KR102005265B1 - 심혈관 및 뇌혈관계 질환이나 치매의 예방 또는 치료를 위한 중약 조성물, 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents
심혈관 및 뇌혈관계 질환이나 치매의 예방 또는 치료를 위한 중약 조성물, 그의 제조방법 및 용도 Download PDFInfo
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Abstract
심혈관 및 뇌혈관계 질환이나 치매를 예방 또는 치료하기 위한 중약 조성물, 및 그의 제조방법과 용도를 개시한다. 상기 조성물은 다음 중량부의 약물 원료: 즉, 1부의 인삼, 0.8 내지1.5부의 은행잎 및 0.018 내지 0.030부의 사프란으로 제조된다.
Description
본 발명은 심혈관 및 뇌혈관계 질환이나 치매의 예방 또는 치료를 위한 중약 조성물에 관한 것이며, 또한 이 중약 조성물의 제조방법과 용도도 개시한다.
심혈관 및 뇌혈관계 질환은 인간의 건강과 생명을 위협하는 주요 질환으로서 이들 질환은 높은 사망률, 높은 치사율, 높은 회복불능성 및 높은 재발률을 수반하는 것을 특징으로 한다. 최근의 통계 자료에 따르면, 중국내 심혈관 및 뇌혈관계 질환으로 인한 사망이 매해 사망자수의 약 절반에 달하고 있다. 심혈관 및 뇌혈관계 질환의 대중성은 사회의 발전 및 생활수준의 향상과 밀접한 관계가 있으며, 심적 압박감, 부적절한 식습관, 운동부족, 과도한 흡연과 음주, 비만 등은 모두 심혈관 및 뇌혈관계 질환의 원인이다. 심혈관 및 뇌혈관계 질환은 관상동맥 심장질환, 협심증, 심근경색, 혈액 중독 폐심장질환, 허혈성 뇌병증, 대뇌혈전증, 고혈압, 고지혈증 등이며, 이들 질환을 유발하는 주요 원인은 죽상 동맥경화증으로, 이는 혈관 협착이나 혈관 차단을 가져옴으로써, 결과적으로 심장 및 뇌에 대한 혈액 공급이 부족하게 되어 머리 무거움, 현기증, 두통, 가슴 답답함 및 기타 증상을 유발하며, 심한 경우 중풍 및 심근경색을 야기하고, 심혈관 허혈이 에너지 대사에 영향을 주어 젖산 축적, 칼슘 과부하, 유리 라디칼 손상과 같은 많은 변화를 일으킨다.
따라서, 심혈관 및 뇌혈관계 질환은 사람의 건강에 심각한 위해가 되므로, 조기 예방 및 적시 치료가 생명 유지에 매우 중요하다.
치매는 유기적 뇌장애에 기인한 후천적 및 지속적인 지능 손상 증후군이다. 노인에게 일어나는 치매는 다음과 같이 분류한다: 1차적 퇴행성 치매, 즉 알츠하이머병 (약어로AD); B. 혈관성 치매 (VaD); C. 복합성 치매 (AD 조합 VaD); D. 기타 치매 (픽스병, 루이소체 치매). AD 및 VaD가 치매중 주요한 2유형이다
혈관성 치매는1회 혹은 반복적인 뇌졸증과 고혈압, 고콜레스테롤, 당뇨, 흡연, 음주 등과 관계가 있으며, 기억력, 계산, 방향성 및 판단 장애, 감정 장애 및 비정상적인 행동, 더 진행된 단계에 이르면 생활력 손실까지 나타난다.
뇌경색이 치매를 유발할 수 있는지 여부는 뇌경색 병변의 크기, 개수 및 위치와 주로 관련이 있음을 연구를 통하여 시사한다. 조사 결과 경색 병변이 50 mL를 초과하는 용적일 경우, 치매 합병증을 유발할 가능성이 있고, 100 mL를 초과하면, 치매를 자주 야기하는 것으로 나타났다; 또한VaD 환자 중 경색 병변이 큰 경우가 11.2%, 경색 병변이 작은 경우는 88.8%, 다발성 병변은 97.6%에 달하는 것을 연구에서 확인하였으며, 병변이 작은 경우라도 치매가 발생할 수 있고, 특히 경색 병변의 개수가 많을수록 치매 유병률이 높은 것으로 언급하고 있다. 또한, 다수의 연구에서 뇌경색 부위가 치매에 있어 핵심변수임을 시사하며; 대부분의 보고서에서 CT에 의해 뇌실주위백질 병변 변화가 확인된 환자는 치매 유병률이 유의미하게 증가하였음을 언급하였다. Pavics는 환자의 뇌혈류 연구에서 혈관성 치매 환자의 경우 평균 반구 혈류가 유의미하게 감소하였고, 경색 부분의 관류가 정상 조직보다 훨씬 낮으며, 완전 무관류 영역이 드물다는 사실을 확인하였다; 뇌혈류와 인지범위를 비교하는 연구에서는 평균 반구 혈류가 치매의 정도와 양성적인 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 이는 VaD 혈류의 감소가 지능 활동과 밀접한 관계가 있음을 시사한다. 최근의 연구는 VaD 환자의 뇌혈류 및 전두엽이나 측두엽 같은 부위 특히 시상부나 기저핵의 당대사율이 기타 부위보다 현저하게 감소하였다는 점을 주목하였으며, 이는 VaD가 피질과 피질하부 구조 간의 연결이 단절된 것, 즉, 뇌신경 기능 간의 연결이 불완전한 것과 관계가 있을 수 있음을 암시한다; 뇌혈관 저항, 혈액 점도 및 신경호르몬 인자는 뇌혈류를 일정하게 유지하는데 있어서 직간접적으로 영향을 미칠 수 있다.
또한 연구에서 확인한 바에 따르면, 뇌허혈 손상은 캐스케이드 과정으로서, 각 단계마다 뉴우런의 퇴행성 손상을 일으키는 상이한 분자 네트워크가 유발되고; 뇌경색 발생후, 뇌혈류 방해 및 재관류가 일어나 뇌조직의 에너지 감소를 야기하며, 신경전달물질, 특히 흥분성 아미노산이 증가하여 혈류를 더욱 감소시키고, 또한 세포내 칼슘 저장부로부터 칼슘이 유출 또는 방출되어 다량의 효소가 촉발한 신호 단계를 유발하고, 일부 효소는 산소 라디칼 발생을 유도하며, 이들이 또다시 2차 메신저 역할을 하여 세포 단백질, 당, 지방산 등을 손상시키고, 경색 주변을 탈분극하여 경색부가 반영부(penumbra region)로 확대되며; 또한 유리 라디칼 및 기타 메신저가 염증성 사이토킨 및 효소의 활성화와 그에 따른 미세아교세포의 활성화로 염증을 일으키고, 결과적으로 혈관 투과도가 증가함으로써, 신경 골격을 손상시키는 한편, 2차적 손상 결과 치매로 이어진다. 또한 연구에서, 허혈성 병리상태 후 신경전달물질이 먼저 증가한 다음 감소하고, 아세틸콜린, 카테콜라민, 뉴로펩티드 같은 신경전달물질은 인지력 감퇴와 밀접한 관계가 있는 것으로 나타났다. 이들은 VaD의 병리-생리학적 과정에 관여하며, VaD의 위중도를 반영하는 중요한 지표가 될 수 있다.
최근에는, 전통적인 중국의학이 심혈관 및 뇌혈관계 길환, 노인성 치매, 특히 혈관성 치매의 치료에 특별한 장점이 있음이 입증되었으며, 전통 중국의학이 효과적이고 지속적이며 부작용이 적고, 특히 장기간의 효능 측면에서 만족스러운 효과를 제공하므로, 치료에 폭넓게 사용되고 있다. 다수의 연구 및 임상치료에서 전통 중국의학이 양호한 내성을 보이는 한편 부작용이 거의 없으므로, 환자에게 장기간 사용하기 적합하다는 특별한 장점이 확인되었다.
인삼은 성질이 따뜻하고 맛이 달며 약간 쓰고, 심장과 신장에 영양을 공급하고, 기를 북돋우며 인지력을 증가시킨다. 은행잎은 중성으로 쓰고 떫은 맛이 있으며 혈액순환을 촉진하여 울혈을 제거한다. 사프란은 중성으로 단맛이 있고, 혈액순환을 촉진하여 울혈을 제거하며 울혈과 뭉친 것을 풀어준다. 현대 약동학적 연구에서 인삼은 뇌허혈 재관류 손상 및 기억력 손상을 크게 개선할 수 있는 각종 사포닌 성분을 함유하는 사실을 다수의 실험 동물 학습에서 확인하였으며, 이러한 성분들은 정상 동물의 학습능력과 기억력을 향상시킬 수 있고, 시납토좀의 신경전달물질 흡수력을 증가시키며 신경성장인자를 향상시키는 효과를 나타낸다; 은행잎 추출물은 세포막 지질의 과산화반응을 억제하고, 혈관을 확장하며, 혈류를 증대하고 혈액의 점도를 낮추고, 혈전을 억제할 수 있으며, 항 혈소판응집, 뇌의 대사 개선, 신경세포 보호 등의 효과가 있다; 사프란은 세포외 칼슘의 유입과 세포질 망상구조로부터의 칼슘 방출, 항산화반응, 항고혈압, 동맥경화증, 뇌부종 등을 억제하는 효과를 나타내고, 또한 이는 포유류의 혈류내 산소 분압을 향상시키며, 최근에는 알코올 유발 기억 손상 방지 및 학습 효과가 있는 것으로 확인되었다.
특허 ZL02131435.7에는 치료학적 유효량의 인삼, 은행잎 및 사프란을 함유하는 것으로서, 허혈성 뇌혈관 질환 및 혈관성 치매, 노인성 치매 질환 등의 치료를 위한 중약 조성물이 개시되어 있다. 이 특허에 근거하여, 출원인은 "사일루오통 캡슐(Sailuotong Capsule)" (원상표명 "웨인나오캉(Weinaokang)")을 개발했으며, 현재 임상실험 중에 있다.
특허 WO2007118363A1 에는 이와 유사한 허혈성 뇌혈관 질환 및 노인성 치매 치료용 중약 조성물이 개시되어 있으며, 이 조성물 인삼, 은행잎, 사프란 및 콩으로 구성된다.
상술한 특허를 체계적으로 연구한 결과, 본 발명자는 특정의 성분들 및 그의 함량을 이용하면 더욱 우수한 결과를 얻을 수 있음을 발견하였다.
본 발명자는 특허 ZL02131435.7 및 WO2007118363A1에 언급된 심혈관 및 뇌혈관계 질환 및 치매의 예방 또는 치료를 위한 조성물의 구성 성분들이 갖는 효과에 대하여 체계적인 실험 연구를 수행하였으며, 이들 조성물에서 콩의 효과는 확실치 않다는 사실을 발견하였다. 본 발명자는 처방에 대한 최적의 연구를 통하여, 다음과 같은 3가지의 한방 약재 성분, 즉, 인삼, 은행잎 및 사프란만을 이용하여 WO2007118363A1의 조성물보다 우수한 약리학적 효과를 달성할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명자는 특정한 중량비율의 인삼, 은행잎 및 사프란으로 구성된 조성물이 심혈관 및 뇌혈관계 질환 및 치매, 특히 허혈성 뇌혈관 질환, 관상동맥 심장질환, 협심증 및 노인성 치매를 치료 또는 예방하는데 탁월한 효과가 있으며, 특히 혈관성 치매질환의 치료에 우수한 효과가 있음을 확인하였다. 연구에 따르면, 약제내 인삼, 은행잎 및 사프란으로 제조된 조성물의 용량을 낮출 수 있어서, 결과적으로 에너지를 절약할 수 있고 비용을 감소시킬 수 있으며, 또한 이 조성물의 장기 사용에 따른 부작용도 추가로 감소시킬 수 있다.
그러므로, 본 발명의 목적은 보다 우수한 효과를 갖는 심혈관계 질환 또는 치매의 예방이나 치료를 위한 중약 조성물, 및 그의 제조방법과 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적은 다음과 같은 해결 방법에 따라 달성된다.
심혈관 및 뇌혈관계 질환이나 치매를 예방 또는 치료하기 위한 중약 조성물은, 이 중약 조성물을 구성하는 약물 원료가 다음과 같은 중량비율의 성분들로 이루어진 약제이다:
1부의 인삼, 0.8 내지 1.5부의 은행잎, 0.018 내지 0.030 부의 사프란.
바람직하게, 중약 조성물의 구성 약물 원료는 다음과 같은 중량비율의 성분들로 이루어진 약제이다:
1 부의 인삼, 1 부의 은행잎, 0.018 내지 0.030부의 사프란.
더욱 바람직하게, 중약 조성물의 구성 약물 원료는 다음과 같은 중량비율의 성분들로 이루어진 약제이다:
1 부의 인삼, 0.9 내지 1.2 부의 은행잎, 0.020 내지 0.025 부의 사프란.
더욱 바람직하게, 중약 조성물의 구성 약물 원료는 다음과 같은 중량비율의 성분들로 이루어진 약제이다:
1부의 인삼, 1부의 은행잎, 0.020 내지 0.025 부의 사프란.
가장 바람직하게, 중약 조성물의 구성 약물 원료는 다음과 같은 중량비율의 성분들로 이루어진 약제이다:
1 부의 인삼, 1 부의 은행잎, 0.022부의 사프란.
본 발명은 상기 중약 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 중약 조성물은 다양한 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 다음 3가지의 중약재: 즉 인삼, 은행잎 및 사프란을 상술한 비율로 계량하고, 이를 혼합후 분쇄하거나, 분쇄후 혼합하여 상기 조성물을 수득한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 다음 3가지의 중약재: 즉 인삼, 은행잎 및 사프란을 상술한 비율로 계량하고, 이를 혼합후 추출하여 상기 조성물을 수득한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 중약 조성물의 제조방법은 다음의 단계들: 즉, 3가지 중약재인 인삼, 은행잎 및 사프란을 상술한 비율로 계량하는 단계; 인삼 추출물을 조제하는 단계; 은행잎 추출물을 조제하는 단계; 사프란 추출물을 조제하는 단계; 이들 인삼 추출물, 은행잎 추출물 및 사프란 추출물을 혼합하는 단계들을 포함한다.
바람직하게, 인삼 추출물 조제단계에서 수득된 주요 성분은 총 진세노사이드류이며; 은행잎 추출물 조제단계에서 수득된 주요 성분은 은행잎 총 플라보노이드류와 총 락톤류이고; 사프란 추출물 조제단계에서 수득된 주요 성분은 사프란 총 글리코사이드류이다.
