CN113181178A - 盐酸去亚甲基四氢小檗碱在制备预防或治疗疼痛药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基四氢小檗碱在制备预防或治疗疼痛药物中的应用。本发明首次发现盐酸去亚甲基四氢小檗碱具有镇痛作用，其作用机制通过可以抑制TRPV1蛋白表达和抑制小鼠脊髓小胶质细胞的活化，发挥镇痛作用，增加了该化合物的新的适应症，为镇痛药物研究与开发提供新的思路。

Description

盐酸去亚甲基四氢小檗碱在制备预防或治疗疼痛药物中的 应用

技术领域：

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基四氢小檗碱在制备预防或治疗疼痛药物中的应用。

背景技术：

疼痛是由多种疾病引起的常见临床症状，主要表现为病患的一种感觉和情绪，对患者的生活质量造成严重影响。同时，疼痛与疼痛相关疾病的高发病率也是导致全球疾病负担的主要因素。疼痛以持续时间和性质可分为急性疼痛和慢性疼痛，急性疼痛持续时间短，如果急性疼痛未完全控制便会发展成慢性疼痛；慢性疼痛发作后其持续时间将会超过三个月。疼痛一般伴随着炎症的发生，炎症是免疫系统、神经元及血管/循环系统等对有害刺激(如组织损伤、病原体或刺激物)的多种生物反应。现阶段，临床上常使用的镇痛药有非甾体抗炎药(NSAIDs)和阿片类药物，但是人体在长期服用后，机体会产生很强的耐药性或成瘾性等不良反应，因此，发现副作用小的新型镇痛药对治疗疼痛是至关重要的。

瞬时受体电位香草酸亚型1(Transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)是一种位于细胞膜上的非选择性阳离子通道，钙离子渗透性高，能被辣椒素(capsaicin，CAP)激活，因此也称辣椒素受体(VR1)。TRPV1是一种重要的伤害性感受器，不仅对疼痛感知和信号传递起着重要的调控作用，而且在炎症诱发的痛觉超敏感受中也发挥着关键作用。阻断TRPV1通道可以抑制神经冲动的产生，避免痛觉超敏，从而达到镇痛效果。因此，特异性阻断TRPV1通道可作为镇痛药治疗的有效靶点，现已成为治疗疼痛的关键靶点之一。

小胶质细胞(Microglia)是一类中枢神经系统(CNS)中的巨噬细胞样细胞，当机体受到伤害并产生痛觉时，会进一步刺激小胶质细胞活化并诱导炎症反应，如环氧化酶2(COX-2)、离子钙接头蛋白1(IBA-1)的过度表达等；同时还会分泌一些促炎细胞因子，如白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)等。已有研究表明，TRPV1在脑驻留免疫细胞中也有功能性表达。TRPV1一旦被激活，将会引起小胶质细胞死亡、吞噬、分泌细胞因子以及产生活性氧等多种效应。因此，抑制小胶质细胞的活化可作为一种筛选治疗疼痛的策略。

盐酸去亚甲基四氢小檗碱，如式(Ⅰ)所示。

盐酸去亚甲基四氢小檗碱(式Ⅰ)的英文名为Demethylenetetrahydroberberine。本发明专利将其简称为DMTHB。式(Ⅰ)中的结构式为盐酸去亚甲基四氢小檗碱，为盐酸去亚甲基小檗碱的还原产物，其具有低毒、抗炎以及抗氧化等药理学活性。它的分子式：C19H21NO4,分子量为：327.2。CAS号为47346-21-4，学术名为6H-Dibenzo[a,g]quinolizine-2,3-diol,5,8,13,13a-tetrahydro-9,10-dimethoxy；6H-二苯并[a，g]喹嗪-2,3-二醇，5,8,13,13a-四氢-9,10-二甲氧基。盐酸去亚甲基四氢小檗碱可以与无机酸或者有机酸形成多种盐，如氯化盐、硫酸盐、磷酸盐、溴化盐、碘化盐、枸橼酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐等分子形式存在。目前并没有关于盐酸去亚甲基四氢小檗碱在镇痛方面研究的记载与报道，DMTHB作为一种潜在的新型镇痛药，其在镇痛方面的效果，可为后续临床上开发新型镇痛药提供一种新思路。

