CN103275187B - 一种镇痛肽fi及其基因和应用 - Google Patents
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
本发明公开了一种皮肤镇痛肽FI及其基因和应用。它包含6个氨基酸残基，分子量为717.87Da，等电点为5.52，其氨基酸序列如SEQID:1所示，编码镇痛肽FI的DNA序列如SEQID:2所示。本发明的镇痛肽FI在小鼠醋酸扭体疼痛模型，福尔马林疼痛模型、摆尾实验以及热板实验中表现出良好的镇痛效果，能够在制备镇痛药物中的应用；且该镇痛肽FI具有结构简单、人工合成方便，生产成本低等优点，利用工业大量生产，具有重要的应用前景和实际意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种镇痛肽FI及其基因和应用。
背景技术
疼痛是人们一生中经常遇到的不愉快的感觉，它提供躯体受到威胁的警报信号，是生命不可缺少的一种特殊保护功能；另一方面，它又是各种疾病最常见的症状，也是当今困扰人类健康最严重的问题之一。从当今世界范围来看，疼痛已经成为危害人类健康的主要“杀手”之一，也是造成人们劳动能力降低和出勤日减少的最普通、最直接的因素。镇痛药物是一类能够减轻疾病痛苦的物质，不仅能够选择地减轻或缓解疼痛感觉，也可以缓解因剧烈疼痛而引起的恐惧、紧张及焦虑等不愉快的情绪。目前的镇痛药物可以分为解热镇痛药和麻醉镇痛药物两类，前者以阿司匹林为代表，通过对组织中前列腺素合成过程的抑制作用，减轻神经末梢对致痛物质的敏感性，主要用于解除炎症性疼痛和其他钝疼；后者以吗啡为代表，其作用部位主要在丘脑和皮层，作用于中枢神经系统中的μ-型阿片受体，以缓解锐痛、钝痛和内脏绞痛，从而产生镇痛作用，主要用于各种疾病所引起的疼痛和手术后病人的严重疼痛，特别是晚期癌症疼痛。但是目前这种以吗啡为代表的麻醉性镇痛药物存在成瘾性强，戒断症状严重，病人必须不断增加剂量才能维持镇痛效果，而且最终导致对这类药物失效，同时对神经损伤性疼痛无疗效等主要缺点。
在中国的传统中药和民族医药中，许多两栖类动物被作为药材而被广泛的应用，如中华蟾蜍Bufogargarizans，大蹼铃蟾Bombinamaxima，黑斑蛙Pelophylaxnigromaculata，沼蛙hylaranaguentheri和泽蛙Euphlyctislimnocharis等，这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有：光谱抗菌作用、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、对心血管系统的作用等；另一方面，传统中药药物成分的复杂性及其炮制方法的局限性也是造成药物活性成分不能更好发挥作用的中药原因，因而从这些传统药物中寻找特定的活性单体化合物是中药现代化的中药内容之一。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已经成为新药发明的热点。近十几年对170多种两栖类皮肤活性肽和类似物进行了筛选，证明有40多种活性肽有较好的药物开发前景。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性蛋白肽类物质的研究还较少。东北雨蛙为雨蛙科雨蛙属的 两栖动物，主要分布于日本北海道和屋久岛，以及黑龙江、辽宁、吉林、内蒙等地，主要栖息于树上生活，为了逃避多种生物天敌的侵袭和适应多变的自然环境以及避免受伤机体损伤，在长期的进化过程中，雨蛙的皮肤发展成为具有多种功能的器官，如：分泌大量抗菌肽抵御微生物侵袭；分泌神经毒素对抗各类天敌；分泌生长因子促进伤口愈合等。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种镇痛肽FI；
本发明的另一个目的在于提供编码镇痛肽FI的氨基酸序列和基因序列；
本发明的又一目的在于提供一种镇痛肽FI在制备镇痛药物中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案来实现，镇痛肽FI，它包含6个氨基酸残基，分子量为717.87Da，等电点为5.52，其氨基酸序列如SEQ ID:1所示，为:苯丙氨酸-色氨酸-脯氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸。
编码一种镇痛肽FI的DNA序列，其核苷酸序列如SEQID:2所示，为：