상기3가지 성분의 추출물은 상기 성분들을 추출하는 종래의 추출법에 따라 조제할 수 있으며, 추출을 통한 상기 성분들의 조제 방법은 당해 분야에서 숙지되고, 예컨대 총 진세노사이드류, 은행잎 총 플라보노이드류 및 총 락톤류 등을 약전에 공지된 추출법에 따라 조제할 수 있으며, 사프란 총 글리코사이드의 추출법은 문헌 "중국 현대 응용약학(Chinese modern applied Pharmacy)" (August 2011, Vol. 28 No. 8, page 729-731)에 공지된 추출법을 채택한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 인삼 추출물 조제방법은 다음과 같다: 인삼을 분말이 되도록 분쇄한 뒤 에탄올을 이용하여 2회 환류 추출하고, 이를 여과하여 얻은 여액을 탈압축하여 상대 점도가70℃에서 1.12 내지 1.14가 될 때까지 용매를 회수하고, 생약의 2내지 6배에 해당하는 양의 물을 첨가하여 균일하게 교반한 다음 냉각 침전하고, 그의 상청액을 거대다공성(macroporous) 흡착제 수지에 붓고, 약물 담지 수지를 증류수로 먼저 세척한 뒤 에탄올로 용리하고, 에탄올 용리제를 수거 및 농축 건조함으로써, 인삼 추출물을 수득한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 은행잎 추출물 조제방법은 다음과 같다: 따뜻한 에탄올을 은행잎 조분말에 첨가하여 침지하고, 이 분말을 여과하고, 여과 잔사를 따뜻한 에탄올에 침지한 뒤 여과하고, 2회 침지 결과로 나온 여액을 혼합하고, 상대밀도가 70℃에서 1.12 내지 1.14가 될 때까지 감압 농축하고, 생약의 2배 내지 6배에 해당하는 양의 물을 첨가하고, 이를 균일하게 교반한 후 냉각 침전 및 여과하고, 이 여액을 거대다공성 흡착제 수지에 붓고, 약물 담지 수지를 증류수로 먼저 세척한 뒤 에탄올로 용리하고, 에탄올 용리제를 수거한 뒤 상대밀도가 70℃에서 1.02 내지 1.04가 될 때까지 농축하고, 이를 에틸 아세테이트: n-부틸 알코올로 추출한 뒤 추출물을 서로 혼합하고 탈압축하여 용매를 회수함으로써 은행잎 추출물을 수득한다.
본 발명의 하나의 구현예에 있어서, 사프란 추출물 조제방법은 다음과 같다: 냉각 에탄올을 사프란 생약에 첨가하여 침지하고, 이 용액을 여과하고, 냉각 에탄올을 여과 잔사에 첨가하여 침지한 뒤 다시 이를 여과하고, 2회 침지 결과로 나온 여액을 혼합 및 상대밀도가 70℃에서 1.12 내지 1.14가 될 때까지 감압 농축하고, 물을 첨가한 뒤 거대다공성 흡착제 수지에 붓고, 약물 담지 수지를 먼저 증류수로 세척한 뒤 에탄올로 용리하고, 에탄올 용리제를 상대밀도가 70℃에서 1.02 내지 1.04가 될 때까지 농축하고, 이를 농축 건조함으로써, 사프란 추출물을 수득한다.
본 발명은 또한 심혈관 및 뇌혈관계 질환 및/또는 치매의 예방이나 치료를 위한 중약 제형을 제공하며, 이 제형은 상술한 중약 조성물과 하나 이상의 약제학적 수용가능한 부형제로 구성된다.
상기 제형은 고체 제형 또는 반고체 제형, 액상 제형 또는 기체상 제형일 수 있다.
고체나 반고체 제형은 다음의 제형, 즉 정제, 환제, 연고, 승화제, 가루약제, 과립제, 좌제, 분말, 유제, 저작 약제, 캡슐 중에서 선택된다.
액상 제형은 다음의 제형, 즉 경구액, 현탁액, 시럽, 주사제, 의료 용액 및 팅크제 중에서 선택된 하나이다.
기체상 조제물은 에어로졸이나 흡입식이다.
본 발명은 또한 심혈관 및 뇌혈관계 질환 및/또는 치매의 예방이나 치료에 있어서의 중약 조성물이나 제형의 용도를 제공한다.
바람직하게, 심혈관 및 뇌혈관계 질환은 다음과 같은 질환: 즉, 허혈성 뇌혈관 질환, 관상동맥 장 질환 또는 협심증 중에서 선택된 적어도 하나이다.
바람직하게, 치매는 노인성 치매, 특히 혈관성 치매이다.
종래기술과 비교하여, 본 발명의 중약 조성물은 다음과 같은 기술적 효과를 갖는다:
(1) 본 발명의 중약 조성물 및 제형은 심혈관 및 뇌혈관계 질환이나 치매의 예방 또는 치료에 더욱 효과적이다.
(2) 약제에 함유된 본 발명의 중약 조성물의 양이 감소하므로, 비용 및 에너지를 절감한다.
(3) 본 발명의 중약 조성물은 부작용이 적고 안전성이 양호하므로 장기 사용이 가능하며, 약제에 대한 사용 전망이 밝다.
본 발명을 다음의 실시예, 비교예 및 관련 시험예의 조합으로 추가로 예시하나, 이들 실시예 및 시험예는 예시 목적일 뿐 본 발명을 제한하지는 않는다. 다음의 실시예 및 시험예에서 특정한 실험 조건이 없는 실험방법은 종래 기술의 조건에 따라서, 또는 제조업자가 권고하는 조건에 따라서 수행된다.
제 1부
: 본 발명의
중약
조성물과 제형의 제조
실시예 1
인삼 1부
은행잎 0.8부
사프란 0.018부
인삼 추출물, 은행잎 추출물 및 사프란 추출물을 각각 특허 ZL02131435.7의 실시예 1에 개시된 방법에 따라 수득하였고, 이들 3가지 추출물을 혼합한 뒤 종래 방법에 따라 과립, 캡슐 및 주사제 형태로 제조했다.
실시예 2
인삼 1부
은행잎 1.5부
사프란 0.030부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 3
인삼 1부
은행잎 1부
사프란 0.018부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 4
인삼 1부
은행잎 1부
사프란 0.030부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 5
인삼 1부
은행잎 0.9부
사프란 0.020부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 6
인삼 1부
은행잎 1.2부
사프란 0.025부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 7
인삼 1부
은행잎 1부
사프란 0.20부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 8
인삼 1부
은행잎 1부
사프란 0.025부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 9
인삼 1부
은행잎 1부
사프란 0.022부
인삼 추출물과 은행잎 추출물을 각각 중국 약전 (2010 판본, 제 1부), 367 내지 368페이지 및392 내지 393 페이지에 기록된 방법에 따라 추출하고 사프란 추출물은 문헌 "현대 중국 응용약학" (2011년 8월, Vol. 28, 8장, 729 내지 731 페이지)에 기록된 방법에 따라 추출하였으며, 이들 3가지 추출물을 혼합하여 종래방법에 따라 과립물, 캡슐 및 주사제 형태로 제조했다.
실시예 10
인삼 1부
은행잎 0.8부
사프란 0.030부
본 발명의 실시예 9의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 11
인삼 1부
은행잎 1.5부
사프란 0.018부
본 발명의 실시예 9의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 12
인삼 1부
은행잎 0.9부
사프란 0.025부
본 발명의 실시예 9의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
실시예 13
인삼 1부
은행잎 1.2부
사프란 0.02부
본 발명의 실시예 9의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
제 2부
:
비교예의
중약
조성물과 제형의 제조
비교예 1
인삼 1부
은행잎 1부
사프란 0.1부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
비교예 2
인삼 1부
은행잎 1부
사프란 0.015부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
비교예 3
인삼 1부
은행잎 1.5부
사프란 0.4부
본 발명의 실시예 1의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
비교예 4
인삼 1부
은행잎 1.9부
사프란 0.05부
본 발명의 실시예 9의 방법에 따라 이들 추출물의 혼합물 및 제제를 제조했다.
비교예 5
특허 ZL02131435.7의 실시예 1의 조성물 및 제조방법에 따라 추출물의 혼합물 및 상응하는 제형을 제조했다.
비교예 6
특허 ZL02131435.7의 실시예 2의 조성물 및 제조방법에 따라 추출물의 혼합물 및 상응하는 제형을 제조했다.
비교예 7
특허 WO2007/118363의 실시예 1의 조성물의 처방 및 제조방법에 따라 추출물의 혼합물 및 상응하는 캡슐을 제조했다.
비교예 8
특허 WO2007/118363의 실시예 2의 조성물의 처방 및 WO2007/118363의 실시예 1의 제조방법에 따라 추출물의 혼합물 및 상응하는 캡슐을 제조했다.
제 3부
: 약동학 실험
시험예
1: 실험쥐의 허혈성 심근질환 예방
1. 실험재료
바이탈 리버 동물 실험센터(Vital River Animal Experiment Center)에서 체중이 180~220g인 클린 등급의(clean grade) 건강한 수컷 와스터 쥐를 공급받았다.
본 발명의 중약 조성물과 비교예에 따른 중약 조성물 (자체 제조, 상기 3가지 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예 및 비교예에 따라 제조)은 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.15g/mL가 되도록 제조했다 (중약 조성물 초기 용량을 기준으로 계산하였다).
시약: 우레탄, 이소프로테레놀 히드로클로라이드, 염화나트륨 주사제, CK, CK-MB 키트.
기기: 생리학적 기록기 BL-420 생리신호 취득시스템, 원심분리기, 반자동 생화학 분석기.
2. 실험방법
a) 그룹 분류 및 모델 준비
시험 전 및 약제 공급 전에, 쥐에 대한 ECG 검사를 실시하여S-T 세그먼트를 제거하자 T 파동에 이상 변화 및 심장리듬 이상이 나타났다. 쥐를 무처리 대조군 및 모델군으로 랜덤하게 분류하였고, 그룹당 10마리씩 배정한 후 각각의 쥐에게 매일 1회 위관 공급했다: 무처리군에는 식염수를 공급하며, 본 발명의 중약 조성물 그룹 (실시예 1, 실시예 2, 실시예 5, 실시예6, 실시예 9, 실시예 11에서는 3g/kg/d의 용량을 공급하였고, 이 용량은 인삼, 은행잎 및 사프란의 초기 용량에 기초하여 계산하였다), 비교예 그룹 (비교예 1, 비교예 2, 비교예 3, 비교예 4, 비교예 5, 비교예 6에서는 3g/kg/d의 용량으로 약제를 공급하였고, 이 용량은 인삼, 은행잎 및 사프란의 초기용량에 기초하여 계산하였다; 비교예7 및 비교예 8에는 3g/kg/d의 용량으로 약제를 공급하였고, 이때의 용량은 인삼, 은행잎, 사프란 및 콩의 초기용량을 기초로 계산하였다), 약제는 10일 동안 계속해서 투여했으며 제 10일째는 관류 30분 후, 다음과 같은 방법에 따라 모델을 형성했다: 5ml/kg의 20% 우레탄을 각 그룹의 쥐에 복강주사로 공급하고, 가벼운 마취후 등을 고정시키고, 이소프로테레놀 히드로클로라이드를 복수의 지점에서 피하 주사하였다. 등량의 염수를 정상 대조군에 공급하고 ECG 장치를 연결하였다. 기록지 이동 속도는 50 cm/s, 표준 전압은 10 mm/mv 이었으며 모델링후 ECG 변화를 기록하였다. ECG를 판독하여 ST 세그먼트의 변화를 관찰하였다. 다음의 조건 중 하나를 심근 허혈에 대해 양성인 것으로 간주하였다: 1) S-T 세그먼트에서 상향 또는 하향 수평이동≥0.1mv; 2) T-파동이 R 파동 진행의 1/2보다 큰 것; 3) T-파동이 크고 S-T 세그먼트의 변위가 있는 것. 음성 조건의 기준은 다음과 같다: 1) S-T 세그먼트에서 사선 이동이나 수평이동<0.1mv; 2) T 파동이 일직선이고 낮거나 2가지 방향으로 변환된 것. 모델군 쥐의 ECG에서ST 세그먼트의 상승이 ≥0.1mv 이면, 성공적인 모델링을 나타내는 것으로 간주한다.
b) 실험방법:
10일 동안 연속 투여하고 마지막 위관 영양공급 뒤 30분 후에 모델을 형성했다. 모델링 전후 즉시, 5분, 10분, 20분 및 30분에 생리학적 기록기를 이용하여 ECG를 판독하고, 6시간후 채혈 및 원심분리, CK 및 CK-MB 처리후 혈청을 수득했다.
c) 통계 분석:
실험 데이터를 평균 ± 표준편차로 표시하고, 통계분석에 t 시험을 이용했다.
3. 결과
a) J 점 변위에 대한 효과
무처리군과 모델군 간에는 현저한 차이가 있었다 (P<0.01); 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹은
상이한 시간에서J 점 변위가 유의미하게 감소했으며 (P<0.05~0.01), 중약 조성물의 효과가 비교군보다 우수했다. 표 1 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
b) 이소프로테레놀 유발 급성 심근 허혈 쥐의 혈청내 CK, CK-MB에 대한 효과
무처리군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물은 현저한 차별성이 있었다: 모델링 6시간후 모델군과 비교시, 크레아틴 키나제(CK) 및 크레아틴 키나제 이소엔자임(CK-MB)이 유의미하게 감소했으며; 비교군과 비교시, 본 발명의 조성물이 더 우수한 효과를 나타냈다. 본 발명의 중약 조성물은 이소프로테레놀 유발 심근 허혈 손상 쥐에 대해 우수한 예방 효과를 나타냈다. 표 2 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
요약: 심근 허혈은 심장의 혈액 관류가 감소하는 병리적 상태를 말하며, 심장의 산소 공급 감소, 심근에너지 대사의 이상, 심장의 정상적인 작동이 지원되지 않는 결과를 가져온다. 관상동맥 심장질환이 심근 허혈의 주된 원인이면서 가장 일반적인 원인이기도 하다. 이소프로테레놀 유발 심근 허혈쥐를 대상으로 비교예의 중약 조성물과 비교시, 본 발명의 중약 조성물은 상이한 시점에서 J 점 변위를 유의미하게 감소시킬 수 있으며 (P<0.05~0.01) 또한 혈청CK 및 CK-MB를 유의미하게 감소시키고, 이에 따라 본 발명의 중약 조성물이 심근 허혈을 유의미하게 예방할 수 있으며, 비교예의 중약 조성물보다 우수한 효과를 나타내는 사실을 보여준다.
시험예
2 - 지질 감소 실험
1. 실험재료
쿤밍 생쥐, 체중18~22g, 암수컷 절반씩, 바이탈 리버 동물 실험센터에서 제공.
본 발명의 중약 조성물과 비교예의 중약 조성물 (자체 제조, 상응하는 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예 및 비교예의 방법에 따라 제조하였다)은 실험 중에에 증류수를 첨가하여 0.2g/mL가 되도록 제조했다 (조성물의 초기 용량을 기초로 계산함).
시약: 총 콜레스테롤(TC) 검사 키트: 트리글리세라이드(TG) 분석 키트
기기: B-260 형 서모스탯 수조; TDL 80-2B형 저속 원심분리기; THER-MO LABSYSTEM MK3형 마이크로플레이트 판독기.