发明内容：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种治疗疼痛的新型化合物，特别是提供了如式(Ⅰ)所示的盐酸去亚甲基四氢小檗碱(DMTHB)作为一种新型镇痛药的应用。

本发明所用盐酸去亚甲基四氢小檗碱产品采用常规化学与分离纯化制得。本实验室采用高效液相色谱(HPLC)分析检测，其纯度达99％以上，并经过化学法、质谱法和核磁共振法分析鉴定，表明本实验室所用的盐酸去亚甲基四氢小檗碱产品化学结构正确。此项研究表明盐酸去亚甲基四氢小檗碱其纯度和化学结构符合开展体内、体外生物学活性和药理作用研究要求。

根据本发明还涉及含有作为活性成份的盐酸去亚甲基四氢小檗碱和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量％的盐酸去亚甲基四氢小檗碱。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg。

本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。

本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。

例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。

例如，将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。

本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过虑器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。

为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。

对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。

给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。

有益效果

本发明首次发现盐酸去亚甲基四氢小檗碱具有镇痛作用，其作用机制通过可以抑制TRPV1蛋白表达和抑制小鼠脊髓小胶质细胞的活化，发挥镇痛作用，增加了该化合物的新的适应症，为镇痛药物研究与开发提供新的思路。

具体而言

本发明通过经典的醋酸扭体实验和建立辣椒素诱导的舔足动物模型，观察盐酸去亚甲基四氢小檗碱(DMTHB)的镇痛效果。研究结果表明，盐酸去亚甲基四氢小檗碱(DMTHB)具有镇痛效果，可作为一种新型候选镇痛药。

本发明以ICR小鼠为动物模型，研究盐酸去亚甲基四氢小檗碱对醋酸引起的扭体模型是否具有镇痛作用。盐酸去亚甲基四氢小檗碱给药组分别口服灌胃给予10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg的剂量，罗通定对照组给予20mg/kg的剂量灌胃，模型组给予相同剂量的赋形剂灌胃，给药容积为10ml/kg，给药30min后，小鼠腹腔注射1％冰醋酸10ml/kg(现配现用)，给药结束后观察各组小鼠15min内出现的由醋酸引起的扭体次数，并计算镇痛率。在腹腔注射1％的冰醋酸后小鼠出现了典型的腹部内凹，同时伴有躯干扭曲，臀部抬高以及后肢伸长等扭体特征反应，给药组出现此类症状的小鼠数量较少，且症状较轻。实验结果分析表明，盐酸去亚甲基四氢小檗碱给药组，无论给药剂量的高低，均能显著减少小鼠的扭体次数，显示出盐酸去亚甲基四氢小檗碱在镇痛方面具有一定的作用。此外，与模型组相比，盐酸去亚甲基四氢小檗碱在低中高治疗组中展现出较好的镇痛效果，镇痛率分别为58.11％，52.45％和57.92％；甚至与罗通定阳性对照组53.40％的镇痛率相比，也显示出更好的镇痛效果。这些实验结果充分地说明了盐酸去亚甲基四氢小檗碱能有效减轻受到的伤害性疼痛。