Atggctttct tgaggaaatc gcttttcctt gtactatttc ttggattagt ctcactgtca 60
ttctgtgaag aagagaaaag agtggaagaa gaagagaaga aaagagatag tagtgtggag 120
gaagaaaaga gattttggcc agtgattggt cgtcgtgatg aagaaaagag attttggcca 180
gtgattggtc gtcgtgatga agaaaagaga ttctggccag tgattggtcg tcgtgatgaa 240
gaaaagagat tttggccagt gattggtcgt cgtgatgaag aaaagagatt ttggccagtg 300
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aagagatttt ggccagtgat tggtcgtcgt gatgaagaaa agagattttg gccagtgatt 420
ggtcgtcgtg atgaagaaaa gagattctgg ccagtgattg gtcgtcgtga tgaagaaaag 480
agattttggc cagtgactgg tcgtcgtgat gaataaaaga gattatggcc gcctggccgt 540
cattaataaa atgtaatgtt tcatccctaa ggaacacaat tactattagt tattccagat 600
ctatattaaa gcttatcaaa ctgataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 649
本发明的镇痛肽FI在制备镇痛药物中的应用。
本发明的有益效果是：实验证明，本发明中的镇痛肽FI具有良好的镇痛效果，能够作为制备镇痛药物中的应用。且该镇痛肽FI具有结构简单、人工合成方便，生产成本低等优点，利用工业大量生产，具有重要的应用前景和实际意义。
附图说明
图1为镇痛肽FI对小鼠摆尾模型的镇痛效果示意图。
图2为镇痛肽FI对小鼠热板模型的镇痛效果示意图。
图3为镇痛肽FI对小鼠扭体镇痛模型的镇痛效果示意图。
图4为镇痛肽FI对小鼠福尔马林镇痛模型的镇痛效果示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：东北雨蛙皮肤镇痛肽FI基因克隆
I.东北雨蛙皮肤总RNA的提取
A.活体东北雨蛙用水清洗干净，液氮中速冻4h，取皮肤组织300mg，加入10mlTrizol提取缓冲液(美国GIBCOBRL公司产品)，置于20ml玻璃匀浆器中匀浆30min；
B.加入等体积酚/氯仿溶液，剧烈振荡混匀，室温放置10min后，于4℃，12000rpm离心机中离心10min，取上清液；
C.上清液中加入等体积异丙醇，室温放置10min后，于4℃，12000rpm离心机中离心10min，沉淀用75%乙醇洗一次，晾干，即为东北雨蛙皮肤总RNA。
D.将所获皮肤总RNA用适量DEPC水溶解，于28OIun、260nm波长处检测所提取的总RNA的浓度及纯度。
II.东北雨蛙皮肤mRNA的纯化
东北雨蛙皮肤mRNA分离纯化采用美国PROMEGA公司的mRNAIsolationSystems试剂盒。
A.取东北雨蛙皮肤总RNA500μg溶于500μlDEPC水中，65℃水浴10min，加入3μl的Oligo(dT)探针和13μl20×SSC溶液，混合均匀，室温冷却，称为A液。
B.磁珠(SA-PMP)的洗涤：将磁珠轻弹混匀，至磁力架吸附30s，弃上清，加0.5×SSC0.3ml，至磁力架吸附30s，再加0.1ml0.5×SSC悬液，称为B液。
C.将A液加入B液中，置室温10min，至磁力架吸附30s，弃上清，用0.1×SSC洗涤4次，再弃上清，加0.1mlDEPC水悬浮，至磁力架上吸附30s，将上清移至新的试管，再加入0.15mlDEPC水重新悬浮，至磁力架吸附30s，移上清至上述试管，上清液为纯化的东北雨蛙皮肤mRNA。
D.加入1/10体积3M乙酸钠，pH5.2，等体积异丙醇，于-70℃放置30min，4℃，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀溶解于10μlDEPC水中。
III.东北雨蛙皮肤cDNA文库构建
采用CLONTECH公司CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit质粒cDNA文库构建试剂盒。