2. 실험방법
쿤밍 생쥐를 선택하여 랜덤하게 대조군(16), 고지방 모델군(16), 본 발명의 조성물 그룹 (각 그룹당10 마리), 비교예의 그룹 (각 그룹당10마리)로 배분하고, 이 각 그룹은 암수컷을 절반씩 포함한다. 정상 대조군에는 규정식을 공급하고, 다른 그룹에는 고지방식을 공급했다 (성분 조성은 다음과 같다: 77.5% 기본먹이, 2% 콜레스테롤, 10% 라아드, 10% 난황 분말, 0.5% 소듐 데옥시콜레이트). 생쥐의 체중을 1주에 1회 측정하고 위와 같은 식이를 5주간 지속했다. 5주 후, 정상 비교군과 고지방 모델군으로부터 암수컷 각각 3마리씩 랜덤하게 선택하고, 안구를 적출 채혈하여 혈청 TC 및 TG를 측정했다. 정상 비교군의 혈청TC 및 TG은 고지방 모델군보다 낮았으며, 이러한 데이터의 차이는 유의성이 있어 고지혈증 생쥐 모델이 생성되었음을 나타낸다. 이들 생쥐를 규정 시험에 이용했다. 다음에, 표 4에 나타낸 용량에 따라 각 그룹에서 생쥐의 위에 같은 부피의 관류를 제공했다 (여기서, 본 발명의 중약 조성물, 즉, 실시예 1, 실시예 2, 실시예 5, 실시예 6, 실시예 9 및 실시예 11에서는 4g/kg/d의 용량으로 투여하였으며, 이 용량은 인삼, 은행잎 및 사프란의 초기용량에 따라 계산한 값이다; 또한 비교군, 즉, 비교예 1, 비교예 2, 비교예 3, 비교예 4, 비교예 5 및 비교예 6에서는 4g/kg/d의 용량으로 투여하였으며, 이 용량은 인삼, 은행잎 및 사프란의 초기용량에 기초하여 계산하였고; 비교예 7 및 비교예 8에서는 3g/kg/d의 용량으로 투여하였으며, 이 용량은 인삼, 은행잎, 사프란 및 콩의 초기용량에 따라 계산한 값이다). 각 그룹의 약제는 1% 소듐 카르복실메틸 셀룰로오스를 이용하여 현탁액으로 제조했다. 투여 3주 후, 모든 동물을 12시간 동안 먹이를 중단하고 체중을 측정한 후 안구를 적출하여 채혈했다. 혈액 시료를 3000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 혈청을 분리하고 총 콜레스테롤과 트리글리세라이드 키트 사용법에 따라 조작하여 TC 및 TG를 측정했다. 결과로 나온 데이터를 SPSS10.0 통계 소프트웨어로 계산하고 
로 표시했다.
3. 결과
a) 고지질 생쥐의 중량 증가에 대한 각 그룹의 약물 효과
실험을 개시할 때 각 그룹의 생쥐 체중은 약 18~20g이었고 5주간 고지방식 모델링 후의 체중은 각 그룹에서 생쥐마다 상이했다. 정상 대조군과 비교시, 고지방 모델군, 본 발명의 조성물 그룹 및 비교예의 그룹에서 체중 변화가 유의미하게 증가하였고 3 주간 투여한 후 모델군의 체중은 최고치에 달함으로써, 고지질 모델군이 생성된 것을 확인할 수 있다. 한편, 본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 중약 조성물은 이러한 고지방 모델군의 동물 체중을 모두 유의미하게 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다 (P<0.05). 또한 본 발명의 중약 조성물이 체중 감소에 있어 더 우수한 효과를 갖는다. 표 3 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05
b) 고지혈증 생쥐의 혈청 TC 및 TG에 대한 각 그룹의 약제의 효과
3주간 투여후, 각 그룹의 생쥐의 혈청 총 콜레스테롤(TC) 및 트리글리세라이드(TG)를 측정했다. 그 결과를 표 4에서 볼 수 있다.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
표 4에서, 정상 대조군과 비교하여 고지질 모델의TC 및 TG 농도가 모두 유의미하게 증가하였음을 알 수 있으며, 이는 고지질 생쥐 모델이 성공적으로 형성되었음을 가리킨다. 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹과 비교예의 그룹은 생쥐의 TC 및 TG 농도를 유의미하게 감소시킬 수 있으며, 본 발명의 중약 조성물이 비교예보다 효과가 우수했다. 이는 본 발명의 조성물의 지질 감소 효과가 비교예보다 우수했음을 나타내는 것이다.
요약: 고지혈증은 혈장내 콜레스테롤이나 트리글리세라이드의 농도가 상승한 것을 말한다.
고지혈증은 주로 콜레스테롤과 관계가 있으며, 콜레스테롤의 증가는 심혈관 및 뇌혈관계 질환, 예컨대 관상동맥 심장질환 등의 치사율을 증가시키는 가장 심각한 위험 중 하나이다. 이상지질혈증 특히, 콜레스테롤 농도의 증가시 "농축 혈액"이 되기 쉽고, 혈관벽에 퇴적하여 점차 작은 플라그를 형성한다 (즉, 소위 "죽상 경화"). 이들 "플라그"의 개수와 크기가 증가하면, 점차 혈관을 막아 혈액의 흐름을 느리게 하고 더욱 심화되면 혈류가 막힐 수 있다; 이러한 상황이 심장에서 발생하면 관상동맥 심장질환을 유발하고; 뇌에서 발생하면 심혈관 및 뇌혈관계 질환 예컨대, 뇌졸증 등을 일으키게 된다. 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물은 고지혈증 생쥐의 혈청TC 및 TG의 감소에 큰 차별성을 갖는데 (**P<0.01), 즉 본 발명의 중약 조성물은 심혈관 및 뇌혈관계 질환의 치료 및 예방에 있어서 비교예의 중약 조성물보다 우수한 효과를 갖는 것을 보여준다.
시험예
3 - 혈당 감소 실험
1. 실험재료
쿤밍 생쥐, 체중18~22g, 바이탈 리버 동물 실험센터에서 제공.
본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 중약 조성물 (자체 제조, 상응하는 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예와 비교예의 방법에 따라 제조하였다)을 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.2g/mL가 되도록 제조했다 (조성물의 초기용량에 기초하여 계산함).
시약: 알록산, 인슐린 방사선면역 키트
기기: 글루코스/혈액 케톤 기기 및 이에 부속된 테스트 용지, 전열형 항온조, 전자저울, 저속 냉장 원심분리기 및 방사선면역분석 계수기.
2. 실험방법
a) 당뇨병 모델 생쥐의 준비:
수컷 생쥐에 10주간 먹이공급 및 순응시켰다. 10마리를 랜덤하게 선택하여 정상 대조군으로 하고, 나머지 생쥐는 24시간 동안 먹이공급을 중단한 뒤 (물은 공급함), 알록산과 염수로 2% 순수액을 조제하여 200mg/kg 의 용량으로 복강 주사하여 공급하고, 72시간 후, 꼬리를 절단하여 채혈 및 혈당을 검사했다. 11.1 mmol/L 혈당의 생쥐는 당뇨병 모델 생쥐며 이를 실험에 사용했다.
b) 그룹 분류 및 투여
당뇨병 모델 생쥐를 각 그룹당 10마리씩 랜덤하게 배분하여 그룹화했다. 그룹의 혈당은 서로 유사했다. 1개 그룹은 모델 대조군이고, 6개 그룹은 본 발명의 조성물 그룹, 8개 그룹은 비교예의 그룹이었다. 그룹내 생쥐에게 각각 해당하는 약제를 위관으로 공급했고 (용량은 시험예 2와 동일했다), 상응하는 염수를 정상 대조군과 모델 대조군에 공급했으며, 체중을 규칙적으로 측정하여 공급 약제의 양을 조정했다. 21일 동안 실행 후 종료했다.
c) 지시계 검출:
실험 중에, 제0일, 제 7일, 제 14일 및 제 21일에 꼬리를 절단하여 채혈 및 혈당 검출했다. 위관 공급 종료 및 혈당 검출후 경구 내당성 시험을 행하고, 관류를 통해 생쥐에게 2.5g/kg 용량으로 당을 공급한 뒤 0분, 30분, 60분, 120분에 혈당을 검출했다. 제 22일째, 생쥐의 안와부에서 채혈하고 4℃에서 혈청을 분리한 뒤3000 rpm으로 10분간 원심분리하여, 혈청 인슐린 농도를 상기 키트의 설명서에 따라 측정했다.
실험 데이터를 SPSS 소프트웨어로 통계적으로 분석했고, 지시계의 결과를 평균±표준편차로 나타냈다. 2개 그룹을 t 시험으로 비교했다.
3. 결과
a) 알록산 고혈당 모델 생쥐의 혈당에 대한 효과
알록산 주사후, 생쥐의 혈당은 유의미하게 증가했다. 7일 동안 투여 및 14일 동안 높은 수준을 유지한 생쥐의 혈당은 정상 대조군과 큰 차이를 보였으며, 이는 알록산 유발 당뇨병 모델이 성공적으로 형성되었음을 가리킨다. 이들의 혈당을 실험 중에 높은 상태로 유지했다. 투여 7일 후 생쥐의 혈당이 감소하기 시작했으며, 14일 후에는 본 발명의 조성물 그룹의 생쥐에서 혈당이 유의미하게 감소한 반면, 모델군의 경우는 아직도 혈당이 높았다. 위관 공급 21일 후, 본 발명의 조성물 그룹이 유의미적인 차별성을 보였으며 (P<0.01), 비교예 그룹은 상기 결과와 유의미하게 상이했다 (P<0.05). 이들 결과는, 본 발명의 조성물이 혈당 감소에 더 우수한 효과가 있고, 또한 본 발명의 조성물의 혈당 감소 효과가 비교예의 그룹보다 우수한 것을 가리킨다.
경구 내당성 시험은 본 발명의 중약 조성물이 실험 생쥐의 내당성을 크게 개선시켰고 (P<0.01), 비교예 그룹도 실험 생쥐의 내당성을 유의미하게 개선할 수 있음을 입증한다 (P<0.05). 이 결과는 본 발명의 중약 조성물의 혈당 감소 효과가 비교예 그룹보다 우수한 것을 시사한다. 표 5 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
b) 알록산 당뇨병 모델 생쥐의 혈청 인슐린에 대한 효과
정상군과 비교시, 모델군 생쥐의 혈청 인슐린 농도가 유의미하게 감소했으며, 이는 알록산 복강 주사후 생쥐의 β 세포의 기능이 손상되었음을 나타내고, 결과적으로 모델이 성공적으로 형성된 것을 의미한다; 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹 및 비교예 그룹의 혈청 인슐린 농도가 다양한 수준으로 증가했으며, 구체적으로 본 발명의 중약 조성물 그룹은 매우 큰 유의미적 차이를 나타냈고 (P<0.01), 반면에 비교예 1, 2, 4, 7 및 8의 그룹들은 이보다 낮은 유의미한 차이를 나타냈으며 (P<0.05), 다른 비교예 그룹의 경우 혈청 인슐린이 증가했으나, 통계적인 유의성은 없었다. 이들 결과는 알록산 당뇨병 생쥐의 혈청 인슐린 증가에 대한 본 발명의 조성물의 효과가 비교예 그룹보다 우수했다는 사실을 시사한다. 이들 결과는 표 6에서 확인할 수 있다.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05, **P<0.01
요약: 사람들의 생활 수준 향상 및 환경적 요인의 영향에 따라 심혈관 및 뇌혈관계 질환이 있는 환자에게서 이상 당대사 발생이 증가하고 있으며, 심혈관 및 뇌혈관계 질환 환자가 이상 당대사를 동시에 갖고 있는 경우, 그 예후가 나쁠 수 있다. 심근 경색을 1회 겪었던 당뇨병 환자의 심근 경색 재발 위험은 40%를 초과한다. 또한 이상 당농도는 내피세포 기능장애, 대동맥 탄성 감소, 좌심실 비대, 경동맥 죽상 동맥경화형 플라그, 마이크로 단백뇨증 등과 같은 병리적 과정을 야기할 수 있고, 궁극적으로는 죽상 동맥경화로 진행된다. 본 발명의 중약 조성물은 알록산 고지혈증 모델 생쥐의 혈액내 혈당을 유의미하게 감소시키고, 알록산 당뇨병 생쥐의 혈청 인슐린을 개선할 수 있으며, 이는 본 발명의 중약 조성물이 심혈관 및 뇌혈관계 질환을 치료 및 예방함에 있어 양호한 효과를 갖는 것을 나타낸다.
시험예
4 -
항혈전
실험
1. 실험재료
SD 쥐, 체중 180.0~220.0g, 암수컷, 바이탈 리버 동물 실험센터 공급, 동물실험 전 1주일 동안 동물 사육실에서 쥐에게 먹이공급 및 순응시켰다 (사육실 온도 제어함).
본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 중약 조성물 (자체 제조, 상응하는 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예와 비교예의 방법에 따라 제조하였다)을 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.15g/mL가 되도록 제조했다 (조성물의 초기용량에 기초하여 계산함).
아스피린: 백색 정제, 50mg/편, 중국제약 상하이 지사 공급. 펜토바르비탈 소듐: 백색 분말, 중국제약 (그룹) 상하이 화학시약사에서 공급한 것으로, 사용시 염수를 이용하여 0.8% 수용액으로 제형화했다. 헤파린: 백색 분말, 125u/mg, 중국제약 (그룹) 상하이 화학시약사에서 공급한 것으로, 사용시 염수를 이용하여 0.1% 용액으로 제형화했다. 시트르산 나트륨: 중국제약 공업사, 남서부 제약공장 중 한 곳에서 공급한 것으로, 염수를 이용하여 3.8% 용액으로 제형화했다. ADP: 시그마사에서 공급한 것으로, pH 7.4의 인산염 완충액을 사용시 200μmol/L 용액으로 제형화했다.
MK4/HC 혈소판 계수 기기 (USA 베이커 인스트루먼트사 제작), 라보 응집측정기-153 이중채널 혈소판 응집측정기 (독일 라보 GmbHHanburg 사)
2. 실험방법
쥐를 랜덤하게 배분하여 그룹화했으며, 각 그룹은 15마리의 쥐로 구성되었다. 즉, 무처리 대조군, 아스피린 그룹(1% CMC-Na 용액, 분쇄 및 0.0044g/kg/d에 기초하여 0.88mg/mL의 현탁액으로 제형화함), 본 발명의 중약 조성물 그룹 (6개의 그룹, 용량은 시험예 1과 동일했다), 비교예의 그룹 (8개의 그룹, 용량은 시험예 1과 동일했다). 동일한 용적의 염수를 무처리 대조군에 공급했다. 쥐에게 1일 1회 7일 동안 투여했다.
체내 혈전 제형 실험: 7일 동안 투여 1시간 후, 그룹내 쥐에게 0.8% 펜토바르비탈 나트륨을 40mg/kg의 용량으로 복강주사하여 최면처리했다. 이 방법은 동맥-정맥 분기 혈전증법에 따른 것이다 [짱 준 티안. 현대 약리학 실험법. 베이징: 베이징 의과대학 출판. 1998; 1216-1217]. 우측 총경동맥과 좌측 외부 경정맥을 분리했다. 폴리에틸렌 플라스틱관의 3개 부분을 취했다. 이 중 중간부의 직경은 2 mm이고 길이는 약 8.5cm이었다. 플라스틱관 양 말단의 직경은 1.5 mm이고 길이는 각각 10cm 이었다. 사전에 계량하고 길이가 약 7cm인 수술용 4번 실크사를 플라스틱관의 중간부에 놓고, 길이가 0.5cm인 실크사의 일단을 관에 노출시킨 상태로 위치를 고정하였다. 또한 길이가 6.5cm인 실크사를 관 안에 유지하고 폴리에틸렌 플라스틱관에 헤파린 용액을 채웠다. 플라스틱관의 일단을 좌측 경정맥에 삽입하고 플라스틱관의 타단은 우측 총경동맥에 삽입한 다음, 혈류를 즉시 개방했다. 개방뒤 20분 후, 다시 혈류를 즉시 차단하고 중간부에 있는 실크사를 즉시 제거했다. 실크의 무게를 측정하여 이 무게를 전체 중량으로 했다. 전체 중량에서 실의 중량을 뺀 나머지가 혈전의 습식중량이다. 혈전증 억제율을 다음의 식에 따라 계산했다:
억제율 = (대조군의 혈전의 습식중량 - 실험군내 대조군의 혈전의 습식중량)/대조군의 혈전의 습식중량 × 100%. 각 그룹의 혈전의 습식중량을 통계적으로 비교했다.
