CN106943408B - 四甲基尿酸预防和治疗糖尿病的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了四甲基尿酸预防和治疗糖尿病的应用，在四氧嘧啶诱导的I型糖尿病模型和STZ诱导的II型糖尿病模型中，四甲基尿酸均显示出较好的降糖活性；建模前两周给药结果显示，亦有较好的预防作用。四甲基尿酸口服给药效果较好，剂量为0.5～100mg/kg范围内，具有良好的安全性和有效性，1～20mg/kg的给药剂量即可发挥良好的预防作用，非常有望开发成为防、治糖尿病的新型口服降糖药物。

Description

四甲基尿酸预防和治疗糖尿病的应用

技术领域

本发明属于制药领域，涉及四甲基尿酸在制备预防和治疗糖尿病的药物中的应用，以及在制备用于糖尿病并发症中协同控制血糖的药物的应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种代谢性疾病，它的特征是患者的血糖长期高于标准值。高血糖会造成俗称“三多一少”的症状，即多饮、多食、多尿和体重下降。如果不进行治疗，可能会引发许多并发症，其中，急性并发症包括糖尿病酮酸血症与高渗透压高血糖非酮酸性昏迷；长期并发症包括心血管疾病、中风、慢性肾脏病、糖尿病足、以及视网膜病变等等。

糖尿病有两个成因：胰脏无法生产足够的胰岛素，或者是细胞对胰岛素不敏感。在临床方面糖尿病则被分为三类：

I型糖尿病是由于身体无法生产足够的胰岛素，过去也被叫做胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus,IDDM)或是青少年糖尿病，病因目前不明。II型糖尿病始于胰岛素抵抗作用异常，随着病情进展胰岛素的分泌亦可能渐渐变得不足。这个类型过去被称为非胰岛素依赖型糖尿病(non insulin-dependent diabetes mellitus,NIDDM)或成人型糖尿病，病因是体重过重或缺乏运动，另据最新研究显示其与身体长期发炎反应有关。III型妊娠糖尿病也是常见的糖尿病种类，它指过去没有糖尿病病史，但在怀孕期间血糖高于正常值。

通过口服药物有效控制血糖(特别是餐后血糖)是目前糖尿病治疗的重要手段之一，且相对于注射胰岛素的治疗方案而言，更加方便和易于接受，因此口服降糖药物的研发在现阶段仍然是十分重要的。

四甲基尿酸(theacrine)，化学名为1,3,7,9-四甲基尿酸或Tetramethyluricacid或1,3,7,9-Tetramethyl-7,9-dihydro-1H-purine-2,6,8(3H)-trione,CAS号是2309-49-1，是最先从中国南方的苦茶，如

(Theobromagrandiflorum)和Camellia kucha(Camellia assamica var.kucha)等中提取的一种黄嘌呤类生物碱。现代药理学研究表明，四甲基尿酸具有抗炎、镇痛及多巴胺神经元保护等多种药理作用。

尽管四甲基尿酸具有广泛的生理活性、较低的毒性和天然来源的属性，但是现有技术中未发现四甲基尿酸具有可以降低I型和II型糖尿病血糖的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供四甲基尿酸预防和治疗糖尿病的应用。

四甲基尿酸在制备预防和治疗糖尿病的药物中的应用。

所述治疗糖尿病是指降低糖尿病患者的血糖，改善多饮多食、体重降低的症状。

所述糖尿病为I型和II型糖尿病。优选的，对于治疗，所述糖尿病是指I型和II型糖尿病，对于预防，所述糖尿病是指II型糖尿病。

所述药物的给药途径为口服给药。

所述药物的制剂为片剂、丸剂、胶囊剂或散剂。

所述四甲基尿酸的有效治疗剂量为0.5～100mg/kg。

所述四甲基尿酸预防糖尿病的剂量为1～20mg/kg。

四甲基尿酸还可以用于制备控制血糖的药物。特别是用于制备在糖尿病并发症中协同控制血糖的药物。

本发明在现有技术的基础上，更加深入的研究了四甲基尿酸的体内降糖性质，在四氧嘧啶诱导的I型糖尿病模型和STZ诱导的II型糖尿病模型中，四甲基尿酸均显示出较好的降糖活性；建模前两周给药结果显示，四甲基尿酸亦有较好的预防糖尿病的作用。四甲基尿酸口服给药效果较好，剂量为0.5～100mg/kg范围内，具有良好的安全性和有效性，1～20mg/kg的给药剂量即可发挥良好的预防作用，结果表明，四甲基尿酸可作为新型的抗糖尿病药物或候选化合物。

附图说明

图1为四甲基尿酸对正常小鼠糖耐受量的影响。

图2为四甲基尿酸对四氧嘧啶诱导的I型糖尿病小鼠血糖的影响。

图3为四甲基尿酸对STZ诱导的II型糖尿病小鼠血糖的影响。

图4为四甲基尿酸对STZ诱导的II型糖尿病小鼠体重的影响。

图5为四甲基尿酸对小鼠II型糖尿病的预防作用。

图6为GK/IRS-1基因敲除大鼠IRS-1蛋白凝胶成像及定量分析结果(GAPDH为内参)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。