本发明通过以ICR小鼠作为动物模型，研究盐酸去亚甲基四氢小檗碱对辣椒素诱导的小鼠舔足模型是否具有镇痛效果。盐酸去亚甲基四氢小檗碱给药组分别口服灌胃给予10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg的剂量，罗通定对照组给予20mg/kg的剂量灌胃，模型组给予相同剂量的赋形剂灌胃，给药容积为10ml/kg，给药30min后，小鼠右后爪足底注射1.6μg的辣椒素，每爪的注射量为20μL，记录5min内小鼠舔足的总时长(s)，实验记录完成且注射30分钟后处死动物小鼠。在注射辣椒素后小鼠出现了明显的长时间连续舔足的情况，给药组小鼠出现此类症状的时间较短，且症状较轻。实验结果分析表明，盐酸去亚甲基四氢小檗碱给药组，无论剂量高低，均能有效减短小鼠舔足时间的现象，表明盐酸去亚甲基四氢小檗碱对于辣椒素诱导的疼痛是具有镇痛作用。动物行为学实验的结果表明，小鼠在经过辣椒素注射后右后爪会出现红肿，且小鼠会出现长时间的舔足行为，经过盐酸去亚甲基四氢小檗碱治疗后小鼠右后爪的肿胀程度有所恢复。此外与模型组89.19±19.58％的肿胀度相比，盐酸去亚甲基四氢小檗碱给药低中高组小鼠右后爪的肿胀度只有40.69±4.17％、37.70±2.67％和34.23±4.33％，甚至与罗通定31.00±9.92％的肿胀度相比，也显示出类似的镇痛作用。这些实验结果充分的说明了盐酸去亚甲基四氢小檗碱能有效地减轻辣椒素诱导的疼痛作用。

对小鼠脊髓部位蛋白进行蛋白免疫印迹实验，其结果表明，盐酸去亚甲基四氢小檗碱可以抑制TRPV1蛋白表达，TRPV1对疼痛感知起着重要作用，因此盐酸去亚甲基四氢小檗碱能够减轻辣椒素诱导的小鼠疼痛反应。

对小鼠脊髓组织的蛋白进行免疫印迹实验，其结果表明，盐酸去亚甲基四氢小檗碱促进了Nrf2活化和HO-1表达升高，通过激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路抑制小胶质细胞的活化，从而发挥有效的镇痛作用

术语

DMTHB：盐酸去亚甲基四氢小檗碱

THP：延胡索乙素、罗通定

Capsaicin：辣椒素

TRPV1：瞬时受体电位香草酸亚型1

COX-2：环氧化酶2

IBA-1：离子钙接头蛋白

Keap1：Kelch样ECH关联蛋白1

Nrf2：核因子E2相关因子2

HO-1：血红素氧合酶1

IP：腹腔注射

IG：灌胃

附图说明

图1盐酸去亚甲基四氢小檗碱减少醋酸引起的小鼠扭体次数

图2辣椒素诱导的小鼠足部肿胀形态变化

图3盐酸去亚甲基四氢小檗碱抑制辣椒素诱导的小鼠右后爪肿胀程度

图4盐酸去亚甲基四氢小檗碱减少辣椒素诱导的小鼠舔足时间

图5辣椒素诱导的小鼠舔足模型脊髓组织病理形态变化

其中A代表正常小鼠脊髓组织HE染色图，B代表辣椒素诱导的舔足模型小鼠脊髓组织HE染色图,C代表罗通定THP 20mg/kg对照组，D代表盐酸去亚甲基四氢小檗碱10mg/kg给药组，E代表盐酸去亚甲基四氢小檗碱20mg/kg给药组，F代表盐酸去亚甲基四氢小檗碱40mg/kg给药组

图6辣椒素诱导的小鼠舔足模型爪组织病理形态变化

其中A、A1代表正常小鼠爪组织HE染色图，B、B1代表辣椒素诱导的舔足模型小鼠爪组织HE染色图,C、C1代表罗通定THP 20mg/kg给药组，D、D1代表盐酸去亚甲基四氢小檗碱10mg/kg给药组，E、E1代表盐酸去亚甲基四氢小檗碱20mg/kg给药组，F、F1代表盐酸去亚甲基四氢小檗碱40mg/kg给药组

