛血清去蛋白注射液的活性成分为多糖，所述多糖的含量为1.0-1.2mg/ml，优选为1.17mg/ml。

Description

一种小牛血清去蛋白注射液及其生产方法

技术领域

本发明涉及一种小牛血清去蛋白注射液及其生产方法。

背景技术

以小牛血清为原料经过除蛋白后得到的提取物具有改善细胞代谢的生理作用，在临床上广泛应用于神经科疾病的治疗。目前所有的小牛血清类产品的研究都认为小分子肽是这类产品的主要有效成份，因此所有的产品提取工艺都将提高小分子肽含量作为目标，在生产工艺中使用酸解、酶解等技术将大分子蛋白及多肽切成小分子肽；还有些产品将控制小分子肽含量作为控制有效成分的手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种小牛血清去蛋白注射液及其生产方法。

本发明所提供的小牛血清去蛋白注射液的制备方法，包括如下步骤：

1)去除小牛血清中的蛋白，然后进行粗滤，收集滤液；

2)对所述滤液依次用甲苯、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，每次萃取中弃去有机相保留水相；

3)对所述水相采用BIO-GEL-P2凝胶进行层析，以纯化水为流动相，收集280nm检测波长的吸光度曲线上的第二吸收峰，得到小牛血清去蛋白注射液。

所述制备方法中还包括将所得到的小牛血清去蛋白注射液进行病毒灭活的步骤。增加病毒灭活步骤可杀灭非脂包膜病毒和脂包膜病毒，保证产品的生物安全性。所述病毒灭活条件为60℃水浴中保存10小时。

上述步骤2)中，加入的甲苯、乙酸乙酯和正丁醇的体积均大于等于所述滤液的体积。当所述BIO-GEL-P2凝胶层析中柱床高度为120—140cm，柱的直径为4-5cm，所述纯化水的洗脱流速为40ml/h。

由所述的制备方法制备的小牛血清去蛋白注射液也属于本发明的保护范围。

所述方法制备的小牛血清去蛋白注射液的活性成分为多糖，所述多糖的含量为1.0-1.2mg/ml，优选为1.17mg/ml。除所述多糖外，所述注射液中还含有小分子肽类物质；所述小分子肽类物质含量为小于等于0.05mg/ml，优选为0.04mg/ml。

本发明所述的小牛血清去蛋白注射液可用于治疗如下疾病：

a)脑缺血缺氧性疾病；

b)营养障碍性疾病所引起的神经功能缺损(缺血性损害、颅脑外伤)；

c)末梢动脉循环障碍及其引起的动脉血管病；

d)静脉循环障碍及其引起的动脉血管病；

e)皮肤烧伤、烫伤、糜烂(创伤、褥疮)；放射所致的皮肤、粘膜损伤；

e)老年痴呆；

本发明所述的小牛血清去蛋白注射液还可促进伤口愈合，可在皮肤移植术中应用。

对不同患者可依据不同病情给予有效治疗量的小牛血清去蛋白注射液，如每日3次，每次10ml静脉滴注。

本发明的发现存在于小牛血清中的天然多糖的生物活性远远高于小分子肽。它改变了以往对小牛血清类产品的认识，证明了多糖的生物活性比小分子肽更强，而且二者存在竞争性抑制。因此，本发明改进了制备小牛血清去蛋白注射液的方法，改变了传统的提取方法把增加小分子肽作为目标的技术方向，通过萃取和层析步骤，使多糖成为所制备的产品的主要有效成分。这种制备方法，通过萃取去除了低极性的酯类等杂质，提高纯度；通过层析去除了高极性的肽类杂质，解除其对于多糖活性的竞争性抑制，使产品生物活性进一步提高，疗效更好。本发明产品的主要有效成分是多糖，除多糖外小分子肽类物质的含量极低，因此，不容易发生聚合反应，增加了产品的稳定，同时减少了小分子肽类物质的含量，使发生过敏反应的几率大大降低，产品更加安全；并且产品的呼吸活性指数由3.0左右提高到7.0以上，产品疗效进一步提高。本发明所述的小牛血清去蛋白注射液可在脑部缺血性损害，动脉血管病，烧伤等疾病的治疗中应用。