A.cDNA第一链合成（mRNA反转录）：
1.在0.5ml无菌的离心管中加入1μl华南雨蛙皮肤mRNA、1μlSMARTIV寡聚核苷酸、1μlCDSIII/3’PCR引物，加2μl去离子水使总体积达到5μl。
2.混匀离心管中的试剂并短暂离心，72℃保温2min。
3.将离心管在冰上孵育2min。
4.在离心管中加入以下试剂：2.0μl5×第一链缓冲、1.0μl20mM二硫苏糖醇、1.0μl10mMdNTP混合物、1.0μlPowerScript反转录酶。
5.混合离心管中试剂并短暂离心，在42℃保温1h。
6.将离心管置于冰上中止第一链的合成。
7.从离心管去2μl所合成的cDNA第一链备用。
B.采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链
1.95℃预热PCR仪。
2.将2μlcDNA第一链（mRNA反转录）、80μl去离子水、10μl10×Asvantage2PCR缓冲、2μl50×dNTP混合物、2μl5’PCR引物、2μlCDSIII/3’PCR引物以及2μl大肠杆菌聚合酶离心管进行反应。
3.在PCR仪中按以下程序扩增：
① 95℃ 20s
②22个循环
95℃ 5s；68℃ 6s
4.循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链进行抽提。
C.PCR产物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System试剂盒进行抽提回收，步骤如下：
1.将通过PCR得到的cDNA双链加入等体积的膜结合缓冲颠倒混匀，然后将混和液转入离心纯化柱，室温静置5分钟，使DNA充分与硅胶膜结合。16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
2.加入700μl的洗脱液（含乙醇）于离心纯化柱中，16,000g离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
3.重复步骤2。
4.16,000g离心5分钟。
5.将离心纯化柱置于新的离心管中。
6.加入30μl超纯水，在室温下静置5分钟。
7.16,000g离心1分钟，管底溶液即为所纯化过的cDNA双链。
D.大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备：
1.挑取单个DH5α菌落，接种于3m1不含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50m1LB培养液中，37℃振荡2小时。当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。
2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50m1聚丙烯管中，在冰上方置10min，使培养物冷却至0℃。
3.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。
5.每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6.于4℃以4100r/min离心10min，以回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。
8.每50m1初始培养物用2m1用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀，分装后备用。
E.酶切、连接以及连接产物的转化：
1.在微量离心管中加入1μlTakarapMD19-T载体、4μl东北雨蛙cDNA双链溶液，全量为5μl。
2.加入5μl（等量）的连接酶缓冲混合物。
3.16℃反应2小时。
4.全量（10μl）加入至100μlDH5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。
5.42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
6.加入37℃温浴过的LB培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。