本发明在四甲基尿酸已有生理活性的基础上更加深入和广泛的研究了其药理学活性。本发明发现了四甲基尿酸的新用途：即可用剂量依赖的降低I型和II型糖尿病模型动物的血糖，并且有效控制体重，且有预防糖尿病作用；同时，本发明发现，四甲基尿酸有较好的理化性质，能够制成各种剂型，其制剂范围广泛，片剂、丸剂、散剂、胶囊剂等各种剂型均可以通过常规制剂技术实现。

(一)四甲基尿酸对正常小鼠糖耐受量的影响

测定方法参考文献报道的标准方法，简述为：实验前雌雄各半的C57BL/6小鼠禁食12h，以4g/kg(浓度为0.35g/mL)体重量的葡萄糖剂量灌胃；同时灌胃给药。用血糖仪分别在给药后0、0.5、1、1.5、2、2.5h测定血糖(BG，Blood Glucose)。

给药方式

(1)空白对照组(简称K组)：与其他组等体积生理盐水(20mL/kg)；

(2)四甲基尿酸组(简称T组)：剂量为T1：5mg/kg，T2：10mg/kg，T3：20mg/kg，溶剂为生理盐水，少量DMSO助溶，灌胃给药；

(3)阳性对照药物组(简称P组)：二甲双胍溶解于超纯水中，终浓度是10g/L，按照10mg/kg灌胃给药；

每组实验动物7只，共35只，罗氏血糖仪(逸动型，已校正)尾静脉采血测定，每组实验数据取平均值。结果表明，四甲基尿酸能够剂量依赖的对正常小鼠的的糖耐受量有提高作用，高剂量(20mg/kg)时，其降糖能力与阳性对照药物相当(图1)。

(二)四甲基尿酸对四氧嘧啶诱导的I型糖尿病小鼠的治疗作用

模型构建及药物筛选方法参考文献报道的标准方法，简述为：取C57BL/6小鼠40只，抽签法分为模型组(n＝35)和正常对照组(n＝5)。模型组禁食不禁水12h后，尾静脉注射四氧嘧啶80mg/kg，1次/4天，连续4次。正常对照组禁食不禁水12h后腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液，1次/4天，连续4次。最后一次注射后1周内，断尾取血测量血糖。连续3天血糖>16.7mmol/L者为I型糖尿病小鼠，第4天进行药物筛选实验。

药物筛选实验：取建模成功的小鼠，禁食12h，以4g/kg(浓度为0.4g/mL)体重量的葡萄糖剂量灌胃，同时灌胃给药。用血糖仪分别在每天给药后0、0.5、1、1.5、2、2.5h测定血糖(BG)。

给药方式

(1)空白对照组(简称K组)：与其他组等体积生理盐水(20mL/kg)，1次/天，连续8周；

(2)四甲基尿酸组(简称T组)：浓度为T1：5mg/kg，T2：10mg/kg，T3：20mg/kg，灌胃给药，1次/天，连续8周；

(3)阳性对照药物组(简称P组)：二甲双胍溶解于超纯水中，终浓度是10g/L，按照10mg/kg灌胃给药，1次/天，连续8周；

结果表明，四甲基尿酸能够剂量依赖的对四氧嘧啶诱导的I型糖尿病小鼠有一定的治疗作用；高剂量时(20mg/kg)，其降糖能力与阳性对照药物相当(图2)。

(三)四甲基尿酸对STZ诱导的II型糖尿病小鼠的治疗作用。

模型构建及药物筛选方法参考文献报道的标准方法，简述为：取C57BL/6小鼠40只，抽签法分为模型组(n＝35)和正常对照组(n＝5)。模型组禁食不禁水12h后，尾静脉注射STZ40mg/kg(0.01mol/L，pH 4.2)，1次/天，连续5天。正常对照组禁食不禁水12h后腹腔注射等体积的枸橼酸缓冲液，1次/天，连续5天。最后一次注射后1周内，每天断尾取血测量血糖。连续3天血糖>16.7mmol/L者为II型糖尿病小鼠，第4天进行药物筛选实验。

药物筛选实验：取建模成功的小鼠，禁食12h，以4g/kg(浓度为0.4g/mL)体重量的葡萄糖剂量灌胃，同时灌胃给药。用血糖仪分别在每天给药后0、0.5、1、1.5、2、2.5h测定血糖(BG)。