附图说明

图1为吸光度曲线

图2为小牛血清去蛋白注射液的高效液相色谱图

具体实施方式

本发明的小牛血清去蛋白注射液的生产方法如下：

除蛋白：按照乙醇和血清比例为2：1的量向血清中加入96％的乙醇，离心(4000转/分，10分钟)后留上清弃沉淀。利用真空旋转蒸发仪，37℃，1个大气压减压除乙醇，蒸发至血清体积的60％。

粗滤：用截留分子量100000D的中空纤维柱粗滤，收集滤液。

萃取：依次加入甲苯、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每次都是除掉有机溶剂保留水溶液。

层析：将萃取所得溶液浓缩至初始血清体积的1/10，用BIO-GEL-P2凝胶层析分离。

上述BIO-GEL-P2凝胶层析的收集液，即为小牛血清去蛋白提取液。

病毒灭活：上述提取液在60℃水浴中保存10小时，杀灭病毒。

小牛血清去蛋白提取液经病毒灭活后，再经过0.2微米孔径的微孔滤膜过滤，无菌操作分装至清洗干净的5ml安瓿中，充氮封口，即得小牛血清去蛋白注射液。

下面通过实施例具体阐明本发明的技术方案。

实施例1、生产小牛血清去蛋白注射液

a)生产小牛血清去蛋白注射液

(1)除蛋白：取小牛血清1000ml(购于内蒙科左中旗锦康牛制品开发有限公司)，加入2000ml 96％的乙醇，混匀后，静置30分钟；离心(4000转/分，10分钟)后留上清，弃沉淀；利用真空旋转蒸发仪，37℃，1个大气压减压蒸馏除乙醇，蒸馏浓缩到体积600ml。

(2)粗滤：用截留分子量100000D的中空纤维柱粗滤，收集滤液；得到滤液500ml。

(3)萃取：依次加入甲苯、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，三种有机溶剂加入量均为500ml，每次萃取充分混匀后静置20分钟等待混合液分层，然后用分液漏斗分离，每次都是除掉有机溶剂保留水溶液。

(4)层析：将萃取所得溶液在37℃，1个大气压减压蒸馏浓缩至100ml备用；用BIO-GEL-P2凝胶层析分离(按照凝胶说明书将胶处理好，灌柱平衡)，层析柱长150cm，直径4.5cm，胶床高度124cm；将上述浓缩液100ml加到胶床上，待其完全渗到胶面以下，连接流动相；以纯化水作为流动相，流速40ml/h；用自动馏分收集器收集层析液，20ml/管，通过紫外分光光度计监测层析液吸光度，检测波长为280nm；所得吸光度曲线如图1所示。完全收集吸光度曲线上的第二吸收峰(F2)10管，收集液200ml。图1中，点号表示收集洗脱液的试管。

(5)病毒灭活：上述收集液在60℃水浴中保存10小时，即得小牛血清去蛋白提取液。

小牛血清去蛋白提取液再经过0.2微米孔径的微孔滤膜过滤，无菌操作分装至清洗干净的5ml安瓿中，充氮封口，即得小牛血清去蛋白注射液。

取上述小牛血清去蛋白注射液作为供试品溶液上样100μl，按照高效液相色谱法(《中国药典》2005年版二部附录VD)，采用凝胶色谱柱(如TSK-G2000sw柱)；流动相为pH7.0的0.1mol/L磷酸盐进行高效液相色谱分析；用示差检测器检测，记录色谱图，记录保留时间至第一主峰保留时间的2倍。以蔗糖色谱峰计算理论塔板数应不低于1000。按照面积归一法计算，主峰面积应占93.0％以上。色谱图如图2所示，主峰面积占总面积的95％，说明所得产品中主糖相对于总糖的纯度为95％。

b)小牛血清去蛋白注射液的生物活性指标的分析

选取10瓶小牛血清去蛋白注射液通过测定小分子肽含量、多糖含量和呼吸活性指标分析小牛血清去蛋白注射液生物活性指标。小分子肽含量测定采用lowry测蛋白法检测；多糖含量测定采用苯酚—硫酸比色法检测；呼吸活性检测按照如下文献方法进行，于洪儒、肖建英，促细胞代谢素注射液生物活性的实验研究，《中国新药杂志》2000年第2期。