图7盐酸去亚甲基四氢小檗碱预防辣椒素诱导的小鼠舔足模型脊髓组织蛋白免疫印迹实验结果

图8盐酸去亚甲基四氢小檗碱对辣椒素刺激的舔足模型小鼠脊髓组织蛋白免疫印迹实验结果

具体实施方式

下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1.盐酸去亚甲基四氢小檗碱(DMTHB)对醋酸扭体实验中小鼠的镇痛保护作用

方法：雌性ICR小鼠，体重20-25g，随机分为5组，每组6只。5组分别为Model组、罗通定THP对照组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)。给药组灌胃给药30min后，每组动物腹腔注射1％冰醋酸10ml/kg，观察各组小鼠15min内出现的由醋酸引起的扭体次数，并计算镇痛率。在腹腔注射1％的冰醋酸后小鼠会出现典型的腹部内凹，同时伴有躯干扭曲，臀部抬高以及后肢伸长等反应记为一次完整的扭体反应发生。

结果：如表1、图1所示，与Model组相比，各剂量的给药组小鼠扭体次数均有显著减少，由实验结果可以看出，盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)与高剂量组(40mg/kg)镇痛效果最为显著，甚至比罗通定THP对照组镇痛效果显著。各组与Model组相比均具有统计学差异。

表1盐酸去亚甲基四氢小檗碱对小鼠醋酸扭体实验的作用

(n＝6,mean±variance，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001VSModel)

实施例2.盐酸去亚甲基四氢小檗碱对辣椒素诱导小鼠舔足模型具有镇痛作用

方法：雌性ICR小鼠，体重20-25g，随机分为6组，每组6只。6组分别为正常CON组、Model组、罗通定THP对照组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)。给药组灌胃给药30min后，除正常CON组外，其余各组动物右后爪足底注射1.6μg的辣椒素，每爪注射容积为20μL，记录5min内小鼠舔足的总时长(s)，拍照并测量小鼠足部的肿胀程度。

结果：由表2、图2、图3可知，正常CON组的右后爪的形态未见异常，辣椒素刺激的Model组的右后爪明显红肿，而罗通定THP对照组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)右后爪红肿症状明显有所缓解，给药组的肿胀度显著性降低。

如图4所示，盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)舔足总时长与Model组相比，显著减少，甚至盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)与罗通定THP对照组(20mg/kg)的镇痛效果极其接近，各剂量的给药组均具有显著的镇痛作用。

表2盐酸去亚甲基四氢小檗碱对辣椒素诱导小鼠舔足模型的作用

(n＝6,mean±variance，#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001、####p<0.0001VS CON，*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001VS Model)

实施例3.盐酸去亚甲基四氢小檗碱对辣椒素诱导舔足模型脊髓组织病理改变的保护作用

方法：雌性ICR小鼠，体重20-25g，随机分为6组，每组6只。6组分别为正常CON组、Model组、罗通定THP对照组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)。给药组灌胃给药30min后，除正常CON组外，其余各组动物右后爪足底注射1.6μg的辣椒素，每爪注射容积为20μL，注射30min后处死动物，不同小鼠取脊髓组织，以10％甲醛固定，对脊髓部位HE染色进行病理学检查。

结果：对小鼠脊髓病理切片研究表明，正常CON组的脊髓区域的形态未见异常，辣椒素刺激的Model组的细胞核不清晰且细胞发生皱缩，而罗通定THP对照组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)细胞皱缩的情况均有所缓解，甚至盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)脊髓组织恢复接近于正常水平，如图5所示。

实施例4.盐酸去亚甲基四氢小檗碱对辣椒素诱导舔足模型爪组织病理改变的保护作用

方法：雌性ICR小鼠，体重20-25g，随机分为6组，每组6只。6组分别为正常CON组、Model组、罗通定THP对照组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)。给药组灌胃给药30min后，除正常CON组外，其余各组动物右后爪足底注射1.6μg的辣椒素，每爪注射容积为20μL，注射30min后处死动物，不同小鼠取右后爪组织，以10％甲醛固定，HE染色进行病理学检查。