혈소판 응집 억제 시험: 그룹내 쥐에게 7일 동안 투여한 뒤 1시간 후, 상기의 방법에 따라 최면처리하고, 총경동맥에 관을 삽입하여 채혈하고, 이 혈액을 3.8% 시트르산 나트륨에 1:9의 비율로 첨가하여 항응고제를 형성하고, 이를 500 rpm으로 5분간 원심분리한 후 혈장의 상부를 취하여 혈소판 농축 혈장 (PRP)을 조제하고, 나머지 부분을 다시 3,500 rpm으로 15분간 원심분리한 후 상청액을 취하여 혈소판이 희박한 혈장 (PPP)을 조제했다. PRP의 혈소판 수를 혈소판 계수기로 측정하고, PRP의 혈소판수가 약 3 × 105/㎟ 이 되도록 PPP로 조정했다. 시료관의 온도를 3분간 37 ℃ 로 유지한 뒤 5 μL ADP를 첨가하여(최종 농도 5μmol/L) 500 r/분의 속도로 교반했다. 상기 첨가 후 기록용 펜의 동작 행렬간 공간을 기록하고 응집률을 다음의 식에 따라 계산했다:
응집률 (%) = ADP 첨가일정× 100%/0~상기 일정의100%
평균 누적률과 각 실험군의 표준편차를 계산하고, 각 실험 그룹에 대하여 혈소판 응집 억제율을 다음의 식에 따라 계산했다:
응집 억제율 (%) = (대조군의 응집률 - 실험군의 응집률)/대조군의 응집률 × 100%.
3. 결과
a) 실험적 혈전에 대한 효과
무처리군과 비교시, 약제를 수용한 각 그룹에서 혈전증에 대한 유의미한 억제 효과를 나타냈으며, 대조군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹, 비교예 2 및 비교예 7의 중약 조성물 그룹내 쥐에서 혈전의 습식중량이 유의미하게 상이했고 (P<0.01), 비교예 1, 비교예 3, 비교예 4, 비교예 5, 비교예 6 및 비교예 8의 중약 조성물 그룹 (P<0.05)의 쥐에서도 혈전의 습식중량이 유의미하게 상이했으며 (P<0.05), 상기의 결과는 본 발명의 중약 조성물이 쥐의 혈전증에 미치는 효과가 비교예보다 우수했음을 나타낸다. 이들 결과는 표 7에서 확인할 수 있다.
추기: 대조군과 비교시, *P<0.05; **P<0.01
(b) 혈소판 응집에 대한 효과
실험 중에, 동물 그룹에서 수거한 혈액 시료의 혈소판 수는 약 3×105/㎟ 로서, 유의미한 차이가 없었다. 이 결과를 표 8에서 확인할 수 있다.
추기: 대조군과 비교시, *P<0.05; **P<0.01
상기 표에서, 무처리 대조군과 비교시, 약제를 수용한 그룹은 쥐의 ADP 유발 혈소판 응집에 대한 억제 효과가 있었음을 확인할 수 있다. 본 발명의 중약 조성물의 응집 억제율은 (대조군과 비교시, **P<0.01) 비교예 그룹을 초과했으며 (대조군과 비교시, *P<0.05), 이는 본 발명의 중약 조성물의 항혈소판 응집 효과가 비교예 그룹보다 우수했음을 나타낸다.
요약: 혈전은 혈액내 성분들 일부가 응집하여 덩어리를 형성하는 것으로, 혈류에 영향을 미친다. 혈전이 나타나는 이유는 주로 혈액의 성분 변화, 혈관성 내피세포 손상과 혈류 속도의 변화 등에 기인한다. 혈전은 관상동맥 혈관을 막아 혈류의 급격한 감소나 중단을 초래할 수 있으며, 해당 심장 근육의 심각한 및 지속적인 급성 허혈을 야기하여 허혈성 심근괴사를 초래할 수 있다: 더욱이, 뇌 혈관 일부가 자발적 혈전증으로 인해 뇌혈관 차단, 혈액 순환 악화, "뇌혈전" 형성 등의 결과를 가져오며, 뇌혈전증 후 혈전이 떨어져나와 혈관을 차단하고, 그로 인해 뇌경색을 초래하게 된다. 비교예의 중약 조성물과 비교시, 본 발명의 중약 조성물은 혈전의 크기 감소, 혈전증 억제 및 혈소판 응집 억제 등의 측면에서 더 우수한 효과를 나타냄으로써, 본 발명의 중약 조성물이 심혈관 및 뇌혈관계 질환의 치료 및 예방에 더욱 우수한 효과를 갖는 것을 시사한다.
시험예
5 - 스코폴라민
히드로브로마이드
유발 후천적 기억장애 모델 생쥐에 대한 효과
1. 실험재료
ICR 생쥐, 체중 18~22g, 암수컷 절반씩, 베이징 바이탈 리버 실험실 동물 기술개발사에서 공급.
본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 중약 조성물 (자체 제조, 상응하는 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예와 비교예의 방법에 따라 제조하였다)을 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.2g/mL 로 제조했다 (조성물의 초기 용량에 기초하여 계산함).
후페르진 (후페르진 A 정제), 50μg/편, 헤난 쭈린 쩡셍 파마슈티컬사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여4μg/mL로 제형화했다; 타나칸 정제 (타나칸), 표준화한 은행잎 추출물 (Egb761) 40mg/정, 프랑스 뷰포트-입센 파마슈티컬 인더스트리사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여1.5mg/mL로 제형화했다; 스코폴라민 히드로브로마이드, 0.6 mg/mL, 상하이 헤펭 파마슈티컬사 제조.
TT-2형 생쥐 점핑 프로그램 자동 제어기: 중국 의료과학 아카데미의 약리학 연구소 제작.
2. 실험방법
암수컷 각각 절반씩의 동물을 랜덤하게 배분하여 그룹을 구성했다.
추기: 무처리 대조군, 모델군, 후페르진 0.08mg/kg 그룹, 타나칸 30mg/kg 그룹, 본 발명의 중약 조성물 그룹 (6개 그룹, 용량은 시험예 2와 동일했다), 비교예 그룹 (8개 그룹, 용량은 시험예 2와 동일했다).
동물에게 1일 1회 20mL/kg 용량으로 위장내 투여하고, 무처리 대조군과 모델군에 증류수를 1일 1회 15일 동안 공급했다. 제 14일째 투여 후, 무처리 대조군 생쥐에게는 10 ml/kg 용량의 생리염수를 복강주사로 공급하고, 나머지 동물에는 스코폴라민 (6mg/kg)을 역시 주사했다. 10분 후 생쥐를 점핑 프로그램 자동 제어기에 넣고 3분간 적응시킨 뒤 전원을 켜서 전기충격을 5회 가해 자극시켰다. 자극시켰을 때, 생쥐가 전기충격을 피하기 위해 다이빙대로 점프하며 5분간 훈련시켜 기억을 갖도록 했다. 제 15일째 투여 뒤 60분 후, 이 동물을 다시 점핑 프로그램 자동 제어기에 넣었다. 점프대에 남아 있고 전기충격을 받는 횟수와 발생기간 (잠복기간)을 측정했다 (실패 횟수). 이들 결과를 통계적으로 분석했다 (t 시험). 표 9 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
3. 결과: 모델군과 비교시, 무처리 대조군의 생쥐의 5분내 실패 횟수가 유의미하게 감소하였고 (P<0.05), 잠복기간이 유의미하게 연장되었으며 (P<0.01), 이는 모델이 성공적으로 형성되었음을 나타낸다. 모델군과 비교시, 후페리진 그룹 생쥐의 5분내 실패 횟수는 유의미하게 감소했으며 (P<0.05) 잠복기간은 유의미하게 연장되었다 (P<0.01); 본 발명의 중약 조성물 그룹 생쥐도 5분내 실패 횟수가 유의미하게 감소했으며 (P<0.05) 잠복기간 역시 유의미하게 연장되었다 (P<0.01); 비교예 1 내지 4, 7 및 8의 중약 조성물 그룹 생쥐는 마찬가지로 5분내 실패 횟수가 유의미하게 감소했으며 (P<0.05) 잠복기간은 유의미하게 연장되었다 (P<0.01). 한편, 비교예 5 및 6의 중약 조성물 그룹 생쥐의 경우, 실패 횟수가 감소하는 경향을 보였고 잠복기간은 연장되는 경향을 보였으나, 통계적인 유의성은 없었다.
요약: 훈련에 앞서 M-수용체 길항제 스코폴라민을 생쥐에게 공급하였고, 이는 뇌내 아세틸콜린 함량을 감소시켜 후천적 기억력 손상을 야기할 수 있다. 본 실험에서, 상기의 화학적 손상에 기초하여 플랫폼 시험을 수행하며, 생쥐의 5분내 실패 횟수 및 잠복기간을 지표로 이용했다. 본 발명의 조성물 및 비교예의 조성물이 해당 모델에 미치는 영향을 관찰했다. 관찰 결과, 본 발명의 중약 조성물이 생쥐의 스코폴라민 유발 후천적 기억력 장애를 유의미하게 개선하며, 그 효과가 비교 그룹보다 우수함을 확인하였고, 이는 본 발명의 중약 조성물이 뇌내 아세틸콜린 함량 증가에 효과적일 수 있음을 시사한다. 또한 이 효과는 비교 그룹보다 높았다.
시험예
6 -
레제르핀
유발 후천적 기억력 장애 모델 생쥐에 대한 영향
1. 실험재료
ICR 생쥐, 체중 25~32g, 암수컷 절반씩, 베이징 바이탈 리버 실험실 동물 기술개발사에서 공급.
본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 중약 조성물 (자체 제조, 상응하는 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예와 비교예의 방법에 따라 제조하였다)을 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.2g/mL 로 제조했다 (조성물의 초기 용량에 기초하여 계산함).
후페르진 (후페르진 A 정제), 50μg/편, 헤난 쭈린 쩡셍 파마슈티컬사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여4μg/mL로 제형화했다; 타나칸 정제 (타나칸), 표준화한 은행잎 추출물 (Egb761) 40mg/정, 프랑스 뷰포트-입센 파마슈티컬 인더스트리사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여1.5mg/mL로 제형화했다; 레제르핀 주사액, 1mg/mL, 상하이 의과대학의 홍 키 파마슈티컬 팩토리사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.05mg/mL로 제형화했다.
TT-2형 생쥐 점핑 프로그램 자동 제어기: 약리학 연구소, 중국 의료과학 아카데미사 제작.
2. 실험방법
실험 그룹 구성은 시험예 5와 동일했다.
동물에게 1일 1회 20mL/kg 용량으로 위장내 투여하고, 무처리군과 모델군에 증류수를 1일 1회 15일 동안 공급했다. 제 14일째 투여 후, 무처리군 생쥐에게는 등과 목에 피하주사로 10 ml/kg 용량의 생리염수를 즉시 공급하고, 나머지 동물에는 레제르핀 히드로클로라이드 (0.5mg/kg)를 역시 등과 목에 피하주사로 공급했다. 주사 60분 후 생쥐를 점핑 프로그램 자동 제어기에 넣고 3분간 적응시킨 뒤 전원을 켜서 전기충격을 5회 가해 자극시켰다. 자극시켰을 때, 생쥐가 전기충격을 피하기 위해 다이빙대로 점프하며 5분간 훈련시켜 기억을 갖도록 했다. 제 15일째 투여 뒤 60분 후, 이 동물을 다시 점핑 프로그램 자동 제어기에 넣었다. 5분내 실패 횟수와 생쥐 잠복기간을 측정했다. 이들 결과를 통계적으로 분석했다 (t 시험).
3. 결과
모델군과 비교시, 무처리 대조군 생쥐의 5분내 실패 횟수가 유의미하게 감소했고 (P<0.05), 잠복기간은 유의미하게 연장되었으며 (P<0.01), 이는 모델이 성공적으로 형성되었음을 나타낸다. 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹 생쥐의 5분내 실패 횟수가 유의미하게 감소했고 (P<0.05), 잠복기간은 유의미하게 연장되었다 (P<0.05); 비교 약제 그룹, 후페리진 그룹 및 타나칸 그룹 생쥐의 5분내 실패 횟수도 유의미하게 감소했고 (P<0.05), 잠복기간은 연장되는 경향을 보였으나, 통계적인 유의성은 없었다. 표 10 참조.
추기:
모델군과
비교시, P<0.05; **P<0.01
요약: 이 연구에서, 레제르핀이 뇌에서 모노아민 신경전달물질의 감소와 학습 및 기억과정에 손상을 야기하므로, 훈련전에 레제르핀을 생쥐에 공급하면 기억 장애를 가져오거나 이를 지속하게 될 수 있음을 확인하였다. 5분내 실패 횟수와 실패가 발생한 잠복기간을 본 실험의 지표로 정하고, 모델에 대한 본 발명 및 비교예 그룹의 중약 조성물의 효과를 관찰하였다. 생쥐에게 본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 조성물을 위관 공급한 후, 상기 2가지 지표가 상이한 정도의 개선 효과를 얻었으며, 본 발명의 중약 조성물 그룹이 달성한 개선 효과가 비교예 그룹보다 훨씬 더 우수하다. 이는 본 발명의 중약 조성물이 동물의 후천적 기억력 장애를 개선하는 효과가 있음을 나타내며, 본 발명의 중약 조성물이 카테콜아민 신경전달물질의 함량을 증가시킬 수 있는 메카니즘에 관련되고, 또한 본 발명의 중약 조성물의 효과가 비교예 보다 우수한 것을 시사한다.
시험예
7 - 아질산나트륨 유발 후천적 연결기억력 장애 모델 생쥐에 대한 효과
1. 실험재료
ICR 생쥐, 체중 18~22g, 암수컷 절반씩, 베이징 바이탈 리버 실험실동물 기술개발사에서 공급.
본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 중약 조성물 (자체 제조, 상응하는 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예와 비교예의 방법에 따라 제조하였다)을 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.2g/mL 로 제조했다 (조성물의 초기 용량에 기초하여 계산함).
후페르진 (후페르진 A 정제), 50μg/편, 헤난 쭈린 쩡셍 파마슈티컬사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여4μg/mL로 제형화했다; 타나칸 정제 (타나칸), 표준화한 은행잎 추출물 (Egb761) 40mg/정, 프랑스 뷰포트-입센 파마슈티컬 인더스트리사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여1.5mg/mL로 제형화했다; 아질산 나트륨, 베이징 일리 정밀화학사 제조. 실험 중에 염수를 첨가하여 12 mg/mL로 제형화했다.
TT-2형 생쥐 점핑 프로그램 자동 제어기: 중국 의료과학 아카데미의 약리학연구소 제작.
2. 실험방법
실험 그룹의 구성은 시험예 5와 동일했다.