7.取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培养基上37℃培养16小时，形成单菌落。
8.每个LB平皿用5m1LB液体培养基洗涤菌落，加30%甘油冻存，构建的cDNA大约含1×106个单独克隆。
IV.东北雨蛙皮肤FI基因克隆筛选
扩增引物长度为17个核苷酸其序列为5’TACCGAAAGAACTCAATTTA3’，PCR另一扩增引物为CLONTECH公司SMARTTMcDNALibraryConstructionKit中的3’PCRPrimer引物，其序列为5＇ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG3＇。
PCR反应在如下条件下进行：94℃30秒钟，56℃30秒钟和72℃45秒钟，30个循环。
将扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切取目的条带，用DNA纯化试剂盒进行纯化。将纯化的目的片段连接到pMD19-T载体中，即得连接产物。将连接产物转化预先制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞。最后，取适量转化产物涂布至含Amp的LB平板上，经37℃培养16h形成的单菌落即为含目的片段的阳性克隆。
V.东北雨蛙皮肤FI基因测定
挑取单菌落用M13引物检测插入片段的大小。挑选含目的片段的阳性克隆送DNA测序公司测序。
东北雨蛙皮肤FI包含6个氨基酸残基，分子量为717.87Da，等电点为5.52，其氨基酸序列如SEQID:1所示，为:苯丙氨酸-色氨酸-脯氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸。
编码东北雨蛙皮肤镇痛肽FI的DNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID:2所示，为：
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实施例2：制备镇痛肽FI
A.称取树脂0.2g放置于干燥洁净的反应管中，加入适量的N,N-二甲基酰胺（DMF）,活化30分钟作用，将称取第一氨基酸残基1mmol，DMAP150mg加入到反应管中，DMF做为溶剂反应3小时。反应完毕后用DMF洗3-6次，加入适当的吡啶和乙酸酐，体积比为1:1，反应30min。反应完毕后DMF洗3-6次。然后用哌啶洗脱氨基酸的保护基团Fmoc，洗脱两次每次15min，再用DMF洗4次，甲醇洗2次。
B.称第二个氨基酸3mmol，HBTU3mmol于反应管中，加入DIEA0.5ml，反应40分钟，用DMF洗3-6次，加入哌啶溶液两次洗脱氨基酸的保护基团Fmoc，每次10分钟，再用DMF洗4次，甲醇洗2次。
C.重复第二个步骤直到最后一个氨基酸残基。
D.最后一个氨基酸反应完毕后，用三氟乙酸切割2小时，反应抽滤，得到多肽的三氟乙酸溶液，用乙醚沉淀，离心，再用乙醚洗3-5遍，得到白色固体，经过HPLC脱盐冻干得到多肽样本。
实施例3：镇痛肽FI对小鼠摆尾模型的镇痛实验
取重量为18～22g昆明小鼠，用鼠尾测痛仪筛选出基础痛阈在3～7s的小鼠50只用于试验，测定方法为：鼠尾测痛仪的红外光束照在距离小鼠尾巴根部的1/3处，痛阈时间是指从小鼠接受红外光束照射到小鼠发生摆尾动作之间的时间间隔，并记录小鼠的基础痛阈值。将小鼠分为5组，每组10只，分别为阴性对照组、阳性对照组组、治疗组1、治疗组2、治疗组3，将镇痛肽FI冻干粉溶解于无菌生理盐水中，制备1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg的镇痛肽FI，采用腹腔注射方式给药，阳性对照组注射100μL5mg/kg吗啡，治疗组1注射100μL1.25mg/kg镇痛肽FI，治疗组2注射100μL2.5mg/kg镇痛肽FI，治疗组3注射100μL5.0mg/kg镇痛肽FI，阴性对照组注射无菌生理盐水，体积为100μL，在注射给药后10min、30min、60min、180min、360min测定小鼠的痛阈值。为了避免造成小鼠的组织伤害，如果小鼠给药后痛阈值大于10s，该小鼠的痛阈值就记为10s，结果见图1。
如图1所示：与对照组相比，小鼠注射镇痛肽FI后，能够明显减轻小鼠的疼痛。
实施例4：镇痛肽FI对小鼠热板模型的镇痛实验