结果：小鼠右后爪病理学研究结果表明，Model组与正常CON组相比出现了组织结构严重破坏，纹理不清晰的现象，而各给药组的组织纹理结构存在明显改善。甚至盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)的足部组织纹理恢复情况比罗通定THP对照组更好，接近于正常CON组的水平，如图6所示。

实施例5.盐酸去亚甲基四氢小檗碱抑制小鼠脊髓小胶质细胞的活化并减轻辣椒素诱导的疼痛反应

方法：雌性ICR小鼠，体重20-25g，随机分为5组，每组6只。5组分别为正常对照组(Control)、模型组(Model)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)。给药组灌胃给药30min后，除Control组外，其余各组动物右后爪足底注射1.6μg的辣椒素，每爪注射容积为20μL，注射30min后处死动物，不同小鼠取脊髓组织，提取脊髓组织蛋白后进行蛋白免疫印迹实验，检测小鼠脊髓部位TRPV1、COX-2和IBA-1蛋白的表达水平。

结果：如图7所示，对小鼠脊髓部位蛋白进行蛋白免疫印迹实验，其结果表明，Model组与Control组相比，出现了明显的TRPV1蛋白表达升高，而低、中、高剂量给药组的TRPV1蛋白表达均明显减少，盐酸去亚甲基四氢小檗碱可以抑制TRPV1蛋白表达，TRPV1对疼痛感知起着重要作用，因此盐酸去亚甲基四氢小檗碱能够减轻辣椒素诱导的小鼠疼痛反应。Model组脊髓部位的COX-2和IBA-1蛋白表达量也出现了明显的升高，表明小鼠脊髓组织的小胶质细胞被激活，而各给药组的COX-2和IBA-1蛋白表达情况均明显降低，盐酸去亚甲基四氢小檗碱可以显著抑制小鼠脊髓小胶质细胞的活化，从而达到显著的镇痛效果。

实施例6.盐酸去亚甲基四氢小檗碱通过调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路抑制小胶质细胞的活化

方法：雌性ICR小鼠，体重20-25g，随机分为5组，每组6只。5组分别为Control组、Model组、盐酸去亚甲基四氢小檗碱低剂量组(10mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱中剂量组(20mg/kg)、盐酸去亚甲基四氢小檗碱高剂量组(40mg/kg)。给药组灌胃给药30min后，除Control组外，其余各组动物右后爪足底注射1.6μg的辣椒素，每爪注射容积为20μL，注射30min后处死动物，不同小鼠取脊髓组织，提取脊髓组织蛋白后进行蛋白免疫印迹实验，检测小鼠脊髓部位Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表达水平。

结果：如图8所示，对小鼠脊髓组织的蛋白进行免疫印迹实验，其结果表明，Model组与Control组相比，出现了Keap1蛋白表达明显上调，而Nrf2及HO-1蛋白表达量减少的情况，而各剂量给药组通过抑制Keap1蛋白表达来调控Nrf2和HO-1蛋白的表达量，盐酸去亚甲基四氢小檗碱促进了Nrf2活化和HO-1表达升高，通过激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路抑制小胶质细胞的活化，从而发挥有效的镇痛作用。

Claims (4)

1.盐酸去亚甲基四氢小檗碱在制备预防或治疗疼痛药物中的应用，其中所述的盐酸去亚甲基四氢小檗碱的结构式为式I所示。

2.一种药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的盐酸去亚甲基四氢小檗碱及药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于所述的去亚甲基四氢小檗碱还包括硫酸盐、磷酸盐、溴化盐、碘化盐、枸橼酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐。

4.根据权利要求2的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是片剂、胶囊、丸剂、注射剂或缓释剂。

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