给药方式

(1)空白对照组(简称K组)：与其他组等体积生理盐水(20mL/kg)，1次/天，连续8周；

(2)四甲基尿酸组(简称T组)：浓度为T1：5mg/kg，T2：10mg/kg，T3：20mg/kg，灌胃给药，1次/天，连续8周；

(3)阳性对照药物组(简称P组)：二甲双胍溶解于超纯水中，终浓度是10g/L，按照10mg/kg灌胃给药，1次/天，连续8周；

结果表明，四甲基尿酸能够剂量依赖的对STZ诱导的II型糖尿病小鼠有一定的治疗作用；高剂量时(20mg/kg)，其降糖能力与阳性对照药物相当(图3)。

(四)四甲基尿酸对STZ诱导的II型糖尿病小鼠体重的影响

建模实验与(三)相同。实验过程中每天定时称量小鼠体重，比较各组小鼠的体重。

给药方式

(1)正常对照组(简称N组)：无STZ诱导，每天注射与其他组等体积生理盐水(20mL/kg)，1次/天，连续8周；

(2)空白对照组(简称K组)：与其他组等体积生理盐水(20mL/kg)，1次/天，连续8周；

(3)四甲基尿酸组(简称T组)：浓度为T1：1mg/kg，T2：10mg/kg，T3：40mg/kg，灌胃给药，1次/天，连续8周；

(4)阳性对照药物组(简称P组)：二甲双胍溶解于超纯水中，终浓度是10g/L，按照10mg/kg灌胃给药，1次/天，连续8周；

结果表明，四甲基尿酸能够剂量依赖的增加STZ诱导的II型糖尿病小鼠的体重，使糖尿病小鼠的体重(Body Weight)趋于正常化(图4)。

(五)四甲基尿酸对STZ诱导的小鼠II型糖尿病的预防作用。

建模实验同(三)，从模型建立前14天开始给予四甲基尿酸，剂量同(三)，每天给药一次，连续给药到最后一次给予STZ后8周，空腹测血糖。

结果表明，四甲基尿酸能够降低STZ诱导下小鼠血糖的升高，对II型糖尿病有一定的预防作用(图5)。

(六)GK/IRS-1基因敲除大鼠的长时降糖实验

GK/IRS-1基因敲除大鼠(西安医甄生物科技有限公司)适应性喂养3天后用于长时降糖实验，给药14天后，断颈处死，采用Western Blotting检测肝脏中的IRS-1蛋白表达，采用现有文献报道的方法，简述如下：肝脏组织50mg，加入蛋白裂解液后，4℃、16000g离心，取上清液，用BCA法检测，SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜，封闭后进行一抗、二抗孵育，显影后置于凝胶成像系统检测，IMAGE-J软件定量分析。

给药方式

(1)空白对照组(简称K组)：正常大鼠，给予等体积生理盐水(20mL/kg)，1次/天，连续14天；

(2)模型组(简称G组)：GK/IRS-1基因敲除大鼠，给予等体积生理盐水(20mL/kg)，1次/天，连续14天；

(3)低剂量组(简称L组)：GK/IRS-1基因敲除大鼠，给予5mg/kg的四甲基尿酸，1次/天，连续14天；

(4)高剂量组(简称H组)：GK/IRS-1基因敲除大鼠，给予20mg/kg的四甲基尿酸，1次/天，连续14天；

(5)阳性对照药物组(简称P组)：二甲双胍溶解于超纯水中，终浓度是10g/L，GK/IRS-1基因敲除大鼠按照10mg/kg灌胃给药，1次/天，连续14天；

空腹血糖的OGTT实验表明，低、高剂量组均能明显降低血糖值，分子生物学实验结果表明，连续给药14天后，四甲基尿酸能够在高剂量下对GK/IRS-1基因敲除大鼠有一定的治疗作用；可能是通过IRS-1信号通路起作用的(图6)。

(七)四甲基尿酸制剂

6.1)四甲基尿酸片剂

四甲基尿酸200g，柠檬黄0.02g，微晶纤维素800g，微粉硅胶5g，硬脂酸镁10g，聚乙烯吡咯烷酮20g。

将上述四甲基尿酸，柠檬黄，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮混合均匀，过80目筛，然后加入微粉硅胶和硬脂酸镁，混合后压片。该片剂用于预防和治疗糖尿病的日服剂量为0.5-50mg/天(四甲基尿酸)。

6.2)四甲基尿酸胶囊剂

四甲基尿酸200g，微晶纤维素700g，羧甲基纤维素钠5g，十二烷基硫酸钠15g，二氧化硅15g。

将上述原料混合均匀，过80目筛，采用辊压法制粒，填充入胶囊。该胶囊剂用于预防和治疗糖尿病的日服剂量为1-100mg/天(四甲基尿酸)。

总之，本发明所提供的四甲基尿酸相较于空白对照组具有显著的降糖作用，能够明显降低四氧嘧啶诱导的I型和STZ诱导的II型糖尿病小鼠的血糖，改善多饮多食(此为观察到的实验现象)和体重降低的症状。另外，建模前两周给予四甲基尿酸，能增加小鼠的葡萄糖耐受，起到一定的预防作用；对于先天性糖尿病患者亦有可能成为辅助治疗的药物。本发明研究为防、治糖尿病的科学研究和临床应用提供了理论依据和实验支持。

Claims (4)

1.四甲基尿酸在制备用于治疗糖尿病的药物中的应用，其特征在于：所述治疗糖尿病是指利用四甲基尿酸作为所述药物的唯一活性成分，降低II型糖尿病患者的血糖，增加体重。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的给药途径为口服给药。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的制剂为片剂、丸剂、胶囊剂或散剂。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述四甲基尿酸的有效治疗剂量为0.5～100mg/kg。

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