동물에게 1일 1회 20mL/kg 용량으로 위장내 투여하고, 무처리 대조군과 모델군에 증류수를 1일 1회 15일 동안 공급했다. 제 14일째 투여 60분 후, 생쥐를 점핑 프로그램 자동 제어기에 넣고 5분간 훈련시킨 뒤 전원을 켜서 전기충격을 5회 가해 자극시켰다. 처리후, 비교 그룹의 생쥐에게 등과 목의 피하주사로 10 ml/kg의 염수를 즉시 공급하였고, 나머지 동물에게는 아질산 나트륨 (120 mg/kg)을 주사했다. 제 15일째 투여 뒤 60분 후, 상기 그룹의 동물들을 다시 점핑 프로그램 자동 제어기에 넣었다. 5분내 실패 횟수 및 생쥐 잠복기간을 측정했다. 이들 결과를 통계적으로 분석했다 (t 시험).
3. 결과
모델군과 비교시, 무처리 대조군 생쥐의 5분내 실패 횟수가 유의미하게 감소했고 (P<0.05) 잠복기간이 유의미하게 연장되었으며 (P<0.01), 이는 모델이 성공적으로 형성되었음을 나타낸다. 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹 생쥐와, 후페리진 그룹 및 타나칸 그룹 생쥐의 5분내 실패 횟수가 유의미하게 감소했고 (P<0.05), 잠복기간은 유의미하게 연장되었다 (P<0.01~0.05). 비교예 7의 중약 조성물 그룹 생쥐의 5분내 실패 횟수가 유의미하게 감소했고 (P<0.05), 잠복기간은 유의미하게 연장되었다 (P<0.05). 비교예 2의 중약 조성물 그룹 생쥐의 5분내 실패 횟수도 유의미하게 감소했고 (P<0.05), 잠복기간은 연장되는 경향을 보였으나, 통계적인 유의성은 없었다. 다른 비교예 그룹들의 실패 횟수는 감소하는 경향이 있고 잠복기간도 연장되는 경향이 있었으나, 이들 모두 통계적인 유의성이 없었다. 이들 결과는 표 11에서 확인할 수 있다.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
이 연구에서, 아질산 나트륨이 헤모글로빈 변성을 일으켜 허혈증 및 뇌조직의 저산소증을 유발하고 학습 및 기억과정에 손상을 야기하므로, 훈련후 즉시 아질산 나트륨이 생쥐의 연결기억력 장애를 야기하거나 이를 지속하게 될 수 있음을 확인하였다. 이러한 화학적 손상에 근거하여, 실패 횟수와 잠복기간을 본 실험의 지표로 정하고, 모델에 대한 본 발명의 조성물 및 비교예 그룹의 조성물의 효과를 관찰하였다. 생쥐에게 본 발명의 조성물 및 비교예의 조성물을 위관 공급한 후, 상기 2가지 지표가 상이한 정도의 개선 효과를 얻었으며, 본 발명의 조성물 그룹이 달성한 개선 효과가 비교 그룹보다 훨씬 더 우수하다. 이는 본 발명의 조성물이 동물의 연결기억력 장애를 개선하는 효과가 있음을 나타내며, 본 발명의 중약 조성물이 뇌 순환 및 허혈과 뇌조직 저산소증을 개선하여 본 연구 대상인 기억력을 향상시킬 수 있고, 또한 본 발명의 중약 조성물의 효과가 비교예 보다 우수한 것을 시사한다.
시험예 8 - 쥐의 양측 총경동맥의 영구 결찰로 야기된 VaD에 대한 효과
1. 실험재료
(1) 동물: SD 쥐, 체중 250~270g, 수컷. 베이징 바이탈 리버 실험실 동물 기술개발사에서 공급.
(2) 약제:
본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 중약 조성물 (자체 제조, 상응하는 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예와 비교예의 방법에 따라 제조하였다)을 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.3g/mL 로 제조했다 (조성물의 초기 용량에 기초하여 계산함).
후페르진 (후페르진 A 정제), 50μg/편, 헤난 쭈린 쩡셍 파마슈티컬사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여6μg/mL로 제형화했다; 타나칸 정제 (타나칸), 표준화한 은행잎 추출물 (Egb761) 40mg/정, 프랑스 뷰포트-입센 파마슈티컬 인더스트리사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여2mg/mL로 제형화했다.
(3) 시약
고성능 액체: 아세틸콜린 클로라이드 (AchCl), 디소듐 히드로겐 포스페이트 (Na2HPO4), 염화물, 테트라메틸 암모늄 클로라이드 (TMACl), 옥탄술폰산 나트륨 (OSA), 티오황산 나트륨 (Na2S2O5), 에틸렌 디아민 테트라아세트산 테트라소듐 염(EDTA), 모두 HPLC 등급, 시그마사 제조 (USA); 인산 (H3PO4, 85%), 퍼콜린산 (HClO4), 모두 HPLC 등급, 피셔 사이언티픽사 제조 (USA); MB 시약, ESA사 제조 (USA).
생화학 측정법: 아세틸콜린 가수분해제 (TCHE) 키트; 수페록시드 디스무타제 (SOD) 키트; 말론디알데히드 (MDA) 키트; 단백질 정량화 (뷰렛법) 키트; 모두 난징 생물공학 지아쳉 연구소에서 공급; 뉴로펩티드 Y (NPY) 키트, PLA 종합병원 과학기술 개발센터 부설RIA 센터에서 공급; β-엔도르핀 (β-EP) 키트, 해양 RIA 기술센터에서 공급.
(4) 기기:
MORRIS 수중 미로, 중국 의료과학 아카데미 연구소 제작. FT-630G γ- 계수기, 베이징 원자력 발전소 제조. 분광광도계, UV-120-02, 시미즈사 제조 (일본). 16 채널 Coularray Cullen 어레이 전기화학 고성능 액체 크로마토그래피 및 크로마토그래피 워크스테이션, 582개의 펌프, 5600A 전기화학 검출기, 자동 샘플러 542, 5040형 고체 다공성 전극 (백금 전극, 고체 팔라듐 전극), CH150형 컬럼 오븐, 컬럼 앞 부동화처리된 효소 반응기, 컬럼 뒤 부동화처리된 효소 반응기, 제품 모두 ESA 사 제조 (USA); 컬럼 (C18150 × 3mm I.D.), ESA사 제품 (USA); 초고속 원심분리기55P-72, HITACHI사 제품 (일본); 극저온 냉장기, JOUAN사 제품 (프랑스); 주사기 미세다공막 필터: 수성 막(0.22μm), 티아진 텡다 필터 공업사 제품.
(5) 아세틸콜린 (ACh)의 함량 결정 조건
이동상: Na2HPO4 (100mmol/L), TMACl (0.5mmol/L), OSA (2.0mmo/L), MB 시약 (0.005% v/v), 증류수로 희석, 85%; PH값은 8.00이 되도록 H3PO4로 조정하고, 0.22μm 수성막에 여과시켰다.
크로마토그래피 조건: ESA582형 2원 펌프장치, ESA ACH-3 컬럼 (150 × 3mm 5μm I.D.), 컬럼 앞 부동화 처리된 ESA 효소반응기 (ESA ACH-SPR, 3cm), 유속, 0.35mL/분, 컬럼온도, 35°C.
시험조건: 5600A 전기화학 검출기; 5040형 고체 다공성 전극 (백금 반응전극, 고체상 팔라듐 기준전극) 전위: + 300mV.
2. 실험방법
샴 그룹, 모델군, 후페르진 그룹, 타나칸 그룹, 본 발명의 중약 조성물 그룹 (6개 그룹, 용량은 시험예 1과 동일했다), 비교예 그룹 (8개 그룹, 용량은 시험예 1과 동일했다).
클로랄 히드레이트 (350mg/kg)로 쥐를 마취시키고, 경부 중앙을 절개하여 양측 총경동맥을 분리 결찰한 후 (샴 그룹에서 동맥은 분리만 하고 결찰하지 않음), 상처를 봉합하여 다시 우리에 넣은 뒤 페니실린으로 4일 동안 쥐를 항감염 처리했다. 1개월 후, MORRIS 수중 미로에서 수영 실험을 행하여 학습 및 기억력 장애 경향을 보이는 쥐를 지표인 체류시간 별로 선택하고 이를 랜덤하게 그룹화했다: 모델군; 후페리진 60μg/kg 그룹; 타나칸 20mg/kg 그룹; 본 발명의 중약 조성물 그룹 및 비교예의 중약 조성물 그룹 (용량은 실험예 1과 동일했다). 1일 1회 (10mL/kg) 2개월간 쥐의 위장내 투여했다. 샴 그룹과 모델군에는 동일 용적의 증류수를 위관 공급했다. 2개월 또는 3개월 후에 모델군이 형성되었고 (투여 1개월 및 2개월 후), MORRIS 수중 미로의 체류시간을 측정했다. 최종 측정후, 복부 대동맥에서 채혈하고 즉시 뇌를 취해 좌측 반구를 액체 질소로 고형화시켰다. 얼음 용기에서 0.15M HCLO4 균질액 (뇌 중량 100mg 당 1ml를 첨가했다)으로 14000 × g 4℃에서 20분간 원심분리한 뒤 상청액을 취하여 0.22μm 막을 통해 여과했다. 10μl를 자동 샘플러에 붓고 HPLC로 Ach의 함량을 측정했다; 각 그룹에서 4개의 반구를 병리학적 검사를 위해 포르말린으로 고형화, 탈수처리, 매입, 편뜨기 (슬라이싱) 및 HE 염색하고, 6가지 뇌조직의 균질체에 대해서는 AchE, SOD 활성 및MDA 함량 (비색법)을 측정하였다; 뉴로펩티드 Y 및 혈장내 β-EP를 측정했다 (RIA). 이들 결과를 통계적으로 분석했다 (t 시험).
3. 결과
3.1 수중 미로에서 쥐의 체류시간에 대한 효과
쥐의 양측 총경동맥을 결찰하고 1개월 후, 학습 및 기억력 장애 경향은 나타났으나, 샴 그룹과 비교시, 큰 차이는 없었다. 결찰 뒤 2개월 및 3 개월 후 모델군과 비교시, 쥐의 MORRIS 수중 미로내 체류시간 측면에서, 샴 그룹의 시간이 모델군보다 유의미하게 단축되었으며 (P<0.01), 이는 모델이 성공적으로 형성되었음을 나타낸다. 2개월 내지 3개월 투여 후, 본 발명의 중약 조성물을 투여한 쥐의 학습 능력 및 기억력은 모두 유의미하게 개선되고 모델군과 비교시, 체류시간은 유의미하게 단축되었다 (P<0.01); 동일한 효과를 비교 약제 후페르진 그룹과 비교예 2, 비교예 3, 비교예 6 및 비교예 7의 중약 조성물 그룹에서도 확인하였다 (P<0.05~0.01); 투여 3 개월 후, 비교 약제 타나칸 그룹의 쥐에서 학습 및 기억력이 향상되는 경향이 있으나, 통계적인 유의성은 없었다. 이들 결과는 표 12에서 확인할 수 있다.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
3.2. AchE 활성 및 쥐의 뇌내 Ach 함량에 대한 효과
쥐의 양측 총경동맥 결찰 3개월 후 뇌내 AchE 활성이 증가했고 Ach 함량은 감소했으며, 샴 그룹과 모델군 간에 유의미한 차이가 있었다 (P<0.01); 투여 2개월 후, 본 발명의 중약 조성물 그룹에서 쥐의 뇌내 AchE 활성은 유의미하게 감소했고 (P<0.05), 쥐의 전체 뇌내Ach 함량은 유의미하게 증가했으며 (P<0.01), 동일한 효과가 비교 약제 후페르진 그룹과 비교예 7의 중약 조성물 그룹에서도 관찰되었다 (P<0.05~0.01). 한편, 다른 비교예의 중약 조성물 그룹 및 타나칸 그룹에서는 AchE 활성의 변화가 유의미하지 않았으나, Ach 함량은 유의미하게 증가했다 (P<0.05). 이들 결과는 표 13에서 확인할 수 있다.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
3.3. 뇌조직의SOD 활성 및 MDA 함량에 대한 효과
쥐의 양측 총경동맥 결찰 3개월 후, 뇌내 SOD 활성이 유의미하게 감소했고, 샴 그룹과 모델군 간에 유의미한 차이가 있으며 (P<0.01), 반면, MDA 함량에는 유의미한 변화가 없었다; 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹의 SOD 활성은 유의미하게 증가했으나, (P<0.05), 나머지 그룹들의 경우 SOD 활성에 유의미한 변화는 없었다. 모델군과 비교시, 이들 그룹의 쥐의 뇌내 MDA 함량 변화에 유의성은 없었다. 이들 결과는 표 14에서 확인할 수 있다.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
3.4 쥐의 혈장 NPY, β-EP 에 대한 효과
쥐의 양측 총경동맥 결찰 3개월 후, 혈장NPY의 함량이 유의미하게 감소했고 β-EP 함량은 유의미하게 증가했으며, 샴 그룹과 모델군 간에 유의미한 차이가 있었다 (P<0.01); 투여 2개월 후, 본 발명의 중약 조성물 그룹, 비교예 2의 중약 조성물 그룹 및 비교예 7의 중약 조성물 그룹 쥐들의 NPY 함량이 유의미하게 증가한 한편, 이들 각 그룹의 β-EP는 유의미하게 감소하였다 (모든 경우 P<0.01); 다른 비교예들의 중약 조성물 그룹 쥐들에 있어 NPY 함량은 유의미하게 증가하고 각 그룹의 β-EP는 유의미하게 감소하였다 (모든 경우 P<0.05). 비교 약제 후페르진과 타나칸에서는 효과가 뚜렷하지 않았다. 이들 결과는 표 15에서 확인할 수 있다.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
3.5 병리학적 검사
병리학적 검사에서 다음과 같은 결과를 나타냈다: 샴 그룹에서 해마 피라미드 세포층의 배열이 거의 규칙적이고 구조는 치밀했으며, 복수의 층으로 이루어지고, 세포핵막이 신선하고 매끈했다. 모델군의 경우 해마 피라미드 세포의 대부분은 일부의 배열이 느슨하고 세포 핵막에 주름이 있었으며, 핵이 상대적으로 작고, 피라미드 세포 일부의 구조가 선명하지 않고 착색이 있으며, 삼각형 또는 덩어리가 있고, 육안상 주변에 틈새가 있으며 핵이 보이지 않았다. 후페르진 그룹의 해마 피라미드 세포의 배열은 약간 느슨하나 세포핵막 대부분을 확인할 수 있고, 핵의 일부가 상대적으로 작고 어떤 일부는 보이지 않았다. 타나칸 그룹, 비교예 1 내지 3 및 7의 중약 조성물 그룹의 경우, 해마 피라미드 세포의 배열이 정돈되고, 세포 크기가 수용가능한 수준이며, 핵막이 선명하고 핵의 일부를 확인할 수 있다. 본 발명의 중약 조성물 그룹에서 해마 피라미드 세포의 배열은 규칙적이고 세포간 구조가 치밀하며, 세포핵막이 상대적으로 신선하고 핵도 수용가능한 수준이며 해당 부위에 산재되어 있고, 육안으로 볼 수 있는 주름 및 착색된 피라미드 세포가 존재했다. 비교예4의 중약 조성물 그룹의 해마 피라미드 세포의 배열은 비교적 느슨하고 세포가 비교적 작으며 일부는 착색되어 있고, 경계가 불분명하고 각각에 주름이 있으며, 삼각형과 덩어리가 있었다. 비교예 5, 6 및 8의 중약 조성물 그룹에서는 해마 피라미드 배열이 수용가능한 수준으로서 복수의 층을 확인할 수 있으나, 피라미드 세포간 경계가 선명하지 않고 핵막이 흐릿하며 핵이 작고 변성된 상태이이며 일부는 보이지 않았다.