实验结果表明，本发明的小牛血清去蛋白注射液小分子肽含量为1.17±0.02、多糖含量为0.043±0.006及呼吸活性为7.2±0.02。

c)小牛血清去蛋白注射液的稳定性

取本发明的小牛血清去蛋白注射液10支，置于人工气候箱内，在温度为50℃±2℃，相对湿度为75％±5％的环境中放置3个月，分别于第1个月、2个月、3个月取样一次，检测性状、澄明度、呼吸活性指标，检测结果与0月比较。性状用肉眼观察，呼吸活性检测按照实施例2中所述文献的方法，澄明度按照《中国药典》2005版2部的方法检测。

检测结果表明在50℃±2℃，相对湿度为75％±5％的环境中放置3个月，本发明的小牛血清去蛋白注射液仍然很稳定性，呼吸活性为7.2±0.03(0月时，呼吸活性为7.2±0.02)。

d)病毒灭活有效性测定

本发明生产的小牛血清去蛋白注射液，在病毒灭活前向其中加入脑心肌炎病毒(EMCV)和牛腹泻病毒(BVDV)为指示病毒，然后经过60℃水浴中保存10小时，通过病毒对照培养，结果显示，本发明的病毒灭活方法可以使脑心肌炎病毒滴度下降≥5.00LgTCID₅₀/0.1ml；可以使牛腹泻病毒滴度下降≥4.00LgTCID₅₀/0.1ml。因此，本发明的病毒灭活工艺能够有效灭活非脂包膜病毒和脂包膜病毒，能保证产品的安全性。

对比例、小牛血清去蛋白注射液的生产

a)生产小牛血清去蛋白注射液

(3)层析：将粗滤所得滤液在37℃，1个大气压减压蒸馏浓缩至100ml备用；用BIO-GEL-P2凝胶层析分离(按照凝胶说明书将胶处理好，灌柱平衡)，层析柱长150cm，直径4.5cm，胶床高度124cm；将上述浓缩液100ml加到胶床上，待其完全渗到胶面以下，连接流动相；以纯化水作为流动相，流速40ml/h；用自动馏分收集器收集层析液，20ml/管，通过紫外分光光度计监测层析液吸光度，检测波长为280nm；完全收集吸光度曲线上的第二吸收峰(F2)10管，收集液200ml。

(4)病毒灭活：上述收集液在60℃水浴中保存10小时，即得小牛血清去蛋白提取液。

实施例2、本发明的小牛血清去蛋白注射液的疗效

选择小白鼠常压耐缺氧能力影响实验检验本发明产品的疗效。

一、实验材料

1、实验药品：实施例1生产的小牛血清去蛋白注射液和对比例生产的小牛血清去蛋白注射液。

2、动物：昆明种一级小白鼠(购于辽宁医学院实验动物中心)，体重18～22g，雌雄各半。

3、碱石灰及250ml广口瓶。

二、实验方法

1、动物分组：选择健康的昆明种一级小白鼠60只，体重18～22g，雌雄各半，分成三组，即实验组、阳性对照组、空白对照组，每组20只。

2、实验方法：I、II、III三组分别为实验组、阳性对照组、空白对照组，每只小鼠一天给药一次，给药方式为尾静脉注射，每次0.1ml。实验组用实施例1生产的小牛血清去蛋白注射液给药；阳性对照组用对比例生产的注射液给药；空白对照组以注射用水配制的生理盐水给药。