取雌性小鼠，昆明种，重量为18～22g，用鼠尾测痛仪筛选出基础痛阈在5～30s的小鼠50只用于试验，测试方法为：将小鼠置于热板上，热板温度保持在55±0.5℃，小鼠在热板上的反应时间是指从小鼠放到热板上到小鼠发生添后足行为或者直接跳出热板之间的时间间隔，并记录小鼠的基础痛阈值。将小鼠分为5组，每组10只，分别为阴性对照组、阳性对照组、治疗组1、治疗组2、治疗组3，将镇痛肽FI冻干粉溶解于无菌生理盐水中，制备1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg的镇痛肽FI，采用腹腔注射方式给药，阳性对照组注射100μL5mg/kg吗啡，治疗组1注射100μL1.25mg/kg镇痛肽FI，治疗组2注射100μL2.5mg/kg镇痛肽FI，治疗组3注射100μL5.0mg/kg镇痛肽FI，阴性对照组注射无菌生理盐水，体积为100μL，在注射给药后10min、30min、60min、180min、360min测定小鼠的痛阈值，为了避免造成小鼠的组织伤害，如果小鼠给药后痛阈值大于60s，该小鼠的痛阈值就记为60s，结果见图2。
如图2所示：与对照组相比，小鼠注射镇痛肽FI后，能够明显减轻热板造成的疼痛。
实施例5：镇痛肽FI对小鼠扭体镇痛模型的镇痛实验
取重量为18～22g昆明小鼠50只，分为5组，每组10只，分别为阴性对照组、阳性对照组、治疗组1、治疗组2、治疗组3，将镇痛肽FI冻干粉溶解于无菌生理盐水中，制备1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg的镇痛肽FI，采用腹腔注射方式给药，阳性对照组注射100μL5mg/kg吗啡，治疗组1注射100μL1.25mg/kg镇痛肽FI，治疗组2注射100μL2.5mg/kg镇痛肽FI，治疗组3注射100μL5.0mg/kg镇痛肽FI，阴性对照组注射无菌生理盐水，体积为100μL，30min后，腹腔注射0.6%的乙酸（10ml/kg体重），计数小鼠注射乙酸后30min的扭体次数，结果见图3。
如图3所示：小鼠注射生理盐水、5mg/kg吗啡、1.25mg/kgFI、2.5mg/kgFI、5.0mg/kgFI，小鼠扭体次数分别为：62、27.9、48.1、32.5和26.9次，实验表明：镇痛肽FI能够明显减轻乙酸造成的疼痛。
实施例6：镇痛肽FI对小鼠福尔马林镇痛模型的镇痛实验
取重量为18～22g昆明小鼠50只，分为5组，每组10只，分别为阴性对照组、阳性对照组、治疗组1、治疗组2、治疗组3，将镇痛肽FI冻干粉溶解于无菌生理盐水中，制备1.25mg/kg、2.5mg/kg、5.0mg/kg的镇痛肽FI，采用腹腔注射方式给药，阳性对照组注射100μL5mg/kg吗啡，治疗组1注射100μL1.25mg/kg镇痛肽FI，治疗组2注射100μL2.5mg/kg镇痛肽FI，治疗组3注射100μL5.0mg/kg镇痛肽FI，阴性对照组注射无菌生理盐水，体积为100μL，30min后，在小鼠的脚掌处注射20mL浓度为0.92%福尔马林，采用摄像记录小鼠总舔脚时间，结果见图4。
如图4所示：小鼠注射生理盐水、5mg/kg吗啡、1.25mg/kgFI、2.5mg/kgFI、5.0mg/kgFI，0～5min小鼠舔趾时间分别为：142.2、57.6、108.4、83.1和71.9次；15～30min小鼠舔趾时间分别为：372.1、258.7、287.6、247.7和216.6次，实验表明：镇痛肽FI能够明显减轻福尔马林造成的疼痛。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川科伦新光生物科技开发有限公司 中国科学院昆明动物研究所
<120> 一种镇痛肽FI及其基因和应用
<130> 1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Hyla japonica
<400> 1
Phe Trp Pro Val Ile Gly
1 5
<210> 2
<211> 649
<212> DNA
<213> Hyla japonica
<400> 2
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Claims (2)
1.一种镇痛肽FI，其特征在于，它包含6个氨基酸残基，分子量为717.87 Da，等电点为5.52，其氨基酸序列如SEQ ID:1所示。
2.如权利要求1所述一种镇痛肽FI在制备镇痛药物中的应用。
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