요약:
만성 뇌허혈은 혈관성 치매(VaD), 알츠하이머병(AD), 피질하 동맥경화성 뇌병증(빈스방거병) 및 기타 질환 등을 포함하는 다수 질환의 발생에 공통적인 병리적 과정이다. 연구를 통해, 쥐의 양측 총경동맥 (2VO) 결찰 후 혈류가 지속적으로 감소하며 3주후에는 만성적인 상태가 시작되고 1개월 후에는 정상군보다 여전히 낮다는 사실이 확인되었고; 학습과 기억에 수반한 뉴우런들 예컨대 피질이나 해마는 위축, 변성 또는 탈색되며, 이는 점차 악화되는 것을 의미하고; 2VO뒤 3개월 후, 피질과 해마 M 아세틸콜린 수용체 간의 접착이 약화되며; 학습 및 기억 행동에 유의미한 장애가 있었다.
다수의 연구에서, 뇌허혈 후 세포내 Ca2 + 의 과부하, 외부도성 및 염증 작용 등을 야기할 수 있음이 확인되었으며, 이는 뉴우런 기능 및 구조의 손상을 초래한다. 뇌 허혈 및 저산소증 역시 미토콘드리아 산화성 대사의 미토콘드리아 산화 대사의 기능 장애도 유발할 수 있으며, 이는 활성 산소 라디칼, 예컨대, 활성산소 라디칼 즉 O-2, HO-2, OH-, H2O2 등을 과잉 생성하게 된다. 이들 활성산소 라디칼은 뉴우런 내의 단백질, 지질, 핵산 분자들과 반응하여 이들 분자 구조를 파괴할 수 있고, 수퍼옥사이드의 변화가 일어나 뇌세포 구조 및 기능을 손상시킬 수 있으며, 말론디알데히드 (MDA) 같은 과잉의 과산화 반응 산물을 생성한다. 해마, 안와전두피질, 측두엽 및 대뇌피질은 허혈증에 민감하였고 이들 부위가 학습 및 기억력에 밀접한 관련이 있는 뇌영역이다. 뇌허혈 후 뇌내 상기 뉴우런의 구조와 기능이 손상되면, 신경전달물질의 장애를 야기하고; 학습 및 기억에 연관하여 학습 및 기억력의 감퇴를 초래하며 치매까지도 유발한다.
본 실험의 2VO 형성 VaD 모델에서 상술한 생화학적, 병리학적 및 행동학적 변화 과정을 확인하였으며, 본 발명의 중약 조성물이 모델 동물의 뇌내 AchE 활성을 유의미하게 억제하고, Ach 함량을 증가시키며, 학습 및 기억력 손상을 개선하고, 또한 이 중약은 뇌내 DOS 활성을 크게 증가시키고 산소 유리 라다킬을 제거하여 뇌조직을 보호할 수 있는 것으로 관찰되었다. 이는 본 발명의 중약 조성물 그룹이 유의미한 VaD 치료 효과를 갖고, 이 효과가 비교예의 중약 조성물 보다 훨씬 우수한 것을 나타낸다.
VaD 환자의 혈장에서 뉴로펩티드 Y의 함량이 감소하고, β-EP 함량이 증가하는 것으로 보고되어 있으며 출원인은 2VO 형성 모델 동물의 뉴로펩티드 Y 및 β-EP 의 함량을 측정하였다. 이들 결과는 상기의 발표와 일치하는 것으로, 본 발명의 중약 조성물 그룹에서 혈장 뉴로펩티드 Y가 크게 증가하는 반면, 혈장 β-EP 은 크게 감소할 수 있는 것으로 관찰되었다.
병리학 실험에서: 모델군의 해마의 소정 영역이 느슨하게 배열되고 핵막에서 가시적 수축을 확인할 수 있으며, 핵이 비교적 작고, 피라미드 세포 일부의 구조가 선명하지 않으며 착색되고, 이들이 삼각형이거나 덩어리이고, 주변부에 가시적인 틈새가 있고, 핵이 사라져 보이지 않았다. 본 발명의 중약 조성물 그룹에서 해마 피라미드 세포는 대부분 규칙적으로 배열되고 세포간 구조가 치밀하며, 핵막이 신선하고, 병변 정도가 유의미하게 감소하였다.
시험예
9 - 생쥐에서 허혈성
재관류
및 D-갈락토스 피하주사로 유발된 학습 및 기억력 손상에 대한 효과
1. 실험재료
(1) 동물: ICR 생쥐, 체중 25~32g, 암수컷 절반씩. 베이징 바이탈 리버 실험실 동물 기술개발사 공급
(2) 약제:
본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 중약 조성물 (자체 제조, 상응하는 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예와 비교예의 방법에 따라 제조하였다)을 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.2g/mL 로 제조했다 (조성물의 초기 용량에 기초하여 계산함).
후페리진 (후페리진A 정제), 50μg/편, 헤난 쭈린 쩡셍 파마슈티컬사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여4μg/mL로 제형화했다; 타나칸 정제 (타나칸), 표준화한 은행잎 추출물 (Egb761) 40mg/정, 프랑스 뷰포트-입센 파마슈티컬 인더스트리사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여1.5mg/mL로 제형화했다; D-갈락토스, 상하이 헹씬 화학시약사 제조; 아세틸콜린 분해효소 (TCHE) 키트; 수퍼옥사이드 디스무타제(SOD) 키트; 말론디알데히드 (MDA) 키트; 글루타티온 페록시다제 (GSH-Px) 키트; 질산 (NO) 키트; 단백질 정량화 (뷰렛법) 키트; 난징 지안쳉 생명공학센터 제공.
(3) 기기:
중국 의료과학 아카데미 의약연구소에서 제작한 MORRIS 수중 미로. 시마즈사에서 제작한 분광광도계 UV-120-02.
2. 실험방법
생쥐를 암수컷 절반씩 랜덤하게 그룹화했다: 샴 그룹, 복합 모델군, D-갈락토스 그룹, 허혈 재관류 그룹, 후페리진 그룹, 타나칸 그룹, 본 발명의 중약 조성물 그룹들 (6개 그룹, 용량은 시험예 2와 동일했다), 비교예 그룹들 (8개 그룹, 용량은 시험예 2와 동일했다).
클로랄 히드레이트로 생쥐를 마취시키고, 경부를 절개하여 허혈과 재관류 수술을 하고; 양측 총경동맥을 분리 및 불독(bulldog) 클램프로 20분간 클립 고정한 뒤 2분간 느슨하게 하고, 다시 20분간 클립 고정한 뒤 느슨하게 했다. 이와 동시에 생쥐 꼬리를 절단하여 0.5 mL의 혈액을 채취하고, 뇌 허혈-재관류 상해를 반복해서 일으키고, 쥐의 상처를 봉합하여 다시 우리에 넣었다. 수술 7일 후, D-갈락토스 (100 m/kg, 10 mL/kg)를 등을 통해 피하주사로 생쥐에게 공급하고 동시에 1일 1회 (20mL/kg) 위장내 투여하고 8주간 지속했다; 샴 그룹의 경우 총경동맥을 클립 고정없이 분리하고, 동일 용적의 염수를 등을 통해 피하주사로 공급했다; D-갈락토스 그룹의 경우, 총경동맥을 클립 고정없이 분리하고, D-갈락토스 (100mg/kg, 10mL/kg)를 등을 통해 피하주사로 공급했다; 허혈 재관류 그룹에는 허혈 재관류 수술하고 동일 용적의 염수를 역시 등을 통해 피하주사로 공급했다. 샴 그룹, 복합 모델군, D-갈락토스 그룹에 동일 용적의 증류수를 위관 공급했다.
투여 8주 후, 생쥐를 MORRIS 수중 미로에서 1일 2회씩 3일 동안 훈련시키고, 제 4일에 학습 및 기억행동을 측정하고, 제 5일에 두부를 절단하여 뇌를 취했다. 염수를 이용하여 뇌를 10% 균질액으로 제형화 하고, AchE, SOD 및 GSH-Px의 활성과 뇌조직내 MDA, NO등 생화학 지표의 함량을 측정했다 (비색계). 이들 결과를 통계적으로 분석했다 (t 시험).
3. 결과
3.1 MORRIS수중 미로에서 생쥐의 학습 및 기억행동에 대한 효과
허혈-재관류 및 D-갈락토스 피하주사한 뒤 8주 후, MORRIS 수중 미로내 생쥐의 수영 체류시간 및 수영경로의 길이가 연장되고, 샴 그룹과 비교하여 유의미한 차이가 있었다 (P<0.01); 탐색방법은 대부분 엣지형이나 랜덤형이다. 샴 그룹 및 모델군과 비교시, 허혈-재관류만 수용한 그룹에서 수영 경과시간 및 수영경로의 길이에 유의미한 차이는 없었다; 복합 모델군과 비교시, 탐색방법에 유의미한 차이가 있었다 (P<0.05); 복합 모델군과 비교시, 수영 체류시간 및 수영경로의 길이와 또한 피하주사로 D-갈락토스만 수용한 그룹에 대한 탐색방법에 있어 유의미한 차이가 없었다; 이는 생쥐의 학습 및 기억 손상이 D-갈락토스 피하주사 및 허혈 재관류 손상에 의해서만 발생할 수 있으나, 이들 두가지의 조합에 따른 것보다 그 정도가 유의적으로 크지 않았음을 나타낸다; 복합 모델군과 비교시, 비교 약제 후페르진 그룹의 수용경로 길이가 감소했고, 탐색방법이 크게 개선되었다 (P<0.05-0.01); 타나칸 그룹의 수영 체류시간과 수영경로 길이가 유의미하게 감소했고 (P<0.05~0.01), 탐색방법은 크게 개선되지 않았다; 본 발명의 중약 조성물 그룹의 생쥐의 수영 체류시간 및 수영경로 길이가 유의미하게 감소했고 (P<0.05~0.01), 탐색방법이 크게 개선되었다 (P<0.01); 비교예 2, 3, 7 및 8의 그룹에서 수영 체류시간과 수영경로 길이가 모두 유의미하게 감소했고 (P<0.05~0.01), 탐색방법이 크게 개선되었다 (P<0.05~0.01); 비교예 1, 4, 5 및 6의 그룹에서 수영 체류시간과 수영경로 길이가 유의미하게 감소했고 (P<0.05), 탐색방법이 크게 개선되었다. 이들 결과는 표 16에서 확인할 수 있다.
추기:① 탐색방법: 직선형
1 점
; 경향형 2점;
엣지형
3 점
;
랜덤형
4 점
; ② 샴 그룹과 비교시, *P<0.05, **P<0.01; ③
모델군과
비교시, * P<0.05, **P<0.01.
3.2 뇌조직의SOD 및 GSH-Px 활성과 MDA 및 NO 함량에 대한 효과
허혈-재관류 및 D-갈락토스 피하주사 처리뒤 8주 후, 생쥐의 뇌조직에서 (복합군), SOD 및 GSH-Px 활성이 감소하고 MDA 및 NO 함량은 증가했으며, 샴 그룹과 비교시, 유의미한 차이가 있었다 (P<0.05~0.01); D-갈락토스만 피하주사를 통해 수용한 그룹과 비교시, 뇌조직에서 SOD 및 GSH-Px 활성이 감소하는 반면에 MDA 및 NO 함량은 증가했고, 샴 그룹과 비교시, 유의미한 차이가 있었으나, (모든 경우P<0.05~0.01), 복합 모델군과 비교시에는 유의미한 변화가 없었다; 허혈-재관류만 수용한 그룹의 경우, 샴 그룹과 비교시, 뇌조직에서SOD 및 GSH-Px 활성과 MDA 및NO 함량이 감소하고 (P<0.05), 반면에 샴 그룹과 비교시, MDA 함량은 유의미한 변화가 없었다. 복합 모델군과 비교시, 비교 약제 후페르진 그룹의 SOD 및 GSH-PX 활성과MDA 및 NO 함량에 유의미한 변화는 없었다; 타나칸 그룹에 있어서 SOD 및 GSH-PX 활성은 유의미하게 증가하는 반면, MDA 및 NO 함량은 유의미하게 증가했다 (P<0.05~0.01); 본 발명의 중약 조성물 그룹에 있어서, SOD 및 GSH-PX의 활성은 유의미하게 증가하고 MDA 및 NO 함량은 유의미하게 감소하며 (P<0.05~0.01); 비교예1 내지 3 및 7의 중약 조성물 그룹에 있어서, 생쥐의 뇌조직에서SOD 활성이 유의미하게 증가하는 반면, NO함량은 유의미하게 감소했고 (모든 경우 P<0.05), GSH-Px 활성과 MDA 함량에는 유의미한 변화가 없었다; 비교예 4 내지 6 및 8의 그룹에서, NO 함량은 유의미하게 감소하였으나, (모든 경우 P<0.05), SOD 및 GSH-PX 활성과 MDA 함량에는 유의미한 변화가 없었다. 이들 결과는 표 17에서 확인할 수 있다.
추기: 샴 그룹과 비교시, P<0.05, **P<0.01; 복합
모델군과
비교시, *P<0.05, **P<0.01
3.3 뇌조직의AchE 활성에 대한 효과
허혈-재관류 및 D-갈락토스 피하주사를 수용한 뒤 8주 후, 생쥐의 뇌조직 (복합군)에서AchE 활성이 유의미하게 증가했고, 샴 그룹과 비교시, 유의미한 차이가 있었다 (P<0.01); D-갈락토스의 피하주사만 수용한 그룹과 허혈-재관류만 수용한 그룹에 있어서, 뇌조직의 AchE 활성이 증가하고 샴 그룹과 비교하여 유의미한 차이가 있으나, (P<0.05), 복합 모델군과 비교하면 유의미한 차이가 없었다. 복합 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹, 비교예 1내지 3 및 7의 중약 조성물 그룹의 AchE 활성은 유의미한 차이가 있었다 (P<0.05); 반면에 비교예 4 내지 6 및 8의 중약 조성물 그룹의 AchE 활성은 유의미한 변화가 없었다. 이들 결과는 표 18에서 확인할 수 있다.
추기: 샴 그룹과 비교시, P<0.05, **P<0.01; 복합
모델군과
비교시, *P<0.05, **P<0.01
요약: 뇌허혈 재관류 손상의 정확한 메커니즘은 아직 명확하지 않으며, 대부분의 학자들은 산소 유리 라디칼의 증가로 인해 유발된 연속 반응과 관계가 있다고 믿고 있다. 정상 조건에서 형성되는 산소 유리 라디칼의 양은 매우 적으며 수명도 짧아 인체에 위험을 야기하지 않는다. 이때의 내인성 산소 유리 라디칼 포착제는 매우 중요한 역할을 한다. 글루타티온 페록시다제 (GSH-Px)는 촉매 히드록실 유리 라디칼에 의해 분해되는 중요한 효소이고; SOD는 대표적인 내인성 산소 유리 라디칼 포착체로서 내인성 산소 유리 라디칼의 포착력을 어느 정도 반영하고; 막 지질 분해에 의해 생성된 주요 대사물질MDA가 통상적으로 지질 과산화반응의 지표로서 이용되고, NO는 신체의 매우 중요한 메신저이며, 뇌허혈 과정에서 이중적인 역할을 하는데, 그 중 하나는 경색 범위를 감소시키면서 피질 혈액 공급을 증가시킬 수 있고, 한편으로, 허혈 및 이로 인한 신경세포 손상으로 생긴 산소 유리 라디칼과의 상승 효과를 발생할 수 있는 것이다. 뇌조직의 SOD, GSH-Px, MDA, NO 등의 농도를 모니터링 하는 것은 뇌허혈-재관류 손상 연구에 중요하다.