3、各组小白鼠连续给药11天，于末次给药后30分钟将所有小白鼠放入装有10g碱石灰的250ml广口瓶中，密闭常压缺氧，观察小白鼠存活时间，小白鼠死亡后测定脑组织中葡萄糖和乳酸的含量；脑乳酸和葡萄糖含量测定按照如下文献所述方法进行：毛捷、陈劲草，GM1对大鼠脑缺血再灌注损伤的乳酸及葡萄糖含量的影响，《安徽医科大学学报》2004年39卷6期。

三、实验结果

常压缺氧小白鼠存活时间测定结果见表1；常压缺氧小白鼠脑乳酸含量测定结果见表2；常压缺氧小白鼠脑葡萄糖含量测定结果见表3。表1、2和3中的数据为平均值±标准差。

表1.常压缺氧小白鼠存活时间

表1中*表示同III组比较P<0.01；△表示同II组比较P<0.01。

表1表明，实验组和阳性对照组小白鼠存活时间均明显长于空白对照组；而实验组小白鼠存活时间又明显长于阳性对照组。

表2.常压缺氧小白鼠脑乳酸含量

表2中*表示同III组比较P<0.01；△表示同II组比较P<0.01。

表2表明，实验组和阳性对照组小白鼠脑乳酸含量明显低于空白对照组；而实验组小白鼠脑乳酸含量明显低于阳性对照组。

表3.常压缺氧小白鼠脑葡萄糖含量

表3中*表示同III组比较P<0.01；△表示同II组比较P<0.01。

表3表明，实验组和阳性对照组小白鼠脑葡萄糖含量明显高于空白对照组，实验组小白鼠脑葡萄糖含量又明显高于阳性对照组。

实验结果表明，实施例1生产的小牛血清去蛋白注射液能够明显延长常压缺氧小白鼠的存活时间，而且能够提高常压缺氧小白鼠脑葡萄糖含量并能降低脑乳酸含量，说明实施例1生产的小牛血清去蛋白注射液能够促进葡萄糖的吸收和代谢，对抗脑缺氧，抑制无氧代谢。因此实施例1生产的小牛血清去蛋白注射液对脑缺血缺氧性疾病具有确切的治疗作用，并且实施例1生产的小牛血清去蛋白注射液的稳定性优于用其他方法获得的小牛血清类产品。

Claims

1、一种小牛血清去蛋白注射液的制备方法，包括如下步骤：

1)去除小牛血清中的蛋白，然后进行粗滤，收集滤液；

3)对所述水相采用BIO-GEL-P2凝胶进行层析，以纯化水为流动相，收集280nm检测波长的吸光度曲线上的第二吸收峰，得到小牛血清去蛋白提取液，小牛血清去蛋白提取液经病毒灭活后，再经过0.2微米孔径的微孔滤膜过滤，得到小牛血清去蛋白注射液。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述病毒灭活为60℃水浴中保存10小时。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，加入的甲苯、乙酸乙酯和正丁醇的体积均大于等于所述滤液的体积。

4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述BIO-GEL-P2凝胶层析中柱床高度为120-140cm，柱的直径为4-5cm；所述纯化水的洗脱流速为40ml/h。

5、由权利要求1至4任一所述的制备方法制备的小牛血清去蛋白注射液。

6、根据权利要求5所述的小牛血清去蛋白注射液，其特征在于：所述小牛血清去蛋白注射液的活性成分为多糖，所述多糖的含量为1.0-1.2mg/ml。

7、根据权利要求6所述的小牛血清去蛋白注射液，其特征在于：所述多糖的含量为1.17mg/ml。

8、根据权利要求5或6或7所述的小牛血清去蛋白注射液，其特征在于：所述注射液中还含有小分子肽类物质；所述小分子肽类物质含量为小于等于0.05mg/ml。

9、根据权利要求8所述的小牛血清去蛋白注射液，其特征在于：所述小分子肽类物质含量为0.04mg/ml。