D-갈락토스 아급성(subacute) 노화 모델을 다음과 같은 과정에 따라 제작한다: 생쥐에게 대용량의 D-갈락토스를 피하주사로 연속 공급하여 동물의 당대사 장애를 야기한다. D-갈락토스 산화분해효소의 촉매반응 하에, 수퍼옥사이드 음이온 같은 산소 유리 라디칼을 D-갈락토스를 이용하여 생성할 수 있다. 산소 유리 라디칼은 반응성이 높으며 근육내 DNA 및 막 인지의 불포화 지방산, 단백질, 효소 등을 공격할 수 있고; 유리 라디칼 역시 지질이 과산화반응을 행하여 과산화지질(LPO)을 형성하도록 한다, MDA는 LPO을 단백질로 침전시킨 뒤의 산성 조건에서 생성되며, 활성 가교제로서 포스파티딜 에탄올아민을 이용하여 형광 염료를 신속하게 생성할 수 있고 따라서 단백질, 펩티드, 지질 등을 이용하여 층상 리포푸신(LF)을 형성하게 된다. D-갈락토스를 연속 주사하면 생쥐는 다수의 생화학 지표들의 변화, 예컨대, 뇌조직 MDA, LF 함량의 증가; 뇌SOD, 혈액GSH-Px, 에리드로사이트CAT 활성의 감소 등을 가져올 수 있다. 이들 변화는 자연 노화 변화와 일치하는 것으로 D-갈락토스가 세포와 기관의 노화를 야기할 수 있음을 입증한다. SOD, GSH-Px, CAT 활성은 간접적으로 산소 유리 라디칼을 제거하는 신체 능력을 반영하고; MDA, LF 등의 농도는 유리 라디칼이 세포를 공격하는 수준의 심각도를 간접적으로 반영한다.
본 실험에서, 뇌허혈 재관류 손상과 D-갈락토스 피하주사를 조합한 생쥐는 뇌 손상이 야기되었고, AchE 활성이 유의미하게 증가하여 인지 장애가 나타나고 공간 학습능력이 감소하였다; 또한 시험 결과 이 복합 모델 생쥐의 뇌조직에서 SOD, GSH-Px 등의 활성이 유의미하게 감소하는 반면, MDA, NO 등의 함량이 유의미하게 증가한 것을 관찰하였다. 생쥐에게 본 발명의 중약 조성물을 위관 공급한 후, 생쥐의 뇌조직에서 AchE 활성이 감소하고 SOD, GSH-Px 등의 활성이 유의미하게 향상되었으며, MDA, NO 등의 함량은 유의미하게 감소했고, 공간 학습능력이 유의미하게 향상되었다. 이는 본 발명의 중약 조성물이 반응성 산소의 발생 및 허혈 재관류에 의한 지질 과산화반응의 영향을 억제하고, 결과적으로 신경세포의 비가역성 손상을 방지하고 학습 및 기억 능력을 개선하는 것을 알 수 있다. 또한 본 발명의 중약 조성물의 효능은 비교예의 중약 조성물보다 우수하다.
시험예
10 - 다발 경색 치매 (MID) 모델 쥐에 대한 효과
1. 실험재료
(1) 동물: SD 쥐, 수컷, 체중 260-280g, 베이징 바이탈 리버 실험실 동물 기술개발사 공급
(2) 약제
본 발명의 중약 조성물 및 비교예의 중약 조성물 (자체 제조, 상응하는 추출물의 혼합물을 본 발명의 실시예와 비교예의 방법에 따라 제조하였다)을 실험 중에 증류수를 첨가하여 0.15g/mL 로 제조했다 (조성물의 초기 용량에 기초하여 계산함).
타나칸 정제 (타나칸), 표준화한 은행잎 추출물 (Egb761) 40mg/정, 프랑스 뷰포트-입센 파마슈티컬 인더스트리사 제조. 실험 중에 증류수를 첨가하여2.0mg/mL로 제형화했다; 알긴산 나트륨 미세구체 혈관성 색전술제 (KMG), 크기: 100~200μm, 베이징 쉥 이 야오 기술개발사 제조; 소마토스타틴 (SS) 방사선면역 키트, 뉴로펩티드Y (NPY), 나발 RIA 기술센터 제조; 칼시토닌 유전자-관련 펩티드 (CGRP) 방사선면역 키트, 베이징 후류이 바이오-엔지니어링사 제조, 엔도텔린 (ET), 베이징 베이 미안 동 야 바이오테크놀로지사 제조. 노레피네프린(NE), 도파민(DA), 3,4- 디히드록시페닐 아세트산 (DOPAC), 호모바닐라산 (HVA), 5- 히드록시트립타민 (5-HT), 5-히드록시 인돌 아세트산 (5-HIAA), 소듐 디히드로겐 포스페이트 (일반식 NaH2PO4), 시트르산, 티오술폰산 나트륨 (Na2S2O5), 에틸렌디아민 테트라아세트산 테트라소듐 염 (EDTA), 모두 AR 등급; 옥타술폰산 나트륨 (OSA), HPLC 등급, 이들 모두 시그마사 제품 (USA); 아세토니트릴 (ACN), 퍼콜린산 (HClO4), 이들 모두 HPLC 등급, 피셔 사이언티픽사 제품 (USA).
(3) 기기:
초고속 원심분리기 (일본 HITACHI 55P-72); 16-채널 Coularray Cullen 어레이 전기화학 고성능 액체 크로마토그래피 및 크로마토그래피 워크스테이션, 580 펌프, 5600A 전기화학 검출기, 자동 샘플러 542, ESA사 제품 (USA); 컬럼 (C1815 × 4.6mm 5μm), WATERS사 제품 (USA). 저온 냉장기, JOUAN사 제품 (프랑스); 주사기 미세다공막 필터: 수성 (0.22μm), 티안진 텡가 필터 팩토리사 제품. MORRIS 수중 미로, produced 중국 의료과학 아카데미 의학연구소 제조. FT-630Gγ-계수기, 베이징 원자력 발전소 제조.
(4) 크로마토그래피 조건:
이동상 조성물: 소듐 디히드로겐 포스페이트, 90mmol/L, 시트르산 50mmol/L, s옥타술폰산 나트륨 1.7mmol/L, 에틸렌디아민 테트라아세트산 테트라소듐 염 (EDTA) 0.05μmol/L. 용액을 0.2um 수막을 통해 여과했다. 아세토니트릴 (10%)을 여액에 첨가했다. 이동상의 유속은 0.6mL/분이고, 작업전극 1: -150mV, 작업전극 2: 450mV, 작업전극 3: 500mV, 작업전극 4: 550mV
표준 용액 제조: 원액 (100μg/mL) 0.1mol/L 퍼콜린산 및 표준물질을 이용하여 조제하고, -70℃ 의 냉장고에 보관했다. 원액을 10μg/mL로 희석하여 희석액으로 했다. 이 희석액을 표준액으로 사용할 일련의 농도를 갖는 용액으로 제형화했다. 0.15mol/L 퍼콜린산 (0.04% 소듐 메타비설파이트 및 0.04% EDTA 함유)을 작업 유체로 사용했다.
2. 실험방법
쥐에게 클로랄 히드레이트 (350mg/kg)를 복강주사하여 마취하고, 경부의 털을 깎아 감염을 방지했다. 경부 중앙을 절개하여 총경동맥, 내부 경동맥 및 외부 경동맥을 분리했다. 외부 경동맥을 결찰하고 총경동맥은 불독 클램프로 클립 고정했다. 0.1mL KMG을 외부 경동맥에서 내부 경동맥으로 주사기를 이용해 주사하고, 불독 클램프를 해제하고, 외부 경동맥을 결찰하고, 쥐의 상처를 봉합하고 우리에 넣어 먹이를 공급했다. 샵 그룹의 경우, 총경동맥, 내부 경동맥 및 외부 경동맥만을 분리하고 미세구체는 주사하지 않았다. 주사용 페니실린 나트륨을 4일 동안 항-감염 용도로 사용했다. 수술 다음날, 동물의 행동을 관찰하고 앞발의 동작에 변화가 있다면 모델이 성공적으로 생성된 것이며 (그렇지 않은 쥐는 폐기), 이들 쥐를 모델군, 타나칸 20mg/kg 그룹, 본 발명의 중약 조성물 그룹 (6개 그룹, 용량은 시험예 1과 같다), 비교예 그룹 (8개 그룹, 용량은 시험예 1과 같다)으로 배분했다.
수술 10일 후, 쥐의 위장내 투여하고 샴 그룹과 모델군에는 동량의 증류수를 1일 1회 90일 동안 위관 공급했다. 40일 및 100일 후에 모델군이 생성되었다 (투여 30일 및 90일 후). MORRIS 수중 미로내 플랫폼을 찾는 쥐의 체류시간 및 경로길이를 측정하고, 쥐에게 클로랄 히드레이트를 복강주사하여 마취시킨 뒤 복부 대동맥에서 채혈하여 항응고시키고, 혈장을 분리하고, 두부를 신속히 절단하여 뇌를 취했다. 피질, 해마, 선조체 등을 분리하여 계량하고 액체 질소로 응고시킨 뒤 -70 ℃ 온도의 냉장고에 보관했다. 각 100 mg 단위의 뇌조직에, 1 mL의 냉각 작업유체를 첨가하고, 이 혼합물을 전자 균질화기를 이용하여15초 동안 얼음수조에서 균질화 처리하고 (11000 회전수/분), 0-4℃에서14000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻은 상청액을 추출하고, 0.22 μm 막 및 주사기형 필터로 여과하고, 이 여액을 분리하여 -20° C의 냉장고에 보관했다. 매회 10 μl를 자동 샘플러에 공급하여 5-HT, 5-HIAA, NE, DA 등의 모노아민 신경전달물질의 함량을HPLC (HPLC-ECD 법)으로 측정하고, 혈장 ET, NPY, SS, CGRP 등도 측정했다 (RIA). 이들 결과를 통계적으로 분석했다 (t 시험).
3. 결과
3.1 대뇌피질, 선조체 및 해마 중량에 대한 효과
생체 미세구체 주사후, 이 미세구체가 혈류와 함께 뇌혈액 속에 들어가도록 했다. 24시간 후 이들은 주로 피질, 해마, 선조체 등의 영역내에 상이한 크기의 다발성 뇌경색을 형성할 수 있다. 100일 후, 모델군의 경우, 경색이 액화되고, 경색 괴사가 일어나며, 공동이 나타나고, 뇌조직이 수축하며, 해마가 작아지고, 피질이 얇아지며 체중도 감소했다. 모델군과 비교시, 샴 그룹은 유의미한 차이를 나타냈다 (P<0.05~0.01). 모델군과 비교하여, 본 발명의 중약 조성물 그룹 및 비교예의 중약 조성물 그룹에서 뇌의 대뇌피질 중량이 증가했으나, 통계적인 유의성은 없었으며, 본 발명의 중약 조성물 그룹의 경우, 선조체 및 해마의 중량이 크게 증가했다 (P<0.05); 한편 비교 약제 타나칸 그룹과 비교예의 중약 조성물 그룹의 경우, 뇌의 대뇌피질, 선조체 및 해마의 중량이 모두 증가했으나, 통계적인 유의성은 없었다. 표 19 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
3.2 MORRIS 수중 미로내 체류시간에 대한 효과
모델군과 비교시, 샴 모델군의 경우 수중 미로내 체류시간은 유의미하게 감소했고 (P<0.05); 투여 30일 후 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹에서 수중 미로내 체류시간이 유의미하게 증가하였으나, (P<0.05), 다른 그룹들의 경우 유의미한 변화가 없었다; 투여 90 일 후, 본 발명의 중약 조성물 그룹에서 수중 미로내 체류시간이 유의미하게 감소했고 (P<0.05~0.01), 모델군과 비교하여 비교예 1 내지 3 및 7의 그룹에서 수중 미로내 체류시간이 유의미하게 감소하나 (P<0.05), 다른 그룹들에서는 유의미한 변화가 없었다. 표 20 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
3.3 혈장ET, NPY, SS, CGRP 함량에 대한 효과
100일 후 모델이 생성되었다. 모델군과 비교시, 샴 그룹의 경우 동물의 혈장 NPY 함량이 유의미하게 증가하고ET 함량이 유의미하게 감소하며 (모든 경우 P<0.01), SS 및 CGRP 함량은 증가했으나, 통계적인 유의성은 없었다 (P<0.01); 100일 후 모델이 생성되었으며 (투여 90일 후), 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹의 경우 NPY 및 SS 함량이 유의미하게 증가하고 (P<0.01) ET 함량이 유의미하게 감소했으나, (P<0.05), CGRP 함량은 유의미한 변화가 없었다; 비교예 1 내지 3 및 7의 중약 조성물 그룹의 경우, NPY 및 SS 함량이 유의미하게 증가하고 (P<0.05~0.01) ET 함량은 감소하는 경향이 있었으나, CGRP 함량에는 유의미한 변화가 없었다; 비교예 4 내지 6 및 8의 중약 조성물 그룹에서, NPY 및 SS 함량이 증가하는 경향 및 ET 함량이 감소하는 경향을 나타냈으나, CGRP 함량에 있어서는 유의미한 변화가 없었다; 비교 약제 타나칸 그룹의 경우, NPY 및 SS 함량이 유의미하게 증가하고 (P<0.01), ET 함량이 유의미하게 감소하였으나, (P<0.01), CGRP 함량은 유의미한 변화가 없었다. 표 21 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
3.4 뇌의 모노아민 신경전달물질에 대한 효과
(1) 피질 모노아민 신경전달물질에 대한 효과
100일 후 모델이 생성되었다. 모델군과 비교시, 샴 그룹의 경우 쥐의 피질의 5-HT, 5-HIAA 함량이 유의미하게 증가하고 (P<0.05) NE및 DA 함량은 증가하였으나, 통계적 유의성은 없었다; 본 발명의 중약 조성물 그룹의 경우, 5-HT 함량이 유의미하게 증가하고 (P<0.01) 또한 DA 및 5-HIAA 함량도 모두 유의미하게 증가했다 (P<0.05); 비교예 1 내지 3 및 7의 중약 조성물 그룹에서, DA 및 5-HT 함량이 유의미하게 증가했다 (P<0.05); 비교예 4 내지 6 및 8의 중약 조성물 그룹에서, 5-HT 함량이 유의미하게 증가하나 통계학적 차이는 없었다; 비교 약제 타나칸 그룹의 경우, 5-HT 및 5-HIAA 함량이 유의미하게 증가하였으나, (P<0.01), 다른 지표들은 유의미한 변화가 없었다. 표 22 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
(2) 선조체의 모노아민 신경전달물질에 대한 효과
100일 후 모델이 생성되었다. 모델군과 비교시, 샴 그룹의 경우 쥐의 선조체의 5-HT, 5-HIAA 함량이 유의미하게 증가하고 (P<0.05), 이는 모델이 성공적으로 생성되었음을 나타낸다: 모델 생성 100일 후 (투여 90일 후), 모델군과 비교시, 본 발명의 실시예 5 및 9의 그룹에서 5-HT 함량이 유의미하게 증가하고 (P<0.05), 본 발명의 실시예 1, 2, 6 및 11의 그룹에서 5-HIAA 함량이 유의미하게 증가했다 (P<0.05); 한편 비교예의 중약 조성물 그룹과 비교 약제 타나칸 그룹의 경우, 5-HT 및 5-HIAA 함량은 유의미한 변화가 없었다. 표 23 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
(3) 해마의 모노아민 신경전달물질에 대한 효과
100일 후 (투여 90일 후) 모델이 생성되었다. 모델군과 비교시, 샴 그룹의 경우 쥐의 해마의 DA, 5-HT 및 5-HIAA 함량이 유의미하게 증가하고 (P<0.05~0.01) NE 함량이 증가하였으나, 통계적인 유의성은 없었다; 본 발명의 중약조성물 그룹에서, NE, DA 및 5-HT 함량이 유의미하게 증가하고 (P<0.05~0.01); 비교예의 중약 조성물 그룹의 경우는 5-HT 함량이 유의미하게 증가하였으나, (P<0.05); 비교 약제 타나칸 그룹의 경우 모든 지표에 있어 유의미한 변화가 없었다. 표 24 참조.
추기:
모델군과
비교시, *P<0.05; **P<0.01
요약
이 연구 결과는, 뇌경색이 치매를 유발할 수 있는지 여부가 주로 경색 병변의 크기, 개수 및 부위와 관계가 있음을 시사한다. 연구 결과, 경색 병변의 용적이 50 mL를 넘으면 치매 합병증이 생길 수 있고, 이 용적이100 mL를 초과하면 치매 합병증이 자주 야기되는 것을 확인하였다; 또한 연구에서 VaD 환자 중 경색 병변의 용적이 큰 경우가 11.2%, 경색 병변의 용적이 작은 경우는 88.8%, 다발성 경색 병변을 가진 환자가 97.6%를 차지하는 것을 발견하였고, 이는 병변 크기가 작은 경우도 치매를 야기할 수 있으며, 특히 경색 병변의 개수가 많을수록 치매 발병률이 증가하는 것을 시사한다. 또한, 치매로 유발하는 핵심 요인이 뇌경색 부위임을 시사하는 연구가 다수 있으며; 대부분의 보고서에서 환자의 뇌실주변의 백색 병변이 CT상에서 변화를 보일 경우 치매 발병률이 유의미하게 증가하였음을 언급하고 있다. 다발성 경색 치매 (MID) 모델에 기초한 연구는 VaD 약물치료의 효용성을 결정하는 가이드라인을 제공한다.
학습과 기억에 관한 뇌의 메커니즘은 주로 신경생리학적 메커니즘과 신경화학적 메커니즘을 포함하며, 신경생리학적 메커니즘은 뇌의 기억 위치 및 이에 수반하는 생체전기 활성 경로에 초점을 두고 있으며, 신경화학적 메커니즘은 주로 신경전달물질, 뉴로펩티드 및 생물학적 대분자가 학습과 기억에 미치는 영향과 이들의 관계를 설명한다. 뉴로펩티드는 일반적으로 신경조직에 존재하고 신경게 기능에 일조하는 내인성 활성물질을 말하며, 특수한 정보 재료의 일종이다. 저함량, 고활성, 광범위하고도 복잡한 영향을 특징으로 하며, 신체의 다양한 생리학적 기능, 예컨대, 통증, 수면, 감정, 학습과 기억, 그외 신경계 자체의 분화와 전개를 조절한다. 이들은 모두 뉴로펩티드에 의해 조절된다. 소마토스타틴(SS)은 신경계에 광범위하게 분포된 신경활성 펩티드이며, 최고함량의 SS가 시상하부와 대뇌피질 및 해마에 존재하고, 이러한 분포는 인지기능 조절과 관계가 있다. 뇌내의 SS는 학습 및 기억의 양성 조절 역할을 하며, 학습 및 기억 조절을 위한 SS는: 칼슘 유입 증가가 야기되는 SS 신경의 흥분을 통한 직접 경로 및 기타 신경관을 통한2차 경로이다. SS 뉴우런과 콜린성 뉴우런이 매우 근접하고 시냅스 연결을 갖고 있으며, 이것이 이들의 기능적 접촉에 대한 증거를 제공한다: SS는 학습 및 기억 작용에 영향을 미치는 아세틸콜린의 방출을 촉진하기도 한다. 엔도텔린 (엔도텔린-1, ET)은 혈관작용성 펩티드에 대한 최근의 집중되는 연구로서, 이는 신경전달물질이고 강한 혈관수축성이 있으며, 신체의 다양한 기관에 분포되어 있고, 또한 혈관수축을 야기한다. 또, ET는 출혈성, 허혈성 뇌혈관 질환 환자에서 뉴우런과 아교세포에 직접적인 손상을 일으킬 수 있고, 혈장 ET의 농도가 유의적으로 증가했으며, ET 농도 및 뇌경색 병변의 크기는 유의미한 양성의 상관관계를 갖는다. ET 는 신경세포에 작용하고, 신경세포에 칼슘이 과부하되게 하며, 유리 라디칼을 생성하고 또한 뇌 손상을 악화시킨다. 뉴로펩티드 Y (NPY)는 중추신경내 36개의 아미노산으로 구성된 활성 폴리펩티드로서 주로 대뇌피질, 해마, 시상, 시상하부 및 뇌간에 위치하며, 해마에 최고농도의 NPY가 존재하고, 이 해마가 학습 및 기억 조적의 핵심부분이다. NPY는 선경세포에서 최초로 합성되어 신경 말단부로 전달되며 근육에 저장된다. 이는 전통적인 신경전달물질 예컨대 노레피네프린, 에피네프린, γ-아미노부티르산 및 소마토스타틴 등과 함께 존재한다. NPY는 장기 기억에 밀접하게 관련할 뿐만 아니라, 단기 기억에도 자극을 준다. NPY는 기본적으로 수용체에 생물학적 역할을 한다. 최근의 연구에서 해마내 Y2 수용체의 mRNA 발현이 가장 많고, 학습 및 기억에 대한 수용체의 조정 작용이 장기 전달 강화(LTP) 메커니즘일 수 있음을 시사한다. 상술한 뉴로펩티드와 학습 및 기억 간의 상관관계와 이들과 콜린성 및 아드레날린성 신경전달물질 간의 상관관계 때문에, 혈장 뉴로펩티드와 더불어 피질, 선조체 및 헤마내 모노아민 신경전달물질 농도 및 MID 모델 쥐의 약물 효과에 대해 실험하였다.
본 실험에서, 미세구체를 경동맥에 주사하여 쥐의 다발성 경색 치매(MID) 모델을 생성했다. 그 결과, 24시간 후 신경작용성 장애가 모델 동물에서 나타났고 다발성 경색이 형성되었으며, 10일 후 경색 병변에서 뇌조직의 액화 괴사가 일어났다. 100일 후, 피질 두께가 감소하고 해마가 위축하며, 피질, 선조체 및 해마의 중량이 유의미하게 감소하였다. 또한 학습 및 기억 손상이 나타났고, 피질과 해마의 5-HT 및 5-HIAA 함량이 유의미하게 감소했으며, DA 함량이 감소하는 경향을 보였으나, 유의미한 차이는 없었다 (P<0.01). 반면에, 혈장내 NPY 함량은 유의미하게 감소하는 한편, ET 함량은 유의미하게 증가했으며, SS 및 CGRP 함량은 감소하는 경향이 있었다.
30~90일 후 본 발명의 중약 조성물을 쥐에게 위관 공급했다 (모델 생성뒤40~100일 후). 모델군과 비교시, 본 발명의 중약 조성물 그룹 쥐에서 MORRIS 수중 미로내 체류시간이 유의미하게 감소한 반면, 학습 및 기억 능력은 유의미하게 증가했다; 투여 90일 후, 해마의 중량이 유의미하게 증가하고 (P<0.05), 피질 5-HT, 5-HIAA 및 DA 함량, 선조체 5-HT 및 5-HIAA 함량, 및 해마 NE, DA 및 5-HT 함량도 모두 유의미하게 증가했으며 (P<0.05~0.01), 혈장 NPY 및 SS 함량도 유의미하게 증가했다. 반면에, ET 함량은 유의미하게 감소했다. 이는 MID 쥐의 뇌에서 학습 및 기억에 관련된 신경전달물질의 함량이 본 발명의 중약 조성물에 의해 증가할 수 있고, 따라서 본 발명의 중약 조성물은 혈관성 치매에 치료 효과가 있음을 나타낸다. 또한, 비교 실험의 데이터로부터 본 발명의 중약 조성물이 비교예의 중약 조성물보다 우수한 효과를 갖고, 이들 데이터가 통계학적 유의성이 있음을 확인할 수 있다.
Claims (25)
- 심혈관계 질환의 예방이나 치료를 위한 중약 조성물로서, 상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1 부의 인삼, 0.8 내지1.5부의 은행잎 및 0.018 내지0.030 부의 사프란. - 제 1항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1 부의 인삼, 1부의 은행잎 및 0.018 내지 0.030 부의 사프란. - 제 1항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1 부의 인삼, 0.9 내지1.2부의 은행잎 및 0.020 내지 0.025부의 사프란. - 제 3항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1 부의 인삼, 1 부의 은행잎 및 0.020 내지 0.025부의 사프란. - 제 4항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1 부의 인삼, 1부의 은행잎 및 0.022부의 사프란. - 제 1항에 있어서,
상기 심혈관계 질환은 관상동맥 심장질환 및 협심증 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 중약 조성물. - 뇌혈관계 질환의 예방이나 치료를 위한 중약 조성물로서, 상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 0.8 내지 1.5부의 은행잎 및 0.018 내지 0.030부의 사프란. - 제 7항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 1부의 은행잎 및 0.018 내지 0.030부의 사프란. - 제 7항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 0.9 내지 1.2부의 은행잎 및 0.020 내지 0.025부의 사프란. - 제 9항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 1부의 은행잎 및 0.020 내지 0.025부의 사프란. - 제 10항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 1부의 은행잎 및 0.022부의 사프란. - 제 7항에 있어서,
상기 뇌혈관계 질환은 허혈성 뇌혈관계 질환인 것을 특징으로 하는 중약 조성물. - 치매의 예방이나 치료를 위한 중약 조성물로서, 상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 0.8 내지 1.5부의 은행잎 및 0.018 내지 0.030부의 사프란. - 제 13항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 1부의 은행잎 및 0.018 내지 0.030부의 사프란. - 제 13항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 0.9 내지 1.2부의 은행잎 및 0.020 내지 0.025부의 사프란. - 제 15항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 1부의 은행잎 및 0.020 내지 0.025부의 사프란. - 제 16항에 있어서,
상기 중약 조성물은 하기 중량비의 약물 원료로 이루어진 중약 조성물 :
1부의 인삼, 1부의 은행잎 및 0.022부의 사프란. - 제 13항에 있어서,
상기 치매는 노인성 치매인 것을 특징으로 하는 중약 조성물. - 제 18항에 있어서,
상기 노인성 치매는 혈관성 치매인 것을 특징으로 하는 중약 조성물. - 인삼, 은행잎 및 사프란을 계량하는 단계, 인삼 추출물을 조제하는 단계, 은행잎 추출물을 조제하는 단계, 사프란 추출물을 조제하는 단계, 상기 인삼 추출물, 은행잎 추출물 및 사프란 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항의 중약 조성물의 제조방법.
- 제 20항에 있어서,
상기 인삼 추출물을 조제하는 단계에서 수득되는 성분은 총 진세노사이드류를 포함하고; 은행잎 추출물을 조제하는 단계에서 수득되는 성분은 은행잎 총 플라보노이드류 및 총 락톤류를 포함하며; 사프란 추출물을 조제하는 단계에서 수득되는 성분은 사프란 총 글리코사이드류를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법. - 제 21항에 있어서,
상기 인삼 추출물을 조제하는 단계는: 인삼을 분말이 되도록 분쇄하고, 에탄올로 2회 환류 추출하며, 여과하고, 이 여액을 탈압축하여 70℃에서의 상대점도가 1.12 내지 1.14가 될 때까지 용매를 회수하고, 생약의 2 내지 6배에 상당하는 양의 물을 첨가하여 균일하게 교반하고, 이를 냉각 침전시키며, 상청액을 거대다공성 흡착제 수지에 붓고, 약물 담지 수지를 증류수로 먼저 세척한 뒤 에탄올로 용리하고, 에탄올 용리제를 수거 및 농축 건조함으로써, 인삼 추출물을 수득하는 것이고;
상기 은행잎 추출물을 조제하는 단계는: 에탄올을 은행잎 조분말에 첨가하여 침지하고, 이 분말을 여과하고, 여과 잔사를 에탄올에 침지하고, 다시 여과하고, 수득된 이들 여액을 혼합하고, 상대밀도가 70℃에서 1.12 내지 1.14가 될 때까지 감압 농축하고, 생약의 2배 내지 6배에 해당하는 양의 물을 첨가하고, 이를 균일하게 교반한 후 냉각 침전 및 여과하고, 이 여액을 거대다공성 흡착제 수지에 붓고, 약물 담지 수지를 증류수로 먼저 세척한 뒤 에탄올로 용리하고, 에탄올 용리제를 수거한 뒤 상대밀도가 70℃에서 1.02 내지 1.04가 될 때까지 농축하고, 이를 에틸 아세테이트: n-부틸 알코올로 추출한 뒤 추출물을 서로 혼합하고 탈압축하여 용매를 회수함으로써, 은행잎 추출물을 수득하는 것이고,
상기 사프란 추출물을 조제하는 단계는: 에탄올을 사프란 생약에 첨가하여 침지한 다음 여과하고, 에탄올을 여과 잔사에 첨가하여 침지한 다음 다시 이를 여과하고, 이로부터 수득된 여액을 서로 혼합하고, 상대밀도가 70℃에서 1.12 내지 1.14가 될 때까지 감압 농축하고, 물을 첨가한 뒤 거대다공성 흡착제 수지에 붓고, 약물 담지 수지를 먼저 증류수로 세척한 뒤 에탄올로 용리하고, 에탄올 용리제를 상대밀도가 70℃에서 1.02 내지 1.04가 될 때까지 농축하고 이를 농축 건조함으로써, 사프란 추출물을 수득하는 것을 특징으로 하는 제조방법. - 심혈관계 질환의 예방이나 치료를 위한 중약 제형으로서, 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 중약 조성물 및 하나 이상의 약제학적 수용가능한 부형제로 이루어진 제형.
- 뇌혈관계 질환의 예방이나 치료를 위한 중약 제형으로서, 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 중약 조성물 및 하나 이상의 약제학적 수용가능한 부형제로 이루어진 제형.
- 치매의 예방이나 치료를 위한 중약 제형으로서, 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 따른 중약 조성물 및 하나 이상의 약제학적 수용가능한 부형제로 이루어진 제